專利名稱：通過(guò)miRNA增強(qiáng)藥物療法的制作方法
通過(guò)mi RNA增強(qiáng)藥物療法
背景技術(shù)：
盡管在闡明引起惡性癌細(xì)胞的基因組異常方面已取得了巨大進(jìn)展，但目前可用的 化學(xué)療法仍不是令人滿意的，并且對(duì)于大多數(shù)被診斷為具有癌癥的患者的預(yù)后仍是令人沮 喪的。因此，需要繼續(xù)開發(fā)新療法，特別是與其他試劑和治療共同一起良好工作(如果不是 協(xié)同地)的新療法。熱休克蛋白(HSPs)是響應(yīng)于升高的溫度和其他環(huán)境應(yīng)激例如紫外線、營(yíng)養(yǎng)剝奪 和缺氧而上調(diào)的一類伴侶蛋白。HSR充當(dāng)其他細(xì)胞蛋白質(zhì)(稱為“客戶”蛋白質(zhì))的分子伴 侶，并且有助于它們的正確折疊和客戶蛋白質(zhì)的修復(fù)。存在幾個(gè)已知的HSI^s家族，其各自 具有其自身的客戶蛋白質(zhì)組。HSP90家族是最豐富的HSP家族之一，其總計(jì)占未處于應(yīng)激下 的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的大約1_2%，并且在處于應(yīng)激下的細(xì)胞中增加至大約4-6%。HSP90的 抑制導(dǎo)致經(jīng)由遍在蛋白蛋白酶體途徑的其客戶蛋白質(zhì)的降解。與其他伴侶蛋白不同，HSP90 的客戶蛋白質(zhì)大多數(shù)是牽涉信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白激酶或轉(zhuǎn)錄因子，并且許多其客戶蛋白質(zhì)已顯 示牽涉癌癥的進(jìn)展。因此，HSP90的抑制是用于治療癌癥和其他疾病的有希望的途徑。17-AAG是與HSP90 (熱休克蛋白90)結(jié)合并且改變其功能的安莎霉素抗生素。特 別地，17-AAG以高親和力結(jié)合到HSP90中的ATP結(jié)合袋內(nèi)，并且誘導(dǎo)需要該分子伴侶用于構(gòu) 象成熟的蛋白質(zhì)的降解。雷帕霉素是用于防止器官和骨髓移植物被機(jī)體排斥的藥物。雷帕霉素是這樣的抗 生素，其阻斷牽涉細(xì)胞分裂的蛋白質(zhì)，并且抑制在機(jī)體排斥外來(lái)組織和器官中所牽涉的免 疫系統(tǒng)的某些T細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能。它是一種類型的免疫抑制劑和一種類型的絲氨酸/蘇 氨酸激酶抑制劑。雷帕霉素也稱為西羅莫司。基于鉬的化學(xué)治療試劑(“鉬試劑”)包括例如奧沙利鉬、順鉬和卡鉬。鉬試劑類 別的藥物以幾種不同方式使DNA交聯(lián)，從而干擾通過(guò)有絲分裂的細(xì)胞分裂。受損的DNA引 發(fā)DNA修復(fù)機(jī)制，這又在當(dāng)修復(fù)經(jīng)證明不可能時(shí)激活細(xì)胞凋亡。此外，已假定鉬試劑還與細(xì) 胞蛋白質(zhì)特別是HMG結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)反應(yīng)，從而進(jìn)一步干擾有絲分裂。紫杉醇是在癌癥化學(xué)治療中所使用的有絲分裂抑制劑。紫杉醇還用于預(yù)防再狹 窄。與多西他賽一起，它形成稱為紫杉烷類的藥物類別。紫杉烷類通過(guò)干擾在細(xì)胞分裂過(guò) 程中的正常微管分解而起作用。值得注意的是，HSP抑制劑、鉬試劑和紫杉烷類是不同藥物類別的成員，并且具有 廣泛不同的作用機(jī)制。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)在患有癌癥、神經(jīng)變性疾病、再狹窄或增殖性細(xì)胞疾病的 生物中治療劑的活性的方法，其包括在施用另一種治療劑之前、期間或之后，施用治療有 效量的miRNA。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物旨在增強(qiáng)HSP90抑制劑 17-AAG的活性。根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物包括例如，其中所述miRNA包含一種或多種下述RNA 序列
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miR145(GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU)(SEQ ID NO 1),miR454-3p(UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)，miR519a(AAAGUGCAUCCUUUUAGA(iU(;UUAC) (SEQ ID NO :3)，miR520c(AAAGUGCUUCCUUUUAGAGG⑶U)(SEQ ID NO :4)，miR520d(AAAGUGCUUCUCUUUG⑶GG⑶U)(SEQ ID NO :5)，miR-425-3p (AUCGGGAAUGUC⑶⑶CCGCC) (SEQ ID NO :6)，miR-495(AAACAAACAUGGUGCACUUCUUU)(SEQ ID NO :7)，miR-572(GUCCGCUCGGCG⑶GGCCCA)(SEQ ID NO :8)，和miR-661(UGCCUGG⑶CUCUGGCCUGCGCGU)(SEQ ID NO :9)。備選地，在其他實(shí)施方案中，所述miRNA包含SEQ ID NO 10-35中的一種或多種。特別地，本發(fā)明提供了這樣的方法和組合物，其中所述miRNA選自miR4M_3p (UAG UGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)，miR520c(AAAGUGCUUCCUUUUAGAGG⑶U) (SEQ ID NO :4)，其互補(bǔ)物，以及其組合；并且所述治療劑為17-AAG、奧沙利鉬或其組合。此外，本發(fā)明提供了這樣的方法和組合物，其中所述miRNA選自miR-425-3p (AUCGGGAAUGUC⑶⑶CCGCC) (SEQ ID NO 6)，miR-495(AAACAAACAUGGUGCACUUCUUU)(SEQ ID NO :7)，miR-572(GUCCGCUCGGCG⑶GGCCCA)(SEQ ID NO :8)，miR-661(UGCCUGG⑶CUCUGGCCUGCGCGU)(SEQ ID NO :9)，其互補(bǔ)物，以及其組合；并且所述治療劑為紫杉醇。因此，本發(fā)明提供了用于預(yù)測(cè)對(duì)于使用HSP90抑制劑、微管抑制劑或有絲分裂抑 制劑的療法的應(yīng)答的方法，其包括(a)提供患病組織的生物學(xué)樣品；(b)測(cè)量患病組織的生物學(xué)樣品中RNA的水平，其中所測(cè)量的RNA由下列序列組 成(i)miR145(GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU)(SEQ ID NO :1)，miR454-3p(UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)，miR519a(AAAGUGCAUCCUUUUAGA(iU(;UUAC) (SEQ ID NO :3)，miR520c(AAAGUGCUUCCUUUUAGAGG⑶U)(SEQ ID NO :4)，miR520d(AAAGUGCUUCUCUUUG⑶GG⑶U)(SEQ ID NO :5)，miR-425-3p (AUCGGGAAUGUC⑶⑶CCGCC) (SEQ ID NO :6)，miR-495(AAACAAACAUGGUGCACUUCUUU)(SEQ ID NO :7)，miR-572(GUCCGCUCGGCG⑶GGCCCA)(SEQ ID NO :8)，miR-661(UGCCUGG⑶CUCUGGCCUGCGCGU)(SEQ ID NO :9)；(ii) (i)的互補(bǔ) RNA ；禾口(iii)具有與(i)或(ii)的21個(gè)鄰接核苷酸至少大約81%同一的序列的RNA ；(c)將患病組織中來(lái)自(b)的RNA的水平與對(duì)照中相同RNA的水平相比較，其中高 于對(duì)照水平的該核酸的水平表明對(duì)所述療法作出應(yīng)答，和低于對(duì)照水平的該核酸的水平表
11明對(duì)所述療法不作出應(yīng)答。備選地，在其他實(shí)施方案中，所述miRNA包含SEQ ID NO 10-35 中的一種或多種。本發(fā)明提供了分離的核酸，包括載體，其具有與報(bào)道基因有效地連接的一種或多 種體內(nèi)表達(dá)控制元件，其中所述報(bào)道基因處于靶基因(其表達(dá)水平待調(diào)節(jié)，增加或降低其 水平)3’非翻譯區(qū)的全部或部分的上游，其中在所述分離的核酸轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中后，經(jīng)轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞表達(dá)編碼處于所述3’非翻譯區(qū)上游的該報(bào)道分子的mRNA。值得注意的是，根據(jù)本 發(fā)明提供的外源miRNA也可以與抑制性內(nèi)源miRNA相互作用，以增加靶基因的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的分離的核酸包括例如，其中載體選自質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、病毒和人 工染色體。根據(jù)本發(fā)明的分離的核酸包括例如，其中所述一種或多種體內(nèi)表達(dá)控制元件選 自啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、RNA剪接信號(hào)及其組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述報(bào)道基因編碼螢光素酶蛋白，并且所述靶基因?yàn)镃D44、 ⑶C27、MAPK活化激酶2、PAR4或PKC γ，并且所述3，非翻譯區(qū)來(lái)自⑶44、⑶C27、MAPK活化 激酶 2、PAR4 或 PKC γ。本發(fā)明進(jìn)一步提供了鑒定靶基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑的方法，其包括(a)用包含與報(bào)道基因有效地連接的一種或多種體內(nèi)表達(dá)控制元件的分離的核酸 轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，所述報(bào)道基因被克隆在靶基因3’非翻譯區(qū)的全部或部分的上游，其中所述 體內(nèi)表達(dá)控制元件導(dǎo)致產(chǎn)生出編碼處于靶基因3’非翻譯區(qū)上游的該報(bào)道分子的mRNA，(b)用包含與所述報(bào)道基因有效地連接的所述一種或多種體內(nèi)表達(dá)控制元件的分 離的核酸轉(zhuǎn)染其他真核細(xì)胞，其中所述表達(dá)控制元件導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄出編碼該報(bào)道分子的mRNA，(c)使來(lái)自(a)和(b)的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與候選表達(dá)調(diào)節(jié)劑相接觸和假接觸 (mock-contacting)，禾口(d)將在經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與候選表達(dá)調(diào)節(jié)劑相接觸和未接觸的情況下在來(lái)自(a)和 (b)的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的報(bào)道基因活性進(jìn)行比較。所要求保護(hù)的方法的實(shí)施方案包括，其中所述方法進(jìn)一步包括用第二報(bào)道構(gòu)建體 共轉(zhuǎn)染(a)和(b)中的細(xì)胞，所述第二報(bào)道構(gòu)建體表達(dá)用于標(biāo)準(zhǔn)化(d)中所比較的數(shù)據(jù)的 第二報(bào)道分子。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述靶基因?yàn)镃D44、CDC27、MAPK活化激酶2、 PAR4或PKC γ。所述方法還規(guī)定使報(bào)道分子表達(dá)構(gòu)建體中的⑶44、⑶C27、MAPK活化激酶 2、PAR4、PKCy的3’非翻譯區(qū)突變，將所述經(jīng)突變的報(bào)道分子表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞 中，和將在經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與候選表達(dá)調(diào)節(jié)劑相接觸和未接觸的情況下由于經(jīng)突變和未突變 的報(bào)道分子表達(dá)構(gòu)建體的表達(dá)而產(chǎn)生的報(bào)道基因活性進(jìn)行比較。因此，本發(fā)明提供了用于鑒定靶基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑的試劑盒，其包括(a)第一分離的核酸，其具有與第一報(bào)道基因有效地連接的第一組一種或多種體 內(nèi)表達(dá)控制元件，所述第一報(bào)道基因被克隆在靶基因3’非翻譯區(qū)的全部或部分的上游，其 中在所述第一分離的核酸轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中后，所述第一組體內(nèi)表達(dá)控制元件導(dǎo)致產(chǎn)生 出編碼處于靶基因3’非翻譯區(qū)上游的該第一報(bào)道分子的mRNA，所述靶基因例如為CD44、 0)〇27、嫩131(活化激酶2、？41 4或？1((^ ；(b)第二分離的核酸，其包含與所述第一報(bào)道基因有效地連接的來(lái)自(a)的該組 體內(nèi)表達(dá)控制元件，其中在所述第二分離的核酸轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中后，所述體內(nèi)表達(dá)控制 元件導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄出編碼所述第一報(bào)道分子的mRNA ；和
(c)第三分離的核酸，其包含與第二報(bào)道基因有效地連接的第二組一種或多種所 述體內(nèi)表達(dá)控制元件，其中在所述分離的核酸轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中后，所述第二組體內(nèi)表達(dá) 控制元件導(dǎo)致所述第二報(bào)道分子表達(dá)。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含miRNA的分離的核酸，其中當(dāng)將所 述miRNA施用至哺乳動(dòng)物細(xì)胞并且隨后將所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露于治療劑或與治療劑 相接觸時(shí)，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞在Apo-ONE 均相胱天蛋白酶-3/7測(cè)定法(Apo-ONE Homogeneous Caspase_3/7Assay) (Promega，Madison,WI)或其他用于定量細(xì)胞凋亡的合適 測(cè)定法中產(chǎn)生至少大約200，優(yōu)選地至少大約225，更優(yōu)選地至少大約250，最優(yōu)選地至少大 約275的485/538nm比率。因此，本發(fā)明還提供了能夠表達(dá)包含miRNAs的轉(zhuǎn)錄物的分離的 核酸，其中當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)所述miRNAs并且隨后將所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露于治 療劑或與治療劑相接觸時(shí)，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞在Apo-ONE 均相胱天蛋白酶-3/7測(cè)定法 (Promega, Madison, WI)或其他用于定量細(xì)胞凋亡的合適測(cè)定法中產(chǎn)生至少大約200，優(yōu)選 地至少大約225，更優(yōu)選地至少大約250，最優(yōu)選地至少大約275的485/538nm比率。用于 根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面進(jìn)行使用的合適治療劑包括例如17-AAG、奧沙利鉬、紫杉醇及其組
I=I ο進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)在患有癌癥、神經(jīng)變性疾病、再狹窄或增殖性細(xì) 胞疾病的生物中治療劑的活性的方法，其包括在施用另一種治療劑之前、期間或之后，施用 治療有效量的miRNA。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物旨在增強(qiáng)雷帕霉 素的活性。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了增強(qiáng)、加強(qiáng)或增加雷帕霉素的活性的方 法，其包括表達(dá)包含下列序列中的一種或多種序列的miRNAs CCAGUAUUAACU⑶GCUGCUGA (SEQ ID NO 36),AAGUGUGCAGGGCACUGGU (SEQ ID N0:37)，和AAGGAGCUUACAAUCUAGCUGGG(SEQ ID NO 38),以及其組合。附圖的幾個(gè)視圖的簡(jiǎn)述

圖1描繪了關(guān)于HSP90抑制劑17-AAG的細(xì)胞凋亡活性的劑量-應(yīng)答曲線。圖2描繪了關(guān)于在HSP90被17-AAG抑制后Her2下調(diào)的劑量-應(yīng)答曲線。圖3描繪了在用HSP90抑制劑17-AAG進(jìn)行處理后，Her2的內(nèi)在化和降解。圖4描繪了萬(wàn)珂(Velcade)抑制由17-AAG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡活性。圖5為與17-AAG的1 800稀釋物協(xié)同地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的miRNAs的表格式呈現(xiàn)。 暗色背景，最佳候選物，在1 800和1 3200下。淺色背景，候選物，僅在1 800下。圖6為與17-AAG的1 3200稀釋物協(xié)同地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的miRNAs的表格式呈 現(xiàn)。暗色背景，最佳候選物，在1 800和1 3200下。淺色背景，候選物，僅在1 800 下。圖7描繪了通過(guò)所鑒定的miRNAs而發(fā)生的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的17-AAG濃度依賴性。 1E2, mir-145(SEQ ID NO 1) ；3F6，mir-454 (SEQ ID NO 2) ；4C6，mir-519 (SEQ ID NO 3)； 4D4-520c (SEQID NO 4) ；4D5, mir-520d(SEQ ID NO 5) ； 17AAG，無(wú) miRNA 的基線活性。圖8呈現(xiàn)了這5種miRNAs的關(guān)系和序列比對(duì)，其中顯示出has-mir-145屬于獨(dú)特 的類別。
圖9顯示了 17-AAG/miRNA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的miRNA濃度依賴性。A，具有治療劑；B， 沒有治療劑。圖10顯示了抗體微陣列結(jié)果。圖11顯示了 miRNAs增強(qiáng)奧沙利鉬活性。圖12顯示了 miRNAs增強(qiáng)紫杉醇活性。發(fā)明詳述I.定義如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“施用”是指將治療劑例如miRNA遞送至生物，從而所述 試劑將會(huì)接觸患病細(xì)胞，并且如果對(duì)于功能而言必需，進(jìn)入患病細(xì)胞。在載體的情況下， miRNA在患病細(xì)胞中的表達(dá)也將會(huì)是由于施用而引起。許多施用方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員已知的。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)治療劑的活性”意指引起治療劑的活性的顯著改變 (例如，至少大約10%，至少大約20%，至少大約25%，至少大約33%，至少大約50%，至少 大約100 %，至少大約2倍，至少大約3倍，至少大約10倍，至少大約100倍或更多的改變)。 所述增強(qiáng)可以表現(xiàn)為減少劑量、減少副作用或縮短療法過(guò)程的能力。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“核酸”是指多個(gè)核苷酸(即，包含與磷酸基團(tuán)和可交換 的有機(jī)堿相連接的糖(例如核糖或脫氧核糖)的分子，所述可交換的有機(jī)堿為經(jīng)取代的嘧 啶(例如胞嘧啶(C)、胸苷(T)或尿嘧啶(U))或經(jīng)取代的嘌呤(例如腺嘌呤(A)或鳥嘌呤 (G)))。該術(shù)語(yǔ)還應(yīng)當(dāng)包括多核苷(即，減去了磷酸的多核苷酸)和任何其他包含有機(jī)堿的 聚合物。嘌呤類和嘧啶類包括但不限于，腺嘌呤，胞嘧啶，鳥嘌呤，胸苷，肌苷，5-甲基胞嘧 啶，2-氨基嘌呤，2-氨基-6-氯嘌呤，2，6_ 二氨基嘌呤，次黃嘌呤，以及其他天然和非天然存 在的核堿基，經(jīng)取代和未取代的芳香族部分。其他此類修飾是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。 因此，術(shù)語(yǔ)“核酸”還包括具有取代或修飾(例如在堿基和/或糖中)的核酸。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“微小RNA”(或miRNA)是指任何類型的干擾RNA，包括但 不限于，內(nèi)源微小RNA和人工微小RNA。內(nèi)源微小RNA是在基因組中天然存在的小RNAs，其 能夠調(diào)節(jié)mRNA的生產(chǎn)利用。術(shù)語(yǔ)“人工的”或“合成的”微小RNA包括除內(nèi)源微小RNA之 外的任何類型的RNA序列，其能夠調(diào)節(jié)mRNA的生產(chǎn)利用。如本文中所使用的，“微小RNA側(cè)翼序列”是指包括微小RNA加工元件的核苷酸序 列。微小RNA加工元件是促成從前體微小RNA產(chǎn)生成熟微小RNA的最小限度核酸序列。稱 為pri-miRNAs的前體miRNA在細(xì)胞核中被加工成大約15-70個(gè)核苷酸的pre-miRNAs，其折 疊成不完全的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。微小RNA側(cè)翼序列可以是天然微小RNA側(cè)翼序列或人工微小RNA側(cè)翼序列。天然 微小RNA側(cè)翼序列是在天然存在的系統(tǒng)中通常與微小RNA序列相聯(lián)合的核苷酸序列，即這 些序列被發(fā)現(xiàn)存在于在體內(nèi)圍繞最小限度微小RNA發(fā)夾的基因組序列內(nèi)。人工微小RNA側(cè) 翼序列是在天然存在的系統(tǒng)中未發(fā)現(xiàn)處于微小RNA序列側(cè)翼的核苷酸序列。人工微小RNA 側(cè)翼序列可以是天然地在其他微小RNA序列的情形下發(fā)現(xiàn)的側(cè)翼序列。備選地，它們可以 由最小限度微小RNA加工元件組成，所述最小限度微小RNA加工元件在天然存在的側(cè)翼序 列內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，并且插入到并不天然地作為側(cè)翼序列存在或僅部分地作為天然側(cè)翼序列存在 的其他隨機(jī)核酸序列中。
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在前體微小RNA分子內(nèi)的微小RNA側(cè)翼序列可以處于包含微小RNA序列的莖-環(huán) 結(jié)構(gòu)的一側(cè)或兩側(cè)的側(cè)翼。優(yōu)選的結(jié)構(gòu)在莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的兩個(gè)末端處具有側(cè)翼序列。側(cè)翼序 列可以與莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的一個(gè)或兩個(gè)末端直接相鄰，或者可以通過(guò)接頭、額外的核苷酸或其 他分子與莖-環(huán)結(jié)構(gòu)相連接。如本文中所使用的，“莖-環(huán)結(jié)構(gòu)”是指具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸，所述二級(jí)結(jié)構(gòu)包括 已知或預(yù)知形成雙鏈的核苷酸的區(qū)域(莖部分)，所述雙鏈在一側(cè)通過(guò)主要地單鏈的核苷 酸的區(qū)域(環(huán)部分)相連接。術(shù)語(yǔ)“發(fā)夾”和“折回”結(jié)構(gòu)在本文中也用于指莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。 此類結(jié)構(gòu)和術(shù)語(yǔ)是本領(lǐng)域眾所周知的。在莖-環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)的核苷酸的實(shí)際一級(jí)序列不是關(guān)鍵 的，只要存在二級(jí)結(jié)構(gòu)。如本領(lǐng)域中已知的，二級(jí)結(jié)構(gòu)不需要精確的堿基配對(duì)。因此，莖可 以包含一個(gè)或多個(gè)堿基錯(cuò)配。備選地，堿基配對(duì)可以不包括任何錯(cuò)配。DNA分離物被理解為意指化學(xué)合成的DNA、cDNA或基因組DNA，其具有或不具有3 ‘ 和/或5 ‘側(cè)翼區(qū)域。編碼miRNA的DNA可以從任何來(lái)源獲得，通過(guò)a)從包含mRNA的細(xì)胞 獲得cDNA文庫(kù)，b)用經(jīng)標(biāo)記的編碼miRNA或其片段(通常，大于IOObp)的DNA進(jìn)行雜交 分析，以便檢測(cè)出在所述cDNA文庫(kù)中的包含同源序列的克隆，和c)通過(guò)限制酶分析和核酸 測(cè)序來(lái)分析所述克隆，以鑒定出全長(zhǎng)克隆。如本文中所使用的，當(dāng)它們天然地或人工地源自共同的祖先核酸或核酸序列時(shí)， 核酸和/或核酸序列是同源的。一般由兩個(gè)或更多個(gè)核酸或蛋白質(zhì)(或其序列)之間 的序列同一性來(lái)推斷同源性。如本文中所使用的，如果兩個(gè)核酸和/或核酸序列(包括 miRNAs)在這兩個(gè)序列中的每個(gè)相應(yīng)位置處具有相同的核苷酸，那么它們是“同一的”，其 中為了該分析的目的，尿嘧啶和胸苷視為等同。當(dāng)兩個(gè)序列通過(guò)合適的算法進(jìn)行比對(duì)時(shí)， 這兩個(gè)序列具有基于它們所共享的相同核苷酸的數(shù)目的同一性百分比，所述合適的算法例 如為 bl2seq (Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), " Blast 2 sequences-a newtool for comparing protein and nucleotide sequences " , FEMSMicrobiol Lett. 174 :247-250),其是公眾通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)可得的。如果兩個(gè)序列可以在所有核苷酸處堿基配對(duì)，那么 它們是“互補(bǔ)的”。互補(bǔ)性百分比基于當(dāng)就堿基配對(duì)將所述序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)每條鏈中可以與 另一序列堿基配對(duì)的核苷酸的百分比。如本文中所使用的，“治療劑”是指用于治療哺乳動(dòng)物疾病或病狀的任何合適的現(xiàn) 有技術(shù)藥物或其他處理。例如，azileCt、L-多巴/卡比多巴、mirapex或苯海索，其用于帕 金森病?！胺蛛x的核酸”表示從其天然狀態(tài)中取出并且對(duì)于進(jìn)行克隆來(lái)說(shuō)是合適地純的。II. 一般原理A.熱休克蛋白 90(HSP90)已通過(guò)突變分析顯示，HSP90為正常真核細(xì)胞的存活所必需的。此外，HSP90在許 多腫瘤類型中過(guò)表達(dá)，這表明它可能在癌細(xì)胞的存活中起重大作用，并且癌細(xì)胞可能對(duì)于 HSP90的抑制比正常細(xì)胞更敏感。例如，癌細(xì)胞通常具有大量的經(jīng)突變且過(guò)表達(dá)的癌蛋白 質(zhì)，其依賴于HSP90來(lái)進(jìn)行折疊。已牽涉癌癥進(jìn)展的HSP90客戶蛋白質(zhì)的實(shí)例包括Her_2、 c-Kit, c-Met, Akt激酶、Cdk4/細(xì)胞周期蛋白D復(fù)合體、Raf-I、v_src、BCR-ABL融合蛋白、 類固醇激素受體、P53和Hif-Ι。此外，因?yàn)槟[瘤的環(huán)境由于低氧、營(yíng)養(yǎng)剝奪、酸中毒等而通
15常是不適宜的，所以腫瘤細(xì)胞可能尤其依賴于HSP90而存活。因此，HSP90的抑制有希望用于開發(fā)新的癌癥療法。HSP90的抑制引起許多癌蛋白 質(zhì)以及激素受體和轉(zhuǎn)錄因子的同時(shí)抑制，這使其成為抗癌劑的有吸引力的靶標(biāo)。HSP90抑制劑可能在治療其他疾病中具有效用。例如，HSP抑制劑，17-AAG， 引起多谷氨酰胺(PolyQ)-擴(kuò)展的雄激素受體(Al )的降解，所述多谷氨酰胺-擴(kuò)展的 雄激素受體是神經(jīng)變性疾病脊髓延髓性肌萎縮中的致病性基因產(chǎn)物(Waza M等人， 2006, Alleviatingneurodegeneration by an anticancer agent. Annals of the New YorkAcademy of Sciences 1086 :21-34)。B.微小 RNAs微小RNAs (稱為“miRNAs”)是小的非編碼RNAs，其屬于在植物和動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的 一類調(diào)節(jié)分子，該類調(diào)節(jié)分子通過(guò)與靶信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄物上的互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合來(lái)控制 基因表達(dá)。mi RNAs由大的RNA前體(稱為pri_miRNAs)產(chǎn)生，所述大的RNA前體在細(xì)胞 核中被加工成大約70個(gè)核苷酸的pre-miRNAs，其折疊成不完全的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(Lee，Y.等 人，Nature (2003) 425 (6956) :415-9)。pre_miRNAs在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)歷額外的加工步驟，其中 通過(guò)RNA酶III酶(切酶(Dicer))而從pre-miRNA發(fā)夾的一側(cè)切割下長(zhǎng)度為18-25個(gè) 核苷酸的成熟 miRNAs (Hutvagner，G.等人，Science (2001) 12 :12 ；和 Grishok，Α.等人， Cell (2001) 106(1) :23-34)。已顯示，miRNAs以兩種方式調(diào)節(jié)基因表達(dá)。首先，與和該miRNA 精確互補(bǔ)的編碼蛋白質(zhì)的mRNA序列結(jié)合的miRNAs誘導(dǎo)RNA介導(dǎo)性干擾(RNAi)途徑。通 過(guò)RISC復(fù)合體中的核糖核酸酶來(lái)切割信使RNA靶。主要在植物中已觀察到這種miRNA-介 導(dǎo)的基因沉默機(jī)制(Hamilton，A. J.和 D. C. Baulcombe，Science (1999) 286 (5441) :950-2; 禾口 Reinhart，B. J.等人，MicroRNAs in plants. Genes and Dev. (2002) 16:1616—1626)， 但從動(dòng)物中獲知了實(shí)例(Yekta, S.，I. H. Shih 和 D. P. Bartel，Science (2004) 304(5670) 594-6)。在第二種機(jī)制中，與信使RNA轉(zhuǎn)錄物上的不完全互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合的mi RNAs指導(dǎo)在 轉(zhuǎn)錄后水平上的基因調(diào)節(jié)，但不切割其mRNA靶。在植物和動(dòng)物中所鑒定的miRNAs使用這 種機(jī)制來(lái)施行其基因靶的翻譯控制(Bartel，D. P.，Cell (2004) 116(2) :281-97)。因此，總體而言，本發(fā)明的目標(biāo)為在聯(lián)合療法中提供天然存在的miRNAs，以增強(qiáng)任 何治療劑的治療活性。在此，呈現(xiàn)了用于使用HSP90抑制劑來(lái)增強(qiáng)治療劑的活性的方法，以 證實(shí)所述方法。適合于活性增強(qiáng)的其他治療劑包括例如奧沙利鉬和紫杉醇。本發(fā)明的進(jìn)一步目標(biāo)為提供天然存在的核酸用于治療或預(yù)防癌癥或增殖性疾病 (其依賴于HSP90失調(diào)或者由HSP90失調(diào)引起)的一種或多種癥狀。本發(fā)明的進(jìn)一步目標(biāo)為將miRNA的檢測(cè)用作關(guān)于對(duì)于療法的應(yīng)答的診斷，所述療 法作為具有miRNA的聯(lián)合療法或者作為使用治療劑例如HSP90抑制劑的單一療法。為了達(dá)到這些和其他目標(biāo)，本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)在患有癌癥、神經(jīng)變性疾病、再 狹窄或增殖性細(xì)胞疾病的生物中治療劑(例如HSP抑制劑17-AAG)的活性的方法和組合 物，其包括在施用所述治療劑之前、期間或之后，施用有效量的miRNA。因此，本發(fā)明提供了可以是合成的或由分離的核酸編碼的miRNA。根據(jù)本發(fā)明的 miRNA包括例如pri-miRNA、pre-miRNA、成熟miRNA、ds miRNA及其片段或變體。所述miRNA 可以是經(jīng)化學(xué)修飾的RNA，例如它可以用選自下列的化學(xué)部分進(jìn)行修飾硫代磷酸酯、硼烷 磷酸酯、2’ -0-甲基、2’ -氟、末端反轉(zhuǎn)-dT堿基、PEG及其組合。根據(jù)本發(fā)明，所述miRNA
16可以作為裸露的RNA即在鹽水或D5中進(jìn)行施用，或者在陽(yáng)離子脂質(zhì)體、中性脂質(zhì)體、基于 聚合物的納米顆粒、膽固醇綴合物、環(huán)狀葡聚糖復(fù)合物、聚乙烯亞胺聚合物或蛋白質(zhì)復(fù)合物 中進(jìn)行施用。根據(jù)本發(fā)明，可以以靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、經(jīng)鼻、腹膜內(nèi)、經(jīng)陰道、經(jīng)肛門、經(jīng)口、 眼內(nèi)或鞘內(nèi)方式將所述miRNA直接施用至患病組織。參見例如，F(xiàn)ougerolles, Human Gene Therapy(2008) 19 :125-132 ；Behlke, Molecular Therapy(2006) 13(4) :644-670 本發(fā)明還提供了用于增強(qiáng)在患有癌癥、神經(jīng)變性疾病、再狹窄或增殖性細(xì)胞疾病 的生物中治療劑的活性的方法和治療性組合物(包括miRNAs)，其包括在施用所述治療劑 之前(包括例如，之前大約8小時(shí)、大約12小時(shí)、大約1天、大約2天、大約3天、大約1周、 大約2周、大約1個(gè)月或更多)、期間(包括例如，同時(shí)地，在大約10分鐘內(nèi)、在大約30分鐘 內(nèi)、在大約1小時(shí)內(nèi)、在大約2小時(shí)內(nèi)、在大約8小時(shí)內(nèi)、在大約12小時(shí)內(nèi)、在大約1天內(nèi)) 或之后(包括例如，之后大約8小時(shí)、大約12小時(shí)、大約1天、大約2天、大約3天、大約1 周、大約2周、大約1個(gè)月或更久)，施用有效量的miRNA或者表達(dá)有效量的miRNA的載體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的核酸，包括包含任何下列miRNAs的序 列的那些miR145(GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU)(SEQ ID NO 1),miR454-3p(UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)，miR519a(AAAGUGCAUCCUUUUAGA(iU(;UUAC) (SEQ ID NO :3)，miR520c(AAAGUGCUUCCUUUUAGAGG⑶U)(SEQ ID NO :4)，miR520d(AAAGUGCUUCUCUUUG⑶GG⑶U)(SEQ ID NO :5)，miR-425-3p (AUCGGGAAUGUC⑶⑶CCGCC) (SEQ ID NO :6)，miR-495(AAACAAACAUGGUGCACUUCUUU)(SEQ ID NO :7)，miR-572 (GUCCGCUCGGCG⑶GGCCCA)(SEQ ID NO :8)，miR-661 (UGCCUGG⑶CUCUGGCCUGCGCGU) (SEQ ID NO :9)，其互補(bǔ)物，或者與其 18 個(gè) 鄰接核苷酸至少81 %同一，優(yōu)選地至少95 %同一的序列。備選地，在其他實(shí)施方案中，所述 miRNA包括SEQ ID NO :10-35中的一種或多種。還提供了包含與miRNAs互補(bǔ)的核酸或肽核酸的探針。還提供了包含所述探針的 組合物。還提供了包含所述探針的生物芯片。本發(fā)明進(jìn)一步提供了生物學(xué)樣品，其可以就可測(cè)量的核酸水平進(jìn)行檢驗(yàn)。所述核 酸可以包含任何下列 miRNAs 的序列miR145 (GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU) (SEQ ID NO 1)，miR454-3p(UA(iUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU) (SEQ ID NO 2)，miR519a (AAAGUGCAUCCUU UUAGA⑶⑶UAC) (SEQ ID NO 3)，miR520c (AAAGUGCUUCCUUUUAGAGG⑶U) (SEQ ID NO :4)， miR520d(AAA⑶GCUUCUCUUUGGUGGGUU) (SEQ ID NO :5)。所述核酸還可以包含與任何所列出 的miRNAs的大約18個(gè)鄰接核苷酸至少大約81%同一，優(yōu)選地至少95%同一的序列。高于 對(duì)照水平的該核酸的水平表明對(duì)所述療法作出應(yīng)答，和低于對(duì)照水平的該核酸的水平表明 對(duì)所述療法不作出應(yīng)答，在這個(gè)實(shí)例中所述療法為HSP90抑制劑，例如17-AAG、奧沙利鉬或 其組合。本發(fā)明進(jìn)一步提供了生物學(xué)樣品，從中可以測(cè)量核酸水平。所述核酸可以包 含任何下列 miRNAs 的序列:miR-425_3p(AUCGGGAAUGUCGUGUCCGCC)(SEQ ID NO :6)， miR-495(AAACAAACAUGGUGCACUUCUUU)(SEQ ID NO :7)，miR-572^UCCGCUCGGCG⑶GGCCCA)(SEQ ID N0:8)，miR-661(UGCCUGG(iUCUCUGGCCUGCGCGU)(SEQ ID NO :9)。所述核酸還可以 包含與任何所列出的miRNAs的大約18個(gè)鄰接核苷酸至少大約81 %同一，優(yōu)選地至少95% 同一的序列。高于對(duì)照水平的該核酸的水平表明對(duì)所述療法作出應(yīng)答，和低于對(duì)照水平 的該核酸的水平表明對(duì)所述療法不作出應(yīng)答，例如關(guān)于用于紫杉醇的miR-425-3p(SEQ ID NO :6)、miR-495(SEQ ID NO :7)、miR_572 (SEQ ID NO :8)和 miR-661 (SEQID NO :9)的序列。本發(fā)明還提供了用于鑒定調(diào)節(jié)癌癥相關(guān)miRNA的表達(dá)的化合物的方法(a)提供 能夠表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1的核酸的細(xì)胞；(b)使所述細(xì)胞與候選調(diào)節(jié)劑相接觸；和(c)測(cè) 量所述核酸的表達(dá)水平，其中相比于對(duì)照而言所述核酸水平的差異將該化合物鑒定為所述 miRNA的表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。III.組合物已顯示了，HSP90抑制劑17-AAG的活性通過(guò)一系列miRNA而得到增強(qiáng)。因此，上 調(diào)這些特定的微小RNAs或者外源地提供類似的藥物化合物，一般而言應(yīng)當(dāng)對(duì)于在特定和 任何治療學(xué)中增強(qiáng)HSP90抑制劑來(lái)說(shuō)是有效的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將miRNA制劑施用給具有已使HSP90表達(dá)失調(diào)的癌癥的個(gè) 體。A.核酸序列和變體本發(fā)明的特別有利的實(shí)施方案包括下列的miRNAs組作為HSP90抑制 齊U 的增強(qiáng)劑miR145 (⑶CCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU) (SEQ ID NO 1), miR454-3p ( UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU) (SEQ ID NO :2)，miR519a (AAAGUGCAUCCUUUUAGAG UGUUAC) (SEQ ID NO :3)，miR520c(AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGUU) (SEQ ID NO :4)， miR520d(AAAGUGCUUCUCUUUG⑶GG⑶U)(SEQ ID NO :5)。miRNA的序列變體落入下列三個(gè)類別中的一個(gè)或多個(gè)之中置換、插入或缺失變 體。插入包括5'和/或3'末端融合物，以及單個(gè)或多個(gè)殘基(包括至少3個(gè)、至少5個(gè)、 至少10個(gè)、至少15個(gè)、至少30個(gè)和至少50個(gè)核苷酸)的序列內(nèi)插入。還可以在成熟序列 內(nèi)引入插入。然而，這些通常將會(huì)是比在5'或3'末端處的那些更小的插入，1-4個(gè)殘基左
右οmiRNA的插入序列變體是其中一個(gè)或多個(gè)殘基引入到靶miRNA中的預(yù)定位點(diǎn)處的 那些。最常見的插入變體是在miRNA的5'或3'末端處的核酸融合物。缺失變體的特征在于從miRNA序列中去除一個(gè)或多個(gè)殘基。這些變體通常通過(guò)下 列方式來(lái)制備對(duì)編碼miRNA的DNA中的核苷酸進(jìn)行位點(diǎn)專一誘變，從而產(chǎn)生編碼變體的 DNA，并在其后在重組細(xì)胞培養(yǎng)中表達(dá)DNA。但是，變體miRNA片段可以方便地通過(guò)體外合成 來(lái)制備。變體通常展示在質(zhì)上與天然存在的類似物相同的生物活性，盡管也選擇變體以便 修飾miRNA的特征。置換變體是其中已去除了序列的例如至少1個(gè)到至少3個(gè)核苷酸并且在其位置處 插入了不同核苷酸的那些。盡管用于引入序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先確定的，但突變本身無(wú)需 是預(yù)先確定的。例如，為了優(yōu)化在給定位點(diǎn)處的突變的性能，可以在靶區(qū)域處進(jìn)行隨機(jī)誘 變，并且就所需活性的最佳組合來(lái)篩選所表達(dá)的miRNA變體。用于在具有已知序列的DNA 中的預(yù)定位點(diǎn)處進(jìn)行置換突變的技術(shù)是眾所周知的。核苷酸置換通常是單個(gè)殘基；插入常常將會(huì)是大約1-10個(gè)殘基左右；和缺失將會(huì)
18是大約1-30個(gè)殘基。優(yōu)選地，在相鄰對(duì)中進(jìn)行缺失或插入；即缺失2個(gè)殘基或插入2個(gè)殘 基。置換、缺失、插入或其任何組合可以相組合以獲得最終構(gòu)建體?？梢赃M(jìn)行改變以增加 miRNA的活性，增加其生物學(xué)穩(wěn)定性或半衰期，等等。包括了對(duì)于編碼此類miRNA的核苷酸 序列的所有此類修飾。在建立同源性中有用的序列之間的精確的同一性百分比隨著所討論的核酸和蛋 白質(zhì)而變化，但低至25%的序列同一性常規(guī)地用于建立同源性。更高水平的序列同一性， 例如30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%或者更高，也可以用于建立同源 性。用于測(cè)定序列相似性百分比的方法(例如，使用缺省參數(shù)的BLASTN)是普遍可獲得的。 用于執(zhí)行BLAST分析的軟件是公眾通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心可得的。B.增強(qiáng)HSP90抑制劑的治療潛能的miRNAs已鑒定了調(diào)節(jié)人癌基因的天然存在的微小RNAs，pri-miRNA、pre-miRNA、成 熟miRNA或者其片段或變體(保留了成熟miRNA的生物活性)，以及編碼pri-miRNA、 pre-miRNA、成熟miRNA、其片段或變體或者編碼該miRNA的調(diào)控元件的DNA。miRNA的大小 通常為18個(gè)核苷酸至170個(gè)核苷酸，盡管可以采用高至2000個(gè)核苷酸的核苷酸。在一個(gè) 優(yōu)選的實(shí)施方案中，pre-miRNA的大小范圍為長(zhǎng)70-170個(gè)核苷酸，和成熟miRNA的長(zhǎng)度為 21-25個(gè)核苷酸。還可以使用允許將成熟的單鏈miRNA并入到RISC復(fù)合體中的合成miRNAs例如 ds-miRNA和經(jīng)修飾的ds_miRNA。ds_miRNA的大小為長(zhǎng)10-70個(gè)核苷酸。從顯示出增強(qiáng)HSP90抑制劑17-AAG的細(xì)胞凋亡活性的miRNA組中選擇miRNA。 這些包括下述 miRNAs 組miR145 (GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU) (SEQ ID NO :1)、miR 454-3p(UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)、miR519a(AAAGUGCAUCCUUUUA GAGUGUUAC) (SEQ ID NO :3)、miR520c(AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGUU) (SEQ ID NO :4)、 miR520d (AAAGUGCUUCUCUUUG⑶GG⑶U) (SEQ ID NO :5)，作為HSP90抑制劑或有絲分裂抑制劑 的增強(qiáng)劑。C.核酸技術(shù)描述了分子生物學(xué)技術(shù)的普通教科書包括Sambrook，MolecularCloning a Laboratory Manual (2. sup. nd ed.), Vols. 1-3, ColdSpring Harbor Laboratory, (1989) ；Current Protocols inMolecular Biology, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc. , NewYork (1997) ；Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology !Hybridization With Nucleic Acid Probes, Parti. Theory and Nucleic Acid Preparation, P. Tijssen, ed. Elsevier, N. Y. (1993) ；Berger 禾口 Kimmel, Guide to Molecular CloningTechniques Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc. ,San Diego,Calif0這些教科書描述了誘變、載體的使用、啟動(dòng)子和許多其他與例如基 因的產(chǎn)生和表達(dá)有關(guān)的相關(guān)主題，所述基因編碼let-7或任何其他miRNA活性。用于核酸 (基因)的分離、純化和操作的技術(shù)，例如產(chǎn)生文庫(kù)、亞克隆到表達(dá)載體中、標(biāo)記探針和DNA 雜交也描述在上述教科書中，并且是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的。核酸(無(wú)論是miRNA、DNA、cDNA或基因組DNA，還是其變體)可以從各種來(lái)源中分 離，或者可以在體外合成。本文中所描述的核酸可以施用至人、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞 或者在人、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)，在經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞裂解物中，或者以經(jīng)部分純
19化的或?qū)嵸|(zhì)上純的形式。依照本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的許多一般手段中的任何手段來(lái)檢測(cè)和定量核酸。 這些包括例如分析型生物化學(xué)方法，例如分光光度法，射線照相術(shù)，電泳，毛細(xì)管電泳，高效 液相色譜法(HPLC)，薄層色譜法(TLC)，和超擴(kuò)散色譜法，各種免疫學(xué)方法，例如流體或凝 膠沉淀素反應(yīng)，免疫擴(kuò)散(單向或雙向)，免疫電泳，放射免疫測(cè)定法(RIA)，酶聯(lián)免疫吸附 測(cè)定法(ELISA)，免疫熒光測(cè)定法等，Southern分析，Northern分析，斑點(diǎn)印跡分析，凝膠電 泳，RT-PCR,定量PCR，其他核酸或靶或信號(hào)擴(kuò)增方法，放射性標(biāo)記，閃爍計(jì)數(shù)，和親和層析?？梢允褂酶鞣N類型的誘變，例如來(lái)修飾編碼具有miRNA活性的基因的核酸。它們 包括但不限于位點(diǎn)定向誘變、隨機(jī)點(diǎn)誘變、同源重組(DNA改組)、使用含尿嘧啶的模板的誘 變、寡核苷酸指導(dǎo)的誘變、硫代磷酸酯修飾的DNA誘變、和使用有缺口的雙鏈體DNA的誘變 等。另外的合適方法包括，點(diǎn)錯(cuò)配修復(fù)、使用修復(fù)缺陷型宿主株系的誘變、限制-選擇和限 制-純化、缺失誘變、通過(guò)全基因合成的誘變、雙鏈斷裂修復(fù)等。例如牽涉嵌合構(gòu)建體的誘 變也包括在本發(fā)明中。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)天然存在的分子或者經(jīng)改變或突變的 天然存在的分子的已知信息(例如序列、序列比較、物理性質(zhì)、晶體結(jié)構(gòu)等)來(lái)指導(dǎo)誘變?？?以進(jìn)行改變以增加miRNA的活性、增加其生物學(xué)穩(wěn)定性或半衰期，等等。比較雜交可以用于鑒定編碼具有l(wèi)et-7或其他miRNA活性的基因的核酸，包括核 酸的保守變異。當(dāng)核酸結(jié)合在一起(通常在溶液中)時(shí)，它們“雜交”。核酸由于各種經(jīng) 充分表征的物理化學(xué)力(例如氫鍵合、溶劑排斥、堿基堆積等)而雜交。關(guān)于核酸 雜交的廣泛指導(dǎo)可在 Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part 1 chapter2, " Overview of principles of hybridization and the strategyof nucleic acid probe assays, “ (Elsevier, N. Y.)中以及在 Ausubel (同上)中找至[U Hames 禾口 Higgins(1995)Gene Probes 1 IRL Pressat Oxford University Press, Oxford, England, (HamesfPHigginsl)以及 Hames 禾口 Higgins (1995) Gene Probes 2 IRL Press at OxfordUniversity Press, Oxford, England(Hames 禾口 Higgins 2)提供了關(guān)于 DNA 禾口 RNA(包括寡核苷酸)的合成、標(biāo)記、檢測(cè)和定量的細(xì)節(jié)。如果它們所編碼的多肽是實(shí)質(zhì)上同一的，那么在嚴(yán)緊條件下不相互雜交的核酸仍 是實(shí)質(zhì)上同一的。這例如在當(dāng)使用由遺傳密碼所允許的最大限度密碼子簡(jiǎn)并性來(lái)產(chǎn)生核酸 拷貝時(shí)發(fā)生。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)緊雜交條件”意指這樣的條件，在所述條件下核酸將會(huì)與其靶子序列雜交 (通常在復(fù)雜的核酸混合物中)，但不與其他序列雜交。嚴(yán)緊條件是序列依賴性的，并且在 不同境況下將是不同的。更長(zhǎng)的序列在更高的溫度下特異性地雜交。一般地，將嚴(yán)緊條件 選擇為比在指定的離子強(qiáng)度和PH下特定序列的熱解鏈溫度(Tm)低大約5-10°C。Tm是這 樣的溫度(在指定的離子強(qiáng)度、PH和核酸濃度下)，在該溫度下50%的與靶互補(bǔ)的探針與 靶序列平衡地雜交(因?yàn)榘行蛄羞^(guò)量存在，所以在Tm下，50%的探針平衡地被占據(jù))。嚴(yán) 緊條件將會(huì)是這樣的條件，其中在PH 7. 0-8. 3下，鹽濃度小于大約1. OM鈉離子，通常大約 0.01-1. OM鈉離子濃度(或其他鹽)，并且溫度對(duì)于短探針(例如，10-50個(gè)核苷酸)為至少 大約30°C，和對(duì)于長(zhǎng)探針(例如，大于50個(gè)核苷酸)為至少大約60°C。嚴(yán)緊條件還可以通過(guò)添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來(lái)達(dá)到。對(duì)于選擇性或特異性雜交，陽(yáng)性信號(hào)為背景的至少2 倍，優(yōu)選地為背景雜交的10倍。示例性的嚴(yán)緊雜交條件可以為如下50%甲酰胺，5XSSC， 和SDS，在42°C下溫育，或5XSSC，1% SDS，在65°C下溫育，采用在65°C下在0. 2XSSC 和0. SDS中進(jìn)行洗滌。用于在本文所描述的方法中使用的合適核酸包括但不限于pri-miRNA、 pre-miRNA.ds miRNA、成熟miRNA或者保留了該miRNA的生物活性的其片段或變體，以及編 碼pri-miRNA、pre-miRNA、成熟miRNA、其片段或變體的DNA，或者編碼該miRNA的調(diào)控元件 的DNA。此外，DNA和PNA可以替代RNA，條件是維持堿基配對(duì)能力。D.載體在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼miRNA分子的核酸在載體上。這些載體包括編碼成熟微 小RNA的序列和體內(nèi)表達(dá)元件。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些載體包括編碼pre-miRNA 的序列和體內(nèi)表達(dá)元件，從而使得所述pre-miRNA在體內(nèi)表達(dá)并加工成成熟miRNA。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，這些載體包括編碼pri-miRNA基因的序列和體內(nèi)表達(dá)元件。在這個(gè)實(shí)施方 案中，首先，初級(jí)轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行加工，從而產(chǎn)生莖-環(huán)前體miRNA分子。然后，該莖-環(huán)前體進(jìn) 行加工，從而產(chǎn)生成熟微小RNA。載體包括但不限于質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、病毒、源自病毒或細(xì)菌來(lái)源的其他媒介物， 其已經(jīng)通過(guò)插入或摻入用于產(chǎn)生微小RNA的核酸序列和可以附著至這些核酸序列的游離 核酸片段而進(jìn)行了操作。病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是優(yōu)選的載體類型，并且包括但不限于 來(lái)自下列病毒的核酸序列逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒；鼠干細(xì)胞病毒，哈維 (Harvey)鼠肉瘤病毒；鼠乳腺腫瘤病毒；勞斯肉瘤病毒；腺病毒；腺伴隨病毒；SV40-型病 毒；多瘤病毒；EB病毒；乳頭狀瘤病毒；皰疹病毒；痘苗病毒；脊髓灰質(zhì)炎病毒；和RNA病毒 例如任何逆轉(zhuǎn)錄病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地采用本領(lǐng)域已知的其他載體。病毒載體通常基于非致細(xì)胞病變性真核病毒，其中非必需基因已被目的核酸序 列替代。非致細(xì)胞病變性病毒包括逆轉(zhuǎn)錄病毒，其生活周期涉及基因組病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄 成DNA，隨后原病毒整合到宿主細(xì)胞DNA中。逆轉(zhuǎn)錄病毒已被批準(zhǔn)用于人基因療法試驗(yàn)。 在遺傳上經(jīng)改變的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體通用于核酸的體內(nèi)高效轉(zhuǎn)導(dǎo)。用于產(chǎn)生復(fù)制缺 陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒的標(biāo)準(zhǔn)方案(包括將外源遺傳材料摻入到質(zhì)粒中，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞 系，通過(guò)該包裝細(xì)胞系產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，從組織培養(yǎng)基中收集病毒顆粒，和用病毒顆 粒轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞這些步驟)提供在 Kriegler，M.，“ Gene Transfer and Expression, A LaboratoryManual, ‘’ W. H. Freeman Co. , New York (1990),禾口 Murry, Ε. J. Ed. '’ Methods in Molecular Biology, " vol. 7, Humana Press, Inc. , Cliffton, N. J. (1991)中。Ε.啟動(dòng)子和其他轉(zhuǎn)錄/表達(dá)控制序列“體內(nèi)表達(dá)元件”是任何調(diào)控核苷酸序列，例如啟動(dòng)子序列或啟動(dòng)子-增強(qiáng)子組合， 其促進(jìn)核酸的有效表達(dá)以產(chǎn)生微小RNA。體內(nèi)表達(dá)元件可以例如為哺乳動(dòng)物或病毒啟動(dòng)子， 例如組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或者組織特異性啟動(dòng)子。其實(shí)例是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周 知的。組成型哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子包括但不限于，聚合酶啟動(dòng)子以及下列基因的啟動(dòng)子次黃嘌 呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPTR)、腺苷脫氨酶、丙酮酸激酶和β -肌動(dòng)蛋白。在真核細(xì)胞中組成性 地起作用的示例性病毒啟動(dòng)子包括但不限于，來(lái)自猿猴病毒、乳頭狀瘤病毒、腺病毒、人免 疫缺陷病毒(HIV)、勞斯肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子，莫洛尼白血病病毒和其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)，和單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動(dòng)子。其他組成型啟動(dòng)子是本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在誘導(dǎo)物存在下表達(dá)，并且包括但不限于金屬誘 導(dǎo)型啟動(dòng)子和類固醇調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子。例如，金屬硫蛋白啟動(dòng)子在某些金屬離子存在下被誘 導(dǎo)以推進(jìn)轉(zhuǎn)錄。其他誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。組織特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于，肌酸激酶的啟動(dòng)子(其已用于指導(dǎo)在肌 肉和心臟組織中的表達(dá))和用于在B細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的免疫球蛋白重鏈或輕鏈啟動(dòng)子。其 他組織特異性啟動(dòng)子包括人平滑肌α-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。用于肝的示例性的組織特異性表達(dá)元件包括但不限于，HMG-COA還原酶啟動(dòng)子、固 醇調(diào)節(jié)元件1、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)啟動(dòng)子、人C-反應(yīng)蛋白(CRP)啟動(dòng)子、人葡 糖激酶啟動(dòng)子、膽固醇7-α羥化酶(CYP-7)啟動(dòng)子、β-半乳糖苷酶α-2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶 啟動(dòng)子、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP-I)啟動(dòng)子、醛縮酶B啟動(dòng)子、人轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動(dòng) 子和I型膠原啟動(dòng)子。用于前列腺的示例性的組織特異性表達(dá)元件包括但不限于，前列腺酸性磷酸酶 (PAP)啟動(dòng)子、前列腺分泌性蛋白94(PSP 94)啟動(dòng)子、前列腺特異性抗原復(fù)合物啟動(dòng)子、和 人腺體激肽釋放酶基因啟動(dòng)子(hgt-1)。用于胃組織的示例性的組織特異性表達(dá)元件包括但不限于，人H+/K+-ATP酶α亞 基啟動(dòng)子。用于胰腺的示例性的組織特異性表達(dá)元件包括但不限于，胰腺炎相關(guān)蛋白啟動(dòng)子 (PAP)、彈性蛋白酶1轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、胰腺特異性淀粉酶和彈性蛋白酶增強(qiáng)子啟動(dòng)子、以及胰 腺膽固醇酯酶基因啟動(dòng)子。用于子宮內(nèi)膜的示例性的組織特異性表達(dá)元件包括但不限于，子宮珠蛋白啟動(dòng) 子。用于腎上腺細(xì)胞的示例性的組織特異性表達(dá)元件包括但不限于，膽固醇側(cè)鏈切割 酶(SCC)啟動(dòng)子。用于一般神經(jīng)系統(tǒng)的示例性的組織特異性表達(dá)元件包括但不限于，Y-Y烯醇化 酶(神經(jīng)元特異性烯醇化酶，NSE)啟動(dòng)子。用于腦的示例性的組織特異性表達(dá)元件包括但不限于，神經(jīng)絲重鏈(NF-H)啟動(dòng) 子。用于淋巴細(xì)胞的示例性的組織特異性表達(dá)元件包括但不限于，人CGL-I/粒酶B啟 動(dòng)子、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)啟動(dòng)子、λ 5啟動(dòng)子、VpreB啟動(dòng)子、和Ick(淋巴細(xì)胞 特異性酪氨酸蛋白激酶p561ck)啟動(dòng)子、人CD2啟動(dòng)子及其3'轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、以及人NK和T 細(xì)胞特異性激活基因(NKGO啟動(dòng)子。用于結(jié)腸的示例性的組織特異性表達(dá)元件包括但不限于，pp60c-src酪氨酸激酶 啟動(dòng)子、器官特異性新抗原(OSNs)啟動(dòng)子和結(jié)腸特異性抗原-P啟動(dòng)子。用于乳腺細(xì)胞的示例性的組織特異性表達(dá)元件包括但不限于，人α-乳清蛋白啟 動(dòng)子。用于肺的示例性的組織特異性表達(dá)元件包括但不限于，囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié) 蛋白(CFTR)基因啟動(dòng)子。幫助在目的組織中的表達(dá)特異性的其他元件可以包括分泌前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子、核
22定位信號(hào)、內(nèi)體分解肽等。優(yōu)選地，這些元件源自目的組織以幫助特異性。一般而言，需要時(shí)，體內(nèi)表達(dá)元件應(yīng)當(dāng)包括涉及轉(zhuǎn)錄起始的5'非轉(zhuǎn)錄和5'非翻 譯序列。它們?nèi)芜x地包括增強(qiáng)子序列或上游激活子序列。F.用于產(chǎn)生miRNA的方法和材料miRNA可以從細(xì)胞或組織中分離，重組產(chǎn)生，或者通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周 知的各種技術(shù)在體外合成。在一個(gè)實(shí)施方案中，從細(xì)胞或組織中分離miRNA。用于從細(xì)胞或組織中分離miRNA 的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的。例如，可以使用來(lái)自Ambion，Inc的mirVana miRNA分離試劑盒從總RNA中分離miRNA。另一種技術(shù)利用flashPAGE Fractionator System (Ambion, Inc.)用于小核酸的PAGE純化。miRNA可以通過(guò)制備其重組形式來(lái)獲得(即，通過(guò)使用基因工程技術(shù)來(lái)產(chǎn)生重組 核酸，其隨后可以通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)來(lái)分離或純化)。這個(gè)實(shí)施方 案涉及在合適的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，并且從所述細(xì)胞或其中生長(zhǎng)有所述細(xì)胞的 培養(yǎng)物中純化出miRNA。例如，所述方法包括用于產(chǎn)生miRNA的過(guò)程，其中將包含包括編 碼miRNA的核酸的合適表達(dá)載體的宿主細(xì)胞在允許所編碼的miRNA表達(dá)的條件下進(jìn)行培 養(yǎng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸編碼let-7。miRNA可以從培養(yǎng)物中、從培養(yǎng)基 中或者從由宿主細(xì)胞制備的裂解物中回收，并且進(jìn)一步進(jìn)行純化。宿主細(xì)胞可以是高等 真核宿主細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，低等真核宿主細(xì)胞例如酵母細(xì)胞，或者宿主細(xì)胞可以是 原核細(xì)胞例如細(xì)菌細(xì)胞。可以通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE、葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔來(lái)實(shí)現(xiàn) 將包含編碼miRNA的核酸的載體引入到宿主細(xì)胞中(Davis，L.等人，Basic Methods in MolecularBiology(1986)) ο任何宿主/載體系統(tǒng)都可以用于表達(dá)所述miRNAs中的一種或多種。這些包括 但不限于，真核宿主例如HeLa細(xì)胞和酵母，以及原核宿主例如大腸桿菌(E. coli)和枯草 芽孢桿菌(B. subtilis)?？梢栽诓溉閯?dòng)物細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或其他細(xì)胞中表達(dá)miRNA，其中 miRNA基因處于合適啟動(dòng)子的控制下。用于與原核和真核宿主一起使用的合適的克隆和表 達(dá)載體由 Sambrook 等人描述在 Molecular Cloning ALaboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)miRNA。哺 乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例包括C127、猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、人腎293細(xì)胞、 人表皮A431細(xì)胞、人Colo205細(xì)胞、3T3細(xì)胞、CV-I細(xì)胞、其他經(jīng)轉(zhuǎn)化的靈長(zhǎng)類細(xì)胞系、正 常二倍體細(xì)胞、衍生自原初組織的體外培養(yǎng)的細(xì)胞株、原初外植塊、HeLa細(xì)胞、小鼠L細(xì)胞、 BHK、HL-60、U937、HaK或Jurkat細(xì)胞。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體將包括復(fù)制起點(diǎn)、合適的啟動(dòng)子、 多腺苷酸化位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列和5'側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。源自SV40病毒基因組的DNA序 列，例如SV40起點(diǎn)、早期啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、剪接和多腺苷酸化位點(diǎn)可以用于提供所需的非轉(zhuǎn) 錄的遺傳元件?？赡芎线m的酵母菌株包括釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂 殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)菌株、假絲酵母屬 (Candida)或能夠表達(dá)miRNA的任何酵母菌株?？赡芎线m的細(xì)菌菌株包括大腸桿菌、枯草芽 孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)或能夠表達(dá)miRNA的任何細(xì)菌菌株。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離編碼選自下列的miRNA的基因組DNA miR145(GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU) (SEQ ID NO 1) , miR454_3p (UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU) (SEQ ID NO 2)，miR519a(AAAGUGCAUCCUUUUAGAGUGUU AC) (SEQ ID NO 3) , miR520c (AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGUU) (SEQ ID NO :4)， miR520d (AAAGUGCUUCUCUUUGGUGGGUU) (SEQ ID NO :5)，miR_425_3p(AUCGGGAAUGUCG UGUCCGCC) (SEQ ID NO :6)，miR-495(AAACAAACAUGGUGCACUUCUUU) (SEQ ID NO :7)， miR-572(GUCCGCUCGGCGGUGGCCCA)(SEQ ID NO :8)和 / 或miR-661(UGCCUGGGUCUCUGGCCUGCG CGU) (SEQ ID NO :9)，在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)所述基因組DNA，純化RNA，并且進(jìn)行修飾， 當(dāng)對(duì)于施用給患者而言必需時(shí)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，miRNA以pre-miRNA的形式，其 可以根據(jù)需要進(jìn)行修飾(即，為了增加的穩(wěn)定性或細(xì)胞攝取)。對(duì)于miRNA的DNA序列的了解使得能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行修飾，以允許或增加內(nèi)源miRNA 的表達(dá)。細(xì)胞可以進(jìn)行修飾(例如，通過(guò)同源重組)以提供增加的miRNA表達(dá)，通過(guò)整體 或部分地用異源啟動(dòng)子的全部或部分替代天然存在的啟動(dòng)子，從而使得細(xì)胞以較高水平 表達(dá)miRNA。異源啟動(dòng)子以這樣的方式插入，即使得它與所希望的miRNA編碼序列有效地 連接。參見例如，Transkaryotic Therapies, Inc.的 PCT 國(guó)際公開號(hào) WO 94/12650，Cell Genesys，Inc.的PCT 國(guó)際公開號(hào)W092/20808，和 Applied Research Systems 的PCT 國(guó)際公 開號(hào)W091/09955。細(xì)胞還可以進(jìn)行改造，以在誘導(dǎo)型調(diào)控元件控制下表達(dá)包含mi RNA的內(nèi) 源基因，在這種情況下該內(nèi)源基因的調(diào)控序列可以通過(guò)同源重組而被替代。基因激活技術(shù) 描述在Chappel的美國(guó)專利號(hào)5，272，071 ；Sherwin等人的美國(guó)專利號(hào)5，578，461 ；Selden 等人的 PCT/US92/09627 (W093/09222)；和 Skoultchi 等人的 PCT/US90/06436 (W091/06667) 中。miRNA可以通過(guò)在適合于表達(dá)miRNA的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞來(lái) 制備。然后，可以從此類培養(yǎng)物中(即，從培養(yǎng)基或細(xì)胞提取物中)純化所得到的表達(dá) 出的miRNA，其中使用已知純化方法，例如凝膠過(guò)濾和離子交換色譜法。miRNA的純化還 可以包括包含將會(huì)與蛋白質(zhì)結(jié)合的試劑的親和柱；在諸如伴刀豆球蛋白A-瓊脂糖、肝 素-toyopearl 或Cikicrom blue 3GA kpharose 的親和樹脂上的一個(gè)或多個(gè)柱步驟；涉 及疏水作用色譜法的一個(gè)或多個(gè)步驟，其中使用諸如苯基醚、丁基醚或丙基醚的樹脂；免疫 親和層析，或互補(bǔ)cDNA親和層析。miRNA也可以被表達(dá)為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)物，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的特征為包含編碼 miRNA的核苷酸序列的體細(xì)胞或生殖細(xì)胞?？梢允褂猛粗亟M將包含編碼miRNA的DNA和 合適的調(diào)控元件的載體插入到動(dòng)物種系中(Capecchi, Science 244 :1288-1292(1989)), 從而使得表達(dá)miRNA。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(優(yōu)選地，非人哺乳動(dòng)物)通過(guò)使用下列文獻(xiàn)中所描述 的方法來(lái)產(chǎn)生:Robinson等人的美國(guó)專利號(hào)5，489，743，和Ontario Cancer Institute的 PCT公開號(hào)WO 94/28122.可以從分離自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞或組織中分離miRNA，如上所討 論的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，miRNA可以合成獲得，例如通過(guò)經(jīng)由技術(shù)人員已知的任 何合成方法來(lái)化學(xué)合成核酸。然后，所合成的miRNA可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行 純化。用于化學(xué)合成核酸的方法包括但不限于，體外化學(xué)合成，其使用磷酸三酯、磷酸酯或 亞磷酰胺化學(xué)和固相技術(shù)，或者經(jīng)由脫氧核苷氫膦酸酯中間體(參見Miongle的美國(guó)專利 號(hào) 5，705，629)。在某些情況下，例如，當(dāng)希望獲得增加的核酸酶穩(wěn)定性時(shí)，具有核酸類似物和/或經(jīng)修飾的核苷間鍵合的核酸可能是優(yōu)選的。包含經(jīng)修飾的核苷間鍵合的核酸也可以 使用本領(lǐng)域眾所周知的試劑和方法來(lái)合成。例如，合成包含下列核苷間鍵合的核酸的方 法是本領(lǐng)域眾所周知的膦酸酯、硫代硫酸酯、二硫代硫酸酯、氨基磷酸酯、甲氧基乙基氨 基磷酸酯、甲縮醛(formacetal)、硫甲縮醛(thioformacetal)、二異丙基甲硅烷基、乙酰 胺化物(acetamidate)、氨基甲酸酯、二亞甲基-硫醚(--CH2—S—CH2)、二亞甲基-亞砜 (-CH2-SO-CH2)、二亞甲基-砜(--CH2--SO2-CH2)、2 ‘ -0-烷基和 2 ‘-脫氧-2 ‘-氟 硫代硫酸酯核苷間鍵合(參見Uhlmann等人，1990，Chem. Rev. 90 :543-584 ；Schneider等 人，1990，"Tetrahedron Let t. 31 :335，以及其中所引用的參考文獻(xiàn))。Cook等人的美國(guó) 專利號(hào)5，614，617和5，223，618，Acevedo等人的美國(guó)專利號(hào)5，714，606，Cook等人的美 國(guó)專利號(hào)5，378，825，Buhr等人的美國(guó)專利號(hào)5，672，697和5，466，786，Cook等人的美國(guó) 專利號(hào)5，777，092，De Mesmaeker等人的美國(guó)專利號(hào)5，602，240，Cook等人的美國(guó)專利號(hào) 5，610，289,以及Wang的美國(guó)專利號(hào)5，858，988，也描述了用于增強(qiáng)的核酸酶穩(wěn)定性和細(xì)胞 攝取的核酸類似物。IV.制劑將所述組合物施用給需要治療或預(yù)防癌癥/增殖性疾病的至少一種癥狀或表現(xiàn) (因?yàn)榧膊】梢栽诓淮嬖诎Y狀的情況下發(fā)生/進(jìn)展)的患者。癌基因的異常表達(dá)是癌癥的 標(biāo)志。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物以有效量進(jìn)行施用，以增強(qiáng)hsp90抑制劑17-AAG 的治療活性。還描述了用于治療或預(yù)防癌癥的至少一種癥狀或表現(xiàn)的方法，其包括施用有效量 的包含核酸分子的組合物，以減輕至少一種癥狀或降低至少一種表現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施 方案中，所述癌癥為肺癌癥。本文所描述的組合物可以單獨(dú)地或者與輔助癌癥療法(例如 手術(shù)、化學(xué)療法、放射療法、溫?zé)岑煼?、免疫療法、激素療法和激光療?相組合地以有效劑 量進(jìn)行施用，以提供有益的效果，例如減少腫瘤大小、減少腫瘤的細(xì)胞增殖、抑制血管生成、 抑制轉(zhuǎn)移，或者改善疾病的至少一種癥狀或表現(xiàn)。上文所描述的核酸優(yōu)選地與合適的藥物載體組合地用于治療用途。此類組合物包 含有效量的化合物以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。制備制劑以適宜于施用方式。藥學(xué) 上可接受的載體部分地由待施用的特定組合物以及用于施用該組合物的特定方法來(lái)決定。 因此，存在有廣泛多樣的包含核酸的藥物組合物的合適制劑，其中某些在本文中描述。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，體內(nèi)施用的核酸被攝取并分配至細(xì)胞和組織(Huang 等人，F(xiàn)EBS Lett. 558(1-3) :69-73 (2004))。例如，Nyce等人已顯示，當(dāng)吸入時(shí)，反義寡脫 氧核苷酸(ODNs)結(jié)合至內(nèi)源表面活性劑(由肺細(xì)胞產(chǎn)生的脂質(zhì))，并且被肺細(xì)胞攝取而 無(wú)需額外的載體脂質(zhì)(Nyce和Metzger，Nature, 385 :721-725 (1997))。小的核酸容易地 被攝取到TM膀胱癌組織培養(yǎng)細(xì)胞中(Ma等人，Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8 415-426(1998))。已將siRNAs用于通過(guò)全身施用來(lái)進(jìn)行內(nèi)源基因的治療沉默(Soutschek 等人，Nature 432,173-178 (2004)) 上文所描述的核酸可以處于用于在合適的藥物載體中表面地、局部地或全身地 施用的制劑中 ° E. W. Martin 的 Remington ‘ sPharmaceutical Sciences,第 15 版(Mark Publishing Company, 1975)公開了典型的載體和制備方法。所述核酸也可以包囊在合適的 生物相容性微膠囊、微顆粒或微球體(其由生物可降解或生物不可降解的聚合物或蛋白質(zhì)
25形成)或者脂質(zhì)體中以用于靶向細(xì)胞。此類系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且可以 就與合適的核酸一起使用來(lái)進(jìn)行優(yōu)化。用于核酸遞送的各種方法描述在例如Sambrook等人，1989，Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory,New York ；禾口Ausubel 等人，1994, Current Protocolsin Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 中。此類核酸 遞送系統(tǒng)包含所希望的核酸，例如但不限于，以作為“裸露”核酸的“裸露”形式(例如，在 鹽水或D5中)，或者配制在適合于遞送的媒介物中，例如在具有陽(yáng)離子分子或脂質(zhì)體形成 性脂質(zhì)的復(fù)合物中，或者作為載體的組分，或者作為藥物組合物的組分?？梢詫⒑怂徇f送系 統(tǒng)直接地(例如通過(guò)使其與細(xì)胞相接觸)或間接地(例如通過(guò)任何生物學(xué)過(guò)程的作用)提 供給細(xì)胞。例如但不限于，可以通過(guò)下列方式將核酸遞送系統(tǒng)提供給細(xì)胞胞吞作用，受體 靶向，與天然或合成細(xì)胞膜片段相偶聯(lián)，物理手段例如電穿孔，使核酸遞送系統(tǒng)與聚合物載 體例如控釋薄膜或納米顆?；蛭㈩w粒相組合，使用載體，將核酸遞送系統(tǒng)注射到圍繞細(xì)胞 的組織或流體中，核酸遞送系統(tǒng)簡(jiǎn)單擴(kuò)散穿過(guò)細(xì)胞膜，或者通過(guò)任何主動(dòng)或被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制 而穿過(guò)細(xì)胞膜。另外，可以通過(guò)使用諸如病毒載體的與抗體相關(guān)的靶向和由抗體介導(dǎo)的固 定化的技術(shù)來(lái)將核酸遞送系統(tǒng)提供給細(xì)胞。用于表面施用的制劑可以包括軟膏劑、洗劑、乳膏劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、 液體制劑和粉劑。根據(jù)需要可以使用常規(guī)的藥物載體，水性、粉末或油性基質(zhì)，增稠劑等。適合于腸胃外施用(例如通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)(在關(guān)節(jié)中)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和 皮下途徑)的制劑包括水性和非水性的、等滲的無(wú)菌注射液，其可以包含抗氧化劑、緩沖 劑、抑菌劑和使得該制劑與預(yù)期受者的血液等滲的溶質(zhì)；以及水性和非水性的無(wú)菌懸浮液、 溶液或乳狀液，其可以包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、分散劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。用于注射的 制劑可以與所添加的防腐劑一起以單位劑量形式呈現(xiàn)，例如在安瓿中或在多劑量容器中。 組合物可以采取此類形式。制備物包括無(wú)菌的水性或非水性的溶液、懸浮液和乳狀液，其可以與受試者的血 液等滲，在某些實(shí)施方案中。非水性溶劑的實(shí)例為聚丙二醇，聚乙二醇，植物油例如橄欖油、 芝麻油、椰子油、落花生油、花生油，礦物油，可注射的有機(jī)酯例如油酸乙酯，或固定油(包 括合成的甘油單酯或甘油二酯)。水性載體包括水，醇性/水性溶液、乳狀液或懸浮液，其 包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外媒介物包括氯化鈉溶液、1，3_ 丁二醇、林格氏葡萄糖、葡萄糖 和氯化鈉、乳酸鹽林格氏液或固定油。靜脈內(nèi)媒介物包括流體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物、電解質(zhì)補(bǔ)充物 (例如基于林格氏葡萄糖的那些)等。還可以存在防腐劑和其他添加劑，例如抗微生物劑、 抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。此外，無(wú)菌的固定油常規(guī)地用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此目 的，可以采用任何溫和的固定油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸 可以用于制備注射劑。載體制劑可以在Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.，Easton, 1 中找到。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定用于制備和配制組 合物的各種參數(shù)，而不依靠過(guò)度的實(shí)驗(yàn)。單獨(dú)的或與其他合適組分相組合的核酸也可以制備成氣霧劑制劑(即，它們可以 “霧化”)，以經(jīng)由吸入進(jìn)行施用。氣霧劑制劑可以置于加壓的可接受的推進(jìn)劑(例如二氯二 氟甲烷、丙烷、氮?dú)獾?中。對(duì)于通過(guò)吸入進(jìn)行施用，常規(guī)地以從加壓的包裝或噴霧器中的 氣霧劑噴霧呈現(xiàn)形式來(lái)遞送核酸，其中使用合適的推進(jìn)劑。
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在一些實(shí)施方案中，上文所描述的核酸可以包括藥學(xué)上可接受的載體，其有著配 制成分，例如鹽、載體、緩沖試齊 、乳化齊 、稀釋齊 、賦形齊 、螯合齊 、填充齊 、干燥齊 、抗氧化 劑、抗微生物劑、防腐劑、粘合劑、增量劑、二氧化硅、增溶劑或穩(wěn)定劑。在一個(gè)實(shí)施方案中， 將核酸綴合至親脂性基團(tuán)例如膽固醇以及具有C32官能度的月桂酸和石膽酸衍生物，以改 善細(xì)胞攝取。例如，膽固醇已被證實(shí)在體外(Lorenz等人，Bioorg. Med. Chem. Lett. 14(19) 4975-4977(2004))和體內(nèi)(Soutschek 等人，Nature 432(7014) :173-178(2004))增強(qiáng) siRNA的攝取和血清穩(wěn)定性。此外，已顯示，綴合有類固醇的寡核苷酸與血流中不同脂蛋白 例如LDL的結(jié)合，保護(hù)完整性并且促進(jìn)生物分布(Rump等人，Biochem. Pharmacol. 59 (11) 1407-1416(2000))?？梢愿街粱蚓Y合至上文所描述的核酸以增加細(xì)胞攝取的其他基團(tuán)包 括但不限于，吖啶衍生物；交聯(lián)劑例如補(bǔ)骨脂素衍生物、疊氮基苯甲酰甲基、原黃素和疊氮 基原黃素；人工核酸內(nèi)切酶；金屬絡(luò)合物例如EDTA-Fe(II)和卟啉-Fe(II)；烷基化部分； 核酸酶例如堿性磷酸酶；末端轉(zhuǎn)移酶；抗體酶；膽固醇基部分；親脂載體；肽綴合物；長(zhǎng)鏈 醇；磷酸酯；放射性標(biāo)記物；非放射性標(biāo)記物；碳水化合物；和聚賴氨酸或其他多胺。Levy 等人的美國(guó)專利號(hào)6，919，208還描述了用于增強(qiáng)的核酸分子遞送的方法。
這些藥物制劑可以以本身已知的方式進(jìn)行制備，例如借助于常規(guī)的混合、溶解、粒 化、水飛、乳化、包囊、包載或凍干過(guò)程。本文所描述的核酸制劑包括核酸的融合物或核酸的修飾物，其中核酸與另外一個(gè) 或多個(gè)部分(例如靶向部分)或另一治療劑相融合。此類類似物可以展示出經(jīng)改善的性 質(zhì)，例如活性和/或穩(wěn)定性?？梢耘c核酸相連接或不相連接的部分的實(shí)例包括例如提供將 核酸遞送至特定細(xì)胞的靶向部分，例如針對(duì)胰腺細(xì)胞、免疫細(xì)胞、肺細(xì)胞或任何其他首選的 細(xì)胞類型的抗體，以及在首選的細(xì)胞類型上表達(dá)的受體和配體。優(yōu)選地，所述部分靶向癌癥 或腫瘤細(xì)胞。例如，由于癌細(xì)胞增加了葡萄糖的消耗，所以核酸可以與葡萄糖分子相連接。 靶向癌癥或腫瘤細(xì)胞的單克隆人源化抗體是優(yōu)選的部分，并且可以與核酸相連接或不相連 接。在癌癥治療學(xué)的情況下，靶抗原通常是對(duì)于腫瘤細(xì)胞而言獨(dú)特的和/或必需的蛋白質(zhì) (例如，受體蛋白HER-2)。V.治療方法A.施用方法一般而言，施用核酸的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。特別地，已用于核酸治療學(xué)的施 用途徑連同目前使用的制劑一起提供了用于上文所描述的核酸的優(yōu)選的施用途徑和制劑。核酸組合物可以通過(guò)許多途徑進(jìn)行施用，包括但不限于經(jīng)口、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌 內(nèi)、透皮、皮下、表面、舌下或經(jīng)直腸方式。核酸還可以經(jīng)由脂質(zhì)體進(jìn)行施用。此類施用途徑 和合適的制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍已知的。本文所描述的制劑的施用可以通過(guò)任何可接受的方法來(lái)完成，所述方法允許 miRNA或編碼miRNA的核酸到達(dá)其靶。所選擇的特定方式當(dāng)然將會(huì)依賴于諸如下列的因素 特定的制劑，待治療的受試者的狀態(tài)的嚴(yán)重度，和對(duì)于治療效果而言所需的劑量。如本文中 通常使用的，核酸的“有效量”是這樣的量，所述量在施用了該制劑的受試者中能夠治療癌 癥或相關(guān)疾病的一種或多種癥狀，逆轉(zhuǎn)癌癥或相關(guān)疾病的一種或多種癥狀的進(jìn)展，停止癌 癥或相關(guān)疾病的一種或多種癥狀的進(jìn)展，或者預(yù)防癌癥或相關(guān)疾病的一種或多種癥狀的出 現(xiàn)，與未接受該化合物或治療劑的相匹配的受試者相比較。根據(jù)待利用的特定藥物或其組
27合，配制的特定組合物，施用方式，和患者的年齡、重量、狀況，以及待治療的癥狀或病狀的 嚴(yán)重度，藥物的實(shí)際有效量可以變化。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何可接受的方法可以用于將制劑施用給受試者。依 賴于待治療的病狀，施用可以是局域性的(即，施用至特定的區(qū)域、生理學(xué)系統(tǒng)、組織、器官 或細(xì)胞類型)或全身性的。注射可以是例如靜脈內(nèi)的、皮內(nèi)的、皮下的、肌內(nèi)的或腹膜內(nèi)的。可以皮內(nèi)注射組 合物以用于治療或預(yù)防例如癌癥。在一些實(shí)施方案中，可以在多個(gè)位置處給予注射。植入包 括插入植入型藥物遞送系統(tǒng)，例如微球體，水凝膠，聚合物儲(chǔ)庫(kù)，膽固醇基質(zhì)，聚合物系統(tǒng)， 例如基質(zhì)侵蝕和/或擴(kuò)散系統(tǒng)，和非聚合物系統(tǒng)，例如壓縮的、融合的或部分融合的小丸。 吸入包括以在吸入器中的氣霧劑來(lái)施用組合物，單獨(dú)地或附著至可以被吸收的載體。對(duì)于 全身施用，優(yōu)選的是將組合物包囊在脂質(zhì)體中。優(yōu)選地，以這樣的方式提供試劑和/或核酸遞送系統(tǒng)，所述方式使得達(dá)到所述試 劑和/或核酸遞送系統(tǒng)的組織特異性攝取。技術(shù)包括使用組織或器官定位裝置例如傷口敷 料或透皮遞送系統(tǒng)，使用侵入性裝置例如血管或尿道導(dǎo)管，和使用介入性裝置例如具有藥 物遞送能力并被設(shè)置為擴(kuò)張裝置或支架移植物的支架?？梢允褂蒙锟晌g解植入物經(jīng)由擴(kuò)散或者通過(guò)聚合物基質(zhì)的降解來(lái)遞送制劑。在 某些實(shí)施方案中，可以這樣設(shè)計(jì)制劑的施用，以便導(dǎo)致在一定的時(shí)間段(例如數(shù)小時(shí)、數(shù) 天、數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年)期間連續(xù)暴露于miRNA。這可以例如通過(guò)制劑的反復(fù)施用或者通過(guò) 持續(xù)釋放或控制釋放遞送系統(tǒng)(其中在延長(zhǎng)的時(shí)間段期間遞送miRNA，而無(wú)需反復(fù)施用) 來(lái)完成。使用此類遞送系統(tǒng)來(lái)施用制劑可以例如通過(guò)口服劑型、推注、透皮貼劑或皮下植入 物。維持基本上恒定的組合物濃度在一些情況下可以是優(yōu)選的。其他合適的遞送系統(tǒng)包括但不限于，擇時(shí)釋放、延遲釋放、持續(xù)釋放或控制釋放遞 送系統(tǒng)。此類系統(tǒng)在許多情況下可以避免反復(fù)施用，從而增加對(duì)于受試者和醫(yī)生而言的方 便。許多類型的釋放遞送系統(tǒng)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可獲得的且已知的。它們包括例如， 基于聚合物的系統(tǒng)，例如聚乳酸和/或聚乙醇酸、聚酐、聚己酸內(nèi)酯、共聚草酸酯、聚酰胺 酯、聚原酸酯、聚羥基丁酸和/或這些的組合。包含核酸的前述聚合物的微膠囊描述在例 如美國(guó)專利號(hào)5，075，109中。其他實(shí)例包括基于脂質(zhì)的非聚合物系統(tǒng)，包括固醇例如膽固 醇，膽固醇酯，和脂肪酸或中性脂肪例如甘油單酯、二酯和三酯；水凝膠釋放系統(tǒng)；基于脂 質(zhì)體的系統(tǒng)；基于磷脂的系統(tǒng)；硅橡膠系統(tǒng)；基于肽的系統(tǒng)；蠟包衣；使用常規(guī)粘合劑和賦 形劑的壓制片劑；或部分融合的植入物。具體的實(shí)例包括但不限于，侵蝕系統(tǒng)，其中miRNA 包含于在基質(zhì)內(nèi)的制劑之中(例如，如在美國(guó)專利號(hào)4，452，775、4，675，189,5, 736, 152、 4，667，013,4, 748，034和5，239，660中所描述的)；或者擴(kuò)散系統(tǒng)，其中活性組分控制釋 放速率(例如，如在美國(guó)專利號(hào)3，832，253,3, 854，480,5, 133，974和5，407，686中所描述 的)。所述制劑可以作為例如微球體、水凝膠、聚合物儲(chǔ)庫(kù)、膽固醇基質(zhì)或聚合物系統(tǒng)。在 一些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)可以允許發(fā)生組合物的持續(xù)釋放或控制釋放，例如通過(guò)控制包 含miRNA的制劑的擴(kuò)散或侵蝕/降解速率。此外，基于泵的硬器具遞送系統(tǒng)(pump-based hardware delivery system)也可以用于遞送一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案。其中釋放以爆發(fā)方式發(fā)生的系統(tǒng)的實(shí)例包括，例如其中組合物包載在脂質(zhì)體中而 所述脂質(zhì)體包囊在聚合物基質(zhì)中的系統(tǒng)，所述脂質(zhì)體對(duì)于特定的刺激例如溫度、PH、光或降解酶敏感；和其中組合物通過(guò)具有微膠囊核心降解酶的離子包覆的微膠囊進(jìn)行包囊的系 統(tǒng)。其中抑制劑的釋放是逐步且連續(xù)的系統(tǒng)的實(shí)例包括，例如其中以在基質(zhì)內(nèi)的形式包含 組合物的侵蝕系統(tǒng)，和其中組合物以受控的速率滲透(例如通過(guò)聚合物)的滲出系統(tǒng)。此 類持續(xù)釋放系統(tǒng)可以例如以小丸或膠囊的形式。在一些實(shí)施方案中，長(zhǎng)期釋放植入物的使用可能是特別合適的。如本文中所使用 的，“長(zhǎng)期釋放”意指，構(gòu)建包含組合物的植入物，并將其布置為以至少30或45天，并且優(yōu)選 地至少60或90天，或者在一些情況下甚至更久，遞送治療有效水平的組合物。長(zhǎng)期釋放植 入物是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的，并且包括上文所描述的釋放系統(tǒng)中的一些。用于特定患者的劑量可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)確定，通過(guò)采用常規(guī)考慮(例 如借助于合適的常規(guī)藥理學(xué)方案)。醫(yī)生可以例如首先開出相對(duì)較低的劑量，隨后增加劑量 直至獲得合適的應(yīng)答。施用給患者的劑量足以隨著時(shí)間過(guò)去而在患者中實(shí)現(xiàn)有益的治療應(yīng) 答，或例如減少癥狀，或其他合適的活性，這取決于應(yīng)用。通過(guò)特定制劑的功效，和所采用的 miRNA的活性、穩(wěn)定性或血清半衰期和患者的狀況，以及待治療的患者的體重或表面積來(lái)確 定劑量。也通過(guò)任何不良副作用的存在、性質(zhì)和程度來(lái)確定劑量的大小，所述不良副作用伴 隨著在特定患者中特定載體、制劑等的施用而出現(xiàn)。任選地在一種或多種合適的體外和/或體內(nèi)疾病動(dòng)物模型中測(cè)試包含一種或多 種核酸的治療組合物，以證實(shí)功效、組織代謝以及評(píng)估用量，這根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法 來(lái)進(jìn)行。特別地，最初可以通過(guò)在相關(guān)測(cè)定法中治療相比于未治療而言(例如，經(jīng)處理的與 未處理的細(xì)胞或動(dòng)物模型的比較)的活性、穩(wěn)定性或其他合適的量度來(lái)確定劑量。以通過(guò) 下列方式確定的速率來(lái)施用制劑相關(guān)制劑的LD50，和/或觀察在各種濃度下的核酸的任 何副作用，其例如應(yīng)用于患者的質(zhì)量和總體健康狀況?？梢越?jīng)由單個(gè)劑量或分份劑量來(lái)完 成施用。體外模型可以用于確定作為潛在癌癥治療的核酸的有效劑量。合適的體外模型 包括但不限于，培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的增殖測(cè)定法，培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞在軟瓊脂中的生長(zhǎng)(參見 Freshney, (1987)Culture ofAnimal Cells :A Manual of Basic Technique, Wily-Liss, New York, N. Y. Ch 18 和 Ch 21)，裸鼠中的腫瘤系統(tǒng)，如在 Giovanella 等人，J. Natl. Can. Inst. ,52 :921-30(1974)中所描述的，Boyden Chamber測(cè)定法中腫瘤細(xì)胞的移動(dòng)性和侵 襲潛力，如在Pilkington等人，Anticancer Res. ,17 :4107-9(1997)中所描述的，和血管 生成測(cè)定法，例如雞尿囊絨膜血管形成的誘導(dǎo)或血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的誘導(dǎo)，其分別描述在 Ribatta 等人，Intl. J. Dev. Biol. ,40 :1189-97(1999)和 Li 等人，Clin. Exp. Metastasis, 17:423-9(1999)中。合適的腫瘤細(xì)胞系是可獲得的，例如可從美國(guó)典型組織培養(yǎng)物保藏中 心(American Type Tissue Culture Collection)目錄中獲得。體內(nèi)模型是用于確定作為潛在癌癥治療的上文所描述的核酸的有效劑量的優(yōu)選 模型。合適的體內(nèi)模型包括但不限于，在KRAS癌基因中攜帶突變的小鼠(Lox-Mop-Lox K-Ras. sup. G12D 突變體，Kras2. sup. tm4TYj)，其可從 National Cancer Institute (NCI) Frederick Mouse R印ository獲得。本領(lǐng)域已知并且可獲得的其他小鼠模型包括但不限 于，用于胃腸癌癥、造血系統(tǒng)癌癥、肺癌癥、乳腺癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、卵巢癌癥、前列腺癌 癥、皮膚癌癥、宮頸癌癥、口腔癌癥和肉瘤癌癥的模型(參見http://emice. nci. nih. gov/ mouse_models/)。
在確定在治療或預(yù)防疾病中待施用的miRNA的有效量中，醫(yī)生評(píng)估循環(huán)血漿水 平、制劑毒性和疾病的進(jìn)展。施用給70千克患者的劑量通常在與目前使用的治療性反義寡核苷酸例如 Yitravene (福米韋生鈉注射劑)(其由fda批準(zhǔn)用于治療巨細(xì)胞病毒rna)的劑量等 價(jià)的范圍中，并且其就相關(guān)組合物的改變的活性或血清半衰期進(jìn)行調(diào)整。本文所描述的制劑可以補(bǔ)充通過(guò)任何已知常規(guī)療法(包括但不限于，抗體施用、 疫苗施用、細(xì)胞毒劑的施用、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸類似物和生物應(yīng)答調(diào)節(jié)物)的 治療病狀。兩種或更多種相組合的化合物可以一起或順次使用。例如，所述核酸也可以作 為抗癌混合物的一部分以治療有效量進(jìn)行施用?？拱┗旌衔锸枪押塑账峄蛘{(diào)節(jié)劑與一種 或多種抗癌藥物的混合物，還包括用于遞送的藥學(xué)上可接受的載體?？拱┗旌衔镉米靼┌Y 治療是常規(guī)的?？拱┲委煱?quán)利要求四-40中任一項(xiàng)的組合物，其中所選擇的治療劑 為放射性核素、癌癥化學(xué)治療劑、靶向抗癌劑、DNA嵌入/損傷試劑、細(xì)胞周期關(guān)卡抑制劑、 抗代謝物、HSP抑制劑、抗生素、激酶抑制劑、放射性核素、生物學(xué)活性多肽、抗體、凝集素、毒 素、激素、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、血管抑制性類固醇或其組合。此外，本領(lǐng)域眾所周知且 可以與本文所描述的核酸相組合地用作治療的治療劑包括但不限于mI、9°Y、mh、211At、 32P、染料木素、阿霉素、安莎霉素、天冬酰胺酶、博來(lái)霉素、白消安、順鉬、卡鉬、卡莫司汀、卡 培他濱、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、喜樹堿、達(dá)卡巴嗪、更生霉素、柔紅霉素、右雷佐 生、多西他賽、多柔比星、依托泊苷、埃坡霉素類、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥 基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、巰基嘌呤、美法侖、氨甲蝶呤、雷帕 霉素、西羅莫司、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亞硝基脲、帕米膦酸、噴司他丁、普卡霉素、丙 卡巴胼、利妥昔單抗、鏈佐星、替尼泊苷、硫鳥嘌呤、塞替派、紫杉烷類、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、 長(zhǎng)春瑞濱、紅豆杉醇、康普瑞汀類、淅皮海綿內(nèi)酯類、反鉬、博來(lái)霉素、激素、他莫昔芬、己烯 雌酚、阿西替尼、阿瓦斯丁、馬立馬司他、貝伐珠單抗、羧胺三唑(carboxyamidotriazole)、 TNP-470、CM101、IFN-a、IL_12、血小板因子_4、蘇拉明、SU5416、血小板反應(yīng)蛋白、VEGFR拮 抗劑、軟骨衍生的血管生成抑制因子、血管抑制素、內(nèi)皮抑制素、2-甲氧基雌二醇、替可加蘭 (tecogalan)、血小板反應(yīng)蛋白、促乳素、α νβ3抑制劑、替可加蘭、BAY 12-9566、AG3340、 CGS27023A、C0L-3、vitaxin、ZD0101、TNP-40、沙立度胺、角鯊胺、IM862、PTK787、夫馬潔林、 夫馬潔林的類似物、BB-94、BB-2516、利諾胺、17-AAG、奧沙利鉬、紫杉醇及其組合。VI.所治療的疾病神經(jīng)變性疾病例如為阿爾茨海默病、帕金森病、ALS和脊髓延髓性肌萎縮。增殖性疾病選自肥大性瘢痕和瘢痕瘤、增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病變、類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎、動(dòng)靜脈畸形、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、傷口愈合延遲、血友病性關(guān)節(jié)、骨不連合性骨折、 奧-韋綜合征、銀屑病、膿性肉芽腫、硬皮病、沙眼、月經(jīng)過(guò)多、血管粘連和再狹窄。癌癥治療通過(guò)下述方式來(lái)促進(jìn)腫瘤消退抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制血管生成(支 持腫瘤生長(zhǎng)所需的新血管的生長(zhǎng))和/或經(jīng)由降低腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性或侵襲力而阻止轉(zhuǎn)移。 本文所描述的治療制劑在成人和兒科腫瘤學(xué)中可以是有效的，包括在固相腫瘤/惡性腫 瘤，局部進(jìn)展的腫瘤，人軟組織肉瘤，轉(zhuǎn)移性癌癥(包括淋巴轉(zhuǎn)移)，血細(xì)胞惡性腫瘤(包括 多發(fā)性骨髓瘤、急性和慢性白血病、和淋巴瘤)，頭與頸癌癥(包括口腔癌癥、喉癌癥和甲狀 腺癌癥)，肺癌癥(包括小細(xì)胞癌和非小細(xì)胞癌)，乳腺癌癥(包括小細(xì)胞癌和導(dǎo)管癌)，胃腸癌癥(包括食管癌癥、胃癌癥、結(jié)腸癌癥、結(jié)腸直腸癌癥和與結(jié)腸直腸瘤形成相關(guān)的息 肉)，胰腺癌癥，肝癌癥，泌尿道癌癥(包括膀胱癌癥和前列腺癌癥)，女性生殖道的惡性腫 瘤(包括卵巢癌、子宮(包括子宮內(nèi)膜)癌癥、和卵泡中的實(shí)體瘤)，腎癌癥(包括腎細(xì)胞 癌)，腦癌癥(包括內(nèi)因性腦腫瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞腦腫瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，在中樞神 經(jīng)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞侵襲)，骨癌癥(包括骨瘤)，皮膚癌癥(包括惡性黑素瘤、人 皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的腫瘤進(jìn)展、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、血管外皮細(xì)胞瘤和卡波西肉瘤) 中。治療制劑可以單獨(dú)地或與輔助癌癥療法(例如手術(shù)、化學(xué)療法、放射療法、溫?zé)岑煼?、?疫療法、激素療法和激光療法)相組合地以治療有效劑量進(jìn)行施用，以提供有益的效果，例 如減少腫瘤大小、減慢腫瘤生長(zhǎng)速率、減少腫瘤的細(xì)胞增殖、促進(jìn)癌細(xì)胞死亡、抑制血管生 成、抑制轉(zhuǎn)移、或者改善總體臨床狀況，而并非必需根除癌癥。癌癥包括但不限于膽道癌癥；膀胱癌癥；乳腺癌癥；腦癌癥，包括成膠質(zhì)細(xì)胞瘤 和成神經(jīng)管細(xì)胞瘤；宮頸癌癥；絨毛膜癌；結(jié)腸癌癥，包括結(jié)腸直腸癌；子宮內(nèi)膜癌癥；食管 癌癥；胃癌癥；頭與頸癌癥；血液學(xué)腫瘤，包括急性淋巴細(xì)胞和髓性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、 AIDS相關(guān)的白血病和成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤；上皮內(nèi)腫瘤，包括鮑恩病和佩吉特病；肝 癌癥；肺癌癥，包括小細(xì)胞肺癌癥和非小細(xì)胞肺癌癥；淋巴瘤，包括霍奇金病和淋巴細(xì)胞性 淋巴瘤；成神經(jīng)細(xì)胞瘤；口腔癌癥，包括鱗狀細(xì)胞癌；骨肉瘤；卵巢癌癥，包括由上皮細(xì)胞、 基質(zhì)細(xì)胞、生殖細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞而產(chǎn)生的那些；胰腺癌癥；前列腺癌癥；直腸癌癥；肉瘤， 包括平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、滑囊肉瘤和骨肉瘤；皮膚癌癥，包括黑 素瘤、卡波西肉瘤、基底細(xì)胞癌癥和鱗狀細(xì)胞癌癥；睪丸癌癥，包括生殖性細(xì)胞腫瘤例如精 原細(xì)胞瘤、非精原細(xì)胞瘤(畸胎瘤、絨毛膜癌)、基質(zhì)瘤和胚細(xì)胞瘤；甲狀腺癌癥，包括甲狀 腺腺癌和髓樣癌；移行細(xì)胞癌癥和腎癌癥，包括腺癌和維爾姆斯瘤。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案 中，施用制劑以用于治療或預(yù)防肺癌癥。因此，本文公開的本發(fā)明方法和組合物可以由正經(jīng)歷選自手術(shù)、化學(xué)療法、放射療 法、溫?zé)岑煼ā⒚庖忒煼?、激素療法和激光療法的一種或多種癌癥療法的人患者來(lái)使用。進(jìn) 一步地，本發(fā)明的方法和組合物允許在正經(jīng)歷選自手術(shù)、化學(xué)療法、放射療法、溫?zé)岑煼?、?疫療法、激素療法、激光療法或放置支架的一種或多種抗增殖療法的人患者中使用。此外，治療性核酸可以用于癌癥的預(yù)防性治療。存在有使個(gè)體易于形成癌癥的本 領(lǐng)域已知的遺傳狀況和/或環(huán)境情況(例如，暴露于致癌物)。在這些情況下，可能有益的 是，用治療有效劑量的核酸治療這些個(gè)體以減少形成癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以 將在合適制劑中的核酸施用給具有癌癥家族史的受試者，或者具有對(duì)于癌癥的遺傳易感性 的受試者。在其他實(shí)施方案中，將在合適制劑中的核酸施用給已達(dá)到特定年齡的受試者，或 者更可能獲得癌癥的受試者。在另外其他實(shí)施方案中，將在合適制劑中的核酸施用給已顯 示出癌癥(例如，早期或晚期)的癥狀的受試者。在另外其他實(shí)施方案中，可以將在合適 制劑中的核酸施用給受試者以作為預(yù)防措施。在一些實(shí)施方案中，可以將在合適制劑中的 核酸施用給基于人口統(tǒng)計(jì)狀況或流行病學(xué)調(diào)查的受試者，或者在特定領(lǐng)域或職業(yè)中的受試 者ο下述實(shí)施例進(jìn)一步舉例說(shuō)明了本發(fā)明，但當(dāng)然不應(yīng)當(dāng)被解釋為以任何方式限制了 其范圍。實(shí)施例1
這個(gè)實(shí)施例證明了 HSP90抑制劑17-AAG的細(xì)胞凋亡活性。ApO-ONE 均相胱天蛋白酶-3/7測(cè)定法(ftOmega，Madison, WI)使用擁有專 利權(quán)的裂解/活性緩沖液連同(Z-DEVD) 2-羅丹明110底物一起，允許用于在貼壁、懸浮和 原代培養(yǎng)細(xì)胞中或者在純化的胱天蛋白酶制備物中檢測(cè)胱天蛋白酶-3和-7的簡(jiǎn)單的“添 加-混合-讀取”形式。該測(cè)定法使用基于羅丹明110的底物，其允許先前用常規(guī)的比色測(cè) 定法或熒光測(cè)定法無(wú)法獲得的極度靈敏度。特別地，將100 μ 1 ApO - ONE 胱天蛋白酶-3/7試劑添加到包含100 μ 1空白、對(duì) 照或培養(yǎng)細(xì)胞的白色或黑色96-孔平板的每個(gè)孔中。用平板密封物覆蓋該平板以用于溫育 延長(zhǎng)的時(shí)間段(>4小時(shí))。為了在384-孔平板中施行該測(cè)定法，采用Αρο-ΟΝΕ 胱天蛋 白酶-3/7試劑樣品的1 1體積比。使用平板搖動(dòng)器以300-500rpm使孔的內(nèi)容物混合 30秒，并且在室溫下溫育6小時(shí)。在485/538nm下測(cè)定每個(gè)孔的熒光(細(xì)胞凋亡的量度，其 中更高的比率表明更多的細(xì)胞凋亡)。使用關(guān)于胱天蛋白酶-3/7活性的測(cè)定法(Αρο-ΟΝΕ試劑盒，Promega)，在結(jié)腸癌癥 系HD9中測(cè)定17-AAG(17-(烯丙基氨基)-17-脫甲氧格爾德霉素)的細(xì)胞凋亡活性。將 經(jīng)17-AAG處理的細(xì)胞與經(jīng)DMSO處理的對(duì)照進(jìn)行比較(圖1)。用各種濃度的17-AAG 在37°C下處理Η ^9細(xì)胞72小時(shí)。17-AAG以0. 07 μ g/ml或0. 12 μ M的EC50誘導(dǎo)細(xì)胞凋 亡。在更高濃度的17-AAG下，細(xì)胞死亡經(jīng)由非細(xì)胞凋亡途徑發(fā)生，并且存在有細(xì)胞凋亡活 性的人為減少。實(shí)施例2這個(gè)實(shí)施例證實(shí)了 HSP90抑制劑17-AAG抑制Her2的表達(dá)。將10，000個(gè)BT474細(xì)胞/孔種植到微量滴定板中，并且生長(zhǎng)48小時(shí)。在該預(yù)溫 育后，用各種濃度的17-AAG及其類似物處理BT474細(xì)胞M小時(shí)。在該溫育結(jié)束時(shí)，從每個(gè) 孔中除去培養(yǎng)基，用冰冷的Tris緩沖鹽水(包含0. 1% Tween 20)將每個(gè)孔洗滌2次，并且 用甲醇(冰冷的)在40°C下固定細(xì)胞10分鐘。經(jīng)固定的BT474細(xì)胞用抗-Her2抗體進(jìn)行 免疫染色。通過(guò)在平板閱讀器中測(cè)量405nm下的吸光度來(lái)測(cè)定Her2蛋白的存在。如圖2中所顯示的，關(guān)于Her2抑制測(cè)定法而言17-AAG的IC50接近32nM。這個(gè)結(jié) 果暗示，17-AAG強(qiáng)烈抑制Her2蛋白表達(dá)。實(shí)施例3這個(gè)實(shí)施例證明了，在17-AAG抑制HSP90后存在有Her2的內(nèi)在化和降解。通過(guò)共焦成像系統(tǒng)來(lái)檢查經(jīng)17-AAG處理的BT474細(xì)胞。將BT474細(xì)胞種植在載 玻片上，并且以IC50的濃度處理M小時(shí)。用甲醇固定經(jīng)17-AAG處理的和對(duì)照BT474細(xì) 胞，用Her2抗體染色，并且通過(guò)共焦成像進(jìn)行分析。如圖3中所顯示的，在17-AAG處理后， Her2蛋白表達(dá)從其細(xì)胞表面亞定位消除，而亞定位至細(xì)胞質(zhì)。實(shí)施例4這個(gè)實(shí)施例證實(shí)了，使用17-AAG和化學(xué)療法的聯(lián)合療法上調(diào)Hsp70。因此，HSP90 療法受到HSP70的補(bǔ)償性增加限制。就使用17-AAG的細(xì)胞凋亡活性的增強(qiáng)來(lái)測(cè)試抗癌化學(xué)治療劑的實(shí)驗(yàn)對(duì)象組(使 用與實(shí)施例1中相同的細(xì)胞凋亡測(cè)定法系統(tǒng))，圖4。在抗癌劑(包括已知的HSP70促進(jìn)劑 誘導(dǎo)物)存在或不存在下，用各種濃度的17-AAG處理HD9細(xì)胞。在藥物處理后3天，通
32過(guò)Apo-ONE試劑盒來(lái)測(cè)量細(xì)胞凋亡活性(參見上文)。當(dāng)與抗癌劑(包括HSP70誘導(dǎo)物) (例如順鉬、依托泊苷、多柔比星、萬(wàn)珂、Dimethylenastron)相聯(lián)合時(shí)。17-AAG的細(xì)胞凋 亡活性在萬(wàn)珂存在下被強(qiáng)烈抑制，已知萬(wàn)珂誘導(dǎo)HSP70表達(dá)(參見Lauricella M.等人， Apoptosis. 2006Apr ；11 (4) :607-25)。對(duì)于HSP70的其他誘導(dǎo)物也觀察到一些抑制。實(shí)施例5這個(gè)實(shí)施例證明了通過(guò)miRNAs增強(qiáng)17-AAG活性。為了觀察17-AAG活性的增強(qiáng)，已將具有470種pre-miRNA的miRNA文庫(kù)轉(zhuǎn)染 (Ambion, siPORT NeoFx轉(zhuǎn)染試劑)到Η ^9結(jié)腸癌癥系中，隨后進(jìn)行17-AAG處理。將來(lái)自 該miRNA文庫(kù)的合成ds-miRNAs轉(zhuǎn)染到Η ^9細(xì)胞中，并且在37°C下溫育48小時(shí)。將各種 濃度的17-AAG添加至經(jīng)miRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并且再溫育48小時(shí)。從每個(gè)孔中吸出 IOOuL培養(yǎng)基。通過(guò)以1 100濃度在緩沖液中稀釋底物來(lái)制備Apo-One胱天蛋白酶試劑。 將IOOuL試劑添加到每個(gè)孔中。使平板在室溫下溫育6小時(shí)。通過(guò)Fluoroskan平板閱讀 器來(lái)測(cè)量細(xì)胞凋亡活性。通過(guò)顯示出超過(guò)單獨(dú)的17-AAG的細(xì)胞凋亡讀數(shù)而與17-AAG發(fā)生 協(xié)同作用的分子。在17-AAG的1 800和1 3200稀釋度下均發(fā)生協(xié)同作用的分子為 miR-145、miR-454-3p、miR519a、miR-520c 和 miR_520d (SEQ ID NO :1_5)(圖 5，分別為暗色 背景)O實(shí)施例6這個(gè)實(shí)施例證實(shí)了一些來(lái)自實(shí)施例5的結(jié)果。將在實(shí)施例5中所使用的相同操作程序用于轉(zhuǎn)染在實(shí)施例5中鑒定發(fā)現(xiàn)的5種 miRNAs。但是，以1 800、1 3200和1 8000添加17-AAG，以進(jìn)一步確定用于細(xì)胞凋亡 活性的其最佳濃度。使細(xì)胞溫育48小時(shí)，并且使用與實(shí)施例5中所描述的相同操作程序來(lái) 進(jìn)行顯色。如圖6 (暗色)和圖7中所顯示的，所有5種miRNAs增強(qiáng)17-AAG的活性，而沒有 一種單獨(dú)地具有活性?！癉MS0”代表了用miRNAs轉(zhuǎn)染但未用17-AAG處理的細(xì)胞。使用用于轉(zhuǎn)染的各種不同miRNA濃度(6、3、1. 5和0. 75pmol)重復(fù)該實(shí)驗(yàn)，以最優(yōu) 化miRNA的工作劑量。使用在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的1 3200的17-AAG濃度。實(shí)施例7這個(gè)實(shí)施例證明了被發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)由17-AAG誘導(dǎo)的殺傷的miRNAs之間的相似性。將所鑒定的miRNAs的序列進(jìn)行比較，其中顯示出共享保守的殘基鏈段。一種 miRNA, hsa-mir-145,共享較少的序列同源性；而其他的 hsa-mir_519a、hsa-mir_520c、 hsa-mir-520d和hsa-4M_3p (分別為SEQ ID NO :3_6)顯示出廣泛的彼此同源性(圖8)。 因此，存在有2類受這些miRNA控制的靶。實(shí)施例8這個(gè)實(shí)施例證明了，17-AAG協(xié)同作用隨著所使用的miRNA的量增加而增加。為了證實(shí)實(shí)施例6中所顯示的活性，以恒定量的17_AAG(3. 125ug/ml)和增加量 的用于轉(zhuǎn)染的miRNAs (60、30、15、7.5nM)重復(fù)該實(shí)驗(yàn)。與17-AAG的協(xié)同作用顯示出隨 著所使用的miRNA的量增加而增加的活性(參見圖9A)。對(duì)于單獨(dú)的miRNA未觀察到細(xì) 胞凋亡活性(參見圖9B)。根據(jù)活性，存在有2種不同類別的miRNAs (—類具有高活性 miR454(SEQ ID NO :2)、miR_520c (SEQ ID NO :4)和 miR_520d (SEQ ID NO :5)；—類具有低活性miR-145(SEQ ID NO 1)和 miR_519a(SEQ ID NO :3))。實(shí)施例9這個(gè)實(shí)施例給出了用miRNAs處理的腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)譜。為了測(cè)定用這些miRNAs處理的細(xì)胞的總蛋白質(zhì)表達(dá)譜，使用包含針對(duì)關(guān)鍵細(xì)胞 蛋白質(zhì)(特別是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)蛋白質(zhì))的2M種人抗體的抗體陣列。(圖10)將所述抗 體一式兩份地點(diǎn)在經(jīng)硝化纖維素包被的載玻片上，并且可以檢測(cè)低至幾ng/ml的蛋白質(zhì)水 平。用Cy5標(biāo)記來(lái)自未處理的Η ^9細(xì)胞的細(xì)胞裂解物。用4種miRNAs (SEQ ID NO :1_4)之 一或者說(shuō)(SEQ ID N0:l、2、3或4)處理來(lái)自Η ^9細(xì)胞的細(xì)胞裂解物。使抗體陣列與Cy3/ Cy5 (經(jīng)處理的/未處理的)裂解物的相等混合物進(jìn)行反應(yīng)，洗滌，并掃描。使經(jīng)log標(biāo)準(zhǔn)化 的“經(jīng)處理的/未處理的”(分開地用17-AAG、mir-145、mir-454、mir519a或mir_520c (分 別為SEQ ID NO 2-4)進(jìn)行處理)之比進(jìn)行聚類分析，以確定類似地受所述4種miRNAs調(diào) 節(jié)的蛋白質(zhì)。如圖10中所顯示的，所有5種經(jīng)處理的樣品的蛋白質(zhì)譜是相似的，這表明這些 miRNAs作用于相同的途徑，并且該途徑也與由17-AAG所作用于的途徑相同，從而產(chǎn)生協(xié)同 作用。此外，聚類分析表明，519a和145屬于一個(gè)類別，而520c和519a屬于另一個(gè)類別，這 與使用活性測(cè)定法所達(dá)到的結(jié)論相一致。與17-AAG—樣由這些miRNAs下調(diào)的基因?yàn)樾盘?hào) 傳導(dǎo)分子，并且包括FAK-pTyr577、cdc27、MAPK 活化激酶 2、PAR4、PKC γ 和 RAF_pkr621。 與17-AAG —樣由這些miRNAs上調(diào)的基因?yàn)榧?xì)胞骨架元件，并且包括細(xì)胞角蛋白4、S100b 和粘著斑蛋白。此外，已顯示hsa-mir-520c (SEQ ID NO :4)調(diào)節(jié) CD44 翻譯(HuangQ 等人，2008)。 微小 RNAs mir-373 (GAAGUGCUUCGAUUUUGGG⑶⑶)(SEQ ID NO :39)和 mir_520c (SEQ ID NO 4)促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。Nature Cell Biology 10:202-10。這將使得 CD44、CDC27、MAPK 活化激酶2、PAR4、PKC γ成為關(guān)于miRNAs的潛在靶。實(shí)施例10這個(gè)實(shí)施例顯示了這些miRNAs的嚴(yán)格序列要求，這是從目前對(duì)于miRNA的了解未 預(yù)期到的。由于miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)不斷更新和變化，所以存在有顯示出增強(qiáng)17-AAG細(xì)胞凋亡活性 的5種miRNAs的幾種經(jīng)報(bào)到的形式。當(dāng)從3'末端刪除少至單個(gè)殘基時(shí)，這些miRNAs的活
性形式失活，如下表中所顯示的
權(quán)利要求
1.用于增強(qiáng)在患有癌癥、神經(jīng)變性疾病、再狹窄或增殖性細(xì)胞疾病的生物中治療劑的 活性的方法，其包括在施用所述治療劑之前、期間或之后，施用有效量的包含miRNA的組合 物。
2.權(quán)利要求1的方法,其中所述miRNA選自pri_miRNA、pre_miRNA、成熟miRNA、ds miRNA及其片段或變體。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述miRNA由分離的核酸編碼。
4.權(quán)利要求3的方法，其中將所述分離的核酸整合到載體中。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述載體選自質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、病毒和人工染色體。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述載體進(jìn)一步包含一種或多種體內(nèi)表達(dá)控制元件。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述一種或多種體內(nèi)表達(dá)控制元件選自啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、 RNA剪接位點(diǎn)及其組合。
8.權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)的方法，其中將所述分離的核酸轉(zhuǎn)染到所述生物的細(xì)胞中。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述miRNA為裸露的合成RNA。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述miRNA為經(jīng)化學(xué)修飾的合成RNA。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述合成RNA用選自下列的化學(xué)部分進(jìn)行修飾硫代磷 酸酯、硼烷磷酸酯、2’ -0-甲基、2’ -氟、PEG、末端反轉(zhuǎn)-dT堿基及其組合。
12.權(quán)利要求1的方法，其中在脂質(zhì)體、基于聚合物的納米顆粒、膽固醇綴合物、環(huán)狀葡 聚糖復(fù)合物、聚乙烯亞胺聚合物或蛋白質(zhì)復(fù)合物中施用所述miRNA。
13.權(quán)利要求1的方法，其中以靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、經(jīng)鼻、腹膜內(nèi)、經(jīng)陰道、經(jīng)肛門、經(jīng) 口、眼內(nèi)或鞘內(nèi)方式將所述miRNA直接施用至所述生物中的患病組織。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述miRNA的長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸至170個(gè)核苷酸。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述miRNA的長(zhǎng)度為18至25個(gè)核苷酸。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述治療劑選自放射性核素、化學(xué)治療劑、靶 向抗癌劑、DNA嵌入/損傷試劑、細(xì)胞周期關(guān)卡抑制劑、抗代謝物、熱休克蛋白抑制劑、激酶 抑制劑及其組合。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述治療劑選自染料木素、mI、9°Y、mIn、211At、32P、阿霉 素、安莎霉素抗生素類、天冬酰胺酶、博來(lái)霉素、白消安、順鉬、卡鉬、卡莫司汀、卡培他濱、苯 丁酸氮芥、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、喜樹堿、達(dá)卡巴嗪、更生霉素、柔紅霉素、右雷佐生、多西他 賽、多柔比星、依托泊苷、埃坡霉素類、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、伊達(dá) 比星、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、巰基嘌呤、美法侖、氨甲蝶呤、雷帕霉素、西羅 莫司、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亞硝基脲、帕米膦酸、噴司他丁、普卡霉素、丙卡巴胼、利 妥昔單抗、鏈佐星、替尼泊苷、硫鳥嘌呤、塞替派、紫杉烷類、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞濱、紅 豆杉醇、康普瑞汀類、淅皮海綿內(nèi)酯類、反鉬、博來(lái)霉素、激素、他莫昔芬、己烯雌酚、生物學(xué) 活性多肽、抗體、凝集素、毒素、阿西替尼、阿瓦斯丁、馬立馬司他、貝伐珠單抗、羧胺三唑、 TNP-470, CMlOU IFN-α、IL-12、血小板因子-4、蘇拉明、SU5416、血小板反應(yīng)蛋白、VEGFR拮 抗劑、血管抑制性類固醇、軟骨衍生的血管生成抑制因子、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、血管抑 制素、內(nèi)皮抑制素、2-甲氧基雌二醇、替可加蘭、血小板反應(yīng)蛋白、促乳素、ανβ3抑制劑、 替可加蘭、BAY 12-9566、AG3340、CGS27023A、C0L-3、vitaxin、ZDOlOU TNP-40、沙立度胺、 角鯊胺、IM862、PTK787、夫馬潔林、夫馬潔林的類似物、BB-94、BB-2516、利諾胺、17-AAG、奧沙利鉬、紫杉醇及其組合。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述治療劑為17-AAG、奧沙利鉬、紫杉醇或其組合。
19.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的方法，其中(a)所述癌癥選自原位癌、非典型增生、癌、肉瘤、癌肉瘤、肺癌癥、胰腺癌癥、皮膚癌癥、 血液學(xué)腫瘤、乳腺癌癥、腦癌癥、結(jié)腸癌癥、膀胱癌癥、宮頸癌癥、子宮內(nèi)膜癌癥、食管癌癥、 胃癌癥、頭與頸癌癥、多發(fā)性骨髓瘤、肝癌癥、白血病、淋巴瘤、口腔癌癥、骨肉瘤、卵巢癌癥、 前列腺癌癥、睪丸癌癥和甲狀腺癌癥，(b)所述再狹窄選自冠狀動(dòng)脈再狹窄、大腦動(dòng)脈再狹窄、頸動(dòng)脈再狹窄、腎動(dòng)脈再狹窄、 股動(dòng)脈再狹窄、外周動(dòng)脈再狹窄或其組合，(c)所述增殖性疾病選自增生、子宮內(nèi)膜異位癥、肥大性瘢痕和瘢痕瘤、增殖性糖尿病 性視網(wǎng)膜病變、增殖性腎小球腎炎、肺動(dòng)脈高壓、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)靜脈畸形、動(dòng)脈粥樣硬 化斑塊、傷口愈合延遲、血友病性關(guān)節(jié)、骨不連合性骨折、奧-韋綜合征、銀屑病、膿性肉芽 腫、硬皮病、沙眼、月經(jīng)過(guò)多、血管粘連和乳頭狀瘤，以及(d)所述神經(jīng)變性疾病選自阿爾茨海默病、帕金森病、ALS和脊髓延髓性肌萎縮。
20.權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的方法，其中所述miRNA選自 miR145(GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU)(SEQ ID NO 1), miR454-3p(UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)， miR519a(AAAGUGCAUCCUUUUAGACT(}UUAC) (SEQ ID NO :3)， miR520c(AAAGUGCUUCCUUUUAGAGG⑶U)(SEQ ID NO :4)， miR520d(AAAGUGCUUCUCUUUG⑶GG⑶U)(SEQ ID NO :5)， miR-425-3p (AUCGGGAAUGUC⑶⑶CCGCC) (SEQ ID NO :6)， miR-495(AAACAAACAUGGUGCACUUCUUU)(SEQ ID NO :7)， miR-572(GUCCGCUCGGCG⑶GGCCCA)(SEQ ID NO :8)， miR-661(UGCCUGG⑶CUCUGGCCUGCGCGU)(SEQ ID NO :9)， 其互補(bǔ)物，以及其組合。
21.權(quán)利要求1-17或19中任一項(xiàng)的方法，其中所述miRNA選自miR4M_3p(UAGUGCAAU AUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)，miR520c (AAAGUGCUUCCUUUUAGAGG⑶U)(SEQ ID NO :4)， 其互補(bǔ)物，以及其組合。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述治療劑為17-AAG、奧沙利鉬或其組合。
23.權(quán)利要求1-17或19中任一項(xiàng)的方法，其中所述miRNA選自 miR-425-3p (AUCGGGAAUGUC⑶⑶CCGCC) (SEQ ID NO 6), miR-495(AAACAAACAUGGUGCACUUCUUU)(SEQ ID NO :7)， miR-572(GUCCGCUCGGCG⑶GGCCCA)(SEQ ID NO :8)， miR-661(UGCCUGG⑶CUCUGGCCUGCGCGU)(SEQ ID NO :9)，其互補(bǔ)物， 以及其組合。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述治療劑為紫杉醇。
25.權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的方法，其中所述miRNA為SEQID NO 10-35中的一種或多種。
26.權(quán)利要求19的方法，其中所述生物為正經(jīng)歷一種或多種癌癥療法的人患者，所述 癌癥療法選自手術(shù)、化學(xué)療法、放射療法、溫?zé)岑煼ā⒚庖忒煼?、激素療法和激光療法?br> 27.權(quán)利要求19的方法，其中所述生物為正經(jīng)歷一種或多種抗增殖療法的人患者，所 述抗增殖療法選自手術(shù)、化學(xué)療法、放射療法、溫?zé)岑煼?、免疫療法、激素療法、激光療法?放置支架。
28.權(quán)利要求I-M中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物為人。
29.用于增強(qiáng)在患有癌癥、神經(jīng)變性疾病、再狹窄或增殖性細(xì)胞疾病的生物中治療劑的 活性的治療組合物，其包含有效量的miRNA，或者在施用所述治療劑之前、期間或之后表達(dá) 有效量的miRNA的載體。
30.權(quán)利要求四的組合物,其中所述miRNA選自pri_miRNA、pre_miRNA、成熟miRNA、 ds miRNA及其片段或變體。
31.權(quán)利要求四的組合物，其中所述miRNA由包含一種或多種體內(nèi)表達(dá)控制元件的分 離的核酸載體編碼。
32.權(quán)利要求31的組合物，其中所述分離的核酸已轉(zhuǎn)染到所述生物的細(xì)胞中。
33.權(quán)利要求四的組合物，其中所述miRNA為裸露的合成RNA。
34.權(quán)利要求四的組合物，其中所述miRNA為經(jīng)化學(xué)修飾的合成RNA。
35.權(quán)利要求34的組合物，其中所述合成miRNA用選自下列的化學(xué)部分進(jìn)行修飾硫 代磷酸酯、硼烷磷酸酯、2’ -0-甲基、2’ -氟、PEG、末端反轉(zhuǎn)-dT堿基及其組合。
36.權(quán)利要求四的組合物，其中在脂質(zhì)體、基于聚合物的納米顆粒、膽固醇綴合物、環(huán) 狀葡聚糖復(fù)合物、聚乙烯亞胺聚合物或蛋白質(zhì)復(fù)合物中負(fù)載所述miRNA。
37.權(quán)利要求四的組合物，其中所述miRNA用于以靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、經(jīng)鼻、腹膜內(nèi)、經(jīng) 陰道、經(jīng)肛門、經(jīng)口、眼內(nèi)或鞘內(nèi)方式直接施用至患病組織。
38.權(quán)利要求四的組合物，其中所述miRNA的長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸至170個(gè)核苷酸。
39.權(quán)利要求38的組合物，其中所述miRNA的長(zhǎng)度為18至25個(gè)核苷酸。
40.權(quán)利要求四的組合物，其中(a)所述癌癥選自原位癌、非典型增生、癌、肉瘤、癌肉瘤、肺癌癥、胰腺癌癥、皮膚癌癥、 血液學(xué)腫瘤、乳腺癌癥、腦癌癥、結(jié)腸癌癥、膀胱癌癥、宮頸癌癥、子宮內(nèi)膜癌癥、食管癌癥、 胃癌癥、頭與頸癌癥、多發(fā)性骨髓瘤、肝癌癥、白血病、淋巴瘤、口腔癌癥、骨肉瘤、卵巢癌癥、 前列腺癌癥、睪丸癌癥和甲狀腺癌癥，(b)所述再狹窄選自冠狀動(dòng)脈再狹窄、大腦動(dòng)脈再狹窄、頸動(dòng)脈再狹窄、腎動(dòng)脈再狹窄、 股動(dòng)脈再狹窄、外周動(dòng)脈再狹窄或其組合，(c)所述增殖性疾病選自增生、子宮內(nèi)膜異位癥、肥大性瘢痕和瘢痕瘤、增殖性糖尿病 性視網(wǎng)膜病變、增殖性腎小球腎炎、肺動(dòng)脈高壓、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)靜脈畸形、動(dòng)脈粥樣硬 化斑塊、傷口愈合延遲、血友病性關(guān)節(jié)、骨不連合性骨折、奧-韋綜合征、銀屑病、膿性肉芽 腫、硬皮病、沙眼、月經(jīng)過(guò)多、血管粘連和乳頭狀瘤，以及(d)所述神經(jīng)變性疾病選自阿爾茨海默病、帕金森病、ALS和脊髓延髓性肌萎縮。
41.權(quán)利要求四-40中任一項(xiàng)的組合物，其中所述治療劑選自放射性核素、癌癥化學(xué)治 療劑、靶向抗癌劑、DNA嵌入/損傷試劑、細(xì)胞周期關(guān)卡抑制劑、抗代謝物、HSP抑制劑、抗生素、激酶抑制劑、放射性核素、生物學(xué)活性多肽、抗體、凝集素、毒素、激素、基質(zhì)金屬蛋白酶 抑制劑、血管抑制性類固醇或其組合。
42.權(quán)利要求四-40中任一項(xiàng)的組合物，其中所述治療劑選自mI、9°Y、mIn、211At、32P、 染料木素、阿霉素、安莎霉素、天冬酰胺酶、博來(lái)霉素、白消安、順鉬、卡鉬、卡莫司汀、卡培他 濱、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、喜樹堿、達(dá)卡巴嗪、更生霉素、柔紅霉素、右雷佐生、多 西他賽、多柔比星、依托泊苷、埃坡霉素類、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、 伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、巰基嘌呤、美法侖、氨甲蝶呤、雷帕霉素、 西羅莫司、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亞硝基脲、帕米膦酸、噴司他丁、普卡霉素、丙卡巴 胼、利妥昔單抗、鏈佐星、替尼泊苷、硫鳥嘌呤、塞替派、紫杉烷類、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞 濱、紅豆杉醇、康普瑞汀類、淅皮海綿內(nèi)酯類、反鉬、博來(lái)霉素、激素、他莫昔芬、己烯雌酚、阿 西替尼、阿瓦斯丁、馬立馬司他、貝伐珠單抗、羧胺三唑、TNP-470、CMlOU IFN-α、IL-12、血 小板因子-4、蘇拉明、STO416、血小板反應(yīng)蛋白、VEGFR拮抗劑、軟骨衍生的血管生成抑制因 子、血管抑制素、內(nèi)皮抑制素、2-甲氧基雌二醇、替可加蘭、血小板反應(yīng)蛋白、促乳素、α νβ 3 抑制劑、替可加蘭、BAY 12-9566、AG3340, CGS27023A、C0L-3、vitaxin、ZDOlOU TNP-40、沙 立度胺、角鯊胺、IM862、PTK787、夫馬潔林、夫馬潔林的類似物、BB-94、BB-2516、利諾胺、 17-AAG、奧沙利鉬、紫杉醇及其組合。
43.權(quán)利要求42的組合物，其中所述治療劑為17-AAG、奧沙利鉬、紫杉醇或其組合。
44.權(quán)利要求四-42中任一項(xiàng)的組合物，其中所述miRNA包含選自下述的序列(a)miR145(GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU)(SEQID NO :1)， miR454-3p(UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)， miR519a(AAAGUGCAUCCUUUUAGA(iU(;UUAC) (SEQ ID NO :3)， miR520c(AAAGUGCUUCCUUUUAGAGG⑶U)(SEQ ID NO :4)， miR520d(AAAGUGCUUCUCUUUG⑶GG⑶U)(SEQ ID NO :5)， miR-425-3p (AUCGGGAAUGUC⑶⑶CCGCC) (SEQ ID NO :6)， miR-495(AAACAAACAUGGUGCACUUCUUU)(SEQ ID NO :7)， miR-572(GUCCGCUCGGCG⑶GGCCCA)(SEQ ID NO :8)， miR-661(UGCCUGG⑶CUCUGGCCUGCGCGU)(SEQ ID NO :9)；(b)(a)中所述序列之中的任何序列的互補(bǔ)RNA ；和(c)具有與(a)或(b)的21個(gè)鄰接核苷酸至少大約81%同一的序列的RNA。
45.權(quán)利要求四-42中任一項(xiàng)的組合物，其中所述miRNA選自miR4M_3p(UAGUGCAAU AUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)，miR520c (AAAGUGCUUCCUUUUAGAGG⑶U)(SEQ ID NO :4)， 其互補(bǔ)物，以及其組合。
46.權(quán)利要求45的組合物，其中所述治療劑為17-AAG、奧沙利鉬或其組合。
47.權(quán)利要求四-42中任一項(xiàng)的組合物，其中所述miRNA選自 miR-425-3p (AUCGGGAAUGUC⑶⑶CCGCC) (SEQ ID NO 6), miR-495(AAACAAACAUGGUGCACUUCUUU)(SEQ ID NO :7)， miR-572(GUCCGCUCGGCG⑶GGCCCA)(SEQ ID NO :8)， miR-661(UGCCUGG⑶CUCUGGCCUGCGCGU)(SEQ ID NO :9)，其互補(bǔ)物，以及其組合。
48.權(quán)利要求47的組合物，其中所述治療劑為紫杉醇。
49.探針，其包含與權(quán)利要求44的RNA序列中的任何RNA序列互補(bǔ)的核酸或肽核酸。
50.生物芯片，其包含肽核酸探針的核酸，所述肽核酸探針包含權(quán)利要求49的miRNA序 列中的任何miRNA序列。
51.用于預(yù)測(cè)對(duì)于使用HSP90抑制劑、微管抑制劑或DNA復(fù)制抑制劑的療法的應(yīng)答的方法(a)提供患病組織的生物學(xué)樣品；(b)測(cè)量患病組織的生物學(xué)樣品中RNA的水平，其中所測(cè)量的RNA選自(i)miR145(GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU)(SEQID NO 1), miR454-3p(UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)， miR519a(AAAGUGCAUCCUUUUAGA(iU(;UUAC) (SEQ ID NO :3)， miR520c(AAAGUGCUUCCUUUUAGAGG⑶U)(SEQ ID NO :4)， miR520d(AAAGUGCUUCUCUUUG⑶GG⑶U)(SEQ ID NO :5)；(ii)(i)的互補(bǔ)RNA ；和(iii)具有與(i)或(ii)的21個(gè)鄰接核苷酸至少大約81%同一的序列的RNA ；(c)將患病組織中來(lái)自(b)的RNA的水平與對(duì)照中相同RNA的水平相比較，其中高于對(duì) 照水平的該核酸的水平表明對(duì)所述療法作出應(yīng)答，和低于對(duì)照水平的該核酸的水平表明對(duì) 所述療法不作出應(yīng)答。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述HSP90抑制劑為17-AAG，所述微管抑制劑為紫杉醇， 和所述DNA復(fù)制抑制劑為奧沙利鉬。
53.權(quán)利要求51的方法，其中所述RNA通過(guò)RT-PCR、微陣列、invader、質(zhì)譜法、雜交或 TMA來(lái)測(cè)量。
54.用于抑制一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法，其包括給生物施用有效量的一種或多 種選自下列的miRNA miR145 (GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU)(SEQ ID NO :1)， miR454-3p(UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)， miR519a(AAAGUGCAUCCUUUUAGA(iU(;UUAC) (SEQ ID NO :3)， miR520c(AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGUU)(SEQ ID NO :4)，和 miR520d(AAAGUGCUUCUCUUUG⑶GG⑶U)(SEQ ID NO :5)。
55.權(quán)利要求討的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自FAK、⑶C27、MAH(活化蛋白激酶2、PAR4、 PKCy 禾口 RAF0
56.用于增強(qiáng)在生物中一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法，其包括給所述生物施用有效 量的一種或多種選自下列的mi RNA miR145(GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU)(SEQ IDNO :1)， miR454-3p(UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)， miR519a(AAAGUGCAUCCUUUUAGA(iU(;UUAC) (SEQ ID NO :3)， miR520c(AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGUU)(SEQ ID NO :4)，和 miR520d(AAAGUGCUUCUCUUUG⑶GG⑶U)(SEQ ID NO :5)。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自細(xì)胞角蛋白4、SlOOb和粘著斑蛋白。
58.分離的核酸，其包含與報(bào)道基因有效地連接的一種或多種體內(nèi)表達(dá)控制元件，其中 所述報(bào)道基因處于靶基因3’非翻譯區(qū)的全部或部分的上游，其中在所述分離的核酸轉(zhuǎn)染到 真核細(xì)胞中后，所述體內(nèi)表達(dá)控制元件導(dǎo)致產(chǎn)生出編碼處于靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)上 游的該報(bào)道分子的mRNA。
59.權(quán)利要求58的分離的核酸，其中所述分離的核酸為選自質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、病毒 和人工染色體的載體。
60.權(quán)利要求59的分離的核酸，其中所述一種或多種體內(nèi)表達(dá)控制元件選自啟動(dòng)子、 增強(qiáng)子、RNA剪接信號(hào)及其組合。
61.權(quán)利要求59的分離的核酸，其中所述報(bào)道基因編碼螢光素酶蛋白。
62.權(quán)利要求59的分離的核酸，其中所述靶基因?yàn)棰?4、⑶C27、MAPK活化激酶2、PAR4 或 PKC γ 0
63.鑒定基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑的方法，其包括(a)用包含與報(bào)道基因有效地連接的一種或多種體內(nèi)表達(dá)控制元件的分離的核酸轉(zhuǎn)染 真核細(xì)胞，所述報(bào)道基因被克隆在靶基因3’非翻譯區(qū)的全部或部分的上游，其中所述體內(nèi) 表達(dá)控制元件導(dǎo)致產(chǎn)生出編碼處于所述3’非翻譯區(qū)上游的該報(bào)道分子的mRNA，(b)用包含與所述報(bào)道基因有效地連接的所述一種或多種體內(nèi)表達(dá)控制元件的分離的 核酸轉(zhuǎn)染其他真核細(xì)胞，其中所述表達(dá)控制元件導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄出編碼該報(bào)道分子的mRNA，(c)使來(lái)自(a)和(b)的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與候選表達(dá)調(diào)節(jié)劑相接觸和假接觸，和(d)將在經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與候選表達(dá)調(diào)節(jié)劑相接觸和未接觸的情況下在來(lái)自(a)和(b) 的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的報(bào)道基因活性進(jìn)行比較。
64.權(quán)利要求63的方法，其進(jìn)一步包括用第二報(bào)道構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染(a)和(b)中的細(xì)胞， 所述第二報(bào)道構(gòu)建體表達(dá)用于標(biāo)準(zhǔn)化(d)中所比較的數(shù)據(jù)的第二報(bào)道分子。
65.權(quán)利要求63或64的方法，其進(jìn)一步包括使該報(bào)道分子表達(dá)構(gòu)建體中的靶基因3’ 非翻譯序列突變，將所述經(jīng)突變的報(bào)道分子表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中，和將在經(jīng)轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞與候選表達(dá)調(diào)節(jié)劑相接觸和未接觸的情況下由于經(jīng)突變和未突變的報(bào)道分子表達(dá) 構(gòu)建體的表達(dá)而產(chǎn)生的報(bào)道基因活性進(jìn)行比較。
66.權(quán)利要求63-65中任一項(xiàng)的方法，其中所述靶基因?yàn)棰?4、⑶C27、MAPK活化激酶 2、PAR4 禾口 PKC γ ο
67.用于鑒定表達(dá)調(diào)節(jié)劑的試劑盒，其包括(a)第一分離的核酸，其具有與第一報(bào)道基因有效地連接的第一組一種或多種體內(nèi)表 達(dá)控制元件，所述第一報(bào)道基因被克隆在靶基因3’非翻譯區(qū)的全部或部分的上游，其中在 所述第一分離的核酸轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中后，所述第一組體內(nèi)表達(dá)控制元件導(dǎo)致產(chǎn)生出編碼 處于靶基因3’非翻譯區(qū)上游的該第一報(bào)道分子的mRNA ；(b)第二分離的核酸，其包含與所述第一報(bào)道基因有效地連接的來(lái)自(a)的該組體內(nèi) 表達(dá)控制元件，其中在所述第二分離的核酸轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中后，所述體內(nèi)表達(dá)控制元件 導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄出編碼所述第一報(bào)道分子的mRNA ；和(c)第三分離的核酸，其包含與第二報(bào)道基因有效地連接的第二組一種或多種所述體 內(nèi)表達(dá)控制元件，其中在所述分離的核酸轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中后，所述第二組體內(nèi)表達(dá)控制元件導(dǎo)致所述第二報(bào)道分子表達(dá)。
68.權(quán)利要求67的試劑盒，其中所述靶基因?yàn)棰?4、⑶C27、MAPK活化激酶2、PAR4或 PKCy 0
69.包含miRNA的分離的核酸，其中當(dāng)將所述miRNA施用至哺乳動(dòng)物細(xì)胞并且隨后將所 述哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露于治療劑時(shí)，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞在Apo - ONE 均相胱天蛋白酶-3/7 測(cè)定法中產(chǎn)生至少大約200的485/538nm比率。
70.權(quán)利要求69的分離的核酸，其中所述治療劑為17-AAG、奧沙利鉬、紫杉醇及其組合。
71.能夠表達(dá)包含miRNA的轉(zhuǎn)錄物的分離的核酸，其中當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)所述 miRNA并且隨后將所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露于治療劑時(shí)，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞在ApO-ONE 均 相胱天蛋白酶-3/7測(cè)定法中產(chǎn)生至少大約200的485/538nm比率。
72.權(quán)利要求71的分離的核酸，其中所述治療劑為17-AAG、奧沙利鉬、紫杉醇及其組合。
73.用于增強(qiáng)在患有癌癥、神經(jīng)變性疾病、再狹窄或增殖性細(xì)胞疾病的生物中雷帕霉素 的活性的方法，其包括在施用所述治療劑之前、期間或之后，施用有效量的包含miRNA的組 合物。
74.權(quán)利要求73的方法，其中所述miRNA選自pri_miRNA、pre_miRNA、成熟miRNA、ds miRNA及其片段或變體。
75.權(quán)利要求74的方法，其中所述miRNA由分離的核酸編碼。
76.權(quán)利要求75的方法，其中將所述分離的核酸整合到載體中。
77.權(quán)利要求76的方法，其中所述載體選自質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、病毒和人工染色體。
78.權(quán)利要求77的方法，其中所述載體進(jìn)一步包含一種或多種體內(nèi)表達(dá)控制元件。
79.權(quán)利要求78的方法，其中所述一種或多種體內(nèi)表達(dá)控制元件選自啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、 RNA剪接位點(diǎn)及其組合。
80.權(quán)利要求75-79中任一項(xiàng)的方法，其中將所述分離的核酸轉(zhuǎn)染到所述生物的細(xì)胞中。
81.權(quán)利要求73的方法，其中所述miRNA為裸露的合成RNA。
82.權(quán)利要求73的方法，其中所述miRNA為經(jīng)化學(xué)修飾的合成RNA。
83.權(quán)利要求81的方法，其中所述合成RNA用選自下列的化學(xué)部分進(jìn)行修飾硫代磷 酸酯、硼烷磷酸酯、2’ -0-甲基、2’ -氟、PEG、末端反轉(zhuǎn)-dT堿基及其組合。
84.權(quán)利要求73的方法，其中在脂質(zhì)體、基于聚合物的納米顆粒、膽固醇綴合物、環(huán)狀 葡聚糖復(fù)合物、聚乙烯亞胺聚合物或蛋白質(zhì)復(fù)合物中施用所述miRNA。
85.權(quán)利要求73的方法，其中以靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、經(jīng)鼻、腹膜內(nèi)、經(jīng)陰道、經(jīng)肛門、經(jīng) 口、眼內(nèi)或鞘內(nèi)方式將所述miRNA直接施用至所述生物中的患病組織。
86.權(quán)利要求73的方法，其中所述miRNA的長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸至170個(gè)核苷酸。
87.權(quán)利要求86的方法，其中所述miRNA的長(zhǎng)度為18至25個(gè)核苷酸。
88.權(quán)利要求73-87中任一項(xiàng)的方法，其中所述miRNA選自 CCAGUAUUAACU⑶GCUGCUGA(SEQ ID NO 36), AAGUGUGCAGGGCACUGGU(SEQ ID NO 37),AAGGAGCUUACAAUCUAGCUGGG(SEQ ID NO :38)，及其組合。
89.權(quán)利要求1-19或四-42中任一項(xiàng)的方法，其中所述miRNA選自SEQID NO :10-35。
90.權(quán)利要求51的方法，其中所述miRNA選自SEQID N0:10_35。
91.權(quán)利要求四-43中任一項(xiàng)的組合物，其中所述miRNA選自SEQIDN0:10_35。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于篩選微小RNA的方法和組合物，所述微小RNA能夠在HSP90抑制劑存在下調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡途徑中的基因表達(dá)。還公開了miRNA用于增強(qiáng)治療劑(并不限于HSP90抑制劑)的活性的用途。還公開了miRNA用于預(yù)測(cè)對(duì)于療法(并不限于治療劑)的應(yīng)答的診斷用途。本申請(qǐng)中還包括用于小分子的鑒定和治療應(yīng)用的方法，所述小分子是這些核酸的調(diào)節(jié)劑。
文檔編號(hào)A61K31/00GK102076853SQ200980124435
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2009年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月7日
發(fā)明者L·黃, N·德塞, V·特里魯 申請(qǐng)人:阿布拉西斯生物科學(xué)有限責(zé)任公司