專利名稱：球蟲病疫苗的制作方法
球蟲病疫苗交叉參考相關(guān)申請本申請根據(jù)35U. S.C. $119(e)要求在2008年5月四日提交的臨時申請美國系列 案61/057，003的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容以其全文通過引用合并入本文。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及提供免受球蟲病侵害的保護作用的疫苗。還提供了制備疫苗以及單獨 地或與其他保護劑組合地使用疫苗的方法。背景球蟲病是世界范圍內(nèi)攻擊家畜的腸道疾病。由于球蟲病的原因，依賴于動物產(chǎn)量 的商業(yè)經(jīng)常面臨重大的成本問題，包括由于患病家畜引起的金融損失以及旨在減少和/或 預(yù)防該疾病的預(yù)防性治療的花費。此類成本尤其與養(yǎng)禽業(yè)相關(guān)，其中禽類的密集聚居有利 于球蟲病的傳播。球蟲病的生態(tài)原因是專性細胞內(nèi)孢子蟲綱(Sporozoa)球蟲亞綱(Coccidia)的 成員。對動物產(chǎn)量具有重大影響的該亞綱的一個屬是艾美爾球蟲屬(Eimeria)。就象對 于密切相關(guān)的等孢球蟲屬(Isospora)、囊等孢球蟲屬(Cystoisospora)和隱孢子蟲屬 (Cryptosporidium)那樣，艾美爾球蟲屬只需要單個宿主就可完成其生命周期。在自然條件 下，其生命周期始于從環(huán)境攝入生成孢子的卵囊。艾美爾球蟲是具有復(fù)雜的單寄主生命周期的單細胞寄生蟲，其展示高度的宿主 物種和組織特異性。艾美爾球蟲種包括發(fā)現(xiàn)于雞中的種柔嫩艾美爾球蟲(E.tenella)、 堆型艾美爾球蟲(E. acervulina)、巨型艾美爾球蟲(E. maxima)、毒害艾美爾球蟲 (E. necatrix)、和緩艾美爾球蟲(E. mitis)、早熟艾美爾球蟲(E. praecox)、變位艾美爾球 蟲(E.mivati)和布氏艾美爾球蟲(E.brimetti)以及發(fā)現(xiàn)于火雞中的艾美爾球蟲種珠雞 和緩艾美爾球蟲(E.meleagrimitis)、腺樣艾美爾球蟲(E. adenoeides)、孔雀艾美爾球蟲 (E. gallopavonis)、分散艾美爾球蟲(E. dispersa)、珠雞艾美爾球蟲(E. meleagridis)、無 毒艾美爾球蟲(E. innocua)和亞圓艾美爾球蟲(E. subrotunda)。艾美爾球蟲屬的生命周期 的階段對于艾美爾球蟲屬的所有種基本上都是相同的，雖然每一個種具有在腸中進行發(fā)育 的優(yōu)選部位并且完成生命周期所需要的時間在種間不同。許多艾美爾球蟲種可通過經(jīng)口途徑、經(jīng)鼻途徑和/或通過感染性顆粒進入淚道而 感染單個宿主。一旦被攝入，該寄生蟲即穿過腸粘膜細胞，然后經(jīng)歷生命周期的無性和有性 階段。所造成的腸道損傷可最終導致受損的生長(矮化)、減少的飼料利用率、色素沉著的 喪失和增加的死亡率。此外，對腸內(nèi)層的損傷使動物對其他感染性狀況易感，例如受累的雞 變得對產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringen)誘導的壞死性腸炎更易感。感染始于宿主攝入生成孢子的艾美爾球蟲卵囊。然后攝入的卵囊在宿主的 腸中釋放胞蚴(sporocyst)。胞蚴釋放子孢子，其進入腸上皮細胞，然后轉(zhuǎn)化成營養(yǎng)子 (trophozoite) 0營養(yǎng)子依次經(jīng)歷稱為卵塊發(fā)育的過程形成第一代裂殖體(schizont)。由 于它們相對較大，因此正是裂殖體引起感染的主要的致病作用，即對宿主的組織損傷。
早期世代的裂殖體產(chǎn)生大量裂殖子(merozoite)，所述裂殖子被釋放，然后生長并 且形成下一代裂殖體。該無性期在開始有性期之前持續(xù)進行可變的代數(shù)。當裂殖體形成小 配子母細胞(microgametocyte)和大配子(macrogamete)時有性期開始。小配子母細胞隨 后發(fā)育成小配子，其使大配子受精而產(chǎn)生未孢子化卵囊后代。然后未孢子化卵囊被釋放入 腸腔并且隨宿主糞便排出。由未孢子化卵囊在宿主糞便中出現(xiàn)預(yù)示的生命周期的完成被稱 為開放(patency)。當環(huán)境是有利的時候，卵囊的孢子形成在宿主外發(fā)生。孢子化卵囊被宿主不可避 免的攝入開始下一個感染循環(huán)。從孢子化卵囊被宿主攝入至糞便中出現(xiàn)未孢子化卵囊稱為 潛隱期(pr印atent time period)。潛隱期在不同艾美爾球蟲種間是不同的。反復(fù)暴露于艾美爾球蟲感染的家禽可從球蟲病獲得免疫力。事實上，取決于各艾 美爾球蟲種的免疫原性，使用少量孢子化卵囊每天感染肉雞(broiler)可導致禽類在少至 2次重復(fù)感染后獲得完全免疫。因此，目前利用活艾美爾球蟲疫苗的方案基于獲得性免疫的 原理，即使用少量感染性卵囊反復(fù)感染。通常在孵化期在禽類出生的當天通過直接對禽類施用艾美爾球蟲疫苗或通過施 加在它們的飼料和/或飲用水中來進行接種。如上所述，感染性卵囊在禽類的腸道內(nèi)完成 它們的生命周期，最終在5至11天后(取決于艾美爾球蟲的種類)釋放新一代未孢子化卵 囊。然后隨糞便一起排泄的未孢子化卵囊在外部環(huán)境中變得具有感染性，即孢子化，并且通 過宿主攝入再感染禽類。在2或3次這樣的循環(huán)后，禽類被免疫而抗球蟲病。這種免疫力 的特征在于(i)腸中通過顯微鏡觀察到的寄生蟲的減少和/或不存在，( )卵囊排出的減 少，(iii)腸損傷的減少，(iv)臨床疾病的減少，和/或(ν)體重減輕的減少或預(yù)防。獲得 性免疫在缺乏后續(xù)對感染性卵囊的暴露時在3至4個月時期內(nèi)減弱。通過從家禽群體的臨床疾病的暴發(fā)分離野生型艾美爾球蟲，可將其繁殖以用作病 原性攻擊菌株。一般的非減毒疫苗由已通過實驗室傳代維持的不同艾美爾球蟲種的輕微至 中等致病性菌株的感染性卵囊組成。當以高數(shù)量被攝入時，此類非減毒艾美爾球蟲能夠引 起球蟲病。疫苗的制造者和使用者必須小心以確保接種只提供在初始宿主(Naiivehost) 中足以誘發(fā)免疫但不誘發(fā)疾病的感染性卵囊。在初始劑量后，接種過程只依賴于通過窩肥 (litter)從垃圾攝入孢子化卵囊來進行的再感染。減毒疫苗由具有降低的致病性的感染性卵囊組成。由于減弱的致病性與獲得更短 的潛隱期之間的強關(guān)聯(lián)性，許多減毒株也是早熟的。與之相符地，具有縮短的潛隱期的減毒 系通常稱為“早熟系”。因此，可通過寄生蟲在宿主動物中反復(fù)傳代的過程中選擇卵囊的早期出現(xiàn)來實現(xiàn) 艾美爾球蟲致病性的一定程度的減弱。這樣，已鑒定到了具有大大縮短的潛隱期并且大大 減小的致病性的艾美爾球蟲給定種的群體。雖然所觀察到的致病性降低的原因還不完全清 楚，但通常據(jù)信與裂殖體至少一代的耗盡和/或大小的減小(從而減少了宿主中組織損傷) 相關(guān)。非減毒和減毒疫苗都有有利方面和不利方面。由非減毒寄生蟲組成的疫苗的一個 有利方面是寄生蟲以更大數(shù)量復(fù)制，從而導致卵囊在環(huán)境中更快積累，這是禽類的再感染 和隨后的免疫所必需的。在另一方面，非減毒艾美爾球蟲在未接種的雞(naive chicken) 的腸道中的復(fù)制過程可產(chǎn)生損傷，導致較差的動物營養(yǎng)、飼料轉(zhuǎn)化效率的喪失和其他有害作用，包括繼發(fā)感染和炎癥。非減毒疫苗的另一個缺點是必須確保每一只禽類接受正確的初始劑量，因為太大 量的接種物將引起嚴重的腸損傷，而太小量的接種物又將導致相對于群體來說其免疫過程 的開始延遲。在后一種情況下，接受不足初始劑量的禽類可變得不能承受由在初次潛隱期 后它們的群體同伴排泄的擴增數(shù)目的感染性卵囊引起的攻擊。事實上，在這樣的后續(xù)艾美 爾球蟲攻擊之前缺乏足夠的免疫是當使用活的非減毒疫苗時發(fā)生的大部分失敗的原因。減毒疫苗的一個主要有利方面是它們只引起最小損傷。然而，減毒疫苗產(chǎn)生的卵 囊比非減毒株更少，導致感染性卵囊在環(huán)境中的積累更慢，從而降低了在初次潛隱期后再 感染的概率。這繼而又導致免疫完全建立所需的時間更長，并且甚至可中斷整個免疫過程。 因為野生型巨型艾美爾球蟲產(chǎn)生相對大量的卵囊，因此當針對艾美爾球蟲種巨型艾美爾球 蟲免疫時，感染性卵囊在環(huán)境中的積累較慢是特別有問題的。因為單個宿主種可被多個艾美爾球蟲種感染，因此通?？骨蛳x病的活疫苗被設(shè)計 成包含來自許多艾美爾球蟲種的卵囊。迄今為止，只存在3種類型的此類活疫苗只由實驗 室培養(yǎng)的卵囊組成的非減毒疫苗、只由減毒卵囊組成的減毒疫苗和混合疫苗(其中來自一 些艾美爾球蟲種的卵囊是非減毒的，來自其他艾美爾球蟲種的卵囊是減毒的)。不幸地是， 此類疫苗中沒有一種克服了上述不利方面。事實上，鑒于目前類型的活艾美爾球蟲疫苗中 每一種的顯著不利方面以及由于艾美爾球蟲感染而導致的球蟲病工業(yè)的相當昂貴的成本， 仍然長期需要可更好地保護家禽免受這種昂貴的腸疾病侵害的改進的疫苗。本文中任何參考文獻的引述不應(yīng)當理解為承認這樣的參考文獻是本申請的“現(xiàn)有 技術(shù)”。發(fā)明概述因此，本發(fā)明提供了可用于抗球蟲病的疫苗的新型免疫原性組合物。在本發(fā)明的 一個方面，提供了疫苗，所述疫苗包含孢子蟲病球蟲屬(coccidia genus)的單個種的至少 兩個不同株系，并且所述孢子蟲病球蟲屬的單個種的至少兩個不同株系具有彼此不同步的 潛隱期。在一個實施方案中，所述疫苗組合物包含球蟲屬的種的第一株系和該相同種的第 二株系，其中第一株系和第二株系具有不同步的潛隱期。在一個這樣的實施方案中，所述球 蟲屬是等孢球蟲屬。在另一個實施方案中，所述球蟲屬是囊等孢球蟲屬。在另一個實施方 案中，所述球蟲屬是隱孢子蟲屬。在一個特定的實施方案中，所述球蟲屬是艾美爾球蟲屬。還提供了包含球蟲屬的任何和所有組合的多價疫苗。在一些特定的實施方案中， 提供了包含兩個或更多個這類球蟲屬的兩個或更多個株系的疫苗。在該類型的一個實施方 案中，疫苗包含多個球蟲屬的株系對，其中球蟲屬單個種的多個株系對具有不同步的潛隱 期。在一個特定的實施方案中，疫苗包含囊等孢球蟲單個種的株系對(所述株系對具有不 同步的潛隱期)和等孢球蟲屬單個種的株系對(所述株系對具有不同步的潛隱期)。在另 一個實施方案中，疫苗中球蟲屬單個種的所有株系對都具有不同步的潛隱期。在一個實施方案中，疫苗中孢子蟲球蟲屬的種的第一株系是非減毒株，第二株系 是早熟株。在該類型的一個特定實施方案中，所述早熟株也是減毒株。本發(fā)明的疫苗可包含處于其生命周期任何階段的孢子蟲，包括其生命周期的一個 或多個階段或甚至所有階段的混合物。在一個特定的實施方案中，疫苗中的孢子蟲是卵囊。在另一個實施方案中，孢子蟲是子孢子(sporozoite)。在另一個實施方案中，孢子蟲是裂殖 子。在另一個實施方案中，孢子蟲是裂殖子和/或子孢子和/或卵囊的混合物。在本發(fā)明的另一個方面，提供了包含以確定的比率和/或數(shù)量存在的球蟲屬相同 種的非減毒孢子蟲和早熟孢子蟲的疫苗。因此，在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的疫苗包 含球蟲屬相同種的非減毒孢子蟲和早熟孢子蟲，其中疫苗中非減毒孢子蟲對早熟孢子蟲的 比率是大約1份減毒孢子蟲對大約4份早熟孢子蟲。在該類型的另一個實施方案中，相同 種的非減毒孢子蟲對早熟孢子蟲的比率是大約1份非減毒孢子蟲對大約2份早熟孢子蟲。 在另一個實施方案中，相同種的非減毒孢子蟲對早熟孢子蟲的比率是大約1份非減毒孢子 蟲對大約1份早熟孢子蟲。在另一個實施方案中，相同種的非減毒孢子蟲對早熟孢子蟲的 比率是大約2份非減毒孢子蟲對大約1份早熟孢子蟲。在另一個實施方案中，相同種的非 減毒孢子蟲對早熟孢子蟲的比率是大約4份非減毒孢子蟲對大約1份早熟孢子蟲。在該類 型的一些特定實施方案中，非減毒孢子蟲是非減毒卵囊。在另一個實施方案中，早熟孢子蟲 是早熟卵囊。在另一個疫苗的實施方案中，非減毒孢子蟲是非減毒卵囊，并且早熟孢子蟲是 早熟卵囊。還提供了包含球蟲屬相同種的株系的任何和/或所有組合和數(shù)量的疫苗，所述株 系具有不同步的潛隱期。在該類型的一個特定實施方案中，疫苗包含大約10至大約1000 個非減毒卵囊。在另一個實施方案，疫苗包含大約25個至大約500個非減毒卵囊。在另一 個實施方案中，疫苗包含大約50至大約250個非減毒卵囊。在另一個實施方案中，疫苗包 含大約100至大約200個非減毒卵囊。在該類型的相關(guān)實施方案中，疫苗包含大約50至大約20000個非減毒卵囊。在另 一個實施方案中，疫苗包含大約100至大約10，000個非減毒卵囊。在另一個實施方案中， 疫苗包含大約250至大約5000個非病毒卵囊。在另一個實施方案中，疫苗包含大約500至 大約3000個非病毒卵囊。在另一個實施方案中，疫苗包含大約750至大約2000非病毒卵Λ ο在另一個實施方案中，疫苗包含大約50至大約20000個早熟和/或減毒卵囊。在 另一個實施方案中，疫苗包含大約100至大約10，000個早熟卵囊。在另一個實施方案中， 疫苗包含大約250至大約5000個早熟卵囊。在另一個實施方案中，疫苗包含大約500至大 約3000個早熟卵囊。在另一個實施方案中，疫苗包含大約750至大約2000個早熟卵囊。在 另一個實施方案中，本發(fā)明的疫苗包含大約10至大約1000個早熟卵囊。在另一個實施方 案中，疫苗包含大約25至大約500個早熟卵囊。在另一個實施方案中，疫苗包含大約50至 大約250個非減毒早熟卵囊，在另一個實施方案中，疫苗包含大約100至大約200個早熟卵 囊。在一些特定實施方案中，早熟卵囊是減毒卵囊。當本發(fā)明的疫苗包括一個特定的孢子蟲球蟲屬例如艾美爾球蟲屬時，可使用任何 這樣的種。在一個這樣的實施方案中，疫苗包含可幫助保護雞免受球蟲病侵害的艾美爾球 蟲種。在一個這樣的實施方案中，所述艾美爾球蟲種是柔嫩艾美爾球蟲。在另一個實施方 案中，所述艾美爾球蟲種是堆型艾美爾球蟲。在另一個實施方案中，所述艾美爾球蟲種是毒 害艾美爾球蟲。在另一個實施方案中，所述艾美爾球蟲種是變位艾美爾球蟲。在另一個實 施方案中，所述艾美爾球蟲種是和緩艾美爾球蟲。在另一個實施方案中，所述艾美爾球蟲種 是早熟艾美爾球蟲。在另一個實施方案中，艾美爾球蟲種是布氏艾美爾球蟲。在一個特定7的實施方案中，艾美爾球蟲種是巨型艾美爾球蟲。還提供了包含此類艾美爾球蟲種的任何和所有組合的疫苗。此外，還提供了包含 兩個或更多個此類單個種的兩個或更多個株系的疫苗。在該類型的一個實施方案中，疫苗 包含多個艾美爾球蟲種的株系對，其中單個艾美爾球蟲種的多個株系對具有不同步的潛隱 期。在該類型的一個特定實施方案中，疫苗中單個艾美爾球蟲種的所有株系對具有不同步 的潛隱期。在一個特定的實施方案中，疫苗包含巨型艾美爾球蟲的野生型和/或非減毒株以 及巨型艾美爾球蟲的減毒和/或早熟株。在一個這樣的實施方案中，巨型艾美爾球蟲的野 生型和/或非減毒株具有以名稱C0CCIVACT銷售的疫苗中發(fā)現(xiàn)的巨型艾美爾球蟲株的 基本上所有的鑒定特征和/或基本上所有的性質(zhì)。在該類型的另一個特定實施方案中，疫 苗包含巨型艾美爾球蟲的減毒和/或早熟株，所述株系具有以名稱PARAC0X 銷售的疫苗 中發(fā)現(xiàn)的巨型艾美爾球蟲株的基本上所有的鑒定特征和/或基本上所有的性質(zhì)。在另一 個實施方案中，疫苗包含巨型艾美爾球蟲的野生型和/或非減毒株(所述株系具有以名稱 COCCIVAiT銷售的疫苗中發(fā)現(xiàn)的巨型艾美爾球蟲株的基本上所有的鑒定特征和/或基本 上所有的性質(zhì))和艾美爾球蟲株的減毒、早熟株(所述株系具有以PARAC0X 銷售的疫苗 中發(fā)現(xiàn)的巨型艾美爾球蟲株的基本上所有的鑒定特征和/或基本上所有的性質(zhì))。本發(fā)明的另一種疫苗包含可幫助保護火雞免受球蟲病的侵害的一個或多個艾美 爾球蟲種。在一個這樣的實施方案中，艾美爾球蟲種是和緩艾美爾球蟲。在另一個實施方 案中，艾美爾球蟲種是腺樣艾美爾球蟲。在另一個實施方案中，艾美爾球蟲種是孔雀艾美爾 球蟲。在另一個實施方案中，艾美爾球蟲種是分散艾美爾球蟲。在另一個實施方案中，艾美 爾球蟲種是珠雞艾美爾球蟲。在另一個實施方案中，艾美爾球蟲種是無毒艾美爾球蟲。在 另一個實施方案中，艾美爾球蟲種是亞圓艾美爾球蟲。還提供了包含珠雞艾美爾球蟲種的 任何和所有組合的疫苗。此外，提供了包含兩個或更多個此類單個種的兩個或更多個株系 的疫苗。在該類型的一個實施方案中，疫苗包含多個珠雞艾美爾球蟲種的株系對，其中單個 珠雞艾美爾球蟲種的多個株系對具有不同步的感染后至排卵囊期。在該類型的一個特定實 施方案中，疫苗中單個珠雞艾美爾球蟲種的所有株系對具有不同步的感染后至排卵囊期。在本發(fā)明的另一個方面，提供了包含等孢球蟲屬、囊等孢球蟲屬和/和隱孢子蟲 屬的一個或多個種和/或種的一個或多個株系的疫苗。在該類型的此類實施方案中，等孢 球蟲屬、囊等孢球蟲屬和/和隱孢子蟲屬的種的至少兩個株系也具有不同步的感染至卵囊 排出期。此外，可將本發(fā)明的任何艾美爾球蟲疫苗與此類等孢球蟲屬、囊等孢球蟲屬和/和 隱孢子蟲屬疫苗組合。在一個特定的實施方案中，疫苗包含隱孢子蟲屬的種的非減毒株和隱孢子蟲屬的 相同種的早熟株。在另一個實施方案中，這樣的隱孢子蟲屬疫苗還包含等孢球蟲屬的種的 非減毒株和等孢球蟲屬的相同種的早熟株。在另一個實施方案中，隱孢子蟲屬疫苗還包含 囊等孢球蟲屬的種的非病毒株和囊等孢球蟲屬的相同種的早熟株，在另一個實施方案中， 隱孢子蟲屬疫苗還包含囊等孢球蟲屬的種的非減毒株、囊等孢球蟲屬的相同種的早熟株、 等孢球蟲屬的種的非減毒株和等孢球蟲屬的相同種的早熟株。在一個相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供了包含等孢球蟲屬的種的非減毒株和等孢球 蟲屬的相同種的早熟株的疫苗。在另一個實施方案中，疫苗包括囊等孢球蟲屬的種的非減8毒株和囊等孢球蟲屬的相同種的早熟株。在另一個實施方案中，疫苗包含囊等孢球蟲屬的 種的非減毒株、囊等孢球蟲屬的相同種的早熟株、等孢球蟲屬的種的非減毒株和等孢球蟲 屬的相同種的早熟株。在本發(fā)明的另一個方面，提供了免疫動物受試者以抗球蟲病的方法。一個這樣的 實施方案包括給所述動物施用免疫有效量的本發(fā)明的任何疫苗。在一個實施方案中，經(jīng)口 施用所述疫苗。在另一個實施方案中，卵內(nèi)(in ovo)施用所述疫苗。在另一個實施方案中， 局部施用所述疫苗。在另一個實施方案中，通過注射施用所述疫苗。在一個特定的實施方案中，在動物的飲用水中施用所述疫苗。在另一個實施方案 中，在動物食物中施用所述疫苗。在另一個實施方案中，在動物的食物和飲用水中施用所述 疫苗。在另一個實施方案中，通過噴霧施用所述疫苗。在一個這樣的實施方案中，對一日 齡小雞噴霧含有疫苗的溶液。在該類型的一個特定實施方案中，在它們的孵化室中使用噴 霧盒(spray cabinet)接種一日齡雞。在另一個實施方案中，通過對動物的眼睛施加疫苗 來施用疫苗。在該類型的一個特定實施方案中，使用滴管將疫苗施用于動物的眼睛。在另 一個實施方案中，通過2、3、4或更多種施用方法施用疫苗。在一個特定的實施方案中，給禽類施用本發(fā)明的疫苗。在一個實施方案中，所述禽 類是家禽。在一個這樣的實施方案中，所述動物是雞。在另一個實施方案中，所述家禽是火 雞。在另一個實施方案中，所述家禽是鴨子。在另一個實施方案中，所述家禽是獵鳥(game bird)。在該類型的一個特定實施方案中，所述獵鳥是鵪鶉。在另一個實施方案中，所述獵 鳥是雉雞。在另一個實施方案中，給哺乳動物施用所述疫苗。在該類型的一個特定實施方 案中，所述哺乳動物是非人哺乳動物。本發(fā)明的這些和其他方面通過參考詳細描述和實施例將會獲得更好地理解。發(fā)明詳述因此，本發(fā)明提供了一種抗球蟲病的疫苗，其被配制成分別使非減毒和早熟球蟲 疫苗的不同性質(zhì)的有利方面最大化同時使它們的個別缺點最小化。在本發(fā)明的一個方面， 疫苗包含野生型球蟲種的一個或多個株系與來自相同種的減毒球蟲的一個或多個株系的 組合。這樣的疫苗可從宿主產(chǎn)生比兩個單個類型的株系單獨產(chǎn)生的免疫反應(yīng)更強的免疫反 應(yīng)。此外，所得的這兩種類型株系的雙重和不同的寄生生命周期可促成宿主中牢固免疫的 獲得?！愕?，與使用非減毒株的疫苗相比，用包含早熟株的疫苗要花費更長的時間才 能獲得抗艾美爾球蟲的給定種的牢固免疫，雖然對于早熟疫苗而言開放性(patency)來得 更早。該結(jié)果表明，相對于對于早熟株觀察到的情形而言，非減毒株在潛隱期中經(jīng)歷的額外 復(fù)制周期可加速宿主的免疫反應(yīng)，和/或在用非減毒艾美爾球蟲感染/接種后，在開放時釋 放的顯著更大數(shù)量的卵囊可在更少的寄生生命周期中使宿主動物產(chǎn)生完全免疫。雖然絕不受任何特定的作用機制限制，但本發(fā)明與通過使用包含球蟲屬例如艾美 爾球蟲屬選定種的兩個或更多個株系的疫苗(其中至少兩個株系具有不同步的潛隱期)接 種宿主動物產(chǎn)生的對宿主免疫系統(tǒng)的協(xié)同作用一致。這樣的不同步的潛隱期由于這種交替 式開放的加強作用而使得免疫過程比單獨地使用任一株系更快地進行。事實上，開放的更 快地繼續(xù)通過增加新產(chǎn)生的卵囊被宿主攝入的可用性的頻率促進再次免疫過程。在本文中稱為“回波效應(yīng)”的這種加強效應(yīng)從而可引發(fā)該宿主動物的更早期免疫。因此，在一個方面，本發(fā)明提供了包含具有更短潛隱期的減毒株和相同種的具有 更長潛隱期(但具有強得多的復(fù)制卵囊新世代和污染環(huán)境的能力)的非減毒株的疫苗。本 發(fā)明的一個這樣的示例性疫苗包括巨型艾美爾球蟲的兩個不同株系(或品系)來源于用 于產(chǎn)生以名稱PARAC0X 銷售的疫苗的相同標準種子(master seed)的減毒早熟株，和來 源于用于產(chǎn)生以名稱COCCIVAC 銷售的疫苗的標準種子的非減毒株。這兩個株系都提供 抗巨型艾美爾球蟲野外攻擊的功效。使用未減毒株的接種導致肉雞群在3周結(jié)束時顯示完 全的免疫，而使用早熟和/或減毒疫苗的接種花費至少4周成才完全建立。由于它們的潛隱期的不同長度，可通過回波效應(yīng)獲得宿主動物的早期免疫。因此 通過產(chǎn)生免疫反應(yīng)的不同步的刺激，即回波效應(yīng)，組合的巨型艾美爾球蟲株可刺激更長的 抗原對免疫系統(tǒng)的暴露，從而加速發(fā)展保護性免疫的過程。事實上，一起施用兩個株系可導致免疫過程功效的增加。非減毒卵囊和早熟卵囊 在宿主中同時開始它們各自的生命周期，但非減毒株比早熟株晚11至31小時完成其潛隱 期。非減毒株還將顯著更大量的卵囊泄入糞便中。因此，早熟株首先在宿主中完成其生命周期，從而起始宿主的免疫反應(yīng)。然后早熟 卵囊被排泄出來，形成孢子，并且在被宿主攝入后，開始它們的第二生命周期。同時，非減毒 株的第一生命周期繼續(xù)產(chǎn)生一個或多個額外世代的裂殖體，最終導致配子體的形成，加強 和擴展了由早熟株引發(fā)的免疫反應(yīng)。然后排泄的非減毒卵囊在廄肥中形成孢子，并且被已 具有早熟株(正經(jīng)歷其第二生命周期)的宿主攝入。因此，此類同時但不同步的細胞周期 可以減少在宿主中獲得牢固免疫所需的時間。但整個過程還可允許疫苗在初始劑量中包含 更少的非減毒卵囊，從而可降低因非減毒株感染在宿主腸中形成的損傷的數(shù)量和/或減輕 嚴重度。為了描述方便使用單數(shù)形式絕不是想這樣限定。因此，例如，提及包含“某一量”的 組合物即包括提及一個或多個這樣的量。此外，除非另外指出，“(一個)卵囊”包括多個這 樣的卵囊。如本文中使用的，下列術(shù)語將具有下面所示的定義術(shù)語“佐劑”和“免疫刺激劑”在本文中可互換使用，并且被定義為引起免疫系統(tǒng) 的刺激的一種或多種物質(zhì)。佐劑是非特異性增加對特定抗原的免疫反應(yīng)，從而減少任何給 定疫苗中所必需的抗原的量和/或產(chǎn)生足夠的對目的抗原的免疫反應(yīng)所必需的注射頻率 的試劑。在本說明書中，佐劑用于增強對一種或多種疫苗抗原/分離株的免疫反應(yīng)?？稍?疫苗施用之前或與疫苗施用組合或在疫苗施用之后施用佐劑。如本文中所使用的，術(shù)語“大致”與術(shù)語“大約”互換使用，表示一個值落入所指定 值的50%的范圍內(nèi)，即包含“大約” 100個卵囊的組合物包含50至150個卵囊。如本文中所使用的，球蟲屬的種的“減毒”株(例如“減毒的艾美爾球蟲”)是已就 其在宿主中的減小的致病性選擇出來的株系。這樣的減毒可通過許多方法來實現(xiàn)，包括連 續(xù)傳代(例如連續(xù)胚胎傳代)、化學誘變和通過輻射方法。如本文中所使用，球蟲屬的種的“早熟”株(例如“早熟艾美爾球蟲”)是相對于相 同種的非減毒株而言具有更短的潛隱期的株系。早熟株也可以是減毒株。如本文中所使用的，球蟲屬的種的“野生型”株(例如“野生型艾美爾球蟲”)是已通過減毒傳代或任何其他處理(包括通過單卵囊分離、免疫耐受或其他分離處理)進行改 變的野外分離株。如本文中所使用的，球蟲屬的種的“非減毒”株(例如“非減毒艾美爾球蟲”)是相 對于相同種的野生型株系而言既不具有縮短的潛隱期也不具有降低的宿主中致病性的株系。如本文中所使用的，球蟲屬的種(例如艾美爾球蟲的種)的“株系”是可通過以下 一個或多個特征與該種的一般群體區(qū)分開的球蟲屬的種的亞群體致病性、免疫原性、潛隱 期和/或由單個卵囊的擴增產(chǎn)生的群體。術(shù)語“不同步的潛隱期”是指球蟲屬的2個或更多個種和/或球蟲屬的種的兩個 或更多個株系的潛隱期相差10%或更大。在一個特定的實施方案中，球蟲屬的2個或更多 個種和/或球蟲屬的單個種的兩個或更多個株系具有相差20%或更大的不同步的潛隱期。 在另一個實施方案中，球蟲屬的2個或更多個種和/或球蟲屬的單個種的兩個或更多個株 系具有相差25%或更大的不同步的潛隱期。在談及早熟和/或減毒株與非減毒株的不同步的潛隱期相差某一百分比(％ )的 時間時，該百分比是基于非減毒株的潛隱期。因此，當球蟲屬的非減毒株具有120個小時的 潛隱期，而該球蟲屬的相同種的早熟株具有108個小時的潛隱期時，這兩個株系的不同步 的潛隱期相差10%。除非另外指出，術(shù)語“家禽”，如本文中所使用的，包括雞、火雞、鴨子、獵鳥(包括 但不限于鵪鶉、野雞和鵝)和平胸鳥(ratites)(包括但不限于鴯鹋(emu)和鴕鳥)。除非另外指出，術(shù)語“艾美爾球蟲”，如本文中所使用的，是指感染家禽類的艾美爾 球蟲屬的一個或多個種。艾美爾球蟲種包括在雞中發(fā)現(xiàn)的那些艾美爾球蟲種，包括例如柔 嫩艾美爾球蟲、堆型艾美爾球蟲、巨型艾美爾球蟲、毒害艾美爾球蟲、和緩艾美爾球蟲、早熟 艾美爾球蟲、變位艾美爾球蟲和布氏艾美爾球蟲，還有在火雞中發(fā)現(xiàn)的那些艾美爾球蟲種， 包括和緩艾美爾球蟲、腺樣艾美爾球蟲、孔雀艾美爾球蟲、分散艾美爾球蟲、珠雞艾美爾球 蟲、無毒艾美爾球蟲和亞圓艾美爾球蟲，還包括感染如上定義的其他家禽的艾美爾球蟲種。 術(shù)語“艾美爾球蟲”還包括艾美爾球蟲的上述種的所有株系，包括但不限于早熟株和減毒 株，其還包括已進行了輻射或其他處理以使它們不能完全發(fā)育的株系。術(shù)語艾美爾球蟲還 包括感染如上定義的家禽的艾美爾球蟲屬任何新發(fā)現(xiàn)的株系或種。術(shù)語“被囊的(encysted)，，是指該原生動物寄生蟲的卵囊階段。如本文中所使用的，術(shù)語“免疫”和“接種”是同義的并且可互換使用。除非另外指 出，術(shù)語“有效免疫劑量”，如本文中使用的，是指處于其生命周期任何階段的孢子蟲的足以 在所接種的動物中引發(fā)免疫反應(yīng)，例如引發(fā)相應(yīng)的抗體滴度的升高和/或細胞介導免疫的 激活的數(shù)量，包括它們的生命周期的一個或多個階段或所有階段的混合物，例如子孢子、卵 囊和/或裂殖子的混合物，或當混合時，是指例如足以實現(xiàn)上述效果的子孢子、卵囊和/或 裂殖子的數(shù)目。優(yōu)選地，當用孢子蟲綱(例如艾美爾球蟲屬或隱孢子蟲屬)的強毒劑量攻 擊時，所引發(fā)的免疫反應(yīng)可提供保護性免疫力，限制或減少被接種動物(例如禽類)的臨床 疾病體征、體重減輕、發(fā)病率和/或死亡率。除非另外指出，術(shù)語“卵囊”、“裂殖子”和“子孢子”，如本文中所使用的，是指有活 力的(即活的)球蟲(例如艾美爾球蟲或隱孢子蟲屬)卵囊、裂殖子和子孢子，其可以是減毒或非減毒的。術(shù)語“牢固免疫”在本文中可與術(shù)語“完全免疫”互換使用，表示對一組被接種動物 (例如一群接種鳥)所提供的一定程度的免疫，該免疫可提供抗同源攻擊的保護作用，使得 被接種動物在健康和性能上(如通過例如飼料轉(zhuǎn)化率、體重增長和/或球蟲病的損傷(總 體的或微觀的)所衡量的)在統(tǒng)計學上與未被攻擊的對照相似(和/或統(tǒng)計學上與未接種 的被攻擊對照不同)。術(shù)語“統(tǒng)計學上相似的”，如本文中所使用的，是指兩組或兩群動物的統(tǒng)計學比較 將導致在< 0.1顯著性水平上接受零假設(shè)(或無差異假設(shè))。術(shù)語“統(tǒng)計上不同的”，如本文中所使用的，是指兩組或兩群動物的統(tǒng)計學比較導 致在< 0. 1顯著性水平上拒絕零假設(shè)(或無差異假設(shè))。術(shù)語“胞蚴”是指將子孢子封閉在卵囊中的被膜。動物受試者待這樣處理的動物優(yōu)選是但不限于脊椎動物，更優(yōu)選哺乳動物、禽類或魚?？山o動 物受試者施用任何本發(fā)明疫苗。適當?shù)膭游锸茉囌甙ㄒ吧鷦游?、家?例如飼養(yǎng)用于獲 得肉、奶、黃油、蛋、毛皮、皮革、羽毛和/或羊毛)、負重的牲畜、研究動物、伴侶動物以及為/ 在動物園、野外棲地和/或馬戲團中飼料的動物?？捎帽景l(fā)明疫苗治療或保護的鳥類(禽類)可與商業(yè)或非商業(yè)鳥類飼養(yǎng)相關(guān)。此 類鳥類包括例如鴨科例如天鵝、鵝和鴨，鳩鴿科例如斑鳩和鴿子例如家鴿，雉科例如鵪鶉、 鷓鴣、松雞、雉雞和火雞，Thesienidae例如家雞(domestic chicken)，鸚鵡科例如鸚鵡、金 剛鸚鵡和鸚鵡等等為寵物或收藏市場飼養(yǎng)的動物。哺乳動物受試者包括牛族動物(例如?；蚰膛?、豬類(例如閹過的公豬或豬)、 羊類(例如山羊或綿羊)、馬科動物(例如馬)、犬科動物(例如狗)、貓科動物(例如家貓)、 駱駝、鹿、羚羊、兔子、豚鼠和嚙齒類動物(例如松鼠、大鼠、小鼠、沙鼠和倉鼠)、鯨類(鯨、海 豚、小鯨)、鰭足類(海豹、海象)。魚也可以是本發(fā)明的疫苗的受試者。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“魚”應(yīng)當被理解為 包括但不限于魚的硬骨類分組，即硬骨魚。鰻形目(其包括鮭科)和鱸形目(其包括刺鱸 科)都包括在鯛分類中。除其他以外，潛在的魚接受者的實例包括鮭科(Salmonidae)、鯧 科、鯛科、麗魚科、刺鱸科、三線眼線解(Parapristipoma trilineatum)和Blue-EyedPleco stomus (Plecostomus spp)?？杀恢委煹聂~的另外的實例包括但不限于鯰魚、黑鱸、鮪魚、大 比目魚、北極嘉魚、鱘魚、比目魚、鰈(flounder)、鰨(sole)、鯉魚、羅非魚、花條鱸(striped kiss)、鰻魚、海鯛、師魚(yellowtail)、琥珀魚、鼻鱸(grouper)和遮目魚?？乖吧吐涯铱蓮谋桓腥緞游锏募S便或組織；污染的飼料或水；土壤；圈墊草或窩； 或多種其他來源獲得。用于分離胞蚴和卵囊的方法是已知的。用于分離卵囊的確切方法 將隨卵囊所獲自的材料而變化，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是很顯然的。可通過例如US 7，250，286B2中公開的方法培養(yǎng)裂殖子。從原始環(huán)境樣品中分離生物體的一個可獲得的方法如下初始步驟是從外來材料 分離胞蚴和/或卵囊。通常通過與飽和鹽溶液形成漿液，然后從漿液分離胞蚴和/卵囊來 處理土壤或排泄物。例如，將待處理的材料與最少2體積(w/v)的飽和NaCl水溶液混合以形成漿液。必要時，可在混合器或攪拌器中處理漿液直至獲得均勻的稠度。以大約SOOxg 在4°C下離心漿液10分鐘。可通過傾倒通過雙層Mx對織粗濾布(weave cheese cloth) 來收集上清液。常用的從樣品純化卵囊的其他方法包括^leather蔗糖浮選法(leather sucrose flotation)和硫酸鋅浮選法[例如參見LR Ash和TC Orihel,Parasites :A Guide to Laboratory Procedures and Identification, ASCP Press 1991]。用兩體積的飲用水稀釋過濾的上清液，然后在4°C下以1600x g離心10分鐘。用 水清洗沉淀的卵囊，然后如所描述的通過離心沉淀(再進行3次)。然后使用與用于水清洗 的方法相同的方法在2. 5%重鉻酸鉀中清洗卵囊3次。在最終的清洗后，可將卵囊在4°C下 貯藏在2. 5 %的重鉻酸鉀中，或轉(zhuǎn)移至容器中以進行孢子形成。備選地，可將連續(xù)過濾用于基于大小分離卵囊。如果使用過濾，則如之前所述用水 和2. 5%重鉻酸鉀清洗卵囊。通過在很多年中連續(xù)傳代將源于野生型野外分離株的非減毒品系一直維持在實 驗室中，并且其被良好地表征為低至中等的致病性，中至高等的產(chǎn)卵力、確定的潛隱期和已 知的從宿主泄出的模式。除了現(xiàn)有的早熟艾美爾球蟲品系(如US 5，055，四2(其內(nèi)容以其全文通過引用合 并入本文)中例舉的)外，早熟品系還可通過在雞中連續(xù)傳代后從野生型、強毒力親本株或 非減毒株獲得。在一個這樣的情況下，只在開放后前面數(shù)小時中從糞便收集卵囊。這樣，可 逐漸縮短潛隱期。該類型的傳代被稱為選擇傳代。備選地，為了增加卵囊的數(shù)量以供收獲， 可有利地在開放開始與親本株的大致潛隱期之間的時間上收集卵囊。該類型的傳代被稱為 中性傳代(neutral passage)。最后，在稱為松馳傳代(relaxed passage)的過程中，實際 上收集所有卵囊，包括比親本株的潛隱期更晚產(chǎn)生的卵囊。疫苗種子批系統(tǒng)(Seed Lot System)可將各非減毒或減毒艾美爾球蟲品系的標準種子例如貯藏在液氮中?？稍诮臃N入 宿主例如SPF雞后從各標準種子的樣品制備工作種子(working seed)?？蓮乃拗骷S便和/ 或盲腸回收卵囊以產(chǎn)生工作種子。將工作種子在4°C下貯藏和用于起始各疫苗的產(chǎn)生。工 作種子具有6至12個月的貯存期，之后應(yīng)當替換它們。當制備工作種子時，卵囊的收獲只 長達到該物種的野生型親本株的大約潛隱期，即中性傳代。當制備疫苗時，在感染的整個顯 露期收獲卵囊，即松馳傳代。雞的飼養(yǎng)從獲自經(jīng)過檢驗的SPF群體的蛋孵育小雞。在飼養(yǎng)至進行疫苗生產(chǎn)的適當?shù)哪挲g (通常1至12周齡)期間使它們保持無球蟲。然后將雞轉(zhuǎn)移至疫苗生產(chǎn)地，按組分配入 分開的室中，或轉(zhuǎn)移至為各艾美爾球蟲種所指定的隔離器內(nèi)。接種用之前確定劑量的工作種子經(jīng)口接種每一組禽類?？梢园凑战诲e排期安排接種以 使在給定的工作日只收獲和處理艾美爾球蟲的一個種。收獲收集糞便，雖然收集的時間點和持續(xù)時間在種間不同。在水中制備糞便(和/或盲 腸內(nèi)容物)的漿液，然后將其勻漿。將勻漿物通過150微米篩子來進行清洗，然后在連續(xù)流13式沉降式離心機中離心清洗物。將離心后的沉淀重懸浮于飽和鹽溶液中，然后再離心。收 集上清液，用水稀釋，然后通過離心進行第三次通過。將沉淀重懸浮于2 %重鉻酸鉀溶液中。孢子形成在強制通氣的情況下將重鉻酸鉀溶液中的卵囊懸浮液在^rc下 溫育48小時以使卵囊形成孢子。在孢子形成后，通過離心除去重鉻酸鹽溶液，用10% chlorox (次氯酸鈉溶液)處理卵囊10分鐘。將處理過的卵囊重懸浮于水中，然后加入福爾 馬林至0.05%的濃度。將懸浮液貯藏在4°C下?；旌蠈Ω髋涯胰芤簯腋∫旱穆涯矣嫈?shù)，將計算體積的各懸浮液與懸浮劑混合，得到 多組分疫苗，其中每一個種的卵囊以期望的比例存在。將疫苗裝入最終的容器內(nèi)并且于4°C 下貯藏。佐劑本發(fā)明的一些疫苗組合物可包括藥學上可接受的佐劑。本發(fā)明的佐劑可獲自 許多來源(來自天然來源、重組來源)中的任何來源和/或化學合成等。用于動物接 種的合適的疫苗包括但不限于佐劑65(包含花生油、二縮甘露醇一油酸酯和單硬脂酸 鋁)；氟式完全或不完全佐劑；礦物凝膠(mineral gel)、鋁化合物例如氫氧化鋁、磷酸鋁 和白礬；表面活性劑例如十六烷基胺、十八烷基胺、溶血卵磷脂、二甲基雙十八烷基溴化 銨(dimethyldioctadecylammonium bromide)、N，N-雙十八烷基-N'，N' _雙0-羥甲 基)丙二胺、甲氧基十六烷基甘油和復(fù)合多元醇(pluronic polyol)；聚陰離子例如吡喃 (pyran)、硫酸葡聚糖、poly IC、聚丙烯酸；肽例如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸和促吞噬肽 (tuftsin)；和油乳劑。關(guān)于佐劑的信息公開于例如由P. Tijssen(Practice and Theory of Enzyme immunoassays,第 3 版，Elsevier, Hew York, (1987)提供的系列中。其他潛在的佐劑包括但不限于可代謝的和非可代謝的油、嵌段聚合物、 ISCOM' s (免疫刺激復(fù)合物)、維生素和礦物質(zhì)(包括但不限于維生素E、維生素A、硒和 維生素B12)、Quil A(皂苷)、丙烯酸與聚鏈烯基醚或二乙烯基二醇交聯(lián)的聚合物(其以商 標號CARB0P0L 銷售例如CARB0P0L 941)，和水乳劑中均勻分散的微米級油滴(例如 以商標Emu 1 s i gen 銷售)。有時被特別地提及為免疫刺激劑的佐劑的另外實例包括細菌和真菌細胞壁成分 (例如脂多糖、脂蛋白、糖蛋白、胞壁酰肽、β -1,3/1,6-葡聚糖)，來源于植物的各種復(fù)雜碳 水化合物(例如聚糖、醋孟南(acemarman))，來源于動物的各種蛋白質(zhì)和肽(例如激素、細 胞因子、共刺激因子)和來源于病毒和其他來源的新型核酸(例如雙鏈RNA、CpG)。此外， 上述物質(zhì)的任何數(shù)目的組合可提供佐劑效果，從而可構(gòu)成本發(fā)明的佐劑。本發(fā)明的疫苗可容易地通過任何途徑施用，包括經(jīng)口(例如通過滴眼、鼻內(nèi)、于飼 料中、于水中或通過噴霧)、卵內(nèi)、局部或通過注射(例如靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、眶內(nèi)、眼內(nèi)、真 皮內(nèi)和/或腹膜內(nèi))接種。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，優(yōu)選針對每一種類型的受體動物和 施用途徑適當?shù)嘏渲埔呙缃M合物。雖然本發(fā)明的疫苗以艾美爾球蟲為例進行說明，但本發(fā)明的疫苗也可用密切相關(guān) 的屬(分別為等孢球蟲屬、囊等孢球蟲屬和隱孢子蟲屬)的未減毒和減毒和/或早熟種和 /或種的株系來構(gòu)建。實施例1
包含減毒和非減毒巨型艾美爾球蟲株的疫苗巨型艾美爾球蟲的株系巨型艾美爾球蟲MFP 具有大約96小時的潛隱期(與親株的121小時潛隱期相比 較有長達25小時的縮短)。收獲時間可在104至110小時之間，例如108至110小時之間 0.5至4.58天)。配子體在感染后大約72小時或更早時間出現(xiàn)。其中裂殖體的平均大小 和裂殖子的平均數(shù)量大體上與親株的相似。巨型艾美爾球蟲球蟲疫苗(Coccivac)具有大約121小時的潛隱期，并且可在144 與192小時之間收獲產(chǎn)生的卵囊。疫苗制劑如上所述收獲卵囊，然后讓其生成孢子。選擇已知滴度的孢子化卵囊產(chǎn) 品批次以提供每體積期望數(shù)量的孢子化卵囊。通過將卵囊的懸浮液轉(zhuǎn)移至無菌容器中，然 后向該容器中定量加入2. 5%重鉻酸鉀溶液來完成疫苗的制備。將疫苗無菌地分配入容器， 然后將其密封。應(yīng)理解本發(fā)明不限于本文中公開的特定離心、處理步驟和材料，因為此類離心、過 程步驟和材料可在一定程度上變化。還應(yīng)理解，本文中使用的術(shù)語僅用于描述一些特定的 實施方案，并且無意進行限定，因為本發(fā)明的范圍將只由所附權(quán)利要求和其等價物來限定。1權(quán)利要求
1.包含球蟲科(Coccidia)之屬的種的第一株系和所述種的第二株系的疫苗組合物； 其中第一株系和第二株系具有不同步的潛隱期。
2.權(quán)利要求1的疫苗，其中所述屬選自等孢球蟲屬(Isospora)、囊等孢球蟲屬 (Cystoisospora)、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)禾口艾美爾球蟲屬(Eimeria)0
3.權(quán)利要求2的疫苗，其中所述屬是艾美爾球蟲屬。
4.權(quán)利要求3的疫苗，其中所述第一株系是非減毒的艾美爾球蟲株，并且所述第二株 系是早熟的艾美爾球蟲株。
5.權(quán)利要求4的疫苗，其中所述早熟的艾美爾球蟲株是減毒的艾美爾球蟲株。
6.權(quán)利要求4的疫苗，其中包含非減毒的艾美爾球蟲卵囊和早熟的艾美爾球蟲卵囊。
7.權(quán)利要求6的疫苗，其中非減毒的艾美爾球蟲卵囊的數(shù)量是大約10至大約1000個。
8.權(quán)利要求6的疫苗，其中早熟的艾美爾球蟲卵囊的數(shù)量是大約100至大約10，000個。
9.權(quán)利要求8的疫苗，其中非減毒的艾美爾球蟲卵囊的數(shù)量是大約10至大約1000個。
10.權(quán)利要求6的疫苗，其還包含非減毒的艾美爾球蟲裂殖子和子孢子，以及早熟的艾 美爾球蟲裂殖子和子孢子。
11.權(quán)利要求4的疫苗，其中所述艾美爾球蟲屬的種選自柔嫩艾美爾球蟲 (E. tenelta)、堆型艾美爾球蟲(E. acervulina)、巨型艾美爾球蟲(E. maxima)、毒害艾美爾 球蟲(E.necatrix)、和緩艾美爾球蟲(E. mitis)、早熟艾美爾球蟲(E. praecox)、變位艾美 爾球蟲(E. mivati)和布氏艾美爾球蟲(E. brunetti)。
12.權(quán)利要求11的疫苗，其中所述艾美爾球蟲的種是巨型艾美爾球蟲。
13.權(quán)利要求12的疫苗，其還包含選自柔嫩艾美爾球蟲、堆型艾美爾球蟲、毒害艾美爾 球蟲、和緩艾美爾球蟲、早熟艾美爾球蟲、變位艾美爾球蟲和布氏艾美爾球蟲中的艾美爾球 蟲屬一個或多個另外的種。
14.權(quán)利要求3的疫苗，其還包含選自等孢球蟲屬、囊等孢球蟲屬和隱孢子蟲屬的球蟲 屬中一個或多個另外的株系。
15.權(quán)利要求14的疫苗，其中所述球蟲科的屬是隱孢子蟲屬，并且所述隱孢子蟲屬的 一個或多個另外的株系包括隱孢子蟲屬之種的非減毒株和該隱孢子蟲屬之種的早熟株。
16.權(quán)利要求4的疫苗，其中所述艾美爾球蟲屬的種選自珠雞和緩艾美爾 球蟲(E. meleagrimitis)、腺樣艾美爾球蟲(E. adenoeides)、孔雀艾美爾球蟲 (E. gallopavonis)、分散艾美爾球蟲(E. dispersa)、珠雞艾美爾球蟲(E. meleagridis)、無 毒艾美爾球蟲(E. innocua)和亞圓艾美爾球蟲(E. subrotunda)。
17.權(quán)利要求2的疫苗，其中所述第一株系是非減毒株，并且所述第二株系是早熟株。
18.權(quán)利要求17的疫苗，其中所述屬是隱孢子蟲屬。
19.權(quán)利要求18的疫苗，其還包含等孢球蟲屬之種的非減毒株和該等孢球蟲屬之種的早熟株。
20.免疫動物受試者以抗球蟲病的方法，其包括給該動物施用免疫學有效量的權(quán)利要 求1的疫苗。
21.權(quán)利要求20的方法，其中經(jīng)口施用所述疫苗。
22.權(quán)利要求21的方法，其中通過選自下述的方法來經(jīng)口施用所述疫苗將該疫苗加至所述動物的飲用水中、將該疫苗加至所述動物的食物中、將該疫苗用于所述動物的眼睛 以及將該疫苗對所述動物噴霧。
23.權(quán)利要求20的方法，其中卵內(nèi)施用所述疫苗。
24.權(quán)利要求20的方法，其中所述動物是家禽。
25.權(quán)利要求対的方法，其中所述家禽選自雞、火雞、鴨和獵鳥。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述家禽是雞。
全文摘要
本發(fā)明公開了提供免受球蟲病侵害的保護作用的疫苗以及制造疫苗和單獨地或與其他保護劑組合地施用疫苗的方法。
文檔編號A61K39/012GK102046197SQ200980119663
公開日2011年5月4日 申請日期2009年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月29日
發(fā)明者C·T·布洛薩德, J·S·施拉德, M·朗 申請人:英特威國際有限公司