專利名稱：在溶瘤呼腸孤病毒治療中消除促炎細胞因子的產生的制作方法
在溶瘤呼腸孤病毒治療中消除促炎細胞因子的產生
背景技術：
呼腸孤病毒是一種向性于具有活化Ras通路的癌細胞的dsRNA病毒。已證實，將 呼腸孤病毒施用于帶有腫瘤的動物導致產生顯著的抗病毒響應，該響應是由免疫系統(tǒng)中的 體液免疫臂(humoral arm)和細胞免疫臂(cellular arm)介導的。該抗病毒響應可拮抗 治療性病毒的溶瘤效力。同樣，已開發(fā)了免疫抑制劑的聯(lián)合使用以克服這種呼腸孤病毒溶 瘤作用的免疫拮抗作用。已證實，消除中和性抗-呼腸孤病毒抗體(NARA)的產生的藥劑的 共施用可導致試驗用動物的發(fā)病。試驗用動物的響應已由在靶腫瘤組織之外的呼腸孤病毒 的復制來表征，提示體液免疫在阻止宿主的呼腸孤病毒感染中具有保護作用(Qiao等人， Clin. Cancer Res. 14(1) :259-69 (2008)) 發(fā)明概述本文提供了用于治療受治療者的增殖性疾患的方法，所述方法包括將一種或多種 呼腸孤病毒以及調節(jié)促炎細胞因子的表達或活生的一種或多種藥劑施用于受治療者。例 如，所述藥劑可抑制促炎細胞因子的表達或活性。一個或多個方面的細節(jié)在以下的附圖和說明書中提出。其他特征、目的和優(yōu)勢從 說明書和附圖以及從權利要求書中將會明顯。附圖簡述

圖1A、1B、1C和ID示出了在呼腸孤病毒/順鉬聯(lián)合治療后減少的腫瘤生長和增 加的存活率。用單獨的呼腸孤病毒經瘤內(i.t.)注射(正方形)、單獨的順鉬經腹膜內 (i. P.)施用(三角形)、或呼腸孤病毒與順鉬聯(lián)合(圓形)在第1天和第4天治療分別帶 有皮下B16.F10腫瘤的C57B1/6小鼠(圖IA和1C)和帶有K1735腫瘤的C3H小鼠(圖IB 和1D)。對照治療的小鼠(菱形)接受PBS。在所指示的天測量腫瘤，并且腫瘤體積表示為 相對于治療開始時的體積的腫瘤體積(圖IA和1B)。當腫瘤在任一方向上超過15mm時使 小鼠安樂死。存活率表示為Kaplan-Myer圖(圖IC和1D)。圖2是示出在沒有治療(對照)或用呼腸孤病毒、順鉬或呼腸孤病毒與順鉬聯(lián)合 治療之后中和性抗-呼腸孤病毒抗體(NARA)響應的圖。圖3A、3B、3C、3D、3E、3F和3G是示出促炎細胞因子響應被順鉬消除的圖。在沒有 治療(對照)或用呼腸孤病毒、順鉬或呼腸孤病毒與順鉬聯(lián)合治療之后測量IL-II的響應 (圖3A)、IL-3的響應(圖;3B)、IL-6的響應(圖3C)、IL_12的響應(圖3D)、IL_17的響應 (圖3E)、MIP-II的響應(圖3F)和RANTES的響應(圖3G)。發(fā)明詳述如前所述(參見，例如，美國專利第6，110,461 ；6, 136，307 ；6, 261,555 ； 6，344，195 ；6, 576，234 ；和6，811，775號)，呼腸孤病毒使用宿主細胞的Ras通路機制來 下調雙鏈RNA-活化的蛋白激酶(H(R)并因此在細胞中復制?；谶@些發(fā)現(xiàn)，已開發(fā)了用 于使用呼腸孤病毒來治療增殖性疾患的方法。已證實，呼腸孤病毒治療導致促炎細胞因 子的釋放。促炎細胞因子拮抗呼腸孤病毒感染并且呼腸孤病毒散布至腫瘤組織中。通 過盡管無胸腺小鼠對呼腸孤病毒感染未顯示發(fā)病，而SClD小鼠和B-細胞敲除的動物(B-cellknock-out animal)總是死于呼腸孤病毒感染的觀察結果，已進一步提示了免疫系 統(tǒng)的體液免疫臂在阻止呼腸孤病毒毒性中的保護功能?？赏ㄟ^在體外使用細胞毒素劑而增強呼腸孤病毒溶瘤作用。令人驚奇地，如本文 所述，聯(lián)合使用鉬化合物不影響NARA的產生但對包括以下的促炎細胞因子的產生具有深 刻影響:IL-lI、IL-3、IL-6、IL-12p70、IL-17、MIP-lI和RANTES0順鉬對促炎細胞因子的抑 制作用阻止了呼腸孤病毒感染的細胞的T-細胞識別，并允許病毒復制以保證沒有細胞免 疫拮抗。然而，順鉬允許保護性的中和性抗-呼腸孤病毒抗體(NARA)NARA的產生及其伴 隨的益處(例如，阻止患者中的呼腸孤病毒毒性)。先前未描述使用鉬化合物來選擇性地阻 斷先天性和適應性T-細胞響應而對B-細胞活性沒有影響。本文提供了治療受治療者的增殖性疾患的方法，包括將呼腸孤病毒施用于受治療 者并將調節(jié)促炎細胞因子的藥劑施用于受治療者。例如，所述的藥劑抑制促炎細胞因子的表達或活性。如本文使用的術語調節(jié)是指 相較于對照水平改變了(正或負)百分之10、20、30、40、50、60、70、80、90或更多。如本文 使用的，對照是指來自未處理的樣品或受治療者的參考標準。作為實例，對照水平是在不存 在刺激下的對照樣品中的表達或活性水平。對照可以是在刺激之前、從刺激恢復后或沒有 刺激。任選地，細胞因子調節(jié)劑阻斷T-細胞響應而對B-細胞活性幾乎沒有影響至沒有 影響。因此，藥劑抑制促炎細胞因子但不抑制或最低限度地抑制NARA的產生。任選地，藥 劑是鉬化合物。合適的鉬化合物包括但不限于，順鉬、卡鉬、metaplatin和奧沙利鉬。抑制促炎細胞因子的其他藥劑包括但不限于，TNF-I抗體如英夫利昔單抗、 ⑶P571、⑶P870和阿達木單抗；重組的、人類可溶性P55TNF受體如奧那西普；可溶性TNF受 體和Fc片段融合蛋白如依那西普；針對TNF的人源化抗體的聚乙二醇化Fab片段如塞妥珠 單抗(certolizumab pegol)；針對IL_2受體的抗-I鏈的嵌合抗體如巴利昔單抗或達克珠 單抗；IL-12p40抗體如ABT-874 ；IL-6受體抗體如MRA或托珠單抗(tocilizumab) ；IFN-K 抗體如芳妥珠單抗(fontolizumab)；抑制IL-I結合至IL-I受體的抗體如AMG108 ；抑制細 胞因子釋放的半胱天冬酶-1抑制劑如二芳基磺酰脲(diarylsulphonylurene) ；IL-15抗 體如美泊利單抗；IL-8抗體如ABX-IL-8 ；IL-9抗體包括IL-9單克隆抗體；還稱為494C10 的重組人類IL-21 ；抑制TNF-I、IL-1&、IL_6和粒細胞單核細胞-集落刺激因子表達的抑 制劑如感應草(biophylum sensitivum)；抑制促炎細胞因子表達的NF-PB信號轉導阻斷劑 如辛伐他??；和IL-6表達和NF-PB活化的抑制劑如(-)_表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯 (EGCG)。其他藥劑包括人類重組乳鐵蛋白，其抑制促炎細胞因子和促轉移細胞因子 (prometastatic cytokine)(包括IL-6、IL-8、粒細胞巨噬細胞集落-刺激因子和TNF-α ) 的細胞釋放。樹突細胞衍生的IL-12和IL-18的抑制劑如雷帕霉素和sanglifehrin也適 用于提供的方法。雷帕霉素是抑制T細胞mTOR激酶活化的免疫抑制劑，而Sanglifehrin A 是還抑制IL-2依賴性T細胞增殖的親環(huán)蛋白-結合的免疫抑制劑。也適用于提供方法的 是食用蘆丁大腸炎(dietary rutin colitis)，其減低諸如IL-1 β、IL-6和GM-CS等促炎 細胞因子的誘導。任選地，所述方法還包括選擇患有增殖性疾患的受治療者，其中受治療者需要促炎細胞因子響應的抑制。例如，這樣的受治療者可包括對單獨呼腸孤病毒具有很少的響應 的受治療者，或對呼腸孤病毒治療具有進行性拮抗的受治療者。如本文使用的術語增殖性疾患是指其中細胞增殖比正常組織生長更快的任何細 胞疾患。增殖性疾患包括但不限于，還被稱為腫瘤的新生物。新生物可包括但不限于，胰腺 癌、乳癌、腦癌(例如，成膠質細胞瘤)、肺癌、前列腺癌、結腸直腸癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上 腺癌、肝癌、神經纖維瘤病1和白血病。新生物可以是實體新生物(例如，肉瘤或癌)，或影 響造血系統(tǒng)的癌性生長(cancerous growth)(例如，淋巴瘤或白血病)。其他增殖性疾患包 括但不限于，神經纖維瘤病。通常，在使用呼腸孤病毒治療的增殖性疾患中，與該疾患相關聯(lián)的至少一些增殖 細胞可具有突變，其中Ras基因(或Ras信號通路的元件)被直接地(例如，通過Ras中的 活化性突變)或間接地(例如，通過對Ras通路中上游或下游元件的活化)活化。對Ras 通路中上游元件的活化包括，例如，以表皮生長因子受體(EGFR)或Sos轉化。參見，例如， Wiessmuller 和 Wittinghofer，1994，Cellular Signaling 6(3) :247-267 ；和 Barbacid， 1987，Ann. Rev. Biochem. 56，779-827。對Ras通路中下游元件的活化包括，例如，在B-Raf 內的突變。參見，例如，Brose等人，2002，Cancer Res. 62 :6997_7000。至少部分地通過 ras.ras的上游元件或ras信號通路中的元件的活化而導致的增殖性疾患在本文中被稱為 ras-介導的增殖性疾患。此外，呼腸孤病毒可用于治療由PKR突變或失調造成的增殖性疾 患。參見，例如，Strong 等人，1998，EMBO J. 17 3351-620任選地，提供的方法還包括選擇患有ras-介導的增殖性疾患的受治療者的步驟。 任選地，提供的方法包括確定增殖性疾患是否是ras-介導的增殖性疾患的步驟。這樣的用 于確定增殖性疾患是否具有某些表型的方法是公知的。參見，例如，美國專利第7，306，902 號，其整體通過引用并入本文。如本文使用的，呼腸孤病毒是指歸類于呼腸孤病毒屬的任何病毒，不管是天然存 在的、修飾的還是重組的。呼腸孤病毒是具有雙鏈的、分段的RNA基因組的病毒。病毒粒子 測量為60-80nm的直徑并具有兩個同中心的衣殼(capsid shell)，每一個均為二十面體。 基因組由10-12個分離的節(jié)段的雙鏈RNA組成，總的基因組大小為16-271Λρ。單獨的RNA 節(jié)段大小不同。已從很多物種中回收了三種不同但相關類型的呼腸孤病毒。所有三種類型 享有共同的補體-結合抗原。人類呼腸孤病毒包括三種血清型1型(菌株Lang或TlL)、2型(菌株Jones，T2J) 和3型(菌株Dearing或菌株Abney，T3D)?；谥泻秃脱?抑制試驗，這三種血清型 可容易地鑒定。根據(jù)本公開內容的呼腸孤病毒可以是3型哺乳動物正呼腸孤病毒。3型哺 乳動物正呼腸孤病毒包括但不限于，Dearing和Abney菌株(分別為T3D或T3A)。參見，例 如，ATCC 登記號 VR-232 和 VR-824。呼腸孤病毒可以是天然存在的或是修飾的。當呼腸孤病毒可從自然界中的源分離 并且未被人類在實驗室中有意修飾時，該呼腸孤病毒是天然存在的。例如，呼腸孤病毒可來 自田野來源(field source)，即，來自已感染呼腸孤病毒的人。還可選擇或誘變呼腸孤病毒 用于增強溶瘤活性。呼腸孤病毒可以是被修飾的，但仍能夠溶胞地(Iytically)感染具有活性ras通 路的哺乳動物細胞。呼腸孤病毒可在施用于增殖細胞之前被化學地或生物化學地預處理(例如，通過用諸如胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶等蛋白酶處理)。采用蛋白酶的預處理移除了 病毒的外層(outer coat)或衣殼并可增強病毒的侵染性。呼腸孤病毒可被包覆在脂質體 或微團中(Chandran 和 Nibert，J. of Virology 72(1) :467-751998)。例如，病毒粒子可以 在微團形成濃度的烷基硫酸鹽洗滌劑存在下用胰凝乳蛋白酶處理以產生新的感染性亞病 毒顆粒(ISVP)。呼腸孤病毒可以是重組的呼腸孤病毒。例如，重組的呼腸孤病毒可以是重配株呼 腸孤病毒，其包括來自兩種或更多種遺傳上不同的呼腸孤病毒的基因組節(jié)段。呼腸孤病毒 基因組節(jié)段的重配可發(fā)生在宿主生物體感染至少兩種遺傳上不同的呼腸孤病毒之后。病毒 的重配可以發(fā)生在細胞培養(yǎng)物中，例如，通過與遺傳上不同的呼腸孤病毒共感染許可性宿 主細胞。因此，提供的方法包括使用由來自兩種或更多種遺傳上不同的呼腸孤病毒的基因 組節(jié)段的重配產生的重組呼腸孤病毒，包括但不限于，人類呼腸孤病毒，例如1型(例如，菌 株Lang)、2型(例如，菌株Jones)和3型(例如，菌株Dearing或菌株Abney)；非人類哺 乳動物呼腸孤病毒；或鳥呼腸孤病毒。重組呼腸孤病毒還可通過遺傳工程、化學合成或用化 學誘變劑或物理誘變劑處理而獲得。任選地，提供的方法包括使用由來自兩種或更多種遺 傳上不同的呼腸孤病毒的基因組節(jié)段的重配產生的重組呼腸孤病毒，其中至少一種親代病 毒是遺傳工程化的，包括一種或多種化學合成的基因組節(jié)段，已用化學誘變劑或物理誘變 劑處理的，或自身是重組事件的結果。任選地，提供的方法包括使用已在化學誘變劑或物理 誘變劑存在下經歷重組的重組呼腸孤病毒，所述化學誘變劑包括但不限于，硫酸二甲酯和 溴化乙錠，所述物理誘變劑包括但不限于，紫外線和其他形式的輻射。任選地，提供的方法包括使用在一個或多個基因組節(jié)段中具有突變(包括插入、 取代、缺失或重復)的呼腸孤病毒。這樣的突變可包括由于與宿主細胞基因組重組產生的 其他遺傳信息或可包括合成基因。例如，本文所述的突變體呼腸孤病毒可包含減少或基本 上消除σ 3多肽的表達的突變或導致功能性0 3多肽不存在的突變，如美國專利申請序列 號12/1Μ，522中所述，其整體通過引用并入本文。消除σ 3多肽表達的突變或導致功能性 σ 3多肽不存在的突變可以在編碼0 3多肽的核酸(S卩，S4基因)中，或在編碼調節(jié)σ3多 肽的表達或功能的多肽的核酸中。如本文使用的，減少σ 3多肽的表達的突變是指，相較于表達野生型σ 3多肽水 平的呼腸孤病毒，導致σ 3多肽的量減少至少30% (例如，至少40%、50%,60%,70%, 80%、90%或95%)的突變。如本文使用的，基本上消除σ 3多肽的表達的突變是指，相對于 由野生型呼腸孤病毒產生的σ3多肽的量，導致0 3多肽的量減少至少95% (例如，96%、 97%.98^^99%或100% )的突變。如本文使用的，導致功能性σ 3多肽減少或不存在的突 變是指允許σ3多肽的表達但產生不能裝配或并入病毒衣殼中的0 3多肽的突變。應當理 解，σ 3多肽保留其他功能性(例如，結合RNA的能力)以便突變體呼腸孤病毒保留繁殖能 力可能是所期望的或必要的。如本文所述的σ 3多肽中的突變可導致相對于不包含突變的σ 3多肽(例如，野 生型ο 3多肽)以減少的水平并入衣殼的0 3多肽。如本文所述的0 3多肽中的突變還可 導致不能并入病毒衣殼的σ3多肽。不受限于任何特定機制，例如由于σ3多肽與μ 多 肽適當結合的無能力，或由于減少或阻止ο 3多肽并入衣殼的構象變化，σ 3多肽可具有減 少的功能或缺乏功能。
除了消除或減少σ 3多肽的表達的突變或導致無功能的或減少的功能的σ 3多 肽的突變，如本文所述的突變體呼腸孤病毒還可包含在其他呼腸孤病毒衣殼多肽(例如， μ 、λ2和/或0 1)之一中的一種或多種進一步的突變(例如，第二、第三或第四突變)。 包含影響ο 3多肽的突變和任選地包含在任意或全部其他外部衣殼蛋白中的進一步突變 的呼腸孤病毒，可篩選這樣的突變體呼腸孤病毒感染并造成細胞溶解的能力。例如，可使用 對野生型呼腸孤病毒的細胞溶解具有抗性的腫瘤細胞來篩選本文所述的有效的突變體呼 腸孤病毒。例如，進一步的突變可減少或基本上消除μ 1多肽的表達或導致功能性μ 1多肽 不存在。被Μ2基因編碼的μ 1多肽可能牽涉在細胞穿透中并可在轉錄酶活化中起作用。每 個病毒粒子包含以與σ 3多肽1 1的復合物形式的約600個拷貝的μ 1多肽。μ 1多肽 在其N端被十四烷酰化，然后十四烷酰化的N端42殘基被裂解開，產生C端片段(μ 1C)。 另外或可選擇地，進一步的突變可減少或基本上消除λ 2多肽的表達或導致功能性λ2多 肽不存在，和/或進一步的突變可減少或基本上消除σ 1多肽的表達或導致功能性σ 1多 肽不存在。λ 2多肽由L2基因編碼并且牽涉在粒子裝配中，并且顯示鳥苷酰基轉移酶和甲 基轉移酶活性。σ 多肽由Sl基因編碼并且牽涉在細胞附著中，作為病毒血凝素。例如，呼腸孤病毒具有帶有一個或多個氨基酸修飾的λ -3多肽；帶有一個或多個 氨基酸修飾的ο-3多肽；帶有一個或多個氨基酸修飾的μ-1多肽；和/或帶有一個或多個 氨基酸修飾的μ -2多肽，如美國專利申請序列號12/046，095中所述，其整體通過引用并入 本文。作為實例，在λ-3多肽中的一個或多個氨基酸修飾是在殘基214處的Val、在殘基 267處的Ala、在殘基557處的Thr、在殘基755處的Lys、在殘基756處的Met、在殘基擬6 處的ftx)、在殘基963處的ftx)、在殘基979處的Leu、在殘基1045處的Arg、在殘基1071處 的Val、或其任意組合(相對于GenBank登記號MM734. 1編號)。應當注意，當氨基酸序列 在殘基214處是Val或在殘基1071處是Val時，該氨基酸序列還包括氨基酸序列中至少一 種另外的變化。任選地，λ -3多肽包括顯示在SEQ ID NO 18的序列。還作為實例，在σ -3 多肽中的一個或多個氨基酸修飾是在殘基14處的Leu、在殘基198處的Lys、或其任意組合 (相對于GenBank登記號K02739編號)。應當注意，當氨基酸序列在殘基14處是Leu時，該 氨基酸序列還包括氨基酸序列中至少一種另外的變化。任選地，σ-3多肽包括顯示在SEQ ID NO 14的序列。還作為實例，在μ -1多肽中的一個或多個氨基酸修飾是在殘基73處的 Asp (相對于GenBank登記號Μ20161. 1編號)。任選地，μ -1多肽包括顯示在SEQ ID NO 16的序列。還是作為實例，氨基酸修飾μ -2多肽是在殘基5 處的kr (相對于GenBank 登記號AF461684. 1編號)。任選地，μ _1多肽包括顯示在SEQ ID NO 15的序列。具有一 個或多個修飾的如本文所述的呼腸孤病毒還可包括呼腸孤病毒σ-2多肽。這樣的ο-2多 肽在位置70、127,195,241,255,294,296或340的一處或多處具有Cys (相對于GenBank登 記號ΝΡ_694684. 1編號)。任選地，σ -2多肽包括顯示在SEQ ID NO 12的序列。任選地，呼腸孤病毒具有帶有一個或多個核酸修飾的Ll基因組節(jié)段；帶有一個或 多個核酸修飾的S4基因組節(jié)段；帶有一個或多個核酸修飾的Ml基因組節(jié)段；和/或帶有 一個或多個核酸修飾的Μ2基因組節(jié)段，如美國專利申請序列號12/046，095中所述，其整體 通過引用并入本文。作為實例，在Ll基因組節(jié)段中的一個或多個核酸修飾是在位置660 的Τ、在位置817的G、在位置1687的Α、在位置2283的G、在位置2284_2沘6的ATG、在位置2794的C、在位置四05的C、在位置四53的C、在位置3153的A、或在位置3231的G (相對 于GenBank登記號M247IM. 1編號)。任選地，Ll基因組節(jié)段包括顯示在SEQ ID NO 8的 序列。還作為實例，在S4基因組節(jié)段中的一個或多個核酸修飾是在位置74的A和在位置 624的A(相對于GenBank登記號K02739編號)。任選地，S4基因組節(jié)段包括顯示在SEQ ID NO 4的序列。還作為實例，在M2基因組節(jié)段中的核酸修飾可以是在位置M8的C(相 對于GenBank登記號M20161. 1編號)。在一個實施方案中，M2基因組節(jié)段包括顯示在SEQ ID NO 6的序列。同樣作為實例，在Ml基因組節(jié)段中的核酸修飾是在位置1595的T (相對 于GenBank登記號AF461684. 1編號)。任選地，Ml基因組節(jié)段包括顯示在SEQ IDNO 5的 序列。如本文所述的呼腸孤病毒可包括本文公開的任何修飾或修飾的組合。任選地，如本 文所述的呼腸孤病毒包括具有顯示在SEQ IDNO :1-10的序列的基因組節(jié)段或顯示在SEQ ID NO: 11、12和16-21或SEQID NO 13或14中任一個或兩者的多肽。任選地，本文公開的呼 腸孤病毒被確定為IDAC登記號190907-01，保藏日期為2007年9月19日，保藏單位為加拿 大國際微生物保藏中心(IDAC)，保藏單位地址為R3E 3R2加拿大馬尼托巴省溫尼伯市阿靈 頓街1015號。如本文所稱的突變或修飾可以是一種或多種核苷酸的取代、插入或缺失。點突變 包括，例如，單個核苷酸轉換(嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶)或顛換(嘌呤到嘧啶或反過來) 以及單個核苷酸或多個核苷酸的缺失或插入。核酸中的突變可導致在編碼的多肽中的保守 的或非保守的氨基酸取代，這可導致構象變化或功能喪失或部分功能喪失，翻譯讀碼框中 的遷移(移碼)導致從那個點開始編碼的完全不同的多肽，提前的終止密碼子導致截短的 多肽(截短)，或者呼腸孤病毒核酸中的突變可完全不改變編碼的多肽(沉默或無義)。參 見，例如，Johnson 和 Overington，1993，J. Mol. Biol. 233 :716-38 ；Henikoff 和 Henikoff， 1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 :10915-19 ；和美國專利第 4，554，101 號對于保守的和非 保守的氨基酸取代的公開內容。使用本領域公知的大量方法的任何方法可在呼腸孤病毒的核酸中產生突變。例 如，可使用定向誘變來修飾呼腸孤病毒核酸序列。定向誘變最常用的方法之一是寡核苷酸 定向誘變。在寡核苷酸定向誘變中，編碼所期望的序列變化的寡核苷酸被退火至感興趣 的DNA的一條鏈并作為用于開始DNA合成的引物。照這樣，包含序列變化的寡核苷酸被合 并到新合成的鏈中。參見，例如，Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :488 ；Kunkel 等人，1987，Meth. Enzymol. 154 :367 ；Lewis 禾口 Thompson，1990，Nucl. AcidsRes. 18 :3439 ； Bohnsack, 1996，Meth. Mol. Biol. 57 1 ；Deng 禾口 Nickoloff，1992，Anal. Biochem. 200 :81 ； 以及Siimada，1996,Meth. Mol. Biol. 57 :157。在本領域中常規(guī)地使用其他方法來修飾蛋白 或多肽的序列。例如，包含突變的核酸可使用PCR或化學合成產生，或者具有所期望的氨基 酸序列變化的多肽可被化學合成。參見，例如，Bang和Kent，2005，Proc. Natl. Acad. Sci. USA102 :5014-9及其中的參考文獻。來自呼腸孤病毒粒子的核酸可使用標準的市售核酸方法而被分離。還參見，例如， khiff 等人，“Orthoreoviruses and Their R印Iication(正呼腸孤病毒及其復制)，”第52 章，在 Fields Virology (費氏病毒學)，Knipe 和 Howley 編著，2006，Lippincott Williams and Wilkins中。如本文使用的，分離的核酸是指從它們通常所結合的其他核酸中分離出的 核酸。因此，分離的核酸包括但不限于，基本上不含非-呼腸孤病毒(例如，宿主細胞)核酸的呼腸孤病毒核酸；或基本上不含與其他基因組節(jié)段對應的核酸的呼腸孤病毒基因組節(jié) 段。此外，分離的核酸可包括工程化的核酸如重組的或合成的核酸。如本文所述的突變體呼腸孤病毒可通過使用本領域公知的方法將含有至少一種 突變或修飾的基因組節(jié)段重構而產生。參見，例如，khiff等人，“Orthoreoviruses and Their R印Iication(正呼腸孤病毒及其復制)，”第52章，在Fields Virology (費氏病毒 學)，Knipe 和Howley 編著，2006，Lippincott Williams and Wilkins 中；Smith等人，1969， Virology39(4) :791-810 ；和美國專利第 7，186，542,7, 049，127,6, 808，916 以及 6，528，305 號。突變體呼腸孤病毒還可通過使用基于質粒的反向遺傳學系統(tǒng)表達呼腸孤病毒基因組 節(jié)段來產生ISVP而產生。參見，例如，Kobayashi等人，2007，Cell Host and Microbe 1 147-57。如本文使用的，遺傳工程化的或突變體ISVP是一種突變體呼腸孤病毒，并且是指 由攜帶至少影響σ 3多肽的、遺傳工程化的或自發(fā)產生的突變的呼腸孤病毒產生的ISVP。 本文所述的ISVP是穩(wěn)定的并可繁殖為用于多代(例如，多于1代，如，2、3、4、5、10、20、50或 更多代)的ISVP。經遺傳工程化的ISVP或經基于質粒的反向遺傳學系統(tǒng)產生的本文所述的突變體 呼腸孤病毒，可以在例如人類腫瘤細胞或小鼠成纖維細胞中培養(yǎng)。本文公開的突變體 呼腸孤病毒可以在僅許可缺乏σ3多肽的呼腸孤病毒菌株的細胞中培養(yǎng)。使用這樣的細胞 系以傳代本文所述的突變體呼腸孤病毒可允許選擇突變體，且還可用于減少或防止突變的 回復。任選地，本文所述的突變體呼腸孤病毒顯示比非突變體呼腸孤病毒(例如，對照 呼腸孤病毒)增加的感染性和/或降低的免疫原性，并可基于這樣的性狀來選擇。增加的 感染性可通過相對于被表達功能性σ 3多肽的呼腸孤病毒(例如，完整病毒粒子；例如，野 生型呼腸孤病毒)感染，被突變體呼腸孤病毒感染的腫瘤細胞的范圍和/或細胞數(shù)量的增 加而證實。突變體呼腸孤病毒的降低的免疫原性可通過這樣的突變體呼腸孤病毒在受治療 者中誘導顯著的免疫響應的無能力而證實。本文所述的突變體呼腸孤病毒還可對于其他期 望的性狀而篩選和選擇，所述性狀包括但不限于，更快的復制速度；更快的包裝速度；誘導 細胞凋亡的能力；在人類腫瘤細胞系中實現(xiàn)溶胞并有效殺死人類腫瘤細胞系的能力；釋放 有效的腫瘤表位的能力；與標準化學療法的相互作用；和增加的病毒后代數(shù)量。此外，突變 體呼腸孤病毒還可對于溶胞地感染腫瘤細胞(例如，具有活性Ras通路的哺乳動物細胞) 的能力而選擇。參見，例如，美國專利第7，052，832號。呼腸孤病毒任選地是被修飾以減少或消除對呼腸孤病毒的免疫反應的呼腸孤病 毒。這樣修飾的呼腸孤病毒在本文稱為免疫保護的呼腸孤病毒。這樣的修飾包括但不限 于，在脂質體、微團或其他媒介物中包裝呼腸孤病毒以將該呼腸孤病毒掩蔽而不接觸免疫 系統(tǒng)。可選擇地，可除去呼腸孤病毒病毒粒子的外部衣殼，因為存在于外部衣殼中的蛋白是 宿主體液和細胞免疫響應的主要決定簇?？墒褂脴藴史椒兓裟c孤病毒。參見，例如，khiff等人，“Orthoreoviruses and Their R印Iication (正呼腸孤病毒及其復制)，”第52章，在Fields Virology (費 氏病毒學)，Knipe 和 Howley，編輯，2006，Lippincott Williams and Wilkins 中；Smith 等人，1969，Virology39(4) :791-810 ；和美國專利第 7，186，542,7, 049，127,6, 808，916 和 6，528，305號。如本文使用的，純化的突變體呼腸孤病毒是指已被從天然伴隨它們的細胞組件中分離的呼腸孤病毒。通常，當呼腸孤病毒干重的至少70% (例如，至少75%、80%、 85^^90^^95%或99% )不含它們天然伴隨的蛋白與其他細胞組件時，該呼腸孤病毒被視 為純化的。本文提供的呼腸孤病毒和藥劑可在藥學上可接受的載體中在體外或體內施用。因 此提供了包含呼腸孤病毒和/或抑制如本文所述的促炎細胞因子的藥劑的藥物組合物。參 見，例如，關于呼腸孤病毒的美國專利第6，576，234號。除了一種或多種呼腸孤病毒和/或 抑制促炎細胞因子的藥劑，藥物組合物通常還包含藥學上可接受的載體。藥學上可接受的 載體可以是能夠作為呼腸孤病毒的媒介物、載體或介質的固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)物質。因此， 含有呼腸孤病毒和/或提供的藥劑的組合物可以是以下形式片劑、丸劑、粉末、錠劑、小袋 (sachet)、酏劑、懸浮液、乳液、溶液、糖漿劑、氣溶膠(作為固體或在液體介質中)、含有例 如高達按重量計10%的活性化合物的軟膏劑、軟明膠膠囊和硬明膠膠囊、栓劑、無菌注射液 和無菌包裝的粉末。任選地，含有呼腸孤病毒的組合物適于輸注。對于靜脈輸液，通常使用兩種流體， 類晶體和膠體。類晶體是礦物鹽或其他水溶性分子的水溶液。膠體包含較大的不溶性分子， 例如明膠；血液自身是膠體。最常用的類晶體流體是生理鹽水，一種0. 9%濃度的氯化鈉溶 液，該濃度接近于血液的濃度(等滲的)。林格氏乳酸鹽或林格氏乙酸鹽是常用于大體積補 液的另一種等滲溶液。如果患者處于低血糖或高鈉的危險中，則經常替代地使用5%右旋糖 于水中的溶液，有時被稱為D5W。合適的載體的一些實例包括磷酸鹽緩沖鹽水或另一種生理學上可接受的緩沖液、 乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、 硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、無菌水、糖漿和甲基纖維素。另外，藥物組合 物可包括但不限于，潤滑劑如滑石、硬脂酸鎂和礦物油；濕潤劑；乳化劑和懸浮劑；防腐劑 如苯甲酸甲酯和羥苯丙酯；甜味劑；和調味劑?？蓪⑺幬锝M合物制劑以在通過使用本領域 公知的程序施用后提供突變體呼腸孤病毒的快速、持續(xù)或延遲的釋放。除了以下所述的典 型制劑，可在 Remington :TheScience and Practice of Pharmacy (雷明頓藥學原理與實 踐)(第 21 版)DavidB. Troy 編著，Lippincott Williams & Wilkins，2005 中發(fā)現(xiàn)其他適 用于藥物組合物的制劑。為了制備諸如片劑的固體組合物，可將突變體呼腸孤病毒與藥物 載體混合以形成固體組合物。任選地，片劑或丸劑可被包衣或以別的方式復合以提供給予 長效優(yōu)勢的劑型。例如，片劑或丸劑可包含內部劑量組分和外部劑量組分，外部劑量組分是 以包著內部劑量組分的包層的形式。兩種組分可被腸溶層間隔，所述腸溶層用于抵抗在胃 中的崩解并允許內部組分完整地通過至十二指腸或被延遲釋放。多種材料可用于這樣的腸 溶層或包衣，這樣的材料包括許多高分子酸和高分子酸與諸如蟲膠、十六醇和乙酸纖維素 等材料的混合物。用于口服施用或用于注射的包含呼腸孤病毒和/或其他藥劑的液態(tài)制劑通常包 括水溶液、適當調味的糖漿、水性或油性的懸浮液和含有諸如玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子 油或花生油等食用油的調味的乳液，以及酏劑和類似的藥用媒介物。用于吸入或吹入的組合物包括在藥學上可接受的水溶劑或有機溶劑或其混合物 中的溶液和懸浮液、以及粉末。這些液態(tài)或固態(tài)的組合物可包含如本文所述的合適的藥學 上可接受的賦形劑。這樣的組合物可通過口或鼻的呼吸途徑施用用于局部效應或全身效
11應。在藥學上可接受的溶劑中的組合物可通過使用惰性氣體而被霧化。霧化的溶液可從霧 化裝置直接吸入，或霧化裝置可連接至面罩帳篷(face mask tent)或間歇式正壓呼吸機。 溶液、懸浮液或粉末的組合物可通過口或鼻從以適當方式遞送該制劑的裝置施用。任選地用于本公開內容的方法中的另一制劑包括透皮遞送裝置(例如，貼 片)。這樣的透皮貼片可用于提供如本文所述的突變體呼腸孤病毒的連續(xù)注入或不連續(xù)注 入。透皮貼片用于遞送藥劑的構建和使用是本領域眾所周知的。參見，例如，美國專利第 5，023，252號。這樣的貼片可被構建用于連續(xù)、脈動或請求式地遞送突變體呼腸孤病毒。如上所述，如果必要，呼腸孤病毒和/或其他藥劑被包覆在脂質體或微團中以減 少或阻止在已對呼腸孤病毒產生免疫性的哺乳動物中的免疫響應。這樣的組合物被稱為免 疫保護的呼腸孤病毒和/或藥劑。參見，例如，美國專利第6，565，831和7，014，847號。此 外，本文公開的突變體呼腸孤病毒(例如，σ 3多肽或功能不存在或不足的突變體呼腸孤病 毒)可以用酶蛋白水解處理以除去或部分除去存在的任何其他外部衣殼蛋白。在提供的方法中，呼腸孤病毒以使得它能夠最終接觸靶腫瘤或腫瘤細胞的方式施 用，例如系統(tǒng)施用。呼腸孤病毒以及制劑、載體或媒介物所施用的途徑取決于靶細胞的位置 以及類型?？刹捎脤挿秶氖┯猛緩?。例如，對于可接近的實體瘤，呼腸孤病毒可通過直接 注射到該腫瘤而施用。例如，對于造血腫瘤，呼腸孤病毒可靜脈內或血管內施用。對于在體 內不容易接近的腫瘤，例如轉移瘤，呼腸孤病毒以使得它可被系統(tǒng)運輸穿過哺乳動物的身 體并從而到達該腫瘤的方式施用(例如，靜脈內或肌肉內)?？蛇x擇地，呼腸孤病毒可被直 接施用于單個實體瘤，然后它在那里被系統(tǒng)攜帶穿過身體至轉移瘤。呼腸孤病毒還可通過 如下施用皮下、腹膜內、鞘內(例如，用于腦瘤)、局部(例如，用于黑素瘤)、口服(例如，用 于口腔癌或食管癌)、直腸(例如，用于結腸直腸癌)、陰道(例如，用于宮頸癌或陰道癌)、 經鼻、通過吸入噴射或通過氣溶膠制劑(例如，用于肺癌)。任選地，在連續(xù)的天數(shù)至少每天1次或達整天地將病毒連續(xù)施用于受治療者，持 續(xù)一段時間。因此，例如，通過在任意藥理學上可接受的溶液中的靜脈內施用，或作為輸注 液，經一段時間將病毒施用于受治療者。例如，物質可通過注射(例如，IM或皮下)而系統(tǒng) 施用，或至少每天1次地每天口服，或通過輸注以導致每天遞送至受治療者的組織或血流 中的方式施用。當經一段時間通過輸注施用病毒時，所述一段時間為，例如，1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、12或對小時，或在1小時和對小時(含)之間的任意時間，或更長時間。任選 地，所述一段時間為5、15、30、60、90、120、150或180分鐘，或在5分鐘和180分鐘(含)之 間的任意時間，或更長時間。因此，例如，病毒通過輸注施用60分鐘或約60分鐘。施用可 每天重復，進行2、3、4、5、6、7、8、9、10、14、21、28天或在2和28天(含)之間的任意天數(shù)， 或更長時間。提供的方法的治療劑，例如抑制促炎細胞因子的產生的藥劑，也通過多種施用途 徑來施用。因此，藥劑通過多種施用途徑的任意施用途徑來施用，包括，局部、口、腸胃外、 靜脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、腔內、透皮、肝內、顱內、噴霧/吸入、或通過經支氣管鏡檢查 的滴注。任選地，以在以上關于溶瘤病毒的描述中提出的方式連續(xù)施用治療劑。因此，例 如，通過在任意藥理學上可接受的溶液中的靜脈內施用，或作為輸注液，經一段時間將所述 藥劑施用于例如受治療者。任選地，在腫瘤位點或其附近局部施用所述藥劑?？蛇x擇地， 系統(tǒng)施用所述藥劑。抑制促炎細胞因子的藥劑以足夠抑制一種或多種促炎細胞因子的量(即，有效量)施用。作為實例，鉬化合物的有效量包括從約5mg/m2至lOOOmg/m2腫瘤體 積，或在5mg/m2和lOOOmg/m2(含)之間的任意量，或更多。因此，例如，順鉬的有效量包括 從約175-200mg/m2，并且對于卡鉬的有效量包括從約100-600mg/m2。其他藥劑的有效量從 0. 001-10，000mg/kg體重變化，或在0. 001和10，000mg/kg體重(含)之間的任意量。任選 地，鉬化合物的有效量包括約ang/mL分鐘(AUC)至7mg/mL分鐘，如通過Calvert公式所計 算。任選地，鉬化合物的有效量包括約5mg/mL分鐘(AUC)或6mg/mL分鐘，如通過Calvert 公式所計算。任選地，鉬化合物作為靜脈內輸注液經30分鐘時間施用。呼腸孤病毒以足夠治療增殖性疾患的量(例如，有效量)施用。當施用于增殖細胞 的呼腸孤病毒實現(xiàn)受感染細胞的細胞溶解(例如，溶瘤作用)，導致了異常增殖細胞數(shù)量的 減少、新生物大小的減少和/或與增殖性疾患相關的癥狀(例如，疼痛)的減少或消除時， 則增殖性疾患被治療了。如本文使用的術語溶瘤作用是指至少10%的增殖細胞被溶解(例 如，至少約20%、30(%、40(%、50(%或75(%的細胞被溶解)。例如，可通過在哺乳動物中測 量新生物大小或增殖細胞數(shù)量的減少或通過在體外(例如，來自增殖細胞的活組織檢查) 測量細胞溶解的量而確定細胞溶解的百分比。病毒的有效量將基于個體而確定，并且可基 于(至少部分地)使用的特定病毒；個體的大小、年齡、性別；和異常增殖細胞的尺寸和其 他特征。例如，對于治療人類，取決于存在的增殖細胞或者新生物的類型、尺寸和數(shù)量，使用 約IO3至IO12蝕斑形成單位(PFU)的病毒。有效量可以是，例如，從約1.0PFU/kg體重至約 1015PFU/kg體重(例如，從約102PFU/kg體重至約1013PFU/kg體重)。任選地，有效量為約 1 X IO8 至約 1 X IO12TCID50 0 任選地，有效量為約 1 X IO10TCID50o作為實例，5_6mg/ml分鐘(如通過Calvert公式計算的AUC)抑制促炎細胞因子 的藥劑，例如卡鉬，被施用于受治療者，并且IX IOiciTCID5ci至3X IOiciTCID5ci的呼腸孤病毒被 施用于該受治療者。任選地，抑制促炎細胞因子的藥劑以30分鐘至1小時靜脈內輸注而施 用。任選地，呼腸孤病毒以1小時靜脈內輸注施用。病毒和治療劑以及含有病毒和藥劑的組合物的最佳劑量取決于多種因素。所需的 準確量將取決于受治療者的物種、年齡、體重和一般健康、所治療的疾病的嚴重性、使用的 特定病毒或載體及其施用模式而從受治療者至受治療者變化。因此，對于每一種組合物指 定準確量是不可能的。然而，合適的量可由本領域普通技術人員在本文提供的指導下僅使 用常規(guī)試驗而確定。施用組合物的有效劑量和時間表可憑經驗確定。例如，對于多種增殖性疾患的動 —M^TII 自 The Jackson Laboratory,600 Main Street,BarHarbor,Maine 04609 USA。 可使用直接的測量(例如，腫瘤組織學)和功能性測量(例如，受治療者的存活率或腫瘤尺 寸)來監(jiān)測對治療的響應。這些方法包括處死典型的動物以評價種群，這增加了試驗所需 的動物數(shù)量。對腫瘤中螢光素酶活性的測量提供了評價腫瘤體積的替代方法而不處死動物 且允許對治療基于縱向種群的分析(longitudinal population-basedanalysis)。用于組合物施用的劑量范圍是足夠大以產生所期望的效果的劑量范圍，其中疾 病的癥狀被影響。劑量不應當過大以至于造成不良副作用，例如不希望的交叉反應和過敏 性反應。如果發(fā)生任何禁忌，單獨的醫(yī)師可調整劑量。劑量是變化的并且以每天1次或多次給藥來施用，進行1天或若干天。提供的病 毒和治療劑以單劑量或以多劑量(例如，2、3、4、6或更多劑量)施用。例如，當通過輸注施
13用時，該輸注可以是單次緩釋劑量或者可以通過多次輸注來遞送。治療可持續(xù)從若干天到 若干月或直到獲得疾病的減少。提供的病毒與治療劑的聯(lián)合相伴地(例如，作為摻混物)、分別但同時地(例如，經 分別的靜脈內通道(intravenous line)進入相同的受治療者)、或順次地(例如，首先將 化合物或藥劑之一給藥然后將第二個給藥)施用。因此，術語聯(lián)合用于指相伴地、同時地或 順次地施用兩種或更多種藥劑。作為實例，抑制促炎細胞因子的藥劑在溶瘤病毒之前或與 其同時施用。當一種化合物在另一種化合物之前施用時，第一種化合物在第二種化合物施 用前幾分鐘、幾小時、幾天或幾周施用。例如，第一種化合物可在施用第二種化合物之前1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、36、48、60或72小時或1和72小時(含)之間的任意時間施 用。任選地，第一種化合物在第二種化合物之前超過72小時施用。作為另一實例，第一種 化合物可在施用第二種化合物之前1、5、15、30、60、90或120分鐘或1和120分鐘(含)之 間的任意時間施用。任選地，第一種化合物在施用第二種化合物之前1、2、3、4、5、6、7、14、 21或觀天或1和觀天(含)之間的任意量施用。任選地，第一種化合物在第二種化合物 之前超過觀天施用。例如，抑制促炎細胞因子的藥劑在施用溶瘤病毒之前約1小時至8小 時施用。作為另一實例，抑制促炎細胞因子的藥劑在施用溶瘤病毒之前約1小時的時間施 用。作為實例，一個治療周期包括將抑制促炎細胞因子的藥劑和溶瘤病毒在第1天施 用。在第2、3、4和5天，僅將溶瘤病毒施用于受治療者。任選地，受治療者接受多個治療周 期，例如，2、3、4、5或更多個治療周期。呼腸孤病毒或含有這樣的呼腸孤病毒的藥物組合物任選地被包裝為藥盒。該藥 盒還包含一種或多種藥劑或含有這種抑制促炎細胞因子的藥劑的藥物組合物。任選地，預 期藥盒還包含一種或多種化療劑、一種或多種免疫抑制劑、和/或一種或多種抗-抗呼腸孤 病毒抗體。藥物組合物可配制為單位劑型。術語“單位劑型”是指適于作為單一劑量用于 人類受治療者和其他哺乳動物的物理上分離的單位，每個單位含有經計算以產生所期望療 效的預定量的突變體呼腸孤病毒連同合適的藥學上可接受的載體。預期提供的方法可與其他腫瘤療法聯(lián)合，例如化學療法、放射療法、外科手術、激 素療法和/或免疫療法。因此，溶瘤病毒可聯(lián)合外科手術或新生物的去除而施用。因此，在 此提供的是用于治療實體新生物的方法，該方法包括用外科手術除去新生物并在該新生物 部位處或附近施用溶瘤病毒。任選地，還預期在提供的方法中的組合物聯(lián)合已知的抗癌化合物或化療劑而施 用，或除了已知的抗癌化合物或化療劑以外而另外施用。化療劑是可抑制腫瘤生長的化合 物。這樣的藥劑包括但不限于，5-氟尿嘧啶、絲裂霉素C、甲氨蝶呤、羥基脲、環(huán)磷酰胺、達卡 巴嗪、米托蒽醌、蒽環(huán)霉素類(表柔比星和多柔比星(Doxurubicin))、受體的抗體例如赫賽 汀、依托泊苷、pregnasome、激素療法例如它莫西芬和抗-雌激素、干擾素、芳香酶抑制劑、 促孕劑和LHRH類似物。如本文使用的術語治療(treatment)、治療(treat)、治療(treating)或改善是指 減少疾病或病癥的影響或疾病或病癥的癥狀的方法。因此，在公開的方法中，治療可以指 對確定的疾病或病癥的嚴重性或該疾病或病癥的癥狀10^^20^^30^^40^^50%, 60%、 70 %、80 %、90 %或100 %的減少或改善。例如，如果癌癥的一個或多個癥狀在受治療者中相對于對照存在10%的減少，則用于治療該疾病的方法被視為治療。因此，所述的減少可以是 相對于天然水平或對照水平 10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、100 % 或 在10%和100%之間的任意百分比的減少。應當理解，治療不必指疾病、病癥或疾病或病癥 的癥狀的治愈或完全消除。如本文使用的，所提及的降低、減少或抑制包括相對于對照水平百分之10、20、30、 40、50、60、70、80、90或更多的改變。這樣的術語包括但不必包括完全消除。如本文使用的術語受治療者可以是脊椎動物，更特別地是哺乳動物(例如，人類、 馬、豬、兔、狗、綿羊、山羊、非人類的靈長類、牛、貓、豚鼠或嚙齒動物)；魚；鳥或爬行動物或 兩棲動物。該術語未指明特定的年齡或性別。因此，意圖涵蓋成年的和新生的受治療者，不 管是雄性的還是雌性的。如本文使用的，患者或受治療者可互換使用并可指患有疾病或疾 患的受治療者。術語患者或受治療者包括人類和獸醫(yī)的受治療者。公開了可用于公開的方法和組合物、可與公開的方法和組合物聯(lián)合使用、可用于 公開的方法和組合物的制備中、或是公開的方法和組合物的產物的物質、組合物和組分。這 些和其他的物質在本文公開，并且應當理解，當這些物質的組合、子集、相互作用、組等被公 開時，雖然每個各種單體的具體參考以及這些化合物的集合的組合與排列可能未明確地公 開，但本文特別地預期和描述了每一個。例如，如果公開并討論了抑制劑并且討論了可對包 括該抑制劑的許多分子進行的許多修飾，則該抑制劑的每一個和所有的組合與排列以及可 能的修飾是特別地預期的，除非相反地明確指明。類似地，這些的任何子集或組合也是特別 地預期和公開的。此原則應用于本公開內容的所有方面，包括但不限于，使用公開的組合物 的方法中的步驟。因此，如果存在可進行的多種另外的步驟，則應當理解，這些另外的步驟 中的每一個可采用公開的方法中的任何具體的方法步驟或方法步驟的組合來進行，并且每 個這樣的組合或組合的子集是特別地預期的并應當視為被公開了。貫穿本申請，提及了各種出版物。這些出版物的公開內容以其整體通過引用并入 本申請。已描述了許多方面。但是，應當理解可作出各種修改。此外，當描述一個特征或步 驟時，其可與本文中的任何其他特征或步驟組合，即使這種組合未明確說明。因此，其他的 方面在權利要求書的范圍內。
實施例實施例1.呼腸孤病毒和順鉬在小鼠黑素瘤模型中的抗腫瘤活性呼腸孤病毒3型Dearing(RV)已在許多體外系統(tǒng)、體內鼠科動物模型和早期臨床 試驗中證實了溶瘤活性。為了促進這些研究，研究了 RV連同順鉬(CP)在體外和在體內中 的溶瘤活性，所述的順鉬是造成DNA交聯(lián)并且在寬范圍的癌癥中有活性的假烷基化化療劑 (pseudoalkylatingchemotherapeutic)。在體外評價了 RV和CP用于協(xié)同腫瘤殺死和腫 瘤死亡機理的作用。在B16. FlO細胞上觀察到了 RV和CP之間(CIV :ED50，0. 42士0. 03 ； ED75，0. 30士0. 02 ;ED90，0. 24士0. 01)的協(xié)同相互作用(協(xié)同指數(shù)值(combination index value,CIV)小于1)。在組合暴露(exposure)后，相對于單藥劑暴露，流式細胞檢測分析顯 示出凋亡細胞的顯著增加。對于體內評價，用瘤內(i. t. )RV和腹膜內(i. p. )CP單獨地或聯(lián)合地治療C57B1/6小鼠中的皮下B16.F10腫瘤或C3H小鼠中的K1735腫瘤。腫瘤體積每周評估3次。治療 后收集腫瘤和器官用于病毒回收(retrieval)和組織學研究；測試血清樣品的細胞因子產 生和對中和性抗-呼腸孤病毒抗體(NARA)的誘導。圖1A、1B、1C和ID示出在呼腸孤病毒 /順鉬聯(lián)合治療后減少的腫瘤生長和增加的存活率。用單獨的呼腸孤病毒瘤內治療(正方 形)、單獨的順鉬腹膜內(三角形)、或呼腸孤病毒與順鉬聯(lián)合(圓形)在第1天和第4天 治療分別帶有皮下B16. FlO腫瘤的C57B1/6小鼠(圖IA和1C)和帶有K1735腫瘤的C3H 小鼠(圖IB和1D)。對照治療的小鼠(菱形)接受PBS。在所指示的天測量腫瘤，并且腫 瘤體積表示為相對于治療開始時的體積的腫瘤體積(圖IA和1B)。當腫瘤在任一方向上 超過15mm時使小鼠安樂死。存活率表示為Kaplan-Myer圖(圖IC和1D)。這些數(shù)據(jù)示出 減少的腫瘤生長，并且在用RV/CP聯(lián)合治療的小鼠中觀察到相對于用單藥劑治療延長的中 值存活時間(圖1A、1B、1C和1D)。在第12天的平均相對腫瘤體積士SD為，對照全部達 到終點；單獨的RV 8. 92士6. 94 ；單獨的CP :9. 87士2. 80 ；RV加CP :3. 86士2. 24。中值存活 (天)為，對照6 ；RV 12 ；CP 8 ；RV和CP聯(lián)合17。從僅為RV治療的全部動物的腫瘤和從 1/6小鼠的肝臟和心臟回收到活的病毒。作為對照，僅在50%來自聯(lián)合治療的小鼠的腫瘤 中但在4/6小鼠的肝臟中檢測到活的病毒。在聯(lián)合使用時，CP不影響中和性抗-呼腸孤病 毒抗體(NARA)對RV的響應(圖2)，但造成響應于RV的促炎細胞因子產生的顯著的削弱 (圖 3A、3B、3C、3D、3E、3F 和 3G)。總之，這些結果表明，化療劑的加入可顯著增強RV療法的抗腫瘤功效。此外，通過 相伴的化療，在重要器官中病毒炎癥反應的減少可允許更密集的給藥時間表以增強呼腸孤 病毒的總功效。實施例2.用于人類的呼腸孤病毒和卡鉬方案這是呼腸孤病毒與卡鉬每3周靜脈內給藥的研究設計?？ㄣf作為30分鐘靜脈內輸注液以通過Calvert公式計算的劑量施用(AUC 5mg/mL 分鐘或6mg/mL分鐘，GFR通過51Cr EDTA測定)。然后，呼腸孤病毒作為1小時靜脈內輸注 液以1 X 101°或3 X IOioTCID50的劑量施用。在第2至5天，使用與在第1天使用的相同的劑量和方法，僅施用呼腸孤病毒。表2-給藥方法
權利要求
1.一種用于治療受治療者的增殖性疾患的方法，所述方法包括以下步驟(a)將一種或多種呼腸孤病毒施用于受治療者；并(b)將抑制促炎細胞因子的表達或活性的一種或多種藥劑施用于受治療者。
2.如權利要求1所述的方法，其中約IO3至IO12蝕斑形成單位(PFU)的溶瘤病毒被施 用于受治療者。
3.如權利要求2所述的方法，其中約IO8至IO12蝕斑形成單位(PFU)的所述溶瘤病毒 被施用于受治療者。
4.如權利要求1所述的方法，其中約IO8至IO12TCID5ci的溶瘤病毒被施用于受治療者。
5.如權利要求1所述的方法，其中約5mg/m2至1000mg/m2的抑制促炎細胞因子的所述 藥劑被施用于受治療者。
6.如權利要求1所述的方法，其中約0.001-10, 000mg/kg體重的抑制促炎細胞因子的 所述藥劑被施用于受治療者。
7.如權利要求1所述的方法，其中2mg/mL分鐘(AUC)至7mg/mL分鐘的抑制促炎細胞 因子的所述藥劑被施用于受治療者。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述藥劑抑制促炎細胞因子但不抑制中和性抗_呼 腸孤病毒抗體(NARA)的產生。
9.如權利要求1所述的方法，其中所述藥劑是鉬化合物。
10.如權利要求9所述的方法，其中所述鉬化合物選自由順鉬、卡鉬和奧沙利鉬組成的組。
11.如權利要求10所述的方法，其中約175-200mg/m2順鉬被施用于受治療者。
12.如權利要求10所述的方法，其中約200-600mg/m2卡鉬被施用于受治療者。
13.如權利要求10所述的方法，其中5mg/mL分鐘(AUC)或6mg/mL分鐘的卡鉬被施用 于受治療者。
14.如權利要求1-13任一項所述的方法，其中所述呼腸孤病毒是哺乳動物呼腸孤病毒 或人類呼腸孤病毒。
15.如權利要求14所述的方法，其中所述人類呼腸孤病毒選自由血清型1呼腸孤病毒、 血清型2呼腸孤病毒和血清型3呼腸孤病毒組成的組。
16.如權利要求14所述的方法，其中所述人類呼腸孤病毒是血清型3呼腸孤病毒。
17.如權利要求14所述的方法，其中所述人類呼腸孤病毒具有IDAC登記號 190907-01 ο
18.如權利要求1-13任一項所述的方法，其中抑制促炎細胞因子的所述藥劑在施用所 述呼腸孤病毒的同時、之前或之后施用。
19.如權利要求18所述的方法，其中抑制促炎細胞因子的所述藥劑與所述呼腸孤病毒 同時施用。
20.如權利要求18所述的方法，其中抑制促炎細胞因子的所述藥劑在施用所述呼腸孤 病毒之前施用。
21.如權利要求20所述的方法，其中所述藥劑在施用所述溶瘤病毒之前1小時至12小 時施用。
22.如權利要求20所述的方法，其中所述藥劑在施用所述溶瘤病毒之前1分鐘至60分鐘施用。
23.如權利要求1所述的方法，其中所述呼腸孤病毒以多劑量施用。
24.如權利要求23所述的方法，其中抑制促炎細胞因子的所述藥劑被施用1次。
25.如權利要求23所述的方法，其中抑制促炎細胞因子的所述藥劑以多劑量施用。
全文摘要
本文提供了用于治療受治療者的增殖性疾患的方法，所述方法包括將一種或多種呼腸孤病毒以及調節(jié)促炎細胞因子的表達或活性的一種或多種藥劑施用于受治療者。例如，所述藥劑可抑制促炎細胞因子的表達或活性。
文檔編號A61K31/555GK102065873SQ200980119397
公開日2011年5月18日 申請日期2009年5月27日 優(yōu)先權日2008年5月27日
發(fā)明者B·G·唐普森, H·潘達, M·C·科菲 申請人:昂科利蒂克斯生物科技公司