專利名稱：用于神經(jīng)成像的包括與病毒組分結(jié)合的熒光染料的成像法和組合物的制作方法
用于神經(jīng)成像的包括與病毒組分結(jié)合的熒光染料的成像法和組合物
相關申請
本申請根據(jù)35U.S.C.§ 119(e)要求于2008年5月14日提交的美國臨時申請?zhí)?61/127,659、和于2008年7月23日提交的美國臨時申請?zhí)?1/082,981的優(yōu)先權利益，所 述美國臨時申請的公開內(nèi)容引入本文作為參考。發(fā)明領域
本文公開的是涉及醫(yī)學成像領域的組合物和方法。
發(fā)明背景
醫(yī)源性神經(jīng)損傷可以導致在人中的致虛弱的功能喪失。醫(yī)源性神經(jīng)損傷的 常見原因包括患者的外科手術失敗、牽引或壓迫性損害、血腫或不適定位(inadequate positioning) (Fercan Komurcu，MD 等 人，2005, Annals of Plastic Surgery, 54(2) 135-139)。
例如，神經(jīng)通常在前列腺切除術手術過程中進行成像。作為背景資料，前列腺 癌是美國男性中最常見類型的癌癥。一種常見治療選項是在癌癥局部擴散前和轉(zhuǎn)移前除 去癌性前列腺組織(即，前列腺切除術)。根治性前列腺切除術(radical prostatectomy)并 發(fā)癥包括失禁和陽萎。由于在外科手術過程中對海綿體神經(jīng)的損傷，經(jīng)歷根治性前列腺 切除術手術的相當大百分比的男性變得陽萎。
通過避免對沿著前列腺表面伸展且是勃起所需的神經(jīng)束的損傷，可以減少醫(yī)源 性神經(jīng)損傷的危險。然而，由于區(qū)分前列腺組織和神經(jīng)支配神經(jīng)組織中的困難，通常難 以實現(xiàn)成功的保留神經(jīng)外科手術(nervesparing surgery)。
存在對用于神經(jīng)成像的改良成像法和組合物的需要。
發(fā)明概述
本文公開的是用于使神經(jīng)成像的組合物和方法。神經(jīng)可以位于受試者的不同區(qū) 域中。
本文還公開的是下述發(fā)現(xiàn)使熒光染料與能夠穿透神經(jīng)軸突的病毒組分(例 如，病毒、病毒蛋白質(zhì)、衣殼)結(jié)合可以形成染料/病毒組分復合物，其可以穿透神經(jīng)軸 突，從而允許改良的神經(jīng)細胞成像。一個實施方案提供了包括下述的組合物
熒光染料；和
選自向神經(jīng)的復制缺陷型病毒、向神經(jīng)病毒的病毒蛋白質(zhì)和向神經(jīng)病毒的衣殼 的病毒組分，
其中熒光染料與病毒組分結(jié)合，以形成能夠穿透神經(jīng)細胞的染料/病毒組分復 合物。
在本文公開的這個和其他實施方案中，向神經(jīng)的復制缺陷型病毒可以是例如減 毒或滅活的病毒組分，其能夠穿透神經(jīng)細胞。在另一個實施方案中，組合物可以是包括 熒光染料和病毒組分的疫苗，所述病毒組分選自向神經(jīng)病毒、向神經(jīng)病毒的病毒蛋白質(zhì)和向神經(jīng)病毒的衣殼。因此，另一個實施方案提供了疫苗，其包括
熒光染料；和
選自向神經(jīng)病毒、向神經(jīng)病毒的病毒蛋白質(zhì)和向神經(jīng)病毒的衣殼的病毒組分，
其中熒光染料與病毒組分結(jié)合，以形成能夠穿透神經(jīng)細胞的染料/病毒組分復 合物。
另一個實施方案提供了制備組合物的方法，其包括
使熒光染料與病毒組分組合，所述病毒組分選自向神經(jīng)的復制缺陷型病毒、向 神經(jīng)病毒的病毒蛋白質(zhì)和向神經(jīng)病毒的衣殼，
允許熒光染料與病毒組分結(jié)合，以形成能夠穿透神經(jīng)細胞的染料/病毒組分復 合物。
另一個實施方案提供了用于使神經(jīng)成像和/或診斷神經(jīng)異常和/或狀況的方法。 該方法包括步驟(a)給受試者施用如本文公開的組合物，(b)允許染料/病毒組分復合 物穿透神經(jīng)細胞，(c)給受試者應用足夠量的輻射能，從而使得染料發(fā)熒光，(d)手術中 (intra-operatively)獲得受試者的熒光圖像。該方法可以包括觀察熒光圖像以觀看受試者 中的一條或多條神經(jīng)，或觀察熒光圖像以確定是否橫切了一條或多條神經(jīng)的步驟。
因此，另一個實施方案提供了用于減少在外科手術程序過程中對受試者的醫(yī)源 性損傷的危險的方法，其包括
(a)給受試者施用組合物，所述組合物包括
熒光染料；和
選自向神經(jīng)的復制缺陷型病毒、向神經(jīng)病毒的病毒蛋白質(zhì)和向神經(jīng)病毒的衣殼 的病毒組分，
其中熒光染料與病毒組分結(jié)合，以形成染料/病毒組分復合物；
(b)允許染料/病毒組分復合物穿透神經(jīng)細胞；
(c)給受試者應用足夠量的輻射能，從而使得染料發(fā)熒光；
(d)手術中獲得受試者的熒光圖像；和
(e)觀察熒光圖像以觀看受試者中的一條或多條神經(jīng)。
另一個實施方案提供了用于診斷神經(jīng)狀況的方法，其包括
(a)給受試者施用組合物，所述組合物包括
熒光染料；和
選自向神經(jīng)的復制缺陷型病毒、向神經(jīng)病毒的病毒蛋白質(zhì)和向神經(jīng)病毒的衣殼 的病毒組分，
其中熒光染料與病毒組分結(jié)合，以形成染料/病毒組分復合物；
(b)允許染料/病毒組分復合物穿透神經(jīng)細胞；
(c)給受試者應用足夠量的輻射能，從而使得染料發(fā)熒光；
(d)手術中獲得受試者的熒光圖像；和
(e)觀察熒光圖像以確定是否橫切了神經(jīng)。
其他實施方案提供了試劑盒，其包含本文公開的組合物，連同根據(jù)本文描述的 一種或多種方法使用組合物的說明書。在其他實施方案中，試劑盒包括一種或多種成 分、試劑、染料、病毒、前體或可以用于制備本文公開的組合物的其他工具，連同根據(jù)本文描述的一種或多種方法使用組合物的說明書。
附圖簡述


圖1示意性描述用于醫(yī)學成像的系統(tǒng)；
圖2是描述用于醫(yī)學成像的算法的流程圖，所述算法可以通過安裝在計算機處 理器上的軟件執(zhí)行；
圖3A顯示實施例3小鼠背部的熒光圖像；
圖3B是圖3A相同小鼠背部的可見(白色)光圖像，但沒有熒光成像；
圖3C是具有一些可見光照明的實施例3小鼠的暴露的脊髓的熒光圖像；
圖3D是接近于小鼠頭部的相同脊髓的熒光圖像，其中與脊髓會合的神經(jīng)未用 ICG/PBS/HSV-2 Δ RR 標記；
圖4Α顯示在實施例4整只小鼠(仰臥)的腹面觀中的ICG/PBS/HSV-2 Δ RR (染 料/病毒組分復合物)熒光；
圖4Β是使用熒光和白光成像顯示實施例4小鼠背部(背面觀)的圖像，所述小 鼠進行解剖以顯示脊柱和來自左爪的熒光神經(jīng)；
圖4C是圖4Β的相同小鼠的熒光圖像；
圖4D是下述的熒光圖像⑴僅以白光的從實施例4小鼠脊柱左側(cè)解剖的熒光 背根神經(jīng)節(jié)，其中它的軸突的短區(qū)段在神經(jīng)節(jié)的右側(cè)上，和Gi)來自脊柱右側(cè)的相應神 經(jīng)節(jié)，其右爪墊軸突未進行注射；
圖4E是(i)圖4D(i)的神經(jīng)節(jié)和(ii)圖4D(ii)的神經(jīng)節(jié)的熒光圖像；
圖4F是來自圖4E (i)的神經(jīng)節(jié)的放大熒光圖像；
圖5A顯示用于與熒光圖像比較的兔左肢的解剖繪圖5B是顯示ICG/HSV-2 Δ RR復合物從趾墊注射部位向上行進到上足底外側(cè)神 經(jīng)內(nèi)的熒光圖像；
圖5C顯示用于與熒光圖像比較的兔右肢的解剖繪圖5D是以可見白光的，隱神經(jīng)分離的區(qū)段的圖像；
圖5Ε是顯示具有ICG/HSV_2ARR復合物熒光的隱神經(jīng)分離的區(qū)段的熒光圖 像；
圖5F和5H是分別顯示前2個框(圖5F)和原位神經(jīng)(圖5H)的隱神經(jīng)切斷的 區(qū)段的熒光圖像；
圖5G和51是顯示圖5F的隱神經(jīng)切斷的區(qū)段的熒光圖像，但就UV滅活的ICG/ PBS/HSV-2 Δ RR病毒的LacZ基因染色；
圖5J是用于與熒光圖像比較的兔左肢的解剖繪圖；和
圖5Κ是實施例5兔左腿背方位的熒光圖像。
詳述
一個實施方案提供了用于神經(jīng)成像的組合物。
在一個實施方案中，組合物包括用于醫(yī)學成像的染料例如熒光染料。然而，許 多染料不適合于使身體的特定部分例如神經(jīng)成像，因為染料一般不能穿透神經(jīng)細胞。本 文公開的是下述發(fā)現(xiàn)向神經(jīng)病毒組分，即能夠穿透神經(jīng)細胞的病毒組分，可以用于使 染料軸突運輸穿過神經(jīng)網(wǎng)絡的部分或全部。這可以通過形成與病毒組分結(jié)合的染料復合物來實現(xiàn)。
爐
如本文使用的，術語“熒光染料”或“染料”意指小分子或蛋白質(zhì)或其他聚合 物或大分子，在經(jīng)由合適波長的輻射光能激發(fā)后，其通過發(fā)射在可見或近紅外波長范圍 中的光而發(fā)熒光。
合適的熒光染料包括當暴露于輻射能例如光時發(fā)熒光的任何無毒染料。在特 定實施方案中，染料是發(fā)射在近紅外光譜中的光的熒光染料。在一些實施方案中，染 料可能不是脂溶性的，而在其他實施方案中，它可以是脂溶性的。在特定實施方案 中，染料是三碳菁(tricarbocyanine)染料，例如由 Akorn，Inc. (Buffalo Grove, IL)銷售 的靛青綠(ICG)。ICG染料是FDA批準用于人使用的。在其他實施方案中，染料是 tafracyaninegreen。在其他實施方案中，染料選自異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、 藻藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二醛、熒光胺、玫瑰紅(Rose Bengal)、錐蟲藍、熒光金 (fluoro-gold)、3-靛青綠-?；?1，3-四氫噻唑-硫酮、綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、 黃色熒光蛋白、藍色熒光蛋白和其他熒光蛋白質(zhì)。染料可以進行混合或組合。在一些實 施方案中，可以使用染料類似物?！叭玖项愃莆铩笔且堰M行化學修飾但仍保留其在暴露 于合適波長的輻射能時發(fā)熒光的能力的染料。
在一個實施方案中，染料是通過用相同但與綠色熒光蛋白基因融合的病毒蛋白 質(zhì)基因置換病毒蛋白質(zhì)基因構建的、與病毒衣殼中的蛋白質(zhì)共價結(jié)合的熒光蛋白質(zhì)，例 如綠色熒光蛋白。在一個實施方案中，綠色熒光蛋白與穿透神經(jīng)細胞的向神經(jīng)病毒蛋白 質(zhì)共價結(jié)合。
病毒組分
在一個實施方案中，病毒組分選自病毒、病毒蛋白質(zhì)和衣殼。在一個實施方案 中，病毒蛋白質(zhì)是衣殼或衣殼蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，病毒蛋白質(zhì)是病毒蛋白質(zhì)類 似物。在一個實施方案中，病毒蛋白質(zhì)和類似物獨自能夠穿透神經(jīng)細胞，而不是病毒衣 殼或完整病毒的部分。在另一個實施方案中，病毒蛋白質(zhì)和類似物可以是自身穿透神經(jīng) 細胞的病毒衣殼或完整病毒的部分。類似物具有導致保守氨基酸改變的不同核酸結(jié)構， 所述保守氨基酸改變盡管改變蛋白質(zhì)或肽的一級序列，但它們通常不改變其功能。保守 氨基酸取代一般包括在下述組內(nèi)的取代
甘氨酸、丙氨酸；
纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；
天冬氨酸、谷氨酸；
天冬酰胺、谷氨酰胺；
絲氨酸、蘇氨酸；
賴氨酸、精氨酸；
苯丙氨酸、酪氨酸。
在一個實施方案中，病毒蛋白質(zhì)及其類似物可以在染料與之結(jié)合前進行分離。
因為它在醫(yī)學應用中使用，所以這種組分是無毒力或“復制缺陷型的”。如本 文使用的，術語“復制缺陷型的”意指在靶細胞(神經(jīng)細胞)中未能形成病毒顆粒(病 毒后代)。在一個實施方案中，“復制缺陷型的”指不能復制?！皬椭迫毕菪汀辈《疽部梢灾笢p毒病毒。在一個實施方案中，減毒病毒是具有低毒力的活病毒。在一個實施方 案中，減毒病毒不復制。在另一個實施方案中，它們可以在受感染細胞中表達病毒抗原 而不復制。在另一個實施方案中，減毒病毒緩慢復制且產(chǎn)生減毒病毒后代。
在一個實施方案中，病毒組分不是神經(jīng)毒性的。
在一個實施方案中，病毒經(jīng)由突變或通過熱、光(例如，紫外線)或化學處理滅 活而變成復制缺陷型的。殺死特定病毒所需的紫外(“UV” )線的劑量和波長是眾所周 失口白勺。 列女口， http://www.americanairandwater.com/uv~facts/uv~dosage.htm 歹[J 出 了在下表 1中再現(xiàn)的，將抑制特定病毒的集落形成的紫外線劑量
表 權利要求
1.一種組合物，其包括 熒光染料；和選自向神經(jīng)的復制缺陷型病毒、向神經(jīng)病毒的病毒蛋白質(zhì)和向神經(jīng)病毒的衣殼的病 毒組分，其中所述熒光染料與所述病毒組分結(jié)合，以形成能夠穿透神經(jīng)細胞的染料/病毒組 分復合物。
2.權利要求1的組合物，其中所述染料選自靛青綠、infracyaninegreen、綠色熒光染料、異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二醛、熒光 胺、玫瑰紅、錐蟲藍、熒光金、3-靛青綠-?；?1，3-四氫噻唑-硫酮、綠色熒光蛋 白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、藍色熒光蛋白和其他熒光蛋白質(zhì)。
3.權利要求2的組合物，其中所述染料是靛青綠。
4.權利要求1的組合物，其中所述病毒組分是向神經(jīng)的復制缺陷型病毒。
5.權利要求4的組合物，其中所述病毒是皰疹病毒或其突變體或變體。
6.權利要求5的組合物，其中所述皰疹病毒是HSV-2。
7.權利要求4的組合物，其中所述病毒是皰疹水痘。
8.權利要求4的組合物，其中所述病毒包括HSV-2ICP10A RR。
9.權利要求4的組合物，其中所述病毒通過UV滅活、突變、化學處理或熱處理而變 成復制缺陷型的。
10.權利要求4的組合物，其中所述復制缺陷型病毒選自減毒病毒、突變病毒和疫田o
11.一種疫苗，其包括 熒光染料；和選自向神經(jīng)病毒、向神經(jīng)病毒的病毒蛋白質(zhì)和向神經(jīng)病毒的衣殼的病毒組分， 其中所述熒光染料與所述病毒組分結(jié)合，以形成能夠穿透神經(jīng)細胞的染料/病毒組 分復合物。
12.—種制備組合物的方法，其包括使熒光染料與病毒組分組合，所述病毒組分選自向神經(jīng)的復制缺陷型病毒、向神經(jīng) 病毒的病毒蛋白質(zhì)和向神經(jīng)病毒的衣殼，允許所述熒光染料與所述病毒組分結(jié)合，以形成能夠穿透神經(jīng)細胞的染料/病毒組 分復合物。
13.權利要求12的方法，其中所述病毒組分是向神經(jīng)的復制缺陷型病毒。
14.權利要求13的組合物，其中所述病毒通過突變、UV滅活、化學處理或熱處理而 變成復制缺陷型的。
15.一種用于減少在外科手術程序過程中對受試者的醫(yī)源性損傷的危險的方法，其包括(a)給所述受試者施用組合物，所述組合物包括 熒光染料；和選自向神經(jīng)的復制缺陷型病毒、向神經(jīng)病毒的病毒蛋白質(zhì)和向神經(jīng)病毒的衣殼的病 毒組分，其中所述熒光染料與所述病毒組分結(jié)合，以形成染料/病毒組分復合物；(b)允許所述染料/病毒組分復合物穿透神經(jīng)細胞；(C)給所述受試者應用足夠量的輻射能，從而使得所述染料發(fā)熒光；(d)手術中獲得所述受試者的熒光圖像；和(e)觀察所述熒光圖像以觀看所述受試者中的一條或多條神經(jīng)。
16.權利要求15的方法，其中所述熒光染料選自靛青綠、infracyaninegreen、綠色熒 光染料、異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二醛、熒 光胺、玫瑰紅、錐蟲藍、熒光金、3-靛青綠-?；?1，3-四氫噻唑-硫酮、綠色熒光蛋 白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、藍色熒光蛋白和其他熒光蛋白質(zhì)。
17.權利要求16的方法，其中所述熒光染料是靛青綠。
18.權利要求15的方法，其中所述組合物包括復制缺陷型皰疹病毒。
19.權利要求18的方法，其中所述皰疹病毒是HSV-2。
20.權利要求18的方法，其中所述復制缺陷型病毒包括HSV-2ICP10A RR。
21.—種用于診斷神經(jīng)狀況的方法，其包括(a)給所述受試者施用組合物，所述組合物包括 熒光染料；和選自向神經(jīng)的復制缺陷型病毒、向神經(jīng)病毒的病毒蛋白質(zhì)和向神經(jīng)病毒的衣殼的病 毒組分，其中所述熒光染料與所述病毒組分結(jié)合，以形成染料/病毒組分復合物；(b)允許所述染料/病毒組分復合物穿透神經(jīng)細胞；(c)給所述受試者應用足夠量的輻射能，從而使得所述染料發(fā)熒光；(d)手術中獲得所述受試者的熒光圖像；和(e)觀察所述熒光圖像以確定是否橫切了所述神經(jīng)。
全文摘要
本文公開的是用于使神經(jīng)細胞成像的組合物和方法。該組合物包括熒光染料；和選自向神經(jīng)的復制缺陷型病毒、向神經(jīng)病毒的病毒蛋白質(zhì)和向神經(jīng)病毒的衣殼的病毒組分。盡管熒光染料自身無法穿透神經(jīng)細胞，但熒光染料與病毒組分結(jié)合，以形成能夠穿透神經(jīng)細胞的染料/病毒組分復合物。
文檔編號A61K49/00GK102026668SQ200980117131
公開日2011年4月20日 申請日期2009年5月14日 優(yōu)先權日2008年5月14日
發(fā)明者R·W·弗勞爾 申請人:諾瓦達克技術公司