專利名稱：附加了糖鏈的glp-1肽的制作方法
附加了糖鏈的GLP-1肽
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及附加了糖鏈的GLP-I肽。背景技術(shù)：
GLP-I (胰高血糖素樣肽-1 :gluCag0n-like ρ印tide-1)是與糖的穩(wěn)態(tài)控制深 度相關(guān)的腸起源的肽。GLP-I通過作為胰高血糖素前體的前原胰高血糖素的組織特異 性的翻譯后加工而在腸的L細(xì)胞中合成，與餐食反應(yīng)而放出到循環(huán)中。此肽是腸胰島軸 (enteroinsular axis)的主要介質(zhì)，通過結(jié)合特定的受體來發(fā)揮作用。已知GLP-I主要在胰腺作用，葡萄糖濃度依賴性地促進由β細(xì)胞的胰島素放出。 另外提示了，抑制胰高血糖素的分泌，延遲胃的空洞化，提高末梢的葡萄糖處理的可能性。通過GLP-I的施用使得胰島素非依賴型糖尿病患者中餐后的葡萄糖水平正?；?， 提示了作為GLP-I的治療藥的可能性。另外，GLP-I有改善胰島素依賴型糖尿病患者中血 糖控制的作用。再，由于GLP-I的胰島素放出促進作用依存于血漿葡萄糖濃度，在低血漿葡 萄糖濃度，GLP-I介導(dǎo)的胰島素放出低，有不導(dǎo)致重度低血糖癥的優(yōu)點。因此，根據(jù)需要，通 過控制血中GLP-I量，認(rèn)為安全性高的糖尿病治療是可能的。但是，GLP-I的血中的半衰期 是2 6分鐘，極其短，有其作為治療劑的可能性受限的問題。作為解決這樣的問題的手段，進行了改變GLP-I的嘗試。例如，專利文獻1中公開 了，包括共價結(jié)合到至少1個聚乙二醇(PEG)分子的GLP-I化合物的聚乙二醇化GLP-I化 合物。所述聚乙二醇化GLP-I化合物是，各PEG用Cys或Lys氨基酸，或者用羧基末端氨基 酸鍵合到GLP-I化合物。所述聚乙二醇化GLP-I化合物有至少1小時的排出半衰期。根據(jù)專利文獻1，可得到相比非聚乙二醇化(imPEGylated)肽，半衰期被延長，清 除延遲的生理活性肽。另外公開了，這些聚乙二醇化(PEGylated)GLP-I化合物及組合物降 低糖尿病，肥胖，過敏性腸綜合征，以及血糖，抑制胃及/或腸運動性，及，抑制胃及/或腸內(nèi) 容物排出，或抑制食物攝取等，對于健康狀態(tài)的治療有用(例如，非專利文獻1)。但是，PEG由于是在體內(nèi)不被代謝的化合物，如果持續(xù)聚乙二醇化GLP-I化合物的 施用，則PEG在體內(nèi)蓄積，有給活體帶來不良藥物反應(yīng)的危險性(非專利文獻1)。另外，為了延長半衰期，也提出了 GLP-I或其修飾體附加糖鏈的方法(例如，專利 文獻3及4)。專利文獻3中記載著，向GLP-I的沈位，34位，及/或37位導(dǎo)入附加了糖鏈 的氨基酸的方法等，無法斷言糖鏈的種類或糖鏈附加位置肯定最適。另一方面，專利文獻4 中記載著使分子量200KDa左右的透明質(zhì)酸修飾物結(jié)合到GLP-I類似物的方法。但是，大量 制備如此巨大的透明質(zhì)酸分子時，使長度或結(jié)構(gòu)均一是困難的，實際上認(rèn)為各透明質(zhì)酸的 結(jié)構(gòu)或長度發(fā)生大大的偏差。作為藥品使用時，長度或結(jié)構(gòu)均一的附加了糖鏈的肽是必要 的。另外，作為類似于GLP-I的結(jié)構(gòu)，有同樣的活性，并且血中穩(wěn)定性高的化合物，從 蜥蜴(Heloderma)的唾液中發(fā)現(xiàn)的毒蜥外秘肽_4 (毒蜥外秘肽_4)(非專利文獻幻在美國 上市，但毒蜥外秘肽-4是非人型序列，想得到長期施用所致的中和抗體的出現(xiàn)或與之伴隨的藥效的減弱(非專利文獻3 5)。另一方面，越來越明了糖鏈在體內(nèi)發(fā)揮各種各樣的作用，雖然已認(rèn)識到其研究的 重要性，但由于結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性或多樣性而研究被延緩。雖然也嘗試了用于得到組成一定的 糖肽的方法(專利文獻幻，但從簡便性或大量生產(chǎn)的觀點來看，不認(rèn)為是足夠好的制備方 法，另外，尤其對于在體內(nèi)存在的長糖鏈而言，無法斷言是實用的制備方法。專利文獻1特表2006-520818號公報專利文獻2再表2005-095331號公報專利文獻3再表2006-095775號廣報專利文獻4國際公開第2007/063907號單行本非專利文獻1lexicological Science，42，152-157 (1998)。非專利文獻2J Biol Chem. 267,402-5(1992)非專利文獻3Vascular Health and Risk Management 2,69-77(2006)非專利文獻4] JAMA. 298,194-206(2007)非專利文獻5Endocrine Reviews 28,187-218(2007)

發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的技術(shù)課題本發(fā)明的課題在于提供，相比GLP-1，血中穩(wěn)定性增大，再優(yōu)選為，顯示高血糖值抑 制活性的，附加了糖鏈的GLP-I肽。解決課題的技術(shù)方案為了解決以上的課題，本發(fā)明有以下的特征。S卩，本發(fā)明是有GLP-I活性的、附加 了糖鏈的GLP-I肽，其特征在于，下列肽中的至少2個氨基酸被附加了糖鏈的氨基酸所置 換(a) GLP-I ；(b)GLP-I中缺失，置換或添加了 1或數(shù)個氨基酸的肽；或(c)GLP-l 的類似物。另外，本發(fā)明是有GLP-I活性的、附加了糖鏈的GLP-I肽，其特征在于，下列肽中的 至少2個氨基酸被附加了糖鏈的氨基酸所置換(a) GLP-I ；或(b) GLP-I中缺失，置換或添加了 1或數(shù)個氨基酸，且有GLP-I活性的肽。另外，本發(fā)明是有GLP-I活性的、附加了糖鏈的GLP-I肽，其是(a)GLP-I中，2個以上的氨基酸被附加了糖鏈的氨基酸所置換的附加了糖鏈的 GLP-I肽，至少1個置換位置是18，20，22，26，30，34或36位的附加了糖鏈的GLP-I肽；或(b) (a)中定義的附加了糖鏈的GLP-I肽中，缺失，置換或添加了附加了糖鏈的氨 基酸之外的氨基酸的1或數(shù)個氨基酸的附加了糖鏈的GLP-I肽。另外，本發(fā)明是有GLP-I活性的、附加了糖鏈的GLP-I肽，其是(a)GLP-I中，2個以上的氨基酸被附加了糖鏈的氨基酸所置換的附加了糖鏈的 GLP-I肽，任何置換位置均選自18，20，22，26，30，34或36位的附加了糖鏈的GLP-I肽；或(b) (a)中定義的附加了糖鏈的GLP-I肽中，缺失，置換或添加了附加了糖鏈的氨
8
Ac表示乙?；鵠。
基酸之外的氨基酸的1或數(shù)個氨基酸的附加了糖鏈的GLP-I肽。本發(fā)明中，附加了糖鏈的氨基酸，根據(jù)實施方式，優(yōu)選為附加了糖鏈的Asn或附加 了糖鏈的Cys，但不限于此。另外，本發(fā)明中，與附加了糖鏈的GLP-I肽結(jié)合的多個附加了糖鏈的氨基酸，可為 糖鏈或氨基酸的種類相同的氨基酸，也可為不同的氨基酸。另外，本發(fā)明中，附加了糖鏈的氨基酸中，糖鏈和氨基酸可經(jīng)接頭結(jié)合，也可不經(jīng) 接頭結(jié)合。根據(jù)實施方式，優(yōu)選為，不經(jīng)接頭(直接)結(jié)合。另外，本發(fā)明中，糖鏈一般優(yōu)選為由4個以上的糖構(gòu)成的糖鏈。再，根據(jù)實施方式， 有時優(yōu)選為由5個 11個糖構(gòu)成的糖鏈。另外，本發(fā)明中，糖鏈，根據(jù)實施方式，優(yōu)選為雙鏈復(fù)合型糖鏈。另外，根據(jù)實施方 式，有時優(yōu)選選自二唾液酸糖鏈，單唾液酸糖鏈，無唾液酸糖鏈，二 N-乙酰葡萄糖胺糖鏈及 二甘露糖糖鏈的糖鏈，但不限于此。另外，本發(fā)明中，糖鏈，根據(jù)實施方式，有時優(yōu)選為以下的式所示的糖鏈，但不限于 此。化1
權(quán)利要求
1.有GLP-I活性的、附加了糖鏈的GLP-I肽，其特征在于，下列肽中的至少2個氨基酸 被附加了糖鏈的氨基酸所置換(a)GLP-I；(b)GLP-I中缺失，置換或添加了1或數(shù)個氨基酸的肽；或(c)GLP-l的類似物。
2.有GLP-I活性的、附加了糖鏈的GLP-I肽，其特征在于，下列肽中的至少2個氨基酸 被附加了糖鏈的氨基酸所置換(a)GLP-I ；或(b)GLP-I中缺失，置換或添加了1或數(shù)個氨基酸的肽。
3.有GLP-I活性的、附加了糖鏈的GLP-I肽，其特征在于，下列肽中的至少2個氨基酸 被附加了糖鏈的氨基酸所置換(a)GLP-I ；或(b)GLP-I中缺失，置換或添加了1或數(shù)個氨基酸，且有GLP-I活性的肽。
4.權(quán)利要求1 3中任一項中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其中所述附加了糖鏈的 氨基酸是附加了糖鏈的Asn及/或附加了糖鏈的Cys。
5.權(quán)利要求1 4中任一項中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其中所述附加了糖鏈的 氨基酸中，糖鏈與氨基酸不經(jīng)接頭結(jié)合。
6.權(quán)利要求1 5中任一項中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其中所述糖鏈均為由4 個以上的糖構(gòu)成的糖鏈。
7.權(quán)利要求1 6中任一項中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其中所述糖鏈均為雙鏈 復(fù)合型糖鏈。
8.權(quán)利要求7中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其中所述糖鏈均為獨立地選自二唾液 酸糖鏈，單唾液酸糖鏈，無唾液酸糖鏈，二 N-乙酰葡萄糖胺糖鏈及二甘露糖糖鏈的糖鏈。
9.權(quán)利要求1 8中任一項所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其中所述糖鏈均為獨立地 以下示表示的糖鏈
10.權(quán)利要求1 9中任 一項中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其中所述糖鏈基本上均一。
11.有GLP-I活性的、附加了糖鏈的GLP-I肽，其為(a)GLP-I中2個以上的氨基酸被附加了糖鏈的氨基酸所置換的附加了糖鏈的GLP-I 肽，且為至少1個置換位置是18，20，22，沈，30，34或36位的附加了糖鏈的GLP-I肽；或(b)(a)中定義的附加了糖鏈的GLP-I肽中，缺失，置換或添加了所述附加了糖鏈的氨 基酸之外的氨基酸的1或數(shù)個氨基酸的附加了糖鏈的GLP-I肽。
12.權(quán)利要求11中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其中所述附加了糖鏈的氨基酸是附 加了糖鏈的Asn及/或附加了糖鏈的Cys。
13.權(quán)利要求11或12中任一項中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其中所述附加了糖鏈 的氨基酸中，糖鏈與氨基酸不經(jīng)接頭結(jié)合。
14.權(quán)利要求11 13中任一項所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其中所述糖鏈均為由4 個以上的糖構(gòu)成的糖鏈。
15.權(quán)利要求11 14中任一項中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其中所述糖鏈均為雙 鏈復(fù)合型糖鏈。
16.權(quán)利要求15中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其中所述糖鏈均為獨立地選自二唾 液酸糖鏈，單唾液酸糖鏈，無唾液酸糖鏈，二 N-乙酰葡萄糖胺糖鏈及二甘露糖糖鏈的糖鏈。
17.權(quán)利要求11 16中任一項中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其中所述糖鏈均為獨 立地以下示表示的糖鏈化3
18.權(quán)利要求11 17中任一項中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其中所述糖鏈99% 以上均一。
19.權(quán)利要求11中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其中，所述附加了糖鏈的氨基酸是附加了糖鏈的Asn，所述附加了糖鏈的氨基酸中，糖鏈與氨基酸不經(jīng)接頭結(jié)合，所述糖鏈?zhǔn)怯?個以上的糖構(gòu)成的糖鏈，所述糖鏈均為獨立地選自二唾液酸糖鏈，單唾液酸糖鏈，無唾液酸糖鏈，二 N-乙酰葡 萄糖胺糖鏈及二甘露糖糖鏈的糖鏈，且所述糖鏈基本上均一。
20.權(quán)利要求1 19中任一項中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其相比GLP-I具有增 大的血中穩(wěn)定性。
21.權(quán)利要求1 20中任一項中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其相比GLP-I具有10 倍以上的0GTT( 口服葡萄糖耐量試驗)中血糖值抑制活性。
22.權(quán)利要求1 20中任一項中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其相比GLP-I具有30 倍以上的DPP-IV抗性。
23.藥物組合物，其含權(quán)利要求1 22中任一項中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽作為 有效成分。
24.權(quán)利要求23中所述的藥物組合物，其用于GLP-I關(guān)聯(lián)疾病的治療或預(yù)防。
25.權(quán)利要求對中所述的藥物組合物，其中所述GLP-I關(guān)聯(lián)疾病是糖尿病。
26.GLP-I關(guān)聯(lián)疾病的治療或預(yù)防方法，其包括施用有效量的權(quán)利要求1 22中任一項 中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽。
27.附加了糖鏈的GLP-I肽，其為下列肽中的至少1個氨基酸被附加了糖鏈的氨基酸所置換的有GLP-I活性的、附 加了糖鏈的GLP-I肽(a)GLP-I ；(b)GLP-I中缺失，置換或添加了1或數(shù)個氨基酸的肽；或(c)GLP-l的類似物，其中所述糖鏈?zhǔn)枪淹该髻|(zhì)酸。
28.附加了糖鏈的GLP-I肽，其為下列肽中的至少1個氨基酸被附加了糖鏈的氨基酸所置換的有GLP-I活性的、附 加了糖鏈的GLP-I肽(a)GLP-I ；或(b)GLP-I中缺失，置換或添加了 1或數(shù)個氨基酸的肽， 其中所述糖鏈?zhǔn)枪淹该髻|(zhì)酸。
29.權(quán)利要求27或觀中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其中所述寡透明質(zhì)酸是以由 N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸構(gòu)成的單元作為1個單元的2個單元0糖)以上，8個單元 (16糖)以下的糖鏈。
30.權(quán)利要求27或觀中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其中所述寡透明質(zhì)酸是以由 N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸構(gòu)成的單元作為1個單元的2個單元G糖)的糖鏈。
31.權(quán)利要求27 30中任一項中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其中所述附加了糖鏈 的氨基酸是附加了糖鏈的Cys。
32.附加了糖鏈的GLP-I肽，其為下列肽中的至少1個氨基酸被附加了糖鏈的氨基酸所置換的有GLP-I活性的、附 加了糖鏈的GLP-I肽(a)GLP-I；(b)GLP-I中缺失，置換或添加了1或數(shù)個氨基酸的肽；或(c)GLP-l的類似物，其中所述附加了糖鏈的氨基酸中，糖鏈與氨基酸經(jīng)接頭結(jié)合。
33.附加了糖鏈的GLP-I肽，其為下列肽中的至少1個氨基酸被附加了糖鏈的氨基酸所置換的有GLP-I活性的、附 加了糖鏈的GLP-I肽(a)GLP-I ；或(b)GLP-I中缺失，置換或添加了 1或數(shù)個氨基酸的肽， 其中所述附加了糖鏈的氨基酸中，糖鏈與氨基酸經(jīng)接頭結(jié)合。
34.權(quán)利要求32或33中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其中與所述接頭結(jié)合的氨基酸 是 Lys0
35.權(quán)利要求32 34中任一項中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其中所述接頭在所述 糖鏈側(cè)的末端含氨基酸。
36.權(quán)利要求35中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其中所述接頭中所含的氨基酸是Asn0
37.權(quán)利要求27 36中任一項中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽，其中所述糖鏈基本上均一。
38.藥物組合物，其含權(quán)利要求27 37中任一項中所述的附加了糖鏈的GLP-I肽作為 有效成分。
39.權(quán)利要求38中所述的藥物組合物，其中所述糖鏈90%以上均一。
40.權(quán)利要求38或39中所述的藥物組合物，其用于GLP-I關(guān)聯(lián)疾病的治療或預(yù)防。
全文摘要
本發(fā)明以提供相比GLP-1，血中半衰期長，且優(yōu)選顯示高血糖值抑制活性的附加了糖鏈的GLP-1肽為課題。本發(fā)明提供有GLP-1活性的、附加了糖鏈的GLP-1肽，其特征在于，下列肽中的至少2個氨基酸被附加了糖鏈的氨基酸所置換(a)GLP-1；(b)GLP-1中缺失，置換或添加了1或數(shù)個氨基酸的肽；或(c)GLP-1的類似物。本發(fā)明還提供附加了糖鏈的GLP-1肽，其為所述(a)，(b)或(c)中的至少1個氨基酸被附加了糖鏈的氨基酸所置換的有GLP-1活性的、附加了糖鏈的GLP-1肽，其中所述糖鏈?zhǔn)前ü淹该髻|(zhì)酸的糖鏈。對于附加了糖鏈的氨基酸而言，糖鏈與氨基酸也可經(jīng)接頭結(jié)合。
文檔編號A61P3/10GK102083854SQ20098012266
公開日2011年6月1日 申請日期2009年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月17日
發(fā)明者南部由利, 坂本泉, 手塚克成, 朝井洋明, 林直宏, 梶原康宏, 深江一博, 石井一之, 辻孝 申請人:大塚化學(xué)株式會社