專利名稱：4-苯基丁酸鈉(4pba)及其藥學(xué)上可接受的鹽的新穎用途的制作方法
4-苯基丁酸鈉(4PBA)及其藥學(xué)上可接受的鹽的新穎用途
本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，其應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，用于治療Tau蛋白病 (tauopathies)伴有的癡呆(尤其阿爾茨海默氏病)中的認(rèn)知障礙。
更具體地，本發(fā)明提供了以使用4PBA為基礎(chǔ)的那些病癥的新穎治療。
本發(fā)明的背景技術(shù)
阿爾茨海默氏病(AD)是最常見的神經(jīng)變性疾病，并且是癡呆的首要原因 (Cummings和Cole，200 。阿爾茨海默氏病(AD)的病理生理特征與聚集的蛋白沉積物有 關(guān)神經(jīng)原纖維纏結(jié)中的細(xì)胞內(nèi)磷酸化Tau蛋白聚集物和老年斑中的細(xì)胞外β -淀粉樣蛋 白(Αβ)聚集物。因此，阿爾茨海默氏病是與異常蛋白折疊有關(guān)的疾病的非常有代表性的 實(shí)例(Selkoe,2004)
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是在蛋白相關(guān)加工的質(zhì)量控制過程中發(fā)揮特別顯著作用的部位，因 為它調(diào)節(jié)體內(nèi)蛋白的合成、折疊和循環(huán)。連續(xù)蛋白生成需要維持嚴(yán)格的質(zhì)量控制過程，這發(fā) 生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并非總是以適當(dāng)?shù)木_性發(fā)揮作用，不良折疊的蛋白可能在其內(nèi)部 積累。可能發(fā)生該狀態(tài)，因?yàn)橐恍┑鞍?例如負(fù)責(zé)引起阿爾茨海默氏病的那些蛋白)難以 折疊，并且還因?yàn)榈鞍缀铣傻乃俣瓤煊贓R能夠折疊蛋白的速度。這引起了 ER的“應(yīng)激”狀 態(tài)。當(dāng)達(dá)到該狀態(tài)時(shí)，傳感器被活化，開始發(fā)送一系列信號(hào)，意在停止較大部分蛋白的合成， 并且還調(diào)節(jié)折疊速度，使得有可能正確折疊所有蛋白，最終幫助ER從應(yīng)激狀態(tài)中恢復(fù)。
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是觸發(fā)和介導(dǎo)阿爾茨海默氏病中的神經(jīng)元死亡的關(guān)鍵事件。幾種類型 的細(xì)胞應(yīng)激可引起異常折疊的蛋白在ER腔中的積聚，該應(yīng)激狀態(tài)觸發(fā)蛋白質(zhì)量控制機(jī)制 的活化，以便防止這種積聚的毒性作用(或者所謂的“未折疊蛋白反應(yīng)”或UPR)。WR控制 機(jī)制的活化導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的總體減少、更大的蛋白降解和編碼存在于ER中的分子伴侶 (molecular chaperons)(如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRPs)GRP78/Bip和GRP94)以及蛋白質(zhì)二硫 鍵異構(gòu)酶(PDI)的基因的轉(zhuǎn)錄增加，以便促進(jìn)蛋白折疊過程(Kozutsumi等人，1998)。照此， Katayama等人(1999)證實(shí)，與來自對(duì)照組的相同年齡個(gè)體的腦中發(fā)現(xiàn)的ER存在分子伴侶 (ER-residing molecular chaperon)的量相比，遭受阿爾茨海默氏病的患者的腦中具有較 少的ER存在分子伴侶，如GRP78和GRP94，這是一種在應(yīng)激下可能導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受損的狀態(tài)。 這些研究人員建議，GRP78的表達(dá)發(fā)揮防止ER應(yīng)激引起的神經(jīng)元死亡的作用。因此，增強(qiáng) GRP78表達(dá)使得可能開發(fā)出對(duì)抗阿爾茨海默氏病(AD)的治療策略。
如果該UPR機(jī)制不能解決神經(jīng)元細(xì)胞所經(jīng)歷的ER應(yīng)激，則很可能疾病進(jìn)展，觸發(fā) 神經(jīng)元凋亡。這是最常見和破壞性的神經(jīng)變性疾病的狀態(tài)，所述神經(jīng)變性疾病(包括阿爾 茨海默氏病、帕金森病和亨廷頓氏病)全部以未折疊蛋白的積聚和聚集為特征。因此，不令 人驚奇的是，許多研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 WR機(jī)制在這些極端條件下也被活化的證據(jù)。然而 在該情況下，該機(jī)制的活化結(jié)束了引起的傷害大于益處的(情況)，因?yàn)槌跏挤磻?yīng)具有保護(hù) 性，但最終反應(yīng)具有破壞性。
存在幾種促進(jìn)蛋白在腦中積聚的狀態(tài)。衰老表示發(fā)展AD的最大風(fēng)險(xiǎn)因素。在細(xì) 胞應(yīng)激狀態(tài)之前誘導(dǎo)伴侶分子表達(dá)的能力隨年齡而降低。還已經(jīng)證明，在年老動(dòng)物中沒有適當(dāng)?shù)鼗罨痷ra機(jī)制。因此，年齡提高了 ER對(duì)應(yīng)激和蛋白積聚的毒性效應(yīng)的敏感性。內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)應(yīng)激可以由缺氧和/或低血糖發(fā)作來誘發(fā)，兩者均是在自然衰老過程中的常見情形。另 外，如果蛋白體活性隨年齡而降低，則身體對(duì)異常蛋白聚集物的形成更敏感。
隨著年齡增長(zhǎng)，在腦中可能產(chǎn)生一種情況(scenario)，其中與異常蛋白積聚有關(guān) 的神經(jīng)變性疾病具有高發(fā)生概率。
中斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白系統(tǒng)是包括在阿爾茨海默氏病、帕金森病和亨廷頓氏病等等的幾 種人類疾病中的一個(gè)因素(Katayama等人，2001 ；Nishitoh等人，2002 ；Ryu等人，200 。存 在稱為“化學(xué)伴侶”的一系列化合物，如甘油、二甲亞砜(DMSO)和4-苯基丁酸鈉或4PBA， 它們?cè)诘鞍渍郫B和定位(localization)期間中顯示了異常過程的改善(Mto等人，1996 ； Chaudhuri和Paul，2006 ；Kubota等人，2006)，并且它們的給藥抑制了帕金森氏病鼠模型 中的神經(jīng)元死亡(Masatoshi I等人，2007)。
4PBA是一種低分子量脂肪酸，已經(jīng)批準(zhǔn)其在遭受尿素循環(huán)障礙的兒童中作為氨 螯合劑用于臨床實(shí)踐(Maestri等人，1996)，并且由于其活化胚胎血紅蛋白轉(zhuǎn)錄的能力，用 于治療鐮狀細(xì)胞貧血和地中海貧血(Dover等人，1994 ；Collins等人，19卯)。還有文獻(xiàn)記 載了其在脊髓性肌萎縮患者中具有有益效果(Mercuri E.等人，2004 ;Mercuri Ε.等人， 2007)。已經(jīng)表明，4ΡΒΑ可擔(dān)當(dāng)逆轉(zhuǎn)與人類疾病有關(guān)的異常蛋白定位和/或蛋白聚集的化學(xué) 伴侶(Rubenstein和Zeitlin，2000 ；Kubota等人，2006)。另夕卜，4PBA可在與神經(jīng)炎性反應(yīng) 有關(guān)的某些疾病(如多發(fā)性硬化和缺血)中發(fā)揮保護(hù)作用(Dasgupta等人，2003 ;Qi等人， 2004)。醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)也列舉了其對(duì)多谷胺酰胺毒性(polyglutaminic toxicity)的有益效果 (Steffan 等人，2001)。
治療AD和具有炎性成分的其他疾病的潛在益處，專利W099/(^6657保護(hù)化合物抑 制可誘導(dǎo)的氧化氮合酶(iNOQ的用途。PBA僅僅在抑制iNOS的化合物(洛伐他汀、弗司扣 林、美伐他汀等)的列表的上下文中有限地提到，然而，說明書部分不含有涉及顯示PBA在 AD對(duì)比模型中的有益效果的任何實(shí)驗(yàn)。
也已經(jīng)表明，在超負(fù)載或應(yīng)激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的狀態(tài)所共有的信號(hào)效應(yīng)中，異常的Tau(蛋 白)磷酸化發(fā)揮決定性作用，這是許多變性疾病所共有的(HermSndez和人vila, 2007)。磷 酸化Tau(蛋白)是游離的(free)，具有降低的對(duì)微管的親合性，因此促進(jìn)它們組裝的能 力極小。負(fù)責(zé)該Tau(蛋白)異常磷酸化的藥劑是過度活化的糖原合酶激酶3 α/β (GSK) (Kim等人，2007)。磷酸-Tau (蛋白)(phospho-tau)聚集物是AD和其他Tau蛋白病的鑒定 特征之一。用于抗ER超負(fù)載的細(xì)胞保護(hù)的適當(dāng)策略能夠直接抑制GSK3活性，因此降低了 Tau(蛋白)磷酸化及其毒性。有可能的是，Tau磷酸化是神經(jīng)機(jī)制的整合成分(integrated component)，達(dá)到缺乏所述功能的調(diào)節(jié)導(dǎo)致在疾病(如阿爾茨海默氏病)的發(fā)展中的記憶 力減退的程度(Arendt等人，2003 ； Ikeda等人，2007)。
與學(xué)習(xí)過程行為有關(guān)的另一個(gè)反應(yīng)是組蛋白乙?；?。組蛋白乙?；閷?dǎo)通過染色 質(zhì)修飾來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制，因此最近(發(fā)現(xiàn))其牽涉突觸可塑性。已經(jīng)證明，給予4PBA 增加了表達(dá)肌萎縮側(cè)索硬化的鼠模型中的組蛋白乙酰化(Petri S等人，2006)。因此，據(jù)推 測(cè)，4PBA可通過抑制組蛋白脫乙酰酶來誘導(dǎo)可能導(dǎo)致神經(jīng)元可塑性基因活化的轉(zhuǎn)錄修飾。 Andreassi等人Q004)將4PBA給藥直接與其損失造成脊髓性肌萎縮的基因的完全表達(dá)的 增加相聯(lián)系。
然后可能的是，增加H4組蛋白乙?；烧{(diào)節(jié)相對(duì)特異性的轉(zhuǎn)錄程序。通過突觸后 膜的AMPA受體運(yùn)輸是快速傳輸和突觸可塑性的跡象。
基因轉(zhuǎn)錄要求活化轉(zhuǎn)錄因子，但也要求誘導(dǎo)進(jìn)行基因表達(dá)的染色質(zhì)的組織化發(fā)生 動(dòng)態(tài)改變。組蛋白高度乙酰化將組蛋白從其鍵(bond)釋放到染色質(zhì)中，隨后對(duì)基因轉(zhuǎn)錄過 程(Lea和Randolph，1998)和蛋白合成產(chǎn)生影響。已經(jīng)顯示，RNA合成和“從頭”蛋白合成 在各種脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物物種的長(zhǎng)期記憶產(chǎn)生過程中是必需的，并且它們還可能介導(dǎo) 新突觸連接的形成(Tully等人，200 。據(jù)信，長(zhǎng)期記憶形成必然伴有基因表達(dá)的持久的效 應(yīng)，越來越多的證據(jù)表明，組蛋白修飾和DNA甲基化可能參與該過程(Bailey等人，2004 ； Levenson和Sweatt，200 。Fischer等人Q007)的工作表明，通過注射組蛋白脫乙酰酶抑 制劑(HDAC)或通過使該環(huán)境富集，增加了組蛋白乙?；?；它促進(jìn)了其中小鼠中發(fā)生神經(jīng)變 性疾病的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械挠洃浌δ?。學(xué)習(xí)過程和記憶鞏固的改進(jìn)與轉(zhuǎn)錄的增加相關(guān)，且更直 接地與突觸可塑性標(biāo)記物和樹突標(biāo)記物(dendritic markers)的調(diào)節(jié)增強(qiáng)相關(guān)，這建議了 可能改進(jìn)記憶功能的新機(jī)制。
該組蛋白乙?；^程控制記憶鞏固和長(zhǎng)時(shí)程突觸增強(qiáng)(LTP)所必需的基因的轉(zhuǎn) 錄(Bailey 等人，2004 ；Levenson 和 Sweatt, 2005 ；Fischer 等人，2007)。組蛋白乙酰基轉(zhuǎn) 移酶(HAT)和組蛋白脫乙酰酶(HDAC)的異?；钚赃€可以是有助于神經(jīng)變性的神經(jīng)系統(tǒng)疾 病(如中風(fēng)、亨廷頓氏病、肌萎縮側(cè)索硬化、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)和阿爾茨海默氏病)所共 有的機(jī)制(根據(jù)Langley等人在2005年出版的修訂本)。一些研究表明，基因轉(zhuǎn)錄在一些 與疾病進(jìn)展有關(guān)的腦區(qū)域中失調(diào)，并且支持RNA轉(zhuǎn)錄破壞機(jī)制在一些變性疾病中存在的觀 念(Anderson 等人，2007)。
AMPA受體中的GluRl亞基以及PSD95是突觸形成和功能中的關(guān)鍵突觸后標(biāo)記物。 在遭受阿爾茨海默氏病的患者的腦中以及Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠的腦中發(fā)現(xiàn)的PSD95和GluRl 突觸后缺乏可能有助于突觸功能障礙和認(rèn)知功能的缺乏(Almeida等人，2005)?；谠撚^ 念，研究人員觀察到，在用4PBA處理的Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠的AMPA受體處的GluRl亞基和 海馬中的PSD95的表達(dá)降低標(biāo)記物的確顯示了認(rèn)知功能的改進(jìn)。幾個(gè)研究已經(jīng)概括了在各 種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭蟹乐股窠?jīng)毒性的4PBA改變基因的光譜(Chang和Min，2002 ；Kang等人，2002 ； Ryu 等人，2005)。
許多變性疾病(如阿爾茨海默氏病)的病理生理學(xué)以及神經(jīng)保護(hù)可能包括很多的 機(jī)制。在阿爾茨海默氏病的具體情況中，這些致病機(jī)制主要包括Αβ聚集和沉積以及斑塊 發(fā)展、Tau(蛋白)過度磷酸化與纏結(jié)形成、神經(jīng)血管功能障礙以及其他機(jī)制，如細(xì)胞周期異 常、炎性過程、氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙。關(guān)于阿爾茨海默氏病因的中心假設(shè)是淀粉樣蛋 白級(jí)聯(lián)(amyloid cascade)假設(shè)。
據(jù)計(jì)算，在下一個(gè)50年里，受AD影響的人數(shù)將增至三倍，在2050年達(dá)到 一千三百二十萬。該增加歸因于老年人群的持續(xù)增長(zhǎng)。每4年，期望壽命增加1年，對(duì)于阿 爾茨海默氏病患者也一樣。這意味著，受該疾病影響的那些患者將活得更長(zhǎng)(這些患者的 目前壽命期望率是在診斷之后10-12年之間)。就預(yù)防性治療而言，疫苗研究由于對(duì)中樞神 經(jīng)系統(tǒng)的副作用而終止。
這些考慮表明，阿爾茨海默氏病將是在下一個(gè)50年中的社會(huì)衛(wèi)生計(jì)劃的重大挑 戰(zhàn)。
由于仍然沒有阿爾茨海默氏病的有效治療，因此本發(fā)明描述了 4PBA憑借其多個(gè) 機(jī)制恢復(fù)屬于鼠模型阿爾茨海默氏病典型特征的學(xué)習(xí)過程和記憶功能減退的能力。
Kim等人Q004)證明淀粉樣蛋白前體蛋白C端片段(APP-CT)的表達(dá)誘導(dǎo)了組蛋 白3和組蛋白4的乙?；脑黾?，并且由APP-CT誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性通過在NGF分化的PC12 細(xì)胞和大鼠原代皮層神經(jīng)元中用丁酸鈉處理而顯著地增加。總而言之，結(jié)果建議，APP-CT通 過轉(zhuǎn)錄依賴性機(jī)制而發(fā)揮神經(jīng)毒性，并且這可能有助于AD的發(fā)病機(jī)理。
Fischer等人Q007)顯示，丁酸鈉而非4PBA恢復(fù)神經(jīng)變性小鼠模型(即，雙轉(zhuǎn)基 因CK-p25 Tg小鼠)中的組蛋白乙?；癄顟B(tài)以及學(xué)習(xí)和記憶，其中p25(牽涉各種神經(jīng)變性 疾病的蛋白)的表達(dá)是在CamKII啟動(dòng)子的控制之下，并且能夠用多西環(huán)素飲食(diet)接 通或關(guān)閉。然而，F(xiàn)ischer等人Q007)所使用的動(dòng)物模型不是阿爾茨海默氏病的典型模型， 因?yàn)樗鼪]有再現(xiàn)與人淀粉樣-β蛋白或異常Tau磷酸化有關(guān)的致病機(jī)制。尤其，它僅僅包 括蛋白Ρ25(ρ35的截短形式)的受損表達(dá)，其為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶_5(CDK5)的調(diào)節(jié) 亞基。
相反，通過使用阿爾茨海默氏病的合法的共有轉(zhuǎn)基因小鼠模型(即，Tg2576小鼠， 其表達(dá)與阿爾茨海默氏病有關(guān)的人淀粉樣-β前體蛋白(APP)變體)，本發(fā)明的發(fā)明人令人 驚奇地發(fā)現(xiàn)，4-苯基丁酸鈉有效治療阿爾茨海默氏病。本發(fā)明人已能表明，改進(jìn)了臨床癥狀 (如記憶獲取和保留)，并且重要的是，也已證明，在給予4ΡΒΑ之后，降低了 Tau過度磷酸化 水平。
發(fā)明描述
本發(fā)明描述了 4ΡΒΑ在阿爾茨海默氏病型健忘癥中的潛在有益作用。我們發(fā)現(xiàn)，用 4ΡΒΑ治療16月齡Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠5周，的確逆轉(zhuǎn)了空間記憶缺陷。所得結(jié)果建議，可能 的是，一方面通過增加分子伴侶的水平和誘導(dǎo)Tau (蛋白)脫磷酸而賦予細(xì)胞對(duì)抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng) 激的效應(yīng)的保護(hù)來介導(dǎo)4PBA的效果，另一方面，通過增加H4組蛋白的乙?；瘉斫閷?dǎo)4PBA 的效果，這進(jìn)而誘導(dǎo)了突觸標(biāo)記物的表達(dá)，所述表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致恢復(fù)長(zhǎng)期空間記憶。
還發(fā)現(xiàn)，GRP78水平在Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬中較低；甚至進(jìn)一步觀察到，在 用4PBA處理之后，在非轉(zhuǎn)基因小鼠中的GRP78表達(dá)達(dá)到類似水平，這與Katayama的觀察 (1999)相一致。
還觀察到，Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠的大腦皮質(zhì)中H4乙?；臏p少可能與致密填充的 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)，這對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)錄抑制。
調(diào)查的結(jié)果提議以下假設(shè)因?yàn)?PBA提高組蛋白H4的乙?；?，所以它也活化了促 進(jìn)神經(jīng)元可塑性的蛋白(AMPA受體GluRl亞基和PSD95)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白(GRP78)的轉(zhuǎn)錄 和合成，這進(jìn)而必然伴有海馬的正確功能并導(dǎo)致恢復(fù)減退了的記憶功能。
在用鹽溶液處理的Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬中于kr202/Thr205 (AT8)部位還觀 察到Tau(蛋白)磷酸化水平的增加，而用4PBA處理的轉(zhuǎn)基因小鼠中的Tau(蛋白)磷酸化 水平與非轉(zhuǎn)基因小鼠的那些Tau(蛋白)磷酸化水平?jīng)]有差別。本發(fā)明證明，降低磷酸化 Tau(蛋白)的水平改善了轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能。該發(fā)現(xiàn)與最近的觀測(cè)相一致，這提示， Tau降低在表達(dá)人淀粉樣蛋白的蛋白前體的轉(zhuǎn)基因小鼠中防止行為缺陷中具有有益效果， 而不改變它們的A β水平(Roberson等人，2007)。
因?yàn)?ΡΒΑ的作用機(jī)制之一是減少Tau(蛋白)的過度磷酸化形式，所以這能假定，6它還有效用于除了阿爾茨海默氏病以外的Tau蛋白病伴有的其他癡呆(例如額顳癡呆、進(jìn) 行性核上麻痹(PSP)、皮克病和路易體癡呆(Lewy body dementia))的認(rèn)知治療。
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療阿爾茨海默氏病的4PBA或其藥學(xué)上可接受的鹽。 換句話說，本發(fā)明涉及4PBA或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于預(yù)防和/或治療阿爾茨海默 氏病的藥物中的用途。類似地，本發(fā)明提供了用于預(yù)防或治療阿爾茨海默氏病的方法，其包 括對(duì)需要所述預(yù)防或治療的患者給予藥學(xué)有效量的4PBA或其藥學(xué)上可接受的鹽。
本文使用的術(shù)語“4PBA”還包括屬于其在體內(nèi)的新陳代謝的產(chǎn)物的那些代謝物或 化合物。與該化合物的不同治療用途有關(guān)的本發(fā)明的實(shí)施方案也包括其代謝物(即，苯基 乙酸酯/鹽(phenylacetate))的用途。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療Tau蛋白病伴有的癡呆，更尤其 用于預(yù)防或治療所述癡呆中的認(rèn)知障礙的4PBA或任何一種其藥學(xué)上可接受的鹽，或者包 含4PBA或任何一種其藥學(xué)上可接受的鹽的組合物。
本發(fā)明也涉及4PBA或任何一種其藥學(xué)上可接受的鹽或者包含4PBA或任何一種其 藥學(xué)上可接受的鹽的組合物在制備預(yù)防或治療Tau蛋白病伴有的癡呆，尤其用于與所述癡 呆有關(guān)的認(rèn)知障礙的藥物中的用途。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，尤其涉及用于預(yù)防或治療與Tau蛋白病伴有的癡呆相 關(guān)的認(rèn)知障礙的4-PBA鈉鹽。
4PBA 是 4-苯基丁酸 G-phenylbutyrate)，其是可從諸如 SIGMA-ALDRICH (產(chǎn) 品號(hào)P21005)之類的公司獲得的市售產(chǎn)品；其CAS登記編號(hào)為1821-12-1 ；其化學(xué)式為 C6H5 (CH2) 3C00H。
4PBA鈉鹽也是可從例如BIOMOL International L. P.獲得的市售產(chǎn)品(Palatine House, Matford Court, Exeter EX2 8NL, UK ；目錄號(hào)EI320) ；CAS 登記編號(hào)為 1716-12-7 ； 其化學(xué)式為C6H5(CH2)3COONa ；并且其結(jié)構(gòu)式為
或者，還可使用已知方法來獲得該化合物。
Buphenyl⑧和Ammonaps 是分別由FDA和EMEA批準(zhǔn)的苯基丁酸鈉組合物的商標(biāo)， 用于治療尿素循環(huán)障礙。它還可作為iTriButyrate (Triple Crown America)獲得。
術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指，該化合物或化合物的組合必需與制劑的其余成分相 容，并且對(duì)于接受它的患者或?qū)ο鬅o害。對(duì)于治療用途，4PBA的鹽是其中抗衡離子為藥學(xué)上 可接受的那些鹽。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包含4PBA或一種其藥學(xué)上可接受的鹽的組合物是還 包含載體或藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物。
上文提到的藥學(xué)上可接受的鹽意圖包括4PBA能夠形成的治療活性的無毒鹽形 式?？赏ㄟ^用此類適當(dāng)?shù)年栯x子處理4PBA的酸形式便利地獲得所述藥學(xué)上可接受的鹽。適 當(dāng)?shù)膲A式鹽包括與有機(jī)陽離子(如芐星、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺、普 魯卡因)形成的那些鹽；以及與金屬陽離子(如鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉和鋅)形成的那些鹽。7
相反地，可通過用適當(dāng)?shù)乃崽幚韺⑺鳆}形式轉(zhuǎn)化為游離形式。
術(shù)語“鹽”還有意包括4PBA能夠形成的水合物或溶劑合物，包括例如醇鹽，例如甲 醇鹽或乙醇鹽。術(shù)語“溶劑合物”是指包含化學(xué)計(jì)算量或非化學(xué)計(jì)算量的溶劑的那些4PBA 晶形。因?yàn)樗侨軇?，所以溶劑合物也包括水合物。術(shù)語“假多晶型物”是溶劑合物的同義 詞，因?yàn)樗鼞?yīng)用于在其晶格結(jié)構(gòu)中并入溶劑分子的多晶形形式。溶劑合物的實(shí)例是水合物 和醇鹽(如甲醇鹽或乙醇鹽)。
術(shù)語“預(yù)防”是指“預(yù)防”的行動(dòng)，理解為避免該術(shù)語應(yīng)用的疾病、障礙或病癥，或者 與該疾病、障礙或病癥有關(guān)的一個(gè)或幾個(gè)癥狀的發(fā)作、存在，或者延遲它們的發(fā)作或復(fù)發(fā)。
術(shù)語“治療”是指“治療”的行動(dòng)，該術(shù)語也理解為逆轉(zhuǎn)、減輕或抑制該術(shù)語應(yīng)用的 疾病、障礙或病癥或者與該疾病、障礙或病癥有關(guān)的一個(gè)或幾個(gè)癥狀的進(jìn)程。
"Tau蛋白病伴有的癡呆”是指神經(jīng)變性疾病，其中Tau蛋白代謝發(fā)生改變，且其中 最相關(guān)的癥狀或后果之一是認(rèn)知障礙的發(fā)作。尤其，4PBA或其鹽可用于預(yù)防或治療與此類 癡呆有關(guān)的認(rèn)知障礙。
本發(fā)明的一個(gè)特別實(shí)施方案涉及預(yù)防或治療疾病，如阿爾茨海默氏病、額顳癡 呆、進(jìn)行性核上麻痹、皮質(zhì)基底節(jié)變性(corticcAasal degeneration)、皮克病、路易體癡 呆、嗜銀顆粒性癡呆(argyrophillic grain dementia)、C型尼曼-皮克病或拳擊員癡呆 (pugilistic dementia)。
本發(fā)明的一個(gè)更特別的實(shí)施方式涉及阿爾茨海默氏病(尤其與該疾病相關(guān)的認(rèn) 知障礙)的預(yù)防或治療。
本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方案是4PBA鈉鹽在制備用于治療前述疾病的藥物中的用 途。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及包含4PBA或任何一種其藥學(xué)上可接受的鹽的組合物， 其用于預(yù)防或治療Tau蛋白病伴有的癡呆，尤其與這些疾病有關(guān)的認(rèn)知障礙。一個(gè)特別實(shí) 施方案中，該組合物包含4PBA鈉鹽。一個(gè)特別實(shí)施方案涉及包含4PBA鈉鹽和藥學(xué)上可接 受的載體的藥物組合物，其用于預(yù)防和/或治療阿爾茨海默氏病。
先前的研究已經(jīng)表明，改進(jìn)學(xué)習(xí)過程和記憶功能并非總是與腦中的Αβ水平的可 檢測(cè)改變有關(guān)(Dodart等人，2002 ;Gong等人，2004)。如果將該信息與本發(fā)明中提供的信 息一起考慮，則結(jié)果建議，轉(zhuǎn)基因小鼠中觀察到的腦中Αβ的可溶性濃度和不溶性濃度與 記憶減退之間的關(guān)系是該任務(wù)所特有的關(guān)系，并且也是復(fù)雜的。另外，在廣泛研究中，在Αβ 的沉積形式(例如在斑塊的情況下)與受阿爾茨海默氏病影響的患者的記憶減退之間沒有 發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性(Hyman等人，1984)。事實(shí)上，最近的報(bào)告建議，可溶性A β的水平可能 與神經(jīng)變性和記憶減退更相關(guān)(Lue等人，1999 ；McLean等人，1999 ；Lesne等人，2007)。
因此，有意加強(qiáng)其療效的本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是包含4PBA和/或任何一種其 藥學(xué)上可接受的鹽作為第一活性成分以及第二活性成分藥劑的組合，所述第二活性成分藥 劑是誘導(dǎo)或促進(jìn)腦中淀粉樣蛋白沉積物清除的藥劑。更優(yōu)選的實(shí)施方案使用金屬螯合 劑、以可溶性形式的β-淀粉樣肽存在的分解代謝酶(catabolizing enzymes)、腦活素或 硝基苯酚作為所述沉積物的清除劑。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供藥物組合，其包含4PBA或其藥學(xué)上可接受的鹽作 為第一活性成分、第二活性成分藥劑、以及藥學(xué)上可接受的載體，所述第二活性成分藥劑是用于清除腦中的淀粉樣蛋白沉積物的誘導(dǎo)劑或促進(jìn)劑。更優(yōu)選的實(shí)施方案使用金屬螯 合劑、以可溶形式的β -淀粉樣肽存在的分解代謝酶、腦活素或硝基苯酚作為所述沉積物 的清除劑。
甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案是使用氯碘羥喹、腦活素或2，4- 二硝基苯酚或3-硝基酚 作為沉積物清除誘導(dǎo)劑。
甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案是使用氯碘羥喹、腦活素、IDE胰島素降解酶或中性溶酶 (neprilysin)或2，4- 二硝基苯酚或3-硝基酚作為沉積物清除誘導(dǎo)劑。
因此本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是作為同時(shí)使用來預(yù)防和/或治療Tau蛋白病伴有 的癡呆中的認(rèn)知障礙的聯(lián)合制劑的產(chǎn)品的用途，所述產(chǎn)品含有4PBA和/或任何一種其藥學(xué) 上可接受的鹽作為第一活性成分、以及第二活性成分，所述第二活性成分為清除腦淀粉樣 蛋白沉積物的誘導(dǎo)劑或促進(jìn)劑。另一個(gè)實(shí)施方案的特征在于相同聯(lián)合制劑，其設(shè)計(jì)用于分 開使用兩種活性成分，而又一個(gè)實(shí)施方案將其設(shè)計(jì)用于按序使用。
照此，本發(fā)明藥物組合中的兩種組分或活性成分可以是同一單位(unitary)藥物 制劑的一部分；或者是作為同一治療方案的一部分的用于共同給予該兩種組分或活性成分 的分開的藥物制劑的一部分。當(dāng)在分開的藥物制劑中給予該兩種組分時(shí)，不必需將它們同 時(shí)給藥，盡管需要時(shí)可以這樣做。
一個(gè)另外的方面中，本發(fā)明涉及產(chǎn)品或試劑盒，其包含藥物組合，該藥物組合包含 本文規(guī)定的實(shí)施方案中的任一個(gè)中的4PBA和/或任何一種其藥學(xué)上可接受的鹽以及用于 清除腦中的β-淀粉樣蛋白沉積物的誘導(dǎo)劑或促進(jìn)劑。
另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及所述藥物組合或試劑盒，所述試劑盒包含用于預(yù)防或 治療Tau蛋白病伴有的癡呆(尤其相關(guān)的認(rèn)知障礙)的所述藥物組合。所述組合或試劑盒 有用于制備藥物，所述藥物用于預(yù)防所述癡呆，尤其前文規(guī)定的那些癡呆中的任何種，更尤 其阿爾茨海默氏病。
本發(fā)明的其他方面還涉及預(yù)防或治療Tau蛋白病伴有的癡呆(尤其相關(guān)的認(rèn)知障 礙)的方法，該方法包括對(duì)需要所述預(yù)防和/或治療的對(duì)象給予藥學(xué)有效量的4ΡΒΑ或任何 一種其藥學(xué)上可接受的鹽、或者包含4ΡΒΑ和/或任何一種其藥學(xué)上可接受的鹽的組合物、 或者包含4ΡΒΑ和/或任何一種其藥學(xué)上可接受的鹽，以及用于清除腦中形成的β -淀粉樣 蛋白沉積物的誘導(dǎo)劑或促進(jìn)劑的藥物組合。
術(shù)語“藥學(xué)有效量”是指一定量的化合物或活性化合物的組合，其有效治療疾??； 改善、減輕或消除該疾病的一個(gè)或幾個(gè)癥狀；或者預(yù)防或延遲該疾病的一個(gè)或多個(gè)癥狀發(fā)作。
待給予的本發(fā)明的活性物質(zhì)(即，4ΡΒΑ和/或其藥學(xué)上可接受的鹽)的劑量取決 于個(gè)體病例，按照慣例，應(yīng)適應(yīng)于個(gè)體病例的狀況，以獲得最佳效果。因此所述劑量當(dāng)然取 決于給藥頻率以及在各病例中使用的該化合物用于治療或預(yù)防的功效和作用持續(xù)時(shí)間，而 且取決于疾病和癥狀的性質(zhì)和嚴(yán)重度，并取決于待治療的人或動(dòng)物的性別、年齡、體重、共 同給藥和個(gè)體反應(yīng)性，以及取決于該治療是急性治療還是預(yù)防性治療。
4ΡΒΑ和/或其藥學(xué)上可接受的鹽的治療有效量可以為Img到200g/日、2mg到 150g/ 日、5mg 到 IOOg/ HUOmg 到 75g/ 日、20mg 到 75g/ 日、50mg 到 75g/ 日、0. Ig 到 75g/ 日、0. 2g 到 75g/ 日、0. 5g 到 75g/ 日、Ig 到 50g/ 日、5g 到 50g/ 日。
術(shù)語“對(duì)象(subject) ”是指動(dòng)物，尤其哺乳動(dòng)物，如靈長(zhǎng)類、狗、貓、?？苿?dòng)物、馬、 綿羊和人。該術(shù)語尤其應(yīng)用于兩種性別的人。
用于如上所述用途的含有4PBA的制備藥物的優(yōu)選給藥模式是含有其鈉鹽的片劑 形式。藥物制劑的這些片劑可以包含賦形劑，如微晶纖維素、硬脂酸鎂或膠體二氧化硅。
另一種優(yōu)選的給藥形式是粉末，其含有4PBA鈉鹽和使之可溶于水的賦形劑。該粉 末的藥物制劑可包含賦形劑，如硬脂酸鈣或膠體二氧化硅。
附圖簡(jiǎn)述
圖IA 與非轉(zhuǎn)基因小鼠所經(jīng)歷的等待時(shí)間相比，在可見平臺(tái)期期間用Morris試 驗(yàn)測(cè)量各水平時(shí)，在不同的天數(shù)，用4PBA和鹽溶液處理的轉(zhuǎn)基因小鼠所經(jīng)歷的等待時(shí)間 (latency time)0
圖IB 與非轉(zhuǎn)基因小鼠所經(jīng)歷的等待時(shí)間相比，在不可見的平臺(tái)期期間用Morris 試驗(yàn)測(cè)量各水平時(shí)，在不同的天數(shù)，用4PBA和鹽溶液處理的轉(zhuǎn)基因小鼠所經(jīng)歷的等待時(shí) 間。
圖IC 與非轉(zhuǎn)基因小鼠的所述時(shí)間相比，在Morris試驗(yàn)期間測(cè)量各水平時(shí)，在不 同的天數(shù)，用4PBA和鹽溶液處理的轉(zhuǎn)基因小鼠保持在正確的象限(quadrant)中的時(shí)間。
圖2A 在用4PBA和鹽溶液處理的轉(zhuǎn)基因小鼠的腦皮質(zhì)提取物中發(fā)現(xiàn)的源自Αβ 42 和Αβ40肽的水平。
圖2Β 與非轉(zhuǎn)基因小鼠的相比，用4ΡΒΑ和鹽溶液處理的轉(zhuǎn)基因小鼠腦中由Αβ肽 積聚所形成的斑塊的標(biāo)記方案(marking scheme)。
圖3A:與非轉(zhuǎn)基因小鼠的相比，用4PBA和鹽溶液處理的轉(zhuǎn)基因小鼠中磷酸化 Tau(蛋白)水平與正常蛋白之間的關(guān)系。
圖;3B 與非轉(zhuǎn)基因小鼠的相比，用4PBA和鹽溶液處理的轉(zhuǎn)基因小鼠中磷酸化 GSK3(無活性形式)水平與非磷酸化蛋白(活性形式)之間的關(guān)系。
圖4 與非轉(zhuǎn)基因小鼠的相比，用4PBA和鹽溶液處理的轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬提取物 中GRP78表達(dá)的水平。
圖5 與非轉(zhuǎn)基因小鼠的相比，用4PBA和鹽溶液處理的轉(zhuǎn)基因小鼠的皮質(zhì)提取物 中乙酰化的組蛋白4(AcH4)和組蛋白3(AcH3)水平。
圖6 與非轉(zhuǎn)基因小鼠的相比，從用4PBA和鹽溶液處理的轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬中獲 得的膜富集的蛋白(membrane-enriched protein)提取物中的GluRl、PSD95和MAP-2蛋白 的表達(dá)水平。
發(fā)明的實(shí)施方式
另外通過以下實(shí)施例來說明本發(fā)明，所述實(shí)施例與前文描述的附圖一起舉例說明 用于其開發(fā)的實(shí)驗(yàn)方法。應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解可在本發(fā)明的范圍內(nèi)實(shí)施的修 改、變型和變化。
實(shí)施例
實(shí)施例1.鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图捌渲委?br> 我們使用表達(dá)695-aa人APP同工型的患有阿爾茨海默氏病的Tg2576轉(zhuǎn)基因小 鼠，所述同工型含有由冷凍倉鼠啟動(dòng)子觸發(fā)的雙重API^swe瑞典型突變(double APPswe Swedish mutation) [ (APP695) Lys670 — Asn，Met671 — Leu]。在用于實(shí)驗(yàn)鼠模型的遭受阿10爾茨海默氏病的Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠中，在其壽命的第7個(gè)月至第12個(gè)月，Αβ肽含量在腦 中按指數(shù)級(jí)積聚。當(dāng)如此處理的小鼠達(dá)到12-15個(gè)月的年齡，并對(duì)其進(jìn)行Morris水迷宮試 驗(yàn)時(shí)，它們顯示記憶功能減退。因此，在5周期間，用200mg/kg 4PBA或其載體對(duì)16月齡雌 性Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)處理，每天處理一次。為了進(jìn)行該處理，制備4PBA溶液，在 PH7. 4下滴定等分子量的4-苯基丁酸(Sigma)和氫氧化鈉。使用相似品系和年齡的沒有基 因改變的一組正常小鼠作為對(duì)照組。按照歐洲和西班牙法規(guī)(86/609/CEE ；RD1201/2005) 進(jìn)行所有臨床試驗(yàn)程序。
實(shí)施例2. Morris 水誅宮(MWM)
在用4PBA處理的Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠中，使用如以前在文獻(xiàn)(Ribe等人，2005)中 所述的Morris水迷宮來評(píng)價(jià)操作性記憶功能和參考記憶功能。當(dāng)它們達(dá)到16月齡時(shí)，使用 Morris水迷宮，對(duì)經(jīng)4PBA(n = 6)、載體(n = 7)處理的Tg2576雌性小鼠組和以及同一窩 非轉(zhuǎn)基因小鼠(non-transgenic litter siblings) (η = 10)組進(jìn)行空間學(xué)習(xí)和記憶試驗(yàn)。 迷宮由充滿20°C水的圓形池構(gòu)成。在具有可見平臺(tái)的池中在3個(gè)連續(xù)日期間，小鼠接受預(yù) 先訓(xùn)練(8次試驗(yàn)/日)，以能夠游向升高到超過水平面的平臺(tái)。使用隱藏平臺(tái)的訓(xùn)練進(jìn)行 9個(gè)連續(xù)日G次試驗(yàn)/日)，在此期間，允許所有小鼠有60秒鐘來發(fā)現(xiàn)浸沒在水面以下Icm 的平臺(tái)。將不能發(fā)現(xiàn)平臺(tái)的那些小鼠引導(dǎo)至該平臺(tái)。允許所有小鼠在平臺(tái)上有20秒休息 期，然后從平臺(tái)上提起小鼠，送回到它們的籠子中。在試驗(yàn)的第4天、第7天和最后一天的 開始時(shí)，進(jìn)行預(yù)先試驗(yàn)，在此期間，從池中移除平臺(tái)，使小鼠在60秒期間尋找該平臺(tái)。用VHS 照相機(jī)和Watermaze軟件監(jiān)控所有試驗(yàn)，以分析逃避等待期和預(yù)先試驗(yàn)期間各池象限的占 據(jù)時(shí)間的百分率(使用Khovision軟件，Wageninge，荷蘭)。將沒學(xué)會(huì)定位可見平臺(tái)的小 鼠或者表現(xiàn)出異常游泳模式或持久漂浮的小鼠從分析中排除。
為了研究4PBA對(duì)認(rèn)知功能的影響，分析5周的4PBA處理是否會(huì)減輕16月齡 Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠在Morris水迷宮試驗(yàn)期間所表現(xiàn)出的學(xué)習(xí)缺陷。在處理結(jié)束時(shí)，用載體 處理的16月齡轉(zhuǎn)基因小鼠所顯示的熟練性低于相同年齡的無基因改變的小鼠所顯示的熟 練性。相反地，用4PBA處理的轉(zhuǎn)基因小鼠所顯示的熟練性與相同年齡的對(duì)照組中的小鼠所 顯示的熟練性沒有差別(

圖1B)。
在12、對(duì)和32次試驗(yàn)之后，對(duì)所有小鼠進(jìn)行預(yù)先試驗(yàn)，在此期間，將它們放入已經(jīng) 移除平臺(tái)的池中游泳15秒時(shí)間。記憶保留測(cè)量是在訓(xùn)練期期間在平臺(tái)過去所在的象限中 游泳15秒鐘的百分率(目標(biāo)象限)。用載體處理的轉(zhuǎn)基因小鼠在目標(biāo)象限中度過的時(shí)間百 分率顯著低于來自對(duì)照組的小鼠在所述象限中度過的時(shí)間。4PBA處理過的轉(zhuǎn)基因小鼠在所 述象限中度過的時(shí)間量與來自對(duì)照組的相同年齡小鼠在所述象限中度過的時(shí)間量沒有差 別(圖1C)。雖然所述差別在不可見平臺(tái)試驗(yàn)中變得明顯，但在其中使用可見平臺(tái)的第一訓(xùn) 練試驗(yàn)期間逃避等待(時(shí)間)沒有顯著差別(圖1A)。這些數(shù)據(jù)建議，4PBA的慢性給藥改 善了 Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠相對(duì)于水迷宮試驗(yàn)的記憶功能。
實(shí)施例3.測(cè)定A β水平的方法
因?yàn)?ΡΒΑ處理清楚顯示對(duì)記憶獲得和保留過程有益，所以下一個(gè)方面將探究 Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠中的A β水平的影響和Tau蛋白病。在Morris水迷宮中進(jìn)行最后一次試 驗(yàn)之后對(duì)小時(shí)處死小鼠。將皮質(zhì)和海馬切片，用于進(jìn)行生化分析。然后，通過夾心型ELISA 試驗(yàn)分析大腦皮質(zhì)中的A β 40和A β 42的水平。
在含有5M|iHCl 和 50mM Tris HCl (pH = 8)、蛋白酶抑制劑(Roche，s CompleteTM Protease Inhibitor Cocktail (羅氏的Complete TM蛋白酶抑制劑雞尾酒))和磷酸酶抑 制劑(0. ImM Na3VO4, ImM NaF)的緩沖液中將大腦皮質(zhì)勻漿。將如此獲得的勻漿聲處理2分 鐘，以100，OOOXg旋轉(zhuǎn)1小時(shí)。將上清液等分試樣在_80°C下冷凍干燥，使用Bradford方 法，用Bio-Rad試劑盒測(cè)定蛋白濃度。用來自Biosource(Camarillo，Ca，USA)的非常靈敏 的夾心型ELISA試劑盒測(cè)定A β 42水平。為了進(jìn)行該測(cè)定，按照制造商的說明，將300 μ g 的總上清蛋白一式二份直接沉積到ELISA板上。
從圖2A可以看出，與用4PBA處理的轉(zhuǎn)基因小鼠相比，用載體處理的Tg2576轉(zhuǎn)基 因小鼠中的Αβ 40或Αβ 42水平?jīng)]有觀察到差別。在同一窩非轉(zhuǎn)基因小鼠中沒有檢測(cè)到 Αβ。當(dāng)測(cè)量Αβ水平和Αβ免疫反應(yīng)性面積的百分率以便計(jì)算海馬中的斑塊負(fù)荷時(shí)，獲得 了類似的結(jié)果(圖2Β)。
_仿丨丨4.胃挪耳又_一料口胃0艦跡辨僻俯
通過頸脫位處死小鼠，從腦中迅速切取它們的海馬。通過以下方式獲得總體勻漿 在4°C下，以14，000 Xg旋轉(zhuǎn)20分鐘，將海馬組織在冰冷的RIPA緩沖溶液(50mM Tris-HCL, pH = 7. 4,0. 25% DOC, 1% Nonidet P-40，150mM NaCl，ImM EDTA, ImM PMSF, 1 μ g/ml 亮肽 素，1 μ g/ml抑肽酶，ImM Na3VO4, ImM NaF)中勻漿，然后將得自上清液的等分試樣在_80°C 下冷凍干燥。使用標(biāo)準(zhǔn)方法來獲得膜的富集蛋白級(jí)分(P2膜蛋白)。將海馬組織在含有 320mM蔗糖和前述蛋白酶和磷酸酶抑制劑的冰冷的Tris-EDTA緩沖溶液(IOmM Tris-HCl和 5mM EDTA，pH = 7. 4)中勻漿。將該勻漿組織以700Xg旋轉(zhuǎn)10分鐘。將所得上清液再次 以37，000X g，在40°C下旋轉(zhuǎn)40分鐘。最后，將沉淀(pellet) (P2)再懸浮于含有如上所述 的酶抑制劑混合物的IOmM的Tris-HCl緩沖溶液(pH = 7. 4)中。在兩種情況下測(cè)定蛋白 濃度(使用購自Bio-Rad的Bradford試驗(yàn))，將等分試樣在_80°C下貯存，直到進(jìn)一步使用 為止。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡型分析，在添加0. 1體積的10%脫氧膽酸鈉的變性條件下，使P2膜 級(jí)分溶解在500mM Tris-HCl緩沖溶液(pH = 9)中。將樣品在36°C下孵育30分鐘，并通過 添加 0. 1 體積的 500mM Tris-HCKpH = 9)/1% Triton X-100 進(jìn)行稀釋。以 37，000Xg，在 4°C下將樣本離心10分鐘之后，將所得上清液在-80°C下貯存。
為了分析組蛋白，獲取來自小鼠的額葉大腦皮質(zhì)的提取物，并在含有蛋白酶抑 制劑的冷的裂解緩沖液(0. 2M NaCl, 0. IM HEPES，10 %甘油，200mM NaF, 2mM Na4P2O7, 5mM EDTA, ImM EGTA, 2mM DTT, 0. 5mM PMSF, ImM Na3VO4, ImM 苯甲脒(benzamydine)，10 μ g/ml 亮 肽素，400U/ml抑肽酶)中進(jìn)行勻漿，然后以14000 X g，在4°C下離心20分鐘。將得自上清液 的等分試樣在 _80°C下C存。用來自 Bio-Rad Bradford(BioRad laboratories,Hercules, California)的Bradford試驗(yàn)獲得總蛋白濃度。
為了進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，將蛋白樣本在具有相同體積QXLaemmli)的緩 沖液中混合，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中解析，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。然后將膜在 PBS或TBS封閉溶液中的5 %牛奶、0. 05 %吐溫-20中封閉，隨后用下列抗體在相應(yīng)緩 沖溶液中孵育，持續(xù)整個(gè)晚上小鼠單克隆抗-磷酸Tau(蛋白)AT8 (Pierce)、兔多克隆 抗-pGSK3-Ser9 (Cell Signalling)、兔多克隆抗-GSK3、山羊多克隆抗GRP78 (Santa Cruz)、 兔多克隆抗乙?；M蛋白4和3 (Upstate)、兔多克隆抗GluRl (Chemicon)、小鼠單克隆抗 PSD95 (Chemi con)、兔多克隆抗MAP2 (Chemi con，Temecula，CA)、小鼠單克隆抗肌動(dòng)蛋白、以及小鼠單克隆抗微管蛋白(Sigma)。所有抗體以1 1000稀釋度使用，除了小鼠單克隆 抗肌動(dòng)蛋白和小鼠單克隆抗微管蛋白以1 10000的稀釋度使用。在PBS/吐溫-20或 TBS/吐溫20中洗滌兩次并在PBS或TBS中洗滌一次之后，先后使用抗兔或抗小鼠HRP綴 合物(Santa Cruz, 1 5000稀釋度)以及化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ECLAmersham Biosciences)和 對(duì)HyperfiImTMECL(Amersham Biosciences)的自動(dòng)射線照相曝光來檢測(cè)免疫標(biāo)記蛋白帶。 使用Scion Image程序(Scion Corporation)來定量所述信號(hào)。
實(shí)施例5.阿爾茨海默氏病的病理標(biāo)記物
為了調(diào)查能夠解釋處理之后的轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)能力中觀察到的差別的變化，使 用AT8 (能夠分辨kr-202/Thr-205中的異常過度磷酸化表位的磷酸特異性抗體)來分析 從小鼠中提取的海馬中的Tau(蛋白)磷酸化水平。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，相比于非轉(zhuǎn)基因小鼠，16月 齡Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬中的Tau(蛋白)磷酸化增加，而Tau(蛋白)的總體水平?jīng)]有 改變。一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)是，用4PBA處理的轉(zhuǎn)基因小鼠的AT8部位處的磷酸化Tau(蛋白) 與非轉(zhuǎn)基因小鼠中的相同功能相比未發(fā)現(xiàn)差別(圖3A)。
通過幾種激酶和磷酸酶蛋白來調(diào)節(jié)Tau(蛋白)磷酸化功能。已經(jīng)表明，GSDb參 與病理Tau (蛋白)磷酸化。測(cè)定在上磷酸化的無活性GSK3b的水平，觀察到4PBA處 理的轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬中的所述水平高于用載體處理的那些小鼠，這解釋了在經(jīng)處理的小 鼠中觀察到的磷酸化Tau(蛋白)形式的減少(圖:3B)。
實(shí)施例6.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記物
研究的下一步是要分析轉(zhuǎn)基因小鼠和對(duì)照組的同一窩小鼠(litter siblings) 的海馬中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)GRP78中存在的分子伴侶的水平。發(fā)現(xiàn)16月齡轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬中的 GRP78水平低于相同年齡的小鼠的GRP78水平。對(duì)于比較，4PBA處理的轉(zhuǎn)基因小鼠的GRP78 水平與非轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)的GRP78水平?jīng)]有差別，這提示4PBA處理的效果可能部分歸因 于GRP78表達(dá)水平的增加(圖4)。
實(shí)施例7.突觸可塑性標(biāo)記物
與來自對(duì)照組的相同年齡的小鼠的H4乙?；较啾?，16月齡Tg2576轉(zhuǎn)基因小 鼠顯示了極低的H4乙酰化水平。因此，在已經(jīng)用4PBA處理的轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)了皮 質(zhì)組蛋白4(H4)的乙?；?圖5)。
AMPA受體GluRl亞基(PSD95)和MAP-2是在突觸形成和功能中至關(guān)重要的可塑性 標(biāo)記物。AD患者和Tg2576小鼠的腦中所述的PSD95、GluRl和MAP-2的突觸后缺乏可能促進(jìn) 突觸功能障礙，導(dǎo)致學(xué)習(xí)功能受損。下一步是調(diào)查這些突觸標(biāo)記物的表達(dá)水平在用4PBA處 理之后是否發(fā)生改進(jìn)，并且相比于用載體處理的小鼠中發(fā)現(xiàn)的表達(dá)水平(81. 18士9. 5% ) 以及相比于無基因改變小鼠組中發(fā)現(xiàn)的水平(100.0士6.5% )，在已經(jīng)用4PBA處理的轉(zhuǎn) 基因小鼠組的海馬的膜富集蛋白提取物中發(fā)現(xiàn)的AMPA受體的GluRl亞基的表達(dá)水平 (161. 37士27. 5% )有穩(wěn)健的提高。4PBA處理還顯著誘導(dǎo)了相同提取物中PSD95的表達(dá)水 平(圖6)。
微管相關(guān)蛋白_2(MAPD是主要定位于神經(jīng)元樹突中的蛋白。MAP-2表達(dá)與樹突 長(zhǎng)出、分支和損害后的樹突重塑一致，這提示該蛋白在可塑性中發(fā)揮關(guān)鍵的作用(Johnson 和Jope，1992)。我們進(jìn)行定量蛋白質(zhì)印跡分析來測(cè)定MAP-2，并且我們發(fā)現(xiàn)Tg2576小鼠中 的MAP-2表達(dá)水平(54. 9士 10. 7)與非轉(zhuǎn)基因小鼠(100.0士 14. 9)相比顯著降低，并且在4PBA處理之后部分恢復(fù)(77. 7 士 11. 6)(圖6)。
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1.4-苯基丁酸(4PBA)或其藥學(xué)上可接受的鹽，其用于預(yù)防和/或治療阿爾茨海默氏病。
2.4PBA或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于預(yù)防和/或治療阿爾茨海默氏病的藥物中 的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的4PBA，其中所述藥學(xué)上可接受的鹽是4PBA鈉鹽。
4.藥物組合物，其包含4PBA鈉鹽和藥學(xué)上可接受的載體，所述藥物組合物用于預(yù)防和 /或治療阿爾茨海默氏病。
5.藥物組合物，其特征在于包含作為第一活性成分的4PBA或任一種其藥學(xué)上可接受 的鹽、第二活性成分和藥學(xué)上可接受的載體，所述第二活性成分是用于清除腦淀粉樣 蛋白沉積物的誘導(dǎo)劑或促進(jìn)劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合，其中它包含4ΡΒΑ鈉鹽作為第一活性成分。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的組合，其中所述腦淀粉樣蛋白沉積物清除誘導(dǎo)劑是 金屬螯合劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合，其中所述金屬螯合物劑是氯碘羥喹。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的組合，其中所述腦β淀粉樣蛋白沉積物清除誘導(dǎo)劑是分 解代謝酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合，其中所述誘導(dǎo)劑是IDE胰島素降解酶或中性溶酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的組合，其中所述腦β淀粉樣蛋白沉積物清除誘導(dǎo)劑是 腦活素。
12.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的組合，其中所述腦β淀粉樣蛋白沉積物清除誘導(dǎo)劑是硝基苯酚。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合，其中所述硝基苯酚是2，4-二硝基苯酚或3-硝基苯酚。
14.根據(jù)權(quán)利要求5-13中任一項(xiàng)所述的藥物組合，其用于預(yù)防或治療阿爾茨海默氏病。
15.用于預(yù)防或治療阿爾茨海默氏病的方法，其包括將藥學(xué)有效量的根據(jù)權(quán)利要求 5-13中任一項(xiàng)所述的4ΡΒΑ或其藥學(xué)上可接受的鹽給予需要所述預(yù)防或治療的對(duì)象。
全文摘要
本文描述4-苯基丁酸鈉(4PBA)在制備用于治療Tau蛋白病伴有的癡呆中的認(rèn)知障礙的藥物中的用途。4PBA治療改善了伴有阿爾茨海默氏病(AD)病理學(xué)特征標(biāo)記物(如磷酸化Tau蛋白)水平降低以及一些突觸可塑性標(biāo)記物蛋白(如GluR1和PSD95)的合成水平增加的經(jīng)典阿爾茨海默氏病(AD)鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械恼J(rèn)知缺陷。作為治療效果的介導(dǎo)機(jī)制，我們提議如通過增加GRP78蛋白所顯示的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的應(yīng)激降低。另一方面，其對(duì)組蛋白脫乙酰的抑制效果及其在染色質(zhì)重塑中的牽涉促進(jìn)了蛋白合成過程，這改進(jìn)了突觸可塑性。
文檔編號(hào)A61K38/16GK102036665SQ200980118367
公開日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2009年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月13日
發(fā)明者A·L·里科巴拉薩阿瓦克羅, A·M·加西亞奧斯塔, D·S·弗雷奇拉曼索, L·A·佩雷斯梅迪亞維利亞 申請(qǐng)人:西馬生物醫(yī)學(xué)計(jì)劃公司