專利名稱：：用于預(yù)防或治療aids的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了用于在人類(lèi)患者中預(yù)防或治療獲得性免疫缺陷綜合征(AIDQ的組合物和方法，以及對(duì)抗HIV感染的疫苗。
背景技術(shù)：
：自從HIV-I發(fā)現(xiàn)以來(lái)(Barre-Sinoussi等，1983)，搜尋對(duì)抗AIDS的疫苗一直是一個(gè)重大問(wèn)題。經(jīng)典的靶向HIV-I包膜蛋白的疫苗途徑的失敗，指出了使用另一種靶、例如被稱為T(mén)at的HIV-I轉(zhuǎn)錄蛋白的反式激活子的重要性，這是由于它的細(xì)胞外功能參與了摧毀對(duì)抗HIV感染細(xì)胞的免疫細(xì)胞性應(yīng)答(Jeang等，1999)。Tat主要以兩種不同長(zhǎng)度存在，86-87個(gè)殘基或99-101個(gè)殘基，它們顯示出多方面的活性(Jeang等，1999)。由于存在非同義的單核苷酸多態(tài)性，在第二個(gè)外顯子編碼序列中產(chǎn)生了終止密碼子，長(zhǎng)的形式在除了亞型D之外所有HIV-I亞型的臨床分離物中是主要的(Jeang等，1999)。Tat被分成六個(gè)區(qū)域(Kuppuswamy等，1989)，具有一個(gè)參與大多數(shù)Tat活性的所謂的基本區(qū)。生物活性Tat變體的NMR研究顯示，基本區(qū)和其他功能區(qū)良好地暴露于溶劑，并包圍由部分N-末端與非常保守的Trp11構(gòu)成的核心(Wlopor^se等，2000；Gregoire等，2001；Watkins等，2008)。在不同的Tat變體間，這種折疊在水性溶液中是相似的，但是當(dāng)暴露于疏水溶劑時(shí)可以急劇變化(Wlopor^se等，1999)。Tat是柔性蛋白，并且結(jié)構(gòu)性變化對(duì)于它與其藥理學(xué)靶的結(jié)合是必需的(Loret等，1992)。Tat主要在被感染細(xì)胞的核中發(fā)現(xiàn)，在那里它起到反式作用轉(zhuǎn)錄激活子(trans-actingtranscriptionalactivator)的作用(Wong-Staal等，1985;Fujisawa等，1985)，在那里已知它通過(guò)復(fù)雜的過(guò)程參與啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄和RNA鏈延伸(Cullen，1990)，所述過(guò)程涉及細(xì)胞蛋白與病毒mRNA上的莖-凸環(huán)前導(dǎo)RNA、——TAR(反式激活響應(yīng)區(qū))的相互作用和Tat的乙?；?Bres等，2002)。研究顯示，它也參與HIV-IRNA的反轉(zhuǎn)錄(Harrich等，1997)。盡管缺乏信號(hào)序列，但Tat是唯一被HIV-I感染的細(xì)胞分泌的HIV-1蛋白，并且以可檢測(cè)的水平在HIV-I感染的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液(0.1-lng/ml)(Ensoli等，1990；Westendorp等，1995b；Chang等，1997)和HIV-1感染的患者的血清(l_40ng/ml)(Xiao等，2000；Westendorp等，1995b)中發(fā)現(xiàn)。細(xì)胞外Tat表現(xiàn)出多方面的活性(Jeang等，1999)，但是最重要的是通過(guò)穿越細(xì)胞膜、經(jīng)線粒體途徑引起凋亡，來(lái)觸發(fā)未感染的T細(xì)胞的凋亡(Chen等，2002，Campbell等，2004，deMareuil等，2005)。在SHIV-1激惹的稱猴中細(xì)胞外Tat的體內(nèi)中和引起⑶8+T細(xì)胞的升高，并且HIV-I感染的⑶4+T細(xì)胞變得檢測(cè)不到(Watkins等，2006)。因此，Tat在HIV-I發(fā)病機(jī)理中的作用不僅是作為HIV-1在被感染細(xì)胞中復(fù)制的必需蛋白，而且作為細(xì)胞外毒素(Gallo，1999)。因此，這與開(kāi)發(fā)靶向Tat的疫苗是相關(guān)的(Goldstein,1996)。但是，具有針對(duì)Tat的抗體的血清反應(yīng)陽(yáng)性患者不能識(shí)別來(lái)自所有HIV-I亞型的Tat變體(Campbell等，2007b)。此外，這些抗體不能減緩疾病向AIDS的進(jìn)展4(Senkaali等，2008)。顯然，如以前提出的使用主要在歐洲和北美發(fā)現(xiàn)的B亞型Tat的Tat疫苗(Godstein,1996；Zagury等，1998；Cafaro等，1999)，只有低的可能性能夠提供針對(duì)世界其他地方、特別是非洲的HIV-I感染的治療和預(yù)防性效應(yīng)。此外，使用B亞型Tat的Tat疫苗甚至對(duì)于在歐洲和北美提供治療和預(yù)防性效應(yīng)也具有低的可能性，這是由于免疫系統(tǒng)不能中和細(xì)胞外！"at。到目前為止，對(duì)抗Tat的兩種主要的疫苗策略使用了失活的(hgury等，1998)或具有完全活性的(Cafaro等，1999)B亞型歐洲Tat變體的86個(gè)殘基的版本。這兩種方法在獼猴上進(jìn)行了試驗(yàn)，隨后進(jìn)行同源SHIV-I激惹(Cafaro等，1999；Pauza等，2000)。在分別在食蟹獼猴(Cafaro等，1999)和恒河獼猴(Pauza等，2000)上進(jìn)行的這兩項(xiàng)研究中，觀察到了病毒血癥的顯著降低，在原發(fā)感染過(guò)程中沒(méi)有顯示出完全保護(hù)。另一項(xiàng)研究顯示了在Tat疫苗接種的食蟹獼猴上進(jìn)行SHIV-I激惹后感染的長(zhǎng)期控制(Maggiorella等，2004)。這些研究指出，使用生物活性Tat的疫苗似乎是安全的方法，正如在猴子上進(jìn)行的安全性研究所指示的，在這些安全性研究中沒(méi)有觀察到局部或全身性毒性或不利效應(yīng)(Cafaro等，1999，2001；Caselli等，1999；Goldstein等，2000)。有趣的是注意到，在恒河猴上的Tat疫苗研究中因?yàn)橛肧IV激惹(Allen等，2002)或用編碼Tat-Rev蛋白的重組病毒接種(Verrier等，200沒(méi)有觀察到保護(hù)作用，出現(xiàn)了沖突的結(jié)果。這些沖突的結(jié)果可以由免疫接種方案、病毒原液、病毒激惹途徑和動(dòng)物物種的不同來(lái)解釋。在第一項(xiàng)研究中SIVTat和HIV-ITat之間的差異，以及第二項(xiàng)研究中Tat-Rev重組蛋白不具有天然Tat折疊或天然Rev折疊的可能性，可以解釋缺乏保護(hù)作用。但是，更費(fèi)解的是使用表達(dá)Tat、Env和Gag的相似病毒載體的兩項(xiàng)其他研究的結(jié)果給出了相反的結(jié)論。一項(xiàng)研究顯示了載體化的Tat的效力，但是feig和Env沒(méi)有效力(Mittelaar等，2002)，而另一項(xiàng)研究顯示了載體化的Gag和Env的效力，但是Tat沒(méi)有效力(Liang等，2005)。兩項(xiàng)研究的主要區(qū)別在于一個(gè)在疫苗和SHIV二者中使用了利用TatBru序列進(jìn)行的同源激惹(Mittelaar等，2002)，另一個(gè)在疫苗中使用iTatBru序列并在SHIV中使用TatJr進(jìn)行了異源激惹(Liang等，2005)。HIV-IJr和HIV-IBru都是B亞型的(圖1)，但是它們的Tat序列具有不保守的突變，誘導(dǎo)了構(gòu)象變化(Gregoire&Loret.，1996)。疫苗與用于激惹的病毒之間的這些突變可能解釋了在第二項(xiàng)研究中Tat載體化的疫苗缺乏效力(Liang等，2005)。顯然，第二項(xiàng)研究更近似于現(xiàn)實(shí)，因?yàn)榻臃N疫苗的人不可能暴露于同源病毒感染，但是在那種情況下為什么使用同源Gag和Env(Liang等，2005)？在過(guò)去20年間，已經(jīng)使用同源SHIV/獼猴模型測(cè)試了靶向HIV-I包膜蛋白的HIV-I疫苗研究并已獲得成功O^inberg等，2002)。但是，臨床試驗(yàn)沒(méi)有成功(Vanichseni等，2004)。這是由于HIV-I的高遺傳多樣性，這也是應(yīng)該使用遺傳上不同的病毒在獼猴中進(jìn)行異源SHIV激惹以確定疫苗是否能夠在人類(lèi)中有效對(duì)抗HIV-I感染的原因Weinberg等，2002)。如果成功的同源SHIV激惹有助于顯示Tat疫苗接種在體內(nèi)的重要性，那么在世界范圍內(nèi)發(fā)開(kāi)用于人類(lèi)的Tat疫苗必須考慮到Tat的遺傳多樣性。重要的是注意到使用B亞型TatBru進(jìn)行免疫接種，不能刺激針對(duì)來(lái)自A和CHIV-I亞型的Tat變體的有效應(yīng)答，而這些亞型占世界上感染的75%(Opi等，2002)。隨著發(fā)現(xiàn)血清反應(yīng)陽(yáng)性的長(zhǎng)期不進(jìn)展(LTNP)患者與血清反應(yīng)陽(yáng)性的快速進(jìn)展(RP)患者相比具有較高水平的Tat抗體，對(duì)開(kāi)發(fā)Tat疫苗的興趣增加了(Re等，1995；vanBaalen等，1997；Zagurry等，1998；Re等，2001；Addo等，2001；Belliard等，2003)。有趣的是，注意到了使用11000稀釋的血清，在歐洲僅在30%的RP患者中識(shí)別到TatBru(Zagury等，1998)，在非洲這一數(shù)字僅為10到14%(Butto等，2003)。如果測(cè)試來(lái)自亞型A、C和D的其他Tat變體，這一百分?jǐn)?shù)在非洲可以達(dá)到高達(dá)50%(Campbell等，2007)。該結(jié)果再一次顯示出Tat變體中的突變能夠如何影響免疫原性，但是它也顯示出大量血清反應(yīng)陽(yáng)性患者不能識(shí)別Tat。此外，非洲RP患者中的Tat抗體對(duì)發(fā)展到AIDS沒(méi)有影響(Sankali等，2008)。對(duì)于大多數(shù)HIV-I感染患者來(lái)說(shuō)，已顯示當(dāng)他們的血液中存在Tat時(shí)該蛋白不被識(shí)別，并且識(shí)別到Tat的患者不能中和該蛋白。Tat被人類(lèi)免疫系統(tǒng)識(shí)別如此不良的原因，可能是由于Tat的基本區(qū)與人類(lèi)蛋白例如魚(yú)精蛋白中發(fā)現(xiàn)的表位的序列相似性。顯然，引發(fā)針對(duì)Tat基本區(qū)(IV區(qū))的免疫應(yīng)答將導(dǎo)致對(duì)人類(lèi)的自身免疫應(yīng)答。IV區(qū)在Tat變體之間非常保守(圖1)，但是它不被來(lái)自HIV-I感染的患者的血清識(shí)別(Campbell等，2007)。有趣的是，注意到了HIV感染的母親所生的新生兒有三分之二成功逃脫了HIV-I感染(Beattie等，2001)。直到18個(gè)月之前他們是血清反應(yīng)陽(yáng)性的，然后發(fā)生血清反應(yīng)逆轉(zhuǎn)。這種高比例的新生嬰兒抵抗HIV感染，排除了可能是由于抗HIV先天性免疫的遺傳因素。有可能的是，對(duì)免疫系統(tǒng)識(shí)別Tat的抑制存在于成年人中但不存在于新生嬰兒中，因?yàn)轸~(yú)精蛋白隨著性成熟出現(xiàn)。應(yīng)該更多地注意在成年人中出現(xiàn)的抗HIV-I天然免疫性。在低比例的人類(lèi)群體中觀察到了針對(duì)HIV-I的天然免疫性，其覆蓋了不同的機(jī)制，從趨化因子突變到產(chǎn)生針對(duì)HIV-I包膜的中和抗體的能力(綜述參見(jiàn)Marmor等，2006)。天然免疫性可以是先天的或獲得的，后者當(dāng)然是疫苗開(kāi)發(fā)最感興趣的。具有針對(duì)HIV-I的天然免疫性的患者可以暴露并持續(xù)血清反應(yīng)陰性(EPS)，或可以是血清反應(yīng)陽(yáng)性和長(zhǎng)期不進(jìn)展者(LTNP)。在大多數(shù)情況下，這種天然免疫性被證明是先天免疫性。但是，存在非常稀少的患者類(lèi)型，他們高度暴露于病毒并顯然由于獲得性免疫性而對(duì)HIV-I有抗性。已經(jīng)對(duì)呈EPS的肯尼亞性工作者進(jìn)行了深入研究，她們對(duì)HIV-I的抗性似乎與她們發(fā)展出針對(duì)HIV-I的有效的CD8T細(xì)胞應(yīng)答的能力相關(guān)(McMichael&Rowland-Jones，2001)。但是，矛盾之處在于，在EPS肯尼亞縫紉工人中的CD8T細(xì)胞應(yīng)答與最終發(fā)展為AIDS的血清反應(yīng)陽(yáng)性的肯尼亞性工作者相比，在量值上低5倍(Alimonti等，2006)。使事情更加費(fèi)解的是，在象牙海岸、越南和柬埔寨的類(lèi)似EPS患者群體中進(jìn)行的研究顯示，他們不具有HIV-I特異性的CD8T細(xì)胞應(yīng)答而是具有自然殺傷(NK)細(xì)胞應(yīng)答(Scott-Algara等，2003Jennes等，2006)、針對(duì)HIV-1包膜蛋白的抗體(Nguyen等，2006)或影響病毒進(jìn)入步驟的細(xì)胞因子(Saez-Cirion等，2006)。盡管認(rèn)為這些肯尼亞EPS患者具有先天性免疫性，但是至少對(duì)于她們中在性工作結(jié)束后變成血清反應(yīng)陽(yáng)性的一部分人來(lái)說(shuō)，已證明它是獲得性免疫性(Kaul等，2001)。更有趣的是在加蓬鑒定到的EPS群體的研究(Huet等，1989)。在非洲，在80年代期間，在被稱為“HautOgooue”的加蓬的邊遠(yuǎn)地區(qū)，發(fā)現(xiàn)了HIV-I感染的患者沒(méi)有發(fā)展出AIDS(Delaporte等，1988)。決定進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查并對(duì)750位妊娠女性進(jìn)行了兩年，其中25位被鑒定為血清反應(yīng)陽(yáng)性(Huet等，1989)。在兩年的調(diào)查期間，從這25位血清反應(yīng)陽(yáng)性女性中，23位發(fā)生血清反應(yīng)逆轉(zhuǎn)并變成EPS。盡管EPS患者通常沒(méi)有可檢測(cè)到的病毒，但能夠從一位名為Oyi的患者在她仍然是血清反應(yīng)陽(yáng)性時(shí)分離和克隆了HIV-I毒株(Huet等，1989)。與其他在第一次暴露于HIV后許多年構(gòu)成的性工作者或藥物濫用者EPS群體相反，加蓬群體是在原發(fā)感染期間構(gòu)成的，這也解釋了為什么能夠克隆到病毒。所有被HIV-IOyi感染的女性發(fā)生了血清反應(yīng)逆轉(zhuǎn)，但是維持了針對(duì)HIV-I的CTL應(yīng)答，并具有針對(duì)PM的抗體(Huet等，1989)。該群體中高比例的EPS表型(92%)表明血清反應(yīng)逆轉(zhuǎn)可能是由于獲得性免疫性而不是先天性免疫性。在該流行病學(xué)調(diào)查發(fā)表后10年，這23位女性健康良好，在她們的血液中不再可以檢測(cè)到HIV-I或感染跡象。此外，與其他中非國(guó)家相比，在加蓬的HIV-I感染似乎非常低(Delaporte等，1996)。HIV-1Oyi具有與常規(guī)HIV-1毒株類(lèi)似的基因，除了tat基因之外，該基因具有在其他Tat變體中從未發(fā)現(xiàn)的突變(Gregoire&Loret，1996)。使用TatOyi進(jìn)行免疫接種，在兔中產(chǎn)生了能夠識(shí)別不同Tat變體、甚至具有高達(dá)38%的突變的變體的抗體，這對(duì)于其他Tat變體是不可能的(Opi等，200。TatOyi表現(xiàn)出誘導(dǎo)了針對(duì)在Tat變體中保守的三維表位的體液免疫應(yīng)答，該體液應(yīng)答可能能夠中和細(xì)胞外Tat。在80年代期間，細(xì)胞外Tat的作用是未知的，因此在該加蓬群體中沒(méi)有檢測(cè)針對(duì)Tat的抗體的存在(Huet等，1989)。使用合成的TatOyi輔以佐劑對(duì)7只恒河獼猴進(jìn)行了免疫接種，然后在TatOyi預(yù)防接種的獼猴和對(duì)照獼猴上進(jìn)行了使用歐洲SHIVBX08的異源激惹。TatOyi預(yù)防接種的獼猴與對(duì)照獼猴相比，具有較低的病毒血癥并伴有CD8T細(xì)胞的升高。此外，在TatOyi預(yù)防接種的獼猴中，在激惹后8周時(shí)不再可以檢測(cè)到SHIV感染的細(xì)胞。有趣的是，注意到了具有最低病毒血癥的獼猴沒(méi)有針對(duì)SHIV包膜蛋白的抗體。對(duì)獼猴再次進(jìn)行激惹，制造了短期的血清反應(yīng)陽(yáng)性和血清反應(yīng)轉(zhuǎn)變(Watkins等，2006)。因此，能夠在獼猴上實(shí)驗(yàn)復(fù)制在對(duì)EPS患者的領(lǐng)域中發(fā)現(xiàn)的情況。重要的是，注意到了該“EPS獼猴”具有可檢測(cè)到的病毒血癥(watkins等，2006)。這是非常有希望的結(jié)果，因?yàn)樗钱愒碨HIV激惹，并且它顯示了顯著降低HIV感染的細(xì)胞的水平是有可能的。該目標(biāo)在HAART治療下的血清反應(yīng)陽(yáng)性患者中從未實(shí)現(xiàn)過(guò)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了在患者中預(yù)防或治療獲得性免疫缺陷綜合征(AIDQ的方法，其中向患者施用能夠刺激針對(duì)Tat蛋白的免疫應(yīng)答的包含氨基酸序列WKHPGSQPKTACNNCYCKRCCLHCQVCFTKKGLGISYGRKKRRQRRRAPQDSKTHQVSLSKQPASQPRGDPTGPKES(SEQIDNO1)的蛋白，或所述蛋白的變體，或編碼所述蛋白或變體的多核苷酸。優(yōu)選，所述蛋白或變體能夠刺激針對(duì)2、3、4或更多種HIV-I亞型的免疫應(yīng)答。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述蛋白或變體能夠刺激針對(duì)選自A、B、C、D、E、F、G、H、J和K的兩種、三種、四種、五種或更多種HIV-I亞型的Tat蛋白的免疫應(yīng)答。最優(yōu)選，所述蛋白或變體能夠刺激針對(duì)五種HIV-I亞型、優(yōu)選為A、B、C、D和E的免疫應(yīng)答。優(yōu)選，所述蛋白包含氨基酸序列MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACNNCYCKRCCLHCQVCFTKKGLGISYGRKKRRQRRRAPQDSKTHQVSLSKQPASQPRGDPTGPKESKKKVERETETDPED(SEQIDNO2)或由該序列構(gòu)成。SEQIDNO:2與W000/61067中描述的HIVOyiTat蛋白的差異在于22位的半胱氨酸，其恢復(fù)了反式激活能力。本文中使用的蛋白表現(xiàn)出Tat的功能活性，即在HeLaP4細(xì)胞分析中能夠進(jìn)行HIV-I基因反式激活(圖4)。7在22位用半胱氨酸取代絲氨酸加強(qiáng)了原始TatOyi序列的免疫原性，正如使用對(duì)TatOyiC22的識(shí)別比對(duì)TatOyiS22更好的100名血清反應(yīng)陽(yáng)性患者群體的血清所顯示的(圖2)。TatOyiCys22的反式激活活性證實(shí)了3D結(jié)構(gòu)是正確的，并允許對(duì)蛋白進(jìn)行表征以用于臨床試驗(yàn)。本發(fā)明的另一個(gè)主題是包含具有反式激活能力的TatOyi蛋白作為活性成分的疫苗，所述TatOyi蛋白在22位上包含半胱氨酸并優(yōu)選選自SEQIDNO:1或SEQIDNO:2。在優(yōu)選實(shí)施方案中，疫苗包含佐劑。本發(fā)明的另一個(gè)主題是對(duì)溫血?jiǎng)游镞M(jìn)行免疫接種的方法，所述方法包含注射有效量的含有SEQIDNO:1或SEQIDNO2中的至少一個(gè)的蛋白和佐劑。該方法可以進(jìn)一步包含確定蛋白是否觸發(fā)了針對(duì)五種或更多種HIV-I亞型的免疫應(yīng)答的步驟，其中蛋白刺激了針對(duì)來(lái)自至少五種HIV-I亞型的Tat蛋白的免疫應(yīng)答。圖1的圖顯示了在三個(gè)群體中抗TatIgG的檢測(cè)，一個(gè)是越南EPS患者(η=25)，第二個(gè)是法國(guó)血清反應(yīng)陽(yáng)性患者(n=100)，第三個(gè)是法國(guó)血清反應(yīng)陰性的未接觸過(guò)抗原的患者(n=20)。在代表了5種主要HIV-I亞型的Tat變體的ELISA滴定曲線中，使用患者血樣觀察了三種類(lèi)型的血清學(xué)圖樣。圖IA顯示了使用來(lái)自越南EPS患者的血清獲得的6種Tat變體的識(shí)別。對(duì)于6種Tat變體來(lái)說(shuō)Tat抗體水平是不相同的，對(duì)于越南患者來(lái)說(shuō)TatCM240被識(shí)別得最好。圖IB顯示了只識(shí)別一種或兩種Tat變體的另一種患者，并主要在法國(guó)血清反應(yīng)陽(yáng)性群體(n=100)中觀察到。圖IC不存在任何Tat變體的識(shí)別(0D低于0.1)，這對(duì)于法國(guó)血清反應(yīng)陰性群體(n=20)來(lái)說(shuō)是典型的，但是一半的法國(guó)血清反應(yīng)陽(yáng)性群體和三分之一的越南EPS群體也是同樣。圖2的圖顯示了用法國(guó)血清反應(yīng)陽(yáng)性群體(η=100)的血清的識(shí)別7種Tat變體。Tat變體代表來(lái)自HIV-I亞型A(Ugl1RP)、B(ΗΧΒ2)、C(96BW),D(Eli)和E(CM240)，對(duì)應(yīng)于字母Α、B、C、D和Ε。字母0對(duì)應(yīng)于TatOyiSer22,0c22對(duì)應(yīng)于TatOyiSer220該實(shí)驗(yàn)顯示，Cys22突變不改變TatOyi的識(shí)別，而是增強(qiáng)了原始TatOyi序列的免疫原性。這肯定是由于與Tat野生型更相似的半胱氨酸區(qū)域。Sl顯示了來(lái)自在分析HPLC中在25分鐘處具有單峰的純化的亞級(jí)份的等份試樣的質(zhì)譜圖。觀察到的分子量(MW)幾乎完全對(duì)應(yīng)于TatOyiCys22的預(yù)計(jì)分子量11578。純化是成功的，沒(méi)有分子量低于或高于11578的痕量肽。5784.5處的峰對(duì)應(yīng)于11575處的峰的暗影峰(shadowpeak)(質(zhì)量除以2)。Si的圖顯示了使用HIVLTR轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞進(jìn)行的反式激活分析。使用細(xì)胞培養(yǎng)物分析法，使用帶有HIVLTR控制下的細(xì)菌Iac-Z基因的HeLaP4細(xì)胞測(cè)試了合成的TatOyiCys22的生物學(xué)活性?；钚訲at蛋白能夠跨過(guò)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜并“反式激活”IacZ基因，正如通過(guò)β-半乳糖苷酶的細(xì)胞質(zhì)積累所顯示的。將&105個(gè)細(xì)胞/孔在M孔板中、在37°C和5%CO2下、在補(bǔ)充10%胎牛血清的Dulbecco修改的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中溫育。在M小時(shí)后將細(xì)胞用PBS洗滌，并加入用補(bǔ)充0.01%魚(yú)精蛋白(Sigma)和0.1%牛血清白蛋白(Sigma)的DMEM稀釋的Tat蛋白。測(cè)試了一種濃度的兩種Tat蛋白(500nM),以便驗(yàn)證β-半乳糖苷酶的水平對(duì)于細(xì)胞外Tat是劑量依賴性的。在37°C、5%CO2下16小時(shí)后，將細(xì)胞用PBS洗滌并裂解。提取蛋白，使用可商購(gòu)的抗原捕獲酶聯(lián)免疫吸附分析(β-半乳糖苷酶ELISA，RocheMolecularBiochemicals)測(cè)量β-半乳糖苷酶含量。在405nm處測(cè)量吸光值。Ml顯示了TatOyiSer22和TatOyiCys22的圓二色性(CD)光譜。在20°C下、在20mMpH4.5的磷酸緩沖液存在下，在JASCOCorp.的J-810分光偏振儀(日本)上使用10(^111程長(zhǎng)，在沈0-17811111范圍內(nèi)記錄了⑶光譜。使用步進(jìn)式自動(dòng)響應(yīng)程序(JASCO)，以0.5nm的間隔收集數(shù)據(jù)。⑶光譜被顯示為每個(gè)酰胺的Δε。蛋白濃度對(duì)于TatOyiSer22來(lái)說(shuō)是lmg/ml，對(duì)于TatOyiCys22來(lái)說(shuō)是0.;3mg/ml。兩個(gè)CD光譜是相同的，顯示出cyS2ker突變沒(méi)有誘導(dǎo)可以被⑶檢測(cè)到的變化?！鲲@示了iTatOyiCys22的分子建模。分子建模使用hsightII2002軟件包進(jìn)行，該軟件包包括生物聚合物、發(fā)現(xiàn)和同源性軟件(Biopolymer，DiscoverandHomology)(Accelrys，SanDiego,CA)建立了對(duì)應(yīng)于TatOyiSer22(數(shù)據(jù)未顯示)和TatOyiCys22的兩個(gè)模型。模型從TatEli的NMR結(jié)構(gòu)(Watkins等，2008)使用CV力場(chǎng)和共軛梯度算法以進(jìn)行能量最小化而獲得。兩個(gè)模型是相同的，cys22ser突變沒(méi)有誘導(dǎo)可以從分子建模推演出的變化。有趣的是觀察到了含有Glu100突變的C-末端非常接近于在Tat變體中具有最保守序列的區(qū)域3和4。發(fā)明詳述本發(fā)明人觀察到，對(duì)HIV感染有抗性的患者(越南EPS患者)能夠識(shí)別代表5種主要HIV-I亞型的Tat變體(圖1A)。這些結(jié)果顯示了有能力交叉識(shí)別不同Tat變體的Tat抗體能夠恢復(fù)針對(duì)HIV的有效細(xì)胞免疫應(yīng)答。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了在患者中預(yù)防或治療獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的方法，其中給患者施用能夠刺激針對(duì)Tat蛋白的免疫應(yīng)答的包含氨基酸序列SEQIDN01或2的蛋白，或所述蛋白的變體。優(yōu)選，蛋白能夠刺激針對(duì)兩種、三種、四種或更多種HIV-I亞型的免疫應(yīng)答。最優(yōu)選，蛋白能夠刺激針對(duì)來(lái)自至少5種HIV-I亞型的Tat變體的免疫應(yīng)答。在優(yōu)選實(shí)施方案中，給患者施用包含氨基酸序列SEQIDNO:2的蛋白，最優(yōu)選由氨基酸序列SEQIDNO2構(gòu)成的蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，給患者施用包含序列SEQIDN0:1或2的截短形式的蛋白。例如，蛋白可以在N-末端被截短1到10個(gè)氨基酸、優(yōu)選1到8個(gè)、優(yōu)選1到6個(gè)、優(yōu)選1到4個(gè)、優(yōu)選1或2個(gè)氨基酸。也可以給患者施用包含在C-末端被截短了1到14個(gè)氨基酸、優(yōu)選1到12個(gè)、優(yōu)選1到10個(gè)、優(yōu)選1到8個(gè)、優(yōu)選1到6個(gè)、優(yōu)選1到4個(gè)、優(yōu)選1或2個(gè)氨基酸的氨基酸序列SEQIDNO:1或2的蛋白。被施用的蛋白可以是源自于SEQIDNO:1或SEQIDNO2的變體。優(yōu)選，蛋白變體與SEQIDNO:1或SEQIDNO2的差異在于保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是同類(lèi)別氨基酸之間的取代。這些類(lèi)別包括例如具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸，例如天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸；具有堿性側(cè)鏈的氨基酸，例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有酸性側(cè)鏈的氨基酸，例如天冬氨酸和谷氨酸；以及具有非極性側(cè)鏈的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸。優(yōu)選，能夠刺激針對(duì)優(yōu)選來(lái)自至少5種HIV-I亞型的Tat蛋白的免疫應(yīng)答的蛋白變體，顯示出與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2至少80%、優(yōu)選至少85%、優(yōu)選至少90%、優(yōu)選至少95%的同一性。同源性或同一性使用序列分析軟件、例如威斯康星大學(xué)生物技術(shù)中心遺傳學(xué)計(jì)#1/1SΡΛWii^lJ/Γ^^^(SequenceAnalysisSoftwarePackageoftheGeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter),1710UniversityAvenue,Madison,WI53705來(lái)測(cè)量。將氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)以最大化同一性。可以在序列中人工導(dǎo)入間隙以獲得適合的比對(duì)。一旦建立起最佳的比對(duì)，就通過(guò)相對(duì)于位置的總數(shù)記錄其中兩個(gè)序列的氨基酸相同的所有位置，建立起同源性或同一性的程度。要施用的蛋白變體也可以包含化學(xué)修飾，例如將肽鍵修飾成假肽鍵。術(shù)語(yǔ)“假肽鍵”是指與參比肽相似的化合物，但是其中一個(gè)或多個(gè)肽鍵一CO--NH-被與肽鍵等效的被稱為假肽鍵的鍵取代，所述假肽鍵例如一CH2—NH-,-CH2—S—,-CH2—0—,—CO—CH2—C0—、一CH2—CH2_。術(shù)語(yǔ)“變體”還包含一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被不是天然氨基酸的化學(xué)殘基取代。也包含了被L-氨基酸的取代。在本發(fā)明的另一方面，蛋白通過(guò)其C-端末端或賴氨酸殘基共價(jià)鍵合到聚乙二醇(PEG)分子、特別是1500或4000MW的PEG上，以降低尿清除率和使用的治療劑量，并增加在血漿中的半衰期。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將蛋白包含在用于藥物投送系統(tǒng)的生物可降解和生物相容聚合物材料中形成微球來(lái)增加蛋白的半衰期。聚合物和共聚物是例如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)(正如在SoonKapHahn等的US2007/0184015中所描述)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白連接到載體上或與載體結(jié)合。載體在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是公知的(Plotkin，1999)。細(xì)菌載體(即源自于細(xì)菌的載體)包括但不限于霍亂毒素B亞基(CTB)、白喉毒素突變體(CRM197)、白喉類(lèi)毒素、B型鏈球菌αC蛋白、腦膜炎球菌外膜蛋白(OMPC)、破傷風(fēng)類(lèi)毒素、不能分型的流感嗜血桿菌的外膜蛋白(例如Ρ6)、Β型腦膜炎球菌的重組3類(lèi)膜孔蛋白(rPorB)、熱殺死的單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)禾口f同綠1叚單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)重組夕卜蛋白Α。另——禾中載體是匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)。源自病毒的載體的例子在本
技術(shù)領(lǐng)域：
是公知的，包括乙型肝炎表面抗原(HBsAg)粒子和乙型肝炎核心抗原(HBcAg)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，能夠刺激針對(duì)Tat蛋白、優(yōu)選來(lái)自至少5種HIV-I亞型的Tat蛋白的免疫應(yīng)答的蛋白變體，能夠起到反式激活作用。有利地，蛋白變體能夠刺激針對(duì)來(lái)自HIV-I亞型A、B、C、D和E的Tat蛋白的免疫應(yīng)答(E亞型HIV毒株主要在東南亞觀察到，但是通常被認(rèn)為是A亞型毒株的重組形式)。蛋白或變體可以是重組蛋白或優(yōu)選為化學(xué)合成的蛋白，其可以以固相合成并優(yōu)選以快速FMOC策略進(jìn)行合成。當(dāng)?shù)鞍淄ㄟ^(guò)化學(xué)合成生產(chǎn)時(shí)，本發(fā)明的多肽可以合成為單一序列的形式，或?yàn)閹讉€(gè)序列然后彼此連接的形式?；瘜W(xué)合成可以在固相或溶液中進(jìn)行，這兩種合成技術(shù)對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員來(lái)說(shuō)都是熟知的。這些技術(shù)具體描述在Atherton和證印ard的“《固相肽合成》(Solidphasepeptidesynthesis)，，(IRLpressOxford，1989)，和Houbenweyl在Ε.Wunsch出版的"《有機(jī)化學(xué)方法》Vol.15-1和II中(MethodenderorganischenChemie,[MethodsinOrganicChemistry],Vol.15-1andII),Stuttgart,1974,以及下列在此以其全文引為參考的文章中:PEDawson等(Science1994；266(5186):776-9)；GGKochendoerfer等(1999;3(6):665-71)；etPEDawson等，Annu.Rev.Biochem.2000;69923-60。蛋白也可以使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員公知的遺傳工程技術(shù)來(lái)生產(chǎn)。當(dāng)?shù)鞍淄ㄟ^(guò)遺傳工程生產(chǎn)時(shí)，它在NH2-末端包含對(duì)應(yīng)于第一個(gè)起始密碼子翻譯的附加的甲硫氨酸殘基。這些技術(shù)詳細(xì)描述在Maniatis等的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(MolecularCloning:amolecularmanual),ColdSpringHarbor,1989中。蛋白可以進(jìn)而以純化的形式獲得，即以表現(xiàn)出至少80%、85%、90%、95%或更高的純度的形式。純度相對(duì)于混合物中存在的被認(rèn)為是污染物的其他蛋白而定義。該純度使用考馬斯亮藍(lán)、通過(guò)SDS-PAGE的比色測(cè)定來(lái)評(píng)估。條帶的密度測(cè)量值能夠?qū)兌冗M(jìn)行定量。純度也可以通過(guò)反相HPLC，通過(guò)計(jì)算各種峰的面積來(lái)測(cè)量?？梢允褂脦追N類(lèi)型的治療性組合物來(lái)引發(fā)針對(duì)來(lái)自至少5種HIV-I亞型的Tat蛋白的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的主題是藥物組合物，其包含其能夠刺激針對(duì)Tat蛋白、優(yōu)選來(lái)自至少5種HIV亞型的Tat蛋白的免疫應(yīng)答的含有氨基酸序列SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的蛋白或所述蛋白的變體，與可藥用載體的組合。被建議適合用作疫苗的免疫原性組合物，最容易可以直接從以本文所公開(kāi)的方式制備的免疫原性iTatOyiCys22蛋白和/或肽(例如SEQIDNO.:1、2或SEQIDNO.:1或2的片段)制備。優(yōu)選，抗原性材料被徹底透析以除去不想要的小分子量分子，和/或冷凍干燥以便更方便地配制在所需介質(zhì)中。含有肽序列作為活性成分的疫苗的制備在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中已被普遍了解，由美國(guó)專利證書(shū)4，608，251,4,601，903,4,599，231,4,599，230,4,596，792和4.578，770所示例。典型地，這樣的疫苗被制備成可注射液作為溶液或懸液，也可以制備適合于在注射前溶解或懸浮在液體中的固體形式。制備物也可以被乳化?；钚悦庖咴猿煞滞ǔＥc可藥用并與活性成分相容的賦形劑混合。適合的賦形劑是例如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其組合。此外，如果需要，疫苗可以包含少量輔助性物質(zhì)例如潤(rùn)濕劑或乳化劑、PH緩沖劑或增強(qiáng)疫苗有效性的佐劑。疫苗常規(guī)可以通過(guò)注射例如皮下或肌肉內(nèi)注射來(lái)腸胃外給藥。適合于其他給藥方式的其他制劑包括栓劑、以及在某些情況下的口服制劑。對(duì)于栓劑來(lái)說(shuō)，傳統(tǒng)的粘合劑和載體可以包括例如聚亞烷二醇或甘油三酯這樣的栓劑可以從含有0.5%到10%、優(yōu)選1-2%活性成分的混合物形成。口服制劑包括常用賦形劑例如藥用級(jí)甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物采用溶液、懸液、片劑、丸劑、膠囊、持續(xù)釋放制劑或粉末的形式，并包含10-95%、優(yōu)選25-70%的活性成分。蛋白可以作為中性或鹽形式配制成疫苗?？伤幱名}包括酸加成鹽(與肽的游離氨基形成)，以及與無(wú)機(jī)酸例如鹽酸或磷酸或者有機(jī)酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的鹽。與游離羧基形成的鹽也可以源自于無(wú)機(jī)堿例如氫氧化鈉、鉀、銨、鈣或鐵，以及有機(jī)堿例如異丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。疫苗以與劑型相容的方式、并以例如治療有效和免疫原性的量給藥。給藥量取決11于待治療的對(duì)象，包括例如個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力以及所需的保護(hù)程度。需要給藥的活性成分的精確量取決于醫(yī)師的判斷。但是，適合的劑量范圍在每次接種幾百毫克活性成分的量級(jí)。用于初次給藥和加強(qiáng)針的適合方案也是可變的，但是典型為在初次給藥繼以后續(xù)接種或其他給藥。施用方式可以廣泛變化。任何用于疫苗給藥的常規(guī)方法都是適用的。它們被認(rèn)為包括了在生理可接受固體基質(zhì)上口服施用，或在生理可接受的分散相中通過(guò)注射等腸胃外施用。疫苗的劑量將取決于給藥途徑，并將隨著宿主的大小而變。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物還包含佐劑。佐劑可以選自能夠促進(jìn)或增加蛋白的免疫原性的任何物質(zhì)、混合物、溶質(zhì)或組合物，所述蛋白包含氨基酸序列SEQIDNO1或SEQIDNO:2或其變體，其中佐劑能夠增強(qiáng)免疫應(yīng)答。佐劑的實(shí)例優(yōu)選包括磷酸鈣，但是也包括ALUM磷酸鹽、ALUM氫氧化物、MontanideCpG、QS21、ISCOM或單磷酰脂A。疫苗實(shí)現(xiàn)佐劑效應(yīng)的其他方法包括使用試劑例如氫氧化鋁或磷酸鋁(alum)，通常作為0.05到0.的磷酸緩沖鹽水溶液使用，與作為0.25%溶液使用的合成的糖類(lèi)聚合物(卡波普)混合，通過(guò)在70°C到lOrC之間的溫度下分別熱處理30秒到2分鐘的時(shí)間，使疫苗中的蛋白聚集。也可以使用通過(guò)用胃蛋白酶處理過(guò)的針對(duì)白蛋白的抗體(Fab)重新激活進(jìn)行聚集，與細(xì)菌細(xì)胞例如微小隱孢子蟲(chóng)(C.parvum)或革蘭氏陰性細(xì)菌的內(nèi)毒素或脂多糖組分進(jìn)行混合，在生理可接受的油介質(zhì)例如二縮甘露醇一油酸(AracelA)中乳化或用20%的全氟化碳(Fluosol-DA)溶液作為區(qū)段替代物進(jìn)行乳化。在許多情況下，希望進(jìn)行多次疫苗給藥，通常不超過(guò)6次疫苗接種、更通常不超過(guò)4次疫苗接種、優(yōu)選為一次或多次、通常至少約3次疫苗接種。疫苗接種一般將以2到12周的間隔、更通常3到5周的間隔進(jìn)行。為了維持抗體的保護(hù)水平，將需要以1-5年、通常3年的間隔期定期加強(qiáng)。免疫接種的過(guò)程后可以進(jìn)行抗原的抗體分析。本發(fā)明的蛋白組合物可以使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員已知的任何常規(guī)方法制備。通常情況下，將蛋白與可藥用稀釋劑或賦形劑例如水或磷酸緩沖鹽水溶液混合。賦形劑或稀釋劑的選擇取決于所選的藥物形式、給藥的方法和途徑以及藥學(xué)實(shí)踐。適合的賦形劑或稀釋劑以及在藥物制劑方面的要求，詳細(xì)描述在《Remington藥物學(xué)》(Remington'sPharmaceuticalSciences)中,其代表了本
技術(shù)領(lǐng)域：
的參考著作。另一種藥物組合物包含氨基酸序列SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或其如上所定義的變體的編碼多核苷酸。這樣的藥物組合物通過(guò)例如注射施用于宿主(稱為DNA疫苗接種)，并且所述核酸在體內(nèi)表達(dá)Tat多肽。這樣的DNA疫苗通常由質(zhì)粒載體構(gòu)成。已經(jīng)顯示，投送裸露的DNA效率很低，通常需要一些載體來(lái)改進(jìn)DNA投送和攝取到細(xì)胞內(nèi)。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了兩種類(lèi)型的載體(1)病毒載體(腺病毒、慢病毒、麻疹病毒)，或⑵非病毒載體例如聚合物(特別是陽(yáng)離子聚合物)、被囊的DNA(脂質(zhì)體，包含陽(yáng)離子脂類(lèi)，其與聚陰離子例如DNA和RNA自發(fā)并快速相互作用，產(chǎn)生脂質(zhì)體/核酸復(fù)合物)或與金微粒相連的DNA。此外，可以有利地使用輔助細(xì)胞攝取核酸的試劑，例如鈣離子、細(xì)菌蛋白、病毒蛋白和其他轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑。上面提到的組合物可以通過(guò)在疫苗領(lǐng)域經(jīng)常使用的任何常規(guī)途徑給藥，例如腸胃外(靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)，皮下等)途徑。在本發(fā)明的情況下，對(duì)于可注射組合物來(lái)說(shuō)優(yōu)選使用肌肉內(nèi)給藥。這樣的給藥可以有利地在大腿或手臂肌肉中進(jìn)行。本發(fā)明的組合物也可以有利地進(jìn)行口服給藥。在本發(fā)明的情況下，還可以推薦通過(guò)鼻、陰道或直腸粘膜給藥。給藥也可以通過(guò)給予單劑，或例如在DO和1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月和12個(gè)月時(shí)給予重復(fù)劑量而進(jìn)行。優(yōu)選使用加強(qiáng)針在JO和1個(gè)月和3個(gè)月時(shí)進(jìn)行注射，其周期性可以由治療醫(yī)師容易地確定。一般來(lái)說(shuō)，每劑將包含約5μg到約500μg蛋白、優(yōu)選在10到200μg之間。更優(yōu)選的劑量可以是約50μg蛋白作為免疫原。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員也可以考慮其他的劑量范圍。在需要時(shí)，起始劑量后可以任選跟有重復(fù)的加強(qiáng)。本發(fā)明還打算覆蓋用作醫(yī)藥產(chǎn)品、特別是用作針對(duì)HIV感染的預(yù)防性或治療性疫苗的藥物組合物。根據(jù)優(yōu)選方面，本發(fā)明的主題是使用本文所述的蛋白或編碼所述蛋白的多核苷酸對(duì)人體進(jìn)行免疫接種。因此，本發(fā)明優(yōu)選涉及施用所述多肽或多核苷酸以便誘導(dǎo)特異性體液應(yīng)答的方法。進(jìn)而，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)HIV中和抗體的方法，所述方法包含施用足以誘導(dǎo)所述體液應(yīng)答的量的如上所定義的藥物組合物?！疤禺愋泽w液應(yīng)答”的表達(dá)打算是指這樣的應(yīng)答，所述應(yīng)答包含產(chǎn)生特異性針對(duì)在Tat變體之間非常保守的表面的抗體。特異性抗體的產(chǎn)生可以使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員公知的常規(guī)技術(shù)，例如ELISA、RIA或western印跡容易地確定。本文中使用的Tat蛋白和變體，對(duì)于開(kāi)發(fā)能夠用于保護(hù)和/或治療大量或甚至所有具有HIV風(fēng)險(xiǎn)或感染HIV的個(gè)體的疫苗，是有價(jià)值的候選物。如果沒(méi)有進(jìn)行抗病毒治療的血清反應(yīng)陽(yáng)性患者的病毒血癥降低、淋巴細(xì)胞CD4細(xì)胞升高和/或淋巴細(xì)胞CD8細(xì)胞含量降低，即可認(rèn)定治療效果。更具體來(lái)說(shuō)，當(dāng)至少55位HIV血清反應(yīng)陽(yáng)性的患者群體的30%在中斷他們的HAART治療6個(gè)月后，將他們的病毒血癥維持在50個(gè)拷貝/ml以下時(shí)，即可認(rèn)定治療效果。在患有確定的AIDS的患者中，這樣的抗Tat疫苗能夠限制某些病理狀況的發(fā)病率，所述病理狀況例如卡波濟(jì)氏(Kaposi's)肉瘤或似乎與Tat蛋白在被HIV感染的細(xì)胞分泌后的直接作用相關(guān)的神經(jīng)綜合征。在無(wú)癥狀的患者中，本發(fā)明的藥物組合物由于降低病毒血癥、升高淋巴細(xì)胞⑶4細(xì)胞和/或降低淋巴細(xì)胞CD8細(xì)胞含量，預(yù)計(jì)將延遲朝向AIDS的發(fā)展。這樣的疫苗將允許患者恢復(fù)針對(duì)HIV感染細(xì)胞的有效的免疫細(xì)胞應(yīng)答，而看起來(lái)在感染發(fā)作時(shí)情況不是這樣。具體來(lái)說(shuō)，恢復(fù)其活性被Tat抑制的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活性。疫苗接種因此將具有使患者變成至少不進(jìn)展者的結(jié)果。在本文中提供了用于消除HIV感染的細(xì)胞并提供針對(duì)AIDS的治愈性治療的疫苗接種。附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，但不限制其范圍。實(shí)施例材料與方法蛋白合成。Tat蛋白按照Barany和Merrifield(1980)的方法，在自動(dòng)合成儀(ABI433A,PerkinElmer,AppliedBiosystemInc.)上，在預(yù)先裝載HMP的樹(shù)脂(0·5-0.65mmol)(PerkinElmer,AppliedBiosystemInc.,ForsterCity,CA)上進(jìn)行組裝。使用HIVLTR轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞進(jìn)行反式激活分析。使用細(xì)胞培養(yǎng)物分析法，使用帶有HIVLTR控制下的細(xì)菌Iac-Z基因的HeLaP4細(xì)胞測(cè)試了合成的TatOyiCys22的生物學(xué)活性。活性Tat蛋白能夠跨過(guò)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜并“反式激活”lacZ基因，正如通過(guò)β-半乳糖苷酶的細(xì)胞質(zhì)積累所顯示的。在37°C和5%CO2下，將2xl05個(gè)細(xì)胞/孔在M孔板中補(bǔ)充有10%胎牛血清的Dulbecco修改的fegle培養(yǎng)基(DMEM)中溫育。在M小時(shí)后將細(xì)胞用PBS洗滌，并加入用補(bǔ)充0.01%魚(yú)精蛋白(Sigma)和0.牛血清白蛋白(Sigma)的DMEM稀釋的Tat蛋白。測(cè)試了一種濃度的兩種Tat蛋白(500nM)，以便驗(yàn)證β-半乳糖苷酶的水平對(duì)于細(xì)胞外Tat是劑量依賴性的。在37°C、5%CO2下16小時(shí)后，將細(xì)胞用PBS洗滌并裂解。提取蛋白，使用可商購(gòu)的抗原捕獲酶聯(lián)免疫吸附分析(β-半乳糖苷酶ELISA，RocheMolecularBiochemicals)測(cè)量β-半乳糖苷酶含量。在405nm處測(cè)量吸光度值。圓二色性(CD)在20°C下、在20mMpH4.5的磷酸緩沖液存在下，在JASCOCorp.的J-810分光偏振儀(日本)上使用IOOym程長(zhǎng)，在沈0-17811111范圍內(nèi)記錄了⑶光譜。使用步進(jìn)式自動(dòng)響應(yīng)程序(JASCO)，以0.5nm的間隔收集數(shù)據(jù)。CD光譜被顯示為每個(gè)酰胺的Δε。分子建模分子建模使用hsightII2002軟件包進(jìn)行，該軟件包包括生物聚合物、發(fā)現(xiàn)禾口同源性軟件(Biopolymer,DiscoverandHomology)(Accelrys,SanDiego,CA)。模型從TatEli的NMR結(jié)構(gòu)(Watkins等，2008)、使用CV力場(chǎng)和共軛梯度算法進(jìn)行能量最小化而獲得。人類(lèi)血清。暴露的持續(xù)血清反應(yīng)陰性(EPS)患者(n=25)是越南靜脈內(nèi)藥物濫用者(IDU)，他們通過(guò)共用針頭高度暴露于HIV-I感染的風(fēng)險(xiǎn)并從1996年起跟蹤(Truong等，200，并提供了他們對(duì)科學(xué)研究的同意書(shū)(Tran等，2006)。法國(guó)人類(lèi)血樣從一組20位HIV-I血清反應(yīng)陰性和100位HIV-I血清反應(yīng)陽(yáng)性的高加索人患者獲得。它們?cè)贛arseille的醫(yī)院中心收集。大多數(shù)HIV-I血清反應(yīng)陽(yáng)性患者處于抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)下。征集的法國(guó)血清反應(yīng)陰性群體參加者被告知了研究的目的(根據(jù)1975年發(fā)布并在1983年修訂的赫爾辛基宣言)。所有血樣在每個(gè)群體的本國(guó)收集并冷凍。ELISA分析。人類(lèi)或小鼠血清中的抗tat抗體通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、使用MaxisorpU96免疫板(Nunc)進(jìn)行。在4°C下，將板用pH4.5的IOOmM磷酸緩沖液稀釋的每種Tat變體以0.5μg/孔包被16小時(shí)。目前，在世界上存在5種主要的HIV-I亞型A和C亞型是優(yōu)勢(shì)的(72%)并主要在非洲、印度和南美發(fā)現(xiàn)；B亞型(10%)主要在歐洲和北美發(fā)現(xiàn)；D亞型主要在非洲發(fā)現(xiàn)，E亞型(現(xiàn)在被描述為重組形式CRF01AE)主要在東南亞發(fā)現(xiàn)(Hemelaar等，2006)。Tat的變異性符合這種地理多樣性，在來(lái)自HIV_1A、B、C、D和E亞型的Tat變體中觀察到了高達(dá)40%的突變，它們不改變Tat活性但是影響Tat的免疫性質(zhì)(Opi等，2002，2004)。這是我們使用TatUgIlRPJatHXB2、Tat92Br、TatEli和TatCM240代表HIV-1A、B、C、D和E亞型的原因。這5種合成的蛋白具有Tat生物活性，其大小為99到101個(gè)殘基，是目前本領(lǐng)域中Tat的優(yōu)勢(shì)形式(Jeang等，1999)。在同一板上將TatOyiCys22和TatOyiSer22的識(shí)別與這5種Tat變體進(jìn)行了比較。然后將板在室溫下與200μ1補(bǔ)充有2%牛奶的PBS溫育1小時(shí)。加入用補(bǔ)充有0.2%牛奶的PBS不同稀釋的血清(一塊板用一種血清)，并在室溫下輕輕搖動(dòng)1小時(shí)。向每個(gè)孔加入在補(bǔ)充2%牛奶的PBS中11000稀釋的第二抗體(來(lái)自Sigma的抗人或抗小鼠IgG過(guò)氧化物酶)，并在室溫下輕輕搖動(dòng)1小時(shí)。在每個(gè)后續(xù)步驟之間將板用200μ1IXPBS/0.05%吐溫20(Genaxis)洗滌3次。向每個(gè)孔加入100μ1ABTS(來(lái)自Sigma的2，2’-連氮基-雙-3-乙基苯并-噻唑啉-6-磺酸)進(jìn)行顯色，吸光度在EL800通用微孔板讀板器(BIO-TEKINSTRUMENT，INC)上在405nm處讀取。實(shí)施例1來(lái)自越南EPS患者的血清能夠識(shí)別來(lái)自5種主要HIV-I亞型的Tat變體，包括iTatOyi。在EPS患者中檢測(cè)的抗TatIgG我們能夠在越南EPS患者群體中檢測(cè)Tat抗體。我們使用代表5種主要HIV-I亞型的Tat變體、包括TatOyi，在三個(gè)群體上進(jìn)行了ELISA測(cè)試，一個(gè)群體是越南EPS患者(n=25)，第二個(gè)是法國(guó)血清反應(yīng)陽(yáng)性患者(n=100)，第三個(gè)是法國(guó)血清反應(yīng)陰性未接觸過(guò)抗原的患者(η=20)。在ELISA測(cè)試中觀察到了三種類(lèi)型的血清學(xué)圖樣(圖1)。第一種圖樣的特征在于特異性識(shí)別(0D高于0.1)所有Tat變體，并只在EPS群體(η=25)中觀察到。圖IA顯示了使用來(lái)自越南EPS患者的血清獲得的6種Tat變體的識(shí)別。對(duì)于6種Tat變體來(lái)說(shuō)Tat抗體的水平是不同的，并且來(lái)自HIV-1〇1240的1~站(01燈等，1996)被該患者識(shí)別得最好。第二種血清學(xué)圖樣的特征在于不存在對(duì)至少一種Tat變體的特異性識(shí)別，并主要在血清反應(yīng)陽(yáng)性群體(η=100)中觀察到。圖IB顯示了使用來(lái)自法國(guó)血清反應(yīng)陽(yáng)性患者的血清獲得的僅僅一種Tat變體的識(shí)別。血清反應(yīng)陽(yáng)性患者能夠識(shí)別一種以上Tat變體，但是不能識(shí)別所有Tat變體(Campbell等，2007)。第三種血清學(xué)圖樣是不識(shí)別任何Tat變體，其特征在于OD低于0.1。圖IC顯示了使用來(lái)自法國(guó)血清反應(yīng)陰性患者的血清獲得的沒(méi)有Tat變體的識(shí)別。在所有未接觸過(guò)抗原的法國(guó)血清反應(yīng)陰性患者群體的志愿者中觀察到了這種血清學(xué)圖樣，但是也在一半的法國(guó)血清反應(yīng)陽(yáng)性患者和三分之一的越南EPS群體中觀察到(數(shù)據(jù)未顯示)。有趣的是，注意到了TatCM240在越南群體中被識(shí)別得最好，其次是TatOyi，如圖IA中所示。TatCM240是越南特有的HIV-IE亞型的代表(Lan等，2003)。TatOyi在這些越南患者中的良好識(shí)別顯示出TatOyi的特異性免疫特征。在血清反應(yīng)陽(yáng)性患者中沒(méi)有觀察到6種Tat變體的交叉識(shí)別與EPS患者的主要差異顯示在圖IB中。只有一半的患者具有Tat抗體，并且它們的血清一般能夠識(shí)別一種或兩種Tat變體(圖1B)。該結(jié)果與使用烏干達(dá)血清反應(yīng)陽(yáng)性患者群體時(shí)觀察到的非常相似(Campbell等，2007)。但是，該研究的設(shè)計(jì)是不同的，因?yàn)樵诜▏?guó)血清反應(yīng)陽(yáng)性群體中在一年內(nèi)進(jìn)行了5次采血。非常有趣的是注意到針對(duì)Tat的抗體在某些患者中可消失，并且當(dāng)他們?cè)俅尉哂嗅槍?duì)Tat的抗體時(shí)，是所識(shí)別的相同的Tat變體(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。大多數(shù)法國(guó)血清反應(yīng)陽(yáng)性患者(75%)被B亞型HIV-I毒株感染，并且75%有效識(shí)別iTatHXB2、TatOyiSer22或TatOyiCys22。但是，有趣的是觀察到iTatOyi比TatHXB2識(shí)別得更好，盡管TatHXB2序列與歐洲B亞型Tat變體具有最接近的同源性。EPS越南人群體的情況相同，這些結(jié)果證實(shí)了TatOyi的特異性免疫特征。我們預(yù)計(jì)，Ser/cys22突變將不會(huì)改變TatOyi的免疫識(shí)別。這被法國(guó)血清反應(yīng)陰性群體所證實(shí)，因?yàn)镃ys22突變不改變TatOyi的識(shí)別。有趣的是，可能是由于富含半胱氨酸區(qū)域與野生型Tat變體的同源性，觀察到TatOyiCys22的識(shí)別甚至比TatOyiS22更好。在法國(guó)血清反應(yīng)陽(yáng)性群體中，TatUgIlRP和TatCM240的滴定曲線通常是相同的15(數(shù)據(jù)未顯示)。這表明在這兩種變體中相似的表位被識(shí)別，并人為地增加了識(shí)別這兩種變體的患者的數(shù)量。在越南EPS患者中，正如圖IA所示，TatUgIlRP和TatCMMO的滴定曲線是不同的，其中頂部的曲線是iTatCM240所致。這表明在越南人中，TatCM240和E亞型Tat變體存在另一個(gè)共有的表位。對(duì)于越南和法國(guó)患者二者來(lái)說(shuō)，TatOyi與TatHXB2之間的滴定曲線也通常是相同的(數(shù)據(jù)未顯示)。圖1和圖2顯示在Tat變體之間不存在共同表位，因?yàn)槲覀兊腅lisa測(cè)試幾乎總是可以鑒定出感染患者的HIV-I亞型。因此，EPS患者中TatIgG抗體的檢測(cè)可能是由于不屬于HIV-I的病原體的感染這一可能性，是非常不可能的。討論TatOyi(101個(gè)殘基)具有在來(lái)自快速進(jìn)展者患者的Tat變體中從未發(fā)現(xiàn)過(guò)的突變(Gr6goire&Loret，1996)，并且我們推測(cè)這些突變使得I^tOyi能夠具有對(duì)應(yīng)于Tat變體中非常保守的區(qū)域的3D表位(Opi等，2002，Watkins等，2006)。因此，TatOyi在越南EPS群體中被非常好地識(shí)別，并且這種識(shí)別不能用與TatHXB2的共同表位來(lái)解釋，這是令人吃驚的。該研究顯示，來(lái)自在泰國(guó)患者中鑒定到的HIV-ICM240的Tat(Carr等，1996)在越南EPS患者中識(shí)別得最好。HIV-ICM240在東南亞是典型的，該結(jié)果表明在EPS中可能發(fā)生了針對(duì)Tat的獲得性體液應(yīng)答，并可能是他們盡管多次暴露但仍對(duì)HIV-I有抗性的原因。在該EPS越南群體中，對(duì)于⑶4-GP120復(fù)合體也觀察到了特異性體液應(yīng)答(Lopalco等，2005)。該EPS越南群體具有與歐洲患者的EPS群體相似的HIV-I免疫性征兆(Lopalco等，2005)，并且TatCM240的識(shí)別證實(shí)了EPS越南患者被HIV感染過(guò)并成功地抵抗了HIV-I感染。另一方面，顯示出三分之一的EPS患者沒(méi)有可檢測(cè)的Tat抗體，他們對(duì)HIV的抗性不是由于Tat抗體(數(shù)據(jù)未顯示)。最近在這個(gè)完全相同的越南EPS群體中鑒定到了先天性免疫性，其中5位患者在他們的CD4淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子中具有影響HIV進(jìn)入步驟的突變(Saez-Cirion等，2006)。有趣的是了解到這些患者中的一位屬于在本研究中不識(shí)別Tat的EPS。在血清反應(yīng)陽(yáng)性患者的血清中已檢測(cè)到Tat抗體，并觀察到了其與長(zhǎng)期不進(jìn)展者(LTNP)狀態(tài)的關(guān)聯(lián)性Gagury等，1998；Re等，2001Belliard等，200。在這些研究中使用了變性的Tat變體或肽，并且只在三分之一的血清反應(yīng)陽(yáng)性患者中檢測(cè)到Tat抗體(hgury等，1998)。我們開(kāi)發(fā)了一種檢測(cè)Tat抗體的新方案，其中使用了pH4.5下的完整Tat變體以維持Tat的三維結(jié)構(gòu)，并且在血樣的低稀釋度(1/4)下開(kāi)始檢測(cè)。這種新方案能夠?qū)z測(cè)到特異性Tat抗體增加到50%的血清反應(yīng)陽(yáng)性患者。但是，令人驚異的是，在其血液中具有細(xì)胞外Tat的血清反應(yīng)陽(yáng)性患者中有50%不能識(shí)別任何Tat變體。另一方面，盡管在血清反應(yīng)陽(yáng)性患者中Tat抗體的濃度比EPS患者高兩倍，但EPS患者中Tat抗體的量對(duì)于HIV感染的細(xì)胞產(chǎn)生的Tat的可能量來(lái)說(shuō)，仍是巨大的。在越南人中奇怪的是TatOyi的識(shí)別。在使用1/1000血樣稀釋度對(duì)越南群體進(jìn)行的第一次篩選實(shí)驗(yàn)中，我們能夠在56%的EPS患者中檢測(cè)到針對(duì)TatOyi的抗體的存在。這種從％血樣稀釋度開(kāi)始的新方案能夠指出，在EPS群體中其他Tat變體被明顯識(shí)別(圖1A)。結(jié)論只有一半的血清反應(yīng)陽(yáng)性患者具有針對(duì)Tat的抗體，并且不能識(shí)別6種Tat變體。此外，這些針對(duì)Tat的抗體可能消失。這些特性可以解釋它們不能中和細(xì)胞外Tat。已經(jīng)顯示，Tat能夠在細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡(Westendorp等，1995)并由于Fas配體的過(guò)表達(dá)而抑制巨噬細(xì)胞(Cohen等，1999)。在EPS群體中唯一的針對(duì)HIV-I的細(xì)胞應(yīng)答是自然殺傷(NK)細(xì)胞所致，并且Tat能夠在NK細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(Poggi等，2002)。我們的結(jié)果表明，對(duì)于不同Tat變體具有交叉識(shí)別能力的Tat抗體，能夠恢復(fù)針對(duì)HIV的有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在EPS群體的大多數(shù)患者中特異性識(shí)別Tat的IgG的存在，表明發(fā)生了針對(duì)Tat的獲得性免疫性，并能夠恢復(fù)它們的細(xì)胞免疫性。這種獲得性免疫性在越南Tat變體中可能是由于與帶有TatOyi的加蓬人中觀察到的突變相似的突變。在TatOyi特有的突變中，Glu100似乎是非常引人關(guān)注的，因?yàn)樨?fù)電荷的出現(xiàn)能夠誘導(dǎo)針對(duì)TatOyi表面的免疫原性，所述表面對(duì)應(yīng)于在Tat變體之間高度保守的表面。實(shí)施例2=TatOyiCys22的合成、純化和表征在固相肽合成中裝配Tat0yiCys22(SEQIDNO:2)。在切除樹(shù)脂前，從707mg的理論量獲得了330mg粗物質(zhì)。合成產(chǎn)率是46.7%，與合成TatOyiSer22時(shí)觀察到的相似。使用三氟乙酸將樹(shù)脂和保護(hù)基團(tuán)從蛋白物質(zhì)上切下。蛋白物質(zhì)首先通過(guò)用叔丁基醚(TBE)沉淀進(jìn)行純化，以除去溶解在TBE中的游離保護(hù)基。將沉淀干燥并重新懸浮在0.1%TFA的水性緩沖液中，然后通過(guò)過(guò)濾(0.22μm)除去樹(shù)脂。將無(wú)樹(shù)脂的蛋白物質(zhì)(約240mg)冷凍干燥，并分成稱為F1、F2、F3和F4的約60mg的四個(gè)部分，以最高20mg/ml的濃度重新懸浮在0.1%TFA的水性緩沖液中。每部分含有約150D單位。使用Beckman高壓液相色譜(HPLC)裝置，使用BeckmanC8反相柱(10x150mm)對(duì)每部分進(jìn)行純化。緩沖液A是含有0.1%TFA的水，緩沖液B是含有0.1%TFA的乙腈(Merck)。梯度是在40分鐘內(nèi)緩沖液B從15到35%，流速為2ml/min。從C8反相分離后獲得的不同亞級(jí)份中，能夠在亞級(jí)份中檢測(cè)到Trp的典型吸收光譜。HPLC分析使用MerckRP-8柱6x100mm)進(jìn)行，使用了相同的緩沖液，但是使用的梯度為40分鐘內(nèi)從10到50%，流速為每分鐘0.8ml。具有Trp的典型吸收光譜的亞級(jí)份的特征在于25分鐘處的單峰，其與TatOyiSer22具有相同的保留時(shí)間(數(shù)據(jù)未顯示)。突變不改變iTatOyi的疏水性。使用在HPLC中在25分鐘處具有單峰的亞級(jí)份，觀察到了對(duì)應(yīng)于！"atOyiCys22的預(yù)計(jì)11578麗的質(zhì)量(圖3)。通過(guò)質(zhì)譜沒(méi)有觀察到污染物。有趣的是，注意到了使用在-22°C儲(chǔ)存6個(gè)月后的Tat0yiCys22獲得了同樣的質(zhì)譜圖?；钚猿煞植淮嬖诮到鈱?duì)于疫苗接種活動(dòng)來(lái)說(shuō)是令人鼓舞的。純化的！"atOyiCys22的總量相當(dāng)于^Onm處OD單位的三分之一和蛋白物質(zhì)的總量的1/5。使用TatOyiCys22進(jìn)行了進(jìn)一步的表征，例如反式激活分析(圖4)和圓二色性(圖5)。反式激活分析使用TatHXB2作為對(duì)照進(jìn)行。使用TatOyiCys22觀察到了與TatHXB2水平相似的反式激活，而變體TatOyiSer22不能進(jìn)行反式激活。Cys22突變使得能夠讓生物學(xué)測(cè)試顯示出TatOyiCys22具有與其他有活性Tat變體相似的結(jié)構(gòu)。在同一天，對(duì)iTatOyiCys22和TatOyiSer22進(jìn)行了圓二色性(CD)。CD光譜(圖5)顯示，突變Cys22Ser不誘導(dǎo)能夠使用⑶檢測(cè)到的結(jié)構(gòu)變化。為了評(píng)估可能由突變誘導(dǎo)但是不能用CD檢測(cè)到的可能的變化，進(jìn)行了TatOyiCys22和TatOyiSer22的分子建模(圖6)。分子建模證實(shí)了突變kr22Cys不誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)性變化。Ser與Cys之間的唯一差別是側(cè)鏈中的不同原子(氧代替硫)。硫和氧在門(mén)捷列夫表的同一族中，共有作為親核物質(zhì)的化學(xué)相似性。硫比氧大，與硫相連的氫比與氧相連的氫更不穩(wěn)定。這似乎是為什么iTat0yiCys22能夠反式激活而Tat0yikr22不能的唯一解釋。有趣的是，觀察到了含有Glu100突變的C-末端與Tat變體中具有最保守序列的區(qū)域3和4非常接近。實(shí)施例3使用！"atOyiCys22免疫接種使用TatOyiCys22(SEQIDNO2)進(jìn)行了小鼠的免疫接種。使用比臨床試驗(yàn)所計(jì)劃使用的濃度高1000倍濃度的TatOyiCys22，在小鼠上沒(méi)有觀察到毒性(數(shù)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ciencyvirustype1subtypeCTatfailstoinduceintracellularcalciumfluxandinducesreducedtumornecrosisfactorproductionfrommonocytes.(1型人類(lèi)免疫缺陷病毒C亞型Tat不能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣通量并誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤壞死因子減少)JVirol2007,81:5919-5928.CarrJK,SalminenMO，KochC，GotteD,ArtensteinAW,HegerichPA,StLouisD，BurkeDS，McCutchanFE.Full-lengthsequenceandmosaicstructureofahumanimmunodeficiencyvirustype1isolatefromThailand.(來(lái)自泰國(guó)的1型人類(lèi)免疫缺陷病毒分離株的全長(zhǎng)序列和鑲嵌結(jié)構(gòu))JVirol.1996，9，5935-5943.Caselli，Ε.，Betti，Μ.，Grossi，Μ.P.，Balboni,P.G.，Rossi，C.，Boarini,C.，Cafaro,Α.，Barbanti-Brodano，G.，Ensoli,B.andCaputo,A.DNAimmunizationwithHIV-Itatmutatedinthetransactivationdomaininduceshumoralandcellularimmuneresponsesagainstwild-typeTat.(WHIV-Itat進(jìn)行DNA免疫誘導(dǎo)了針對(duì)野生型Tat的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答)J.Immunol.1999,1625631-5638.ChangHC,SamaniegoF，NairBC,BuonaguroL，EnsoliB:HIV_lTatproteinexitsfromcellsviaaleaderlesssecretorypathwayandbindstoextracellularmatrix-associatedheparansulfateproteoglycansthroughitsbasicregion.(HIVTat蛋白通過(guò)無(wú)前導(dǎo)肽的分泌途徑離開(kāi)細(xì)胞并通過(guò)其基本區(qū)域結(jié)合到細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的硫酸肝素蛋白多糖上)AIDS1997,11:1421-1431.ChenD,WangΜ,ZhouS,ZhouQ.HIV-ITattargetsmicrotubulestoinduceapoptosis,aprocesspromotedbythepro—apoptoticBcl_2relativeBim.(HIV-120Tat靶向微管以誘導(dǎo)凋亡，一種由促凋亡Bcl-2相關(guān)的Bim促進(jìn)的過(guò)程)EMBOJ.2002,216801-6810.CoetzerM,CilliersT,PingLH,SwanstromR,MorrisLGeneticcharacteristicsoftheV3regionassociatedwithCXCR4usageinHIV-IsubtypeCisolates.(在HIV-1C亞型分離株中與CXCR4用法相關(guān)的V3區(qū)的遺傳特征)Virology2006，356:95-105.CohenSS,LiC,DingL,CaoY,PardeeAB,ShevachEM,CohenDI.PronouncedacuteimmunosuppressioninvivomediatedbyHIVTatchallenge.(由HIVTat激惹介導(dǎo)的顯著的體內(nèi)急性免疫抑制)ProcNatlAcadSciUSA.1999,96:10842-10847.CullenBRTheHIV-ITatprotein:anRNAsequence-specificprocessivityfactor？(HIV-1Tat蛋白R(shí)NA序列特異性的持續(xù)合成能力因子？)Cell1990,63655-657.deMareuilJ,CarreM,BarbierP,CampbellGR,LancelotS,OpiS,EsquieuD,WatkinsJD,PrevotC,BraguerD,PeyrotV,LoretEP.HIV-ITatproteinenhancesmicrotubulepolymerization.(HIV-1Tat蛋白增強(qiáng)微管聚合作用)Retrovirology.2005，2:5.Delaporte,Ε.,Dupont,Α.,Merlin,Μ.,Josse,R.,Hamono,B.,Larouze,B.&Brun-Vezinet,F.SeroepidemiologicalsurveyofHIV-1andHIV—2antibodiesinGabon.(加蓬HIV-1和HIV-2抗體的血清流行病學(xué)調(diào)查)AIDS1988，2136-137.Delaporte,Ε.,Janssens,W.,Peeters,Μ.,Buve,Α.,Dibanga,G.,Perret,J.L.,Ditsambou,V.,Mba,J.R.,Courbot,Μ.C.,Georges,Α.,Bourgeois,Α.,Samb,B.,Henzel,D.,Heyndrickx,L.,Fransen,K.,VanderGroen,G.&Larouze,B.EpidemiologicalandmolecularcharacteristicsofHIVinfectioninGabon,1986-1994.(加蓬HIV感染的流行病學(xué)和分子特征，1986-1994)AIDS1996,8:903-910.EnsoliB,BarillariG,SalahuddinSZ,GalloRC,Wong-StaalF.TatproteinofHIV-IstimulatesgrowthofcellsderivedfromKaposi'ssarcomalesionsofAIDSpatients.(HIV-1的Tat蛋白刺激源自于AIDS患者的卡波濟(jì)氏肉瘤病變的細(xì)胞的生長(zhǎng))Nature.1990,345:84-86.FeinbergMB&MooreJP.AIDSvaccinemodels:challengingchallengeviruses.(AIDS疫苗模型挑戰(zhàn)激惹病毒)NatMed2002,8:207-210.FisherAG,RatnerL,MitsuyaH,MarselleLM,HarperME,BroderS,GalloRC,Wong-StaalF.InfectiousmutantsofHTLV-IIIwithchangesinthe3'regionandmarkedlyreducedcytopathiceffects.(在3，區(qū)中具有變化并具有顯著降低的細(xì)胞病理效應(yīng)的HTLV-III傳染性突變體)Science.1986,233:655-659.FittipaldiA,FerrariA,ZoppeM,ArcangeliC,PellegriniV,BeltramF,GiaccaM:CellmembranelipidraftsmediatecaveolarendocytosisofHIV-lTatfusionproteins.(細(xì)胞膜脂筏介導(dǎo)HIV-ITat融合蛋白的胞膜窖胞吞作用)JBiolChem2003，278:34141-34149.FujisawaJ,SeikiM,KiyokawaT,YoshidaM!FunctionalactivationoftheLongTerminalRepeatofHumanTcellleukemiavirustypeIbyatrans—actingfactor.(人類(lèi)I型T細(xì)胞白血病病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列被反式作用因子的功能性激活)ProcNatlAcadSciUSA1985，82:2277-2281.GalloRC:TatasonekeytoHIV-inducedimmunepathogenesisandTattoxoidasanimportantcomponentofavaccine.(Tat作為HIV誘導(dǎo)的免疫發(fā)病機(jī)理的一個(gè)關(guān)鍵以及Tat類(lèi)毒素作為疫苗的重要組分)ProcNatlAcadSciUSA1999,968324-8326.GoldsteinG:HIV_1TatproteinasapotentialAIDSvaccine.(HIV-lTat蛋白作為潛在的AIDS疫苗)NatMed1996，9:960-964.Goldstein，G.，Manson,K.，Tribbick，G.&Smith,R.MinimizationofchronicplasmaviremiainrhesusmacaquesimmunizedwithsyntheticHIV-1Tatpeptidesandinfectedwithachimericsimian/humanimmunodeficiencyvirus(SHIV33).(在用合成的HIV-ITat肽免疫接種并用嵌合的猿/人類(lèi)免疫缺陷病毒(SHIV3;3)感染的恒河獼猴中慢性血漿病毒血癥的最小化)Vaccine2000,25:2789-2795.GregoireC,PeloponeseJMJr,EsquieuD,OpiS,CampbellG,SolomiacΜ,LebrunΕ,LebretonJ,LoretEP.Homonuclear(1)H-NMRassignmentandstructuralcharacterizationofhumanimmunodeficiencyvirustype1TatMalprotein.(1型入類(lèi)免疫缺陷病毒iTatMal蛋白的同核(I)H-NMR賦值和結(jié)構(gòu)表征)Biopolymers.2001，62324-335.GregoireCJ,LoretEP.ConformationalheterogeneityintworegionsofTATresultsinstructuralvariationsofthisproteinasafunctionofHIV-1isolates.(TAT的兩個(gè)區(qū)域中的構(gòu)象異質(zhì)性導(dǎo)致該蛋白的結(jié)構(gòu)隨著HIV-I分離株而變)JBiolChem.1996，271:22641-22646.HemelaarJ,GouwsE,GhysPD,OsmanovSGlobalandregionaldistributionofHIV-Igeneticsubtypesandrecombinantsin2004.U004年HIV-1遺傳亞型和重組的全球和地區(qū)性分布)AIDS.2006,20:13-23.Huet,Τ.,Dazza,Μ.C.,Brun-Vezinet,F.,Roelants,G.Ε.&ffain-Hobson,S.AhighlydefectiveHIV-IstrainisolatedfromahealthyGaboneseindividualpresentinganatypicalwesternblot.(從表現(xiàn)出非典型western印跡的健康力口蓬人個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到8個(gè)、優(yōu)選1到6個(gè)、優(yōu)選1到4個(gè)、優(yōu)選1或2個(gè)氨基酸的氨基酸序列SEQIDNO2的蛋白。7.權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)的方法，其中給患者施用包含在C-末端被截短1到14個(gè)氨基酸、優(yōu)選1到12個(gè)、優(yōu)選1到10個(gè)、優(yōu)選1到8個(gè)、優(yōu)選1到6個(gè)、優(yōu)選1到4個(gè)、優(yōu)選1或2個(gè)氨基酸的氨基酸序列SEQIDNO2的蛋白。8.權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)的方法，其中能夠刺激針對(duì)來(lái)自至少5種HIV-I亞型的Tat蛋白的免疫應(yīng)答的蛋白變體，顯示出與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2至少80%、優(yōu)選至少85%、優(yōu)選至少90%、優(yōu)選至少95%的同一性。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述蛋白變體與SEQIDNO:1或SEQIDNO2的差別在于保守性氨基酸取代。10.權(quán)利要求1到9任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白變體能夠反式激活。11.權(quán)利要求1到10任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白或變體能夠刺激針對(duì)來(lái)源于選自A、B、C、D、E、F、G、H、J和K的兩種、三種、四種、五種或更多種HIV-I亞型的Tat蛋白的免疫應(yīng)答。12.權(quán)利要求1到11任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白或變體是化學(xué)合成的蛋白。13.權(quán)利要求1到11任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白或變體是重組蛋白。14.一種藥物組合物，其包括與可藥用載體組合的能夠刺激針對(duì)Tat蛋白的免疫應(yīng)答并能夠反式激活的含有氨基酸序列SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的蛋白或所述蛋白的變體。15.權(quán)利要求14的藥物組合物，其中所述蛋白或變體能夠刺激針對(duì)2、3、4或更多種HIV-I亞型的免疫應(yīng)答。16.權(quán)利要求15的藥物組合物，其中所述蛋白或變體能夠刺激針對(duì)5種HIV-I亞型的免疫應(yīng)答。17.權(quán)利要求14的藥物組合物，其用作針對(duì)HIV-I感染的預(yù)防性或治療性疫苗。18.一種預(yù)防或治療患者獲得性免疫缺陷綜合征(AIDQ的方法，其中給患者施用多核苷酸，所述多核苷酸編碼能夠刺激針對(duì)Tat蛋白、優(yōu)選來(lái)自至少5種HIV-I亞型的Tat蛋白的免疫應(yīng)答的包含氨基酸序列SEQIDNO1的蛋白或所述蛋白的變體。19.一種藥物組合物，其包含與可藥用載體組合的多核苷酸，所述多核苷酸編碼能夠刺激針對(duì)Tat蛋白、優(yōu)選來(lái)自至少5種HIV-I亞型的Tat蛋白的免疫應(yīng)答的包含氨基酸序列SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的蛋白，或所述蛋白的變體。20.權(quán)利要求19的藥物組合物，其用作針對(duì)HIV-I感染的預(yù)防性或治療性疫苗。21.一種疫苗，其包括在22位上含有半胱氨酸的有反式激活能力的TatOyi蛋白作為活性成分。22.權(quán)利要求21的疫苗，其中所述蛋白選自SEQIDNO:1或SEQIDNO:2。23.權(quán)利要求21或22的疫苗，其還包含佐劑。24.一種對(duì)溫血?jiǎng)游镞M(jìn)行免疫接種的方法，所述方法包含注射有效量的包含SEQIDNO1或SEQIDNO2中的至少一種的蛋白和佐劑。25.權(quán)利要求M的方法，其還包含確定所述蛋白是否觸發(fā)針對(duì)五種或更多種HIV-I亞型的免疫應(yīng)答的步驟，其中所述蛋白刺激針對(duì)Tat蛋白、優(yōu)選來(lái)自至少五種HIV-I亞型的Tat蛋白的免疫應(yīng)答。全文摘要本發(fā)明涉及在患者中預(yù)防或治療獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的方法，其中給患者施用能夠刺激針對(duì)Tat蛋白的免疫應(yīng)答的包含氨基酸序列SEQIDNO1或2的Tat蛋白、或其變體。文檔編號(hào)A61P31/18GK102056618SQ200980121522公開(kāi)日2011年5月11日申請(qǐng)日期2009年4月22日優(yōu)先權(quán)日2008年4月22日發(fā)明者伊爾萬(wàn)·洛雷特申請(qǐng)人:地中海大學(xué),法國(guó)國(guó)家科學(xué)研究中心