專利名稱：通過胃腸道中微生物的營養(yǎng)物溫度誘導遞送的制作方法
通過胃腸道中微生物的營養(yǎng)物溫度誘導遞送本發(fā)明大體上涉及健康和安寧(well-being)領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及溫度敏感 微生物以及其用作制備遞送化合物例如營養(yǎng)物(nutrient)到身體特定區(qū)域的組合物之載 體的用途。由于某些化合物或其食品制劑本身的特定性能，目前在食物基質(zhì)中加入這些化合 物可能是食品工業(yè)的挑戰(zhàn)。例如，這些化合物可能是處理敏感性的，可能在儲存或運輸期間 穩(wěn)定性差，可能與其他食物成分相互作用導致例如脂質(zhì)氧化和/或變色，可能具有對味道 的有害影響，可能在胃液中穩(wěn)定性差，和/或可能在腸中可用性差。迄今為止已經(jīng)開發(fā)了許多營養(yǎng)物遞送載體，包括蛋白質(zhì)復合物、植物油或凝膠珠。 然而，由于濕度敏感性、食物基質(zhì)不相容性、處理敏感性、從介質(zhì)的滲漏以及在胃腸道中沒 有遞送或遞送差，它們的用途限于某些應用。獲得下面這樣的載體將是有幫助的，該載體允許安全運送敏感化合物，特別是營 養(yǎng)物，到身體的特定位置，同時克服了上述的問題。胃腸道是攝取有機體為維持其健康和安寧所利用的營養(yǎng)化合物的主要器官。腸 道中建群有合生(synbiotic)或互利共生微生物，例如擬桿菌屬(Bacteroides)、梭菌 屬(Clostridium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、真桿菌屬(Eubacterium)、埃希氏菌屬 (Escherichia)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、消化球菌屬(P印tococcus)、消化鏈球菌屬 (Pepstreptococcus) >^LIfliiM (Lactobacillus)禾口雙歧桿菌屬(Bifidobacterium),其主 要的貢獻之一是進行多種有益的功能，例如分解和促進食物吸收，刺激細胞生長，抑制有害 細菌生長，訓練免疫系統(tǒng)和抵御一些疾病。過去，由于發(fā)現(xiàn)了一些菌株在攝入后對顯示出人和動物的有價值性能，益生生物 吸引了許多注意。益生菌被認為是促進個體健康的活微生物(細菌和酵母)。最近，W003053474公開了細菌，即乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬 (Streptococci)、乳酸小球菌屬(Pediococci)、腸球菌屬(Enterococci)、乳球菌屬 (Lactococci)、酒球菌屬(Oenococci)、葡萄球菌屬(Staphylococci)、擬桿菌屬，用于定向 遞送物質(zhì)到腸的特定部分的用途。本發(fā)明公開了具有特異性和可能改變的對胃液和/或膽 汁抗性的微生物用于實現(xiàn)此目的的用途。但是，由于年齡、健康狀態(tài)、個體間和種間差異，胃液和膽汁組合物有很大的變化 性。為了將化合物遞送到大范圍的生物體內(nèi)腸的多個位置，需要開發(fā)新的工具。本發(fā)明提供了用于化合物的遞送系統(tǒng)的技術(shù)，特別是用于將在消化后在身體內(nèi)釋 放的營養(yǎng)物的遞送系統(tǒng)的技術(shù)。另外，本發(fā)明在產(chǎn)品的生產(chǎn)和存儲期間保護了處理敏感化 合物，它確?；衔锊慌c其他食物成分相互作用，導致例如脂質(zhì)氧化和/或變色，并且其對 味道具有積極的影響，對于食用是安全的，例如對于食品產(chǎn)品。本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，可通過獨立權(quán)利要求的主題實現(xiàn)這一目的。從屬權(quán)利要求進一步發(fā)展了本發(fā)明。本發(fā)明涉及溫度敏感微生物，其在暴露于約32至45攝氏度的溫度范圍時完全或 至少部分裂解，而且其可用作制備用于遞送化合物，特別是營養(yǎng)物到身體部分，特別是胃腸道的組合物的載體。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，部分裂解表示至少10 %，優(yōu)選至少20 %，更優(yōu)選至 少30 %，最優(yōu)選至少40 %的微生物，理想地至少95 %的溫度敏感微生物在暴露于37攝氏度 5分鐘至M小時后裂解。如果全部微生物在暴露于37攝氏度下小于M小時后裂解，則是 尤其優(yōu)選的。如果全部溫度敏感微生物在暴露于37攝氏度5分鐘至M小時后裂解，則實 現(xiàn)完全裂解。至少部分裂解還包括細胞壁和或膜是通透和/或削弱的，使得所運載的化合物可 離開細胞，同時一部分(細胞)群體可能保持存活的情況。如果微生物在暴露于約32至45攝氏度范圍的溫度至少5分鐘后至少部分裂解， 則認為其是溫度敏感的。這些裂解測試可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何類型的微生物標準菌種生長培 養(yǎng)基中進行?？墒褂美鏨PD培養(yǎng)液。進行這些測試的實例在實施例2中給出。本發(fā)明的一個實施方案是在約32至45攝氏度的溫度范圍中至少部分裂解的溫度 敏感微生物用作制備遞送營養(yǎng)物到胃腸道的組合物之載體的用途。該方法也允許化合物例如營養(yǎng)物在身體特定區(qū)域(例如胃腸道中)靶向釋放，同 時改善化合物的生物利用率?？墒褂玫奈⑸镌?2至45攝氏度的溫度范圍中至少部分裂解。優(yōu)選使用微生物 是食品級的食品應用。如果材料或微生物被批準用于人或動物食用，則其是“食品級”的。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案中，微生物是酵母，例如低溫誘導的(Iti)酵 母，優(yōu)選食品級酵母，選自半子囊菌綱(hemiascetomycetous)酵母物種，子囊菌亞門 (Ascomycotina)或半知菌亞門(Deuteromycotina)0更優(yōu)選地，酵母選自德巴利酵母屬(Debaryomyces)、克魯維酵母屬 (Kluyveromyces)、酵母屬(Saccharomyces)、耳口氏酵母屬(Yarrowia)、接合酵母屬 (Zygosaccharomyces)、fi絲酵母屬(Candida)、裂歹直酵母屬(Schizosaccharomyces)禾口紅 酵母屬(Rhodotorula)。例如，酵母可以是釀酒酵母(面包酵母)(Saccharomyces cerevisiae)或馬克斯 克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)。〔優(yōu)選菌株有溫度敏感釀酒酵母菌株CNCM1-4000、CNCM 1-400 U CNCM 1-4002、 CNCM 1-4003、CNCM 1-4004、CNCM 1-4005、CNCM 1-4006、CNCM 1-4007、CNCM 1-4165、 CNCM 1-4166、CNCM 1-4167、和/或CNCM 1-4168和溫度敏感馬克斯克魯維酵母菌株CNCM 1-4009、CNCM 1-4010、CNCM 1-4011、CNCM 1-4160、CNCM 1-4161、CNCMI_4162、CNCM 1-4163 和/或CNCM 1-4164，或其組合。所有菌株按照布達佩斯條約保藏。酵母具有下列優(yōu)點，它們通常對產(chǎn)品的味道有積極的影響，易于產(chǎn)生并且有效積 累由其菌種生長培養(yǎng)基提供或由它們合成的化合物。在某些情況下，使用低溫誘導(Iti)酵母用于本發(fā)明目的甚至可能是優(yōu)選的。Lti 酵母描述于例如文獻EP 0487878、EP 066；3441或EP 1148121。Lti酵母在低溫下不增殖， 其具有以下優(yōu)點，例如，在冷凍溫度下基本不發(fā)生發(fā)酵。或者，微生物也可以是細菌，特別是選自下列的乳酸菌，特別是乳桿菌屬和/或雙歧桿菌屬和，更優(yōu)選約氏乳桿菌(LactcAacillus johnsonii)、儒氏乳桿菌 (Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、類干酪乳桿 lif (Lactobacillus paracasei) > ^lJ ？L If lif (Lactobacillus plantarum) > zF If 菌(Lactobacillus casei)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)、短雙歧桿 菌(Bifidobacterium breve)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、動物雙歧桿菌 (Bifidobacterium animais)、乳酸雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)、嬰兒雙歧桿菌 (Bifidobacterium infantis)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis) > j[x /J"· 1連雙歧桿lif (Bifidobacterium pseudocatenulatum)、雙歧桿菌(Bifidobacterium catenulatum)或其混合物，最優(yōu)選是來源于約氏乳桿菌菌株NCC 533 (CNCM 1-1225)、類 干酪乳桿菌NCCM61 (CNCM 1-2116)、鼠李糖乳桿菌NCC4007 (CGMC 1. 37 )、青春雙歧桿 菌 NCC 251 (CNCM 1-2168)、長雙歧桿菌 NCC 490 (CNCM 1-2170)、NCC 2705 (CNCM 1-2618) 和 NCC 3001 (ATCC BAA-999)、乳酸雙歧桿菌 NCC 2818 (CNCM 1-3446)、短雙歧桿菌 NCC 2950 (CNCM 1-3865)、NCC 466 (CNCM 1-3914)的溫度敏感性細菌。細菌具有下列優(yōu)點，它們易于大量產(chǎn)生，而且它們經(jīng)常已經(jīng)在腸中天然存在，使得 身體不面對外源物種。也可使用不同微生物的混合物。這些溫度敏感微生物可通過例如自然選擇來鑒定。用于鑒定溫度敏感微生物的一 種可能的實驗方案描述于實施例Ib中。例如，可通過pkcl基因中的突變使得酵母成為溫 度敏感性的?；蛘?，微生物也可通過其他方法成為溫度敏感性的。例如，微生物可以預先處理。 這些預處理可包括減弱微生物的存活力，使得降低其總生長或持久表現(xiàn)。例如，合適的預處 理可通過對微生物進行休克處理實現(xiàn)，例如分別將它們暴露于特定的熱、低溫或者低或高 PH值的條件下，將其與將實現(xiàn)細胞早期裂解的噬菌體一起孵育，或?qū)崿F(xiàn)細胞早期裂解的 重組構(gòu)建物插入到微生物中，酶處理以損傷細胞壁，使用已知含有原噬菌體的微生物，使得 它們處于不利于生長的特定發(fā)酵狀態(tài)下，引發(fā)SOS應答或者使在調(diào)節(jié)或基因表達水平上修 復受損胞內(nèi)蛋白質(zhì)的內(nèi)在保護性應激-應答系統(tǒng)失活，使得所得微生物最終顯示出存活力 和/或?qū)δc中環(huán)境條件/改變的抗性下降。此外，例如可通過常規(guī)方法(化學或輻射誘導的誘變)和不想要突變的異型雜交 從細菌或半子囊菌綱酵母物種獲得溫度敏感突變型，例如釀酒酵母(S. cerevisiae)，乳酸 克魯維斯酵母(K. lactis)或粟酒裂殖酵母(S.pombe)。所需突變具有條件性溫度敏感細 胞裂解表型，其導致引入的營養(yǎng)物在高于30攝氏度下釋放。文獻中已經(jīng)記載了 8種這樣 ^ ] ! ^ ^^ (clyl M cly8) (Hartwell, L. H. (1967)Macromolecule synthesis in temperature sensitive mutants of yeast J. Bact. 93 :1662-1670)。合適的溫度敏感釀酒酵母可選自下列突變株遺傳互補組cly U cly 2、cly 3、 cly 4、cly 5、cly 6、cly 7、cly 8 或其組合。溫度敏感酵母經(jīng)常描述為在調(diào)節(jié)極性生長、分隔(s印tation)和/或細胞壁完整 性維持的基因中有改變。如果酵母是釀酒酵母，這些基因可以優(yōu)選選自BCKl、raC12、raC15、raC31、raC24、 GLC7、GPI7、HSFl、IQGl、KICl、LST8、MID2、WSCl、M0T2、MPKl、MPT5、SSDl、MSS4、NUDl、PKCl、PMT2、PMT4、PPH22、PPZ1、PPZ2、RH03 和 RH04、ROMl、R0M2、SRB1、SWI4、SWMl、TIF51A、TSC11、 TOR1、TC089、TAP42、T0R2、BIG1、TUS1、VIG9、WSC1、WSC2、WSC3、YPK1、YPK2、YPK1、YKR2、7個
酵母天冬酶，及其組合。如果酵母是粟酒裂殖酵母，該基因優(yōu)選選自agSl、bgS3、bgS4、CWgl、orbll、CpSl、 cwgl、cwg2、ehsl、PP2C、psul、rgfl、rgf3、rhol、sidl、sid2、sid4、spgl 禾口 mobl，以及其組
口 O溫度敏感釀酒酵母菌株的一個典型實例是cly5突變體；釀酒酵母的靶基因是 H(C1，其編碼蛋白激酶C。2871位核苷酸的C至T的轉(zhuǎn)換性突變導致958位氨基酸的從蘇 氨酸變化為異亮氨酸。改變的多肽為突變體賦予了溫度敏感性其在23-25攝氏度下培養(yǎng) 時可生長并積累來自培養(yǎng)基的營養(yǎng)物(例如鐵)，但是在37攝氏度下酵母細胞不能復制并 且將裂解，因為ts突變干擾了細胞壁的修復和生長能力。因此，與合適食品產(chǎn)品一起攝取 的富含營養(yǎng)物的活突變體細胞將由于開始出芽而在身體內(nèi)裂解，并且將在37攝氏度下在 體內(nèi)遞送營養(yǎng)物。如果使用Iti-酵母(低溫失活)菌株并且，例如通過如上所述方法之一使得其溫 度敏感，那么這將具有以下優(yōu)點，這些Iti-酵母菌株會導致在冷藏狀態(tài)不發(fā)酵，同時僅僅 在升高的溫度下，例如室溫或更高，Iti-酵母菌株開始增殖。在更高的溫度下，例如在高于 35攝氏度的溫度下，其將裂解并釋放其有價值的內(nèi)含物。Lti酵母是本領(lǐng)域公知的。因此，EP 0，487，878描述了具有Iti性能(換句話說 在冷凍期間不是非常有活性的但是在這些溫度下存活的性能)的酵母菌株(Lti是表述“低 溫失活(low-temperature inactive) ”的縮寫)用作面包制作生產(chǎn)用品的膨脹劑的用途， 所述用品在冷凍保存后在烤箱中烘焙。術(shù)語“l(fā)ti”在說明書中理解為表示顯示低溫失活的酵母，即基本上無活性但是存 活的性能，例如在生面團中，在生面團不冷凍的小于或等于14攝氏度的溫度下，并且在含 有麥芽糖的介質(zhì)中高達18攝氏度下基本上沒有活性。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，溫度敏感性微生物是Iti酵母菌株，例如釀 酒酵母菌株 CNCM 1-4006、CNCM 1-4007、CNCM 1-4167、CNCMI-4168, CNCM 1-4165 或 CNCM 1-4166 或者馬克斯克魯維酵母菌株 CNCMI-4160、CNCM 1-4161, CNCM 1-4162, CNCM 1-4163 或 CNCM 1-4164。本發(fā)明的微生物遞送的化合物可通過本領(lǐng)域已知的任何方式弓I入微生物。將營養(yǎng)物引入微生物特別是弓I入酵母有不同的方式。酵母可天然攝取和積累存在 于其生長環(huán)境中的分子，或者依靠其代謝活性合成和積累所述營養(yǎng)物。也可通過改變其基因獲得在正常培養(yǎng)條件下不由微生物特別是酵母積累或合成 的所需物質(zhì)的合成，例如通過對微生物進行隨機誘變并選擇表達較高量所需物質(zhì)的突變 體。另外，也可使用重組方式，其中通過例如下列方式增加內(nèi)源或外源基因的表達，將相應 基因與強于內(nèi)源啟動子的啟動子相連，或者通過將編碼一種或多種目的物質(zhì)的一種或多種 基因插入微生物中的質(zhì)粒上或其染色體中，任選地與驅(qū)動一種或多種目的基因表達的強啟 動子相連使得重組微生物含有更高量的所需物質(zhì)。例如，可由微生物本身合成化合物，優(yōu)選作為微生物天然代謝的一部分。也可通過生物技術(shù)方式修飾微生物，例如，通過引入導致微生物產(chǎn)生載體所編碼的目的化合物的表達載體。類似地，可通過例如引入強啟動子增強微生物對化合物的天然 合成。微生物也可積累來自外界的待遞送化合物。這些化合物可存在于微生物培養(yǎng)物的 培養(yǎng)基中。例如，酵母天然積累許多微量營養(yǎng)物，例如礦物質(zhì)和維生素。通過這種方法，例 如可容易地制備富含硒的酵母，并且可用于補充膳食組合物，以治療或預防硒缺乏。當然也可使用這些方法的組合從而將目的化合物包含于可使用的微生物。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，通過將微生物在富含化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 將化合物優(yōu)選營養(yǎng)物引入微生物，優(yōu)選酵母。作為替代地或者另外地，微生物可合成化合物本身?；衔锟梢允窍率鋈魏位衔?，即微生物可合成的，可能是在生物技術(shù)修飾之后， 或者可由微生物在生長和/或培養(yǎng)過程中攝取的。但是，優(yōu)選化合物是營養(yǎng)物。營養(yǎng)物是用于生物體(人、寵物、伴侶動物和家畜)代謝的化合物。優(yōu)選地，待遞 送的營養(yǎng)物是食用細胞裂解微生物的生物體自身不能合成或者生物體僅能合成不足量的 化合物，使得它們必須從環(huán)境中攝取。如果其不能由生物體以充分的量合成并且必須從外 部來源獲得，則營養(yǎng)物是生物體所必需的。以相對較大的量需要的營養(yǎng)物稱為常量營養(yǎng)物， 以相對較小的量需要的則稱為微量營養(yǎng)物。本發(fā)明的微生物可用于遞送常量營養(yǎng)物或微量營養(yǎng)物。通常，營養(yǎng)物選自礦物質(zhì)，優(yōu)選鐵、硒、鋅、鉻、銅；維生素，優(yōu)選葉酸、煙酸、維生素 C;植物多酚，優(yōu)選兒茶精素、綠原酸、異黃酮；類胡蘿卜素，優(yōu)選胡蘿卜素、蝦青素、玉米 黃素、番茄紅素(lycopen)；生物堿，優(yōu)選咖啡因；氨基酸，優(yōu)選半胱氨酸、必需氨基酸例如 異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸；抗氧化 劑；芳香族化合物，優(yōu)選檸檬油、橙皮油、百里香、迷迭香油、牛至油(oregano oil)脂質(zhì)，優(yōu) 選多不飽和脂肪酸、長鏈多不飽和脂肪酸、脂肪酰胺、甘油磷脂(glycerophospholipids)、 甘油酯；酶和/或輔酶，優(yōu)選輔酶Q10、β -半乳糖苷酶；非分泌性異源蛋白質(zhì)，優(yōu)選疫苗或 其混合物。因此，例如，微生物可以是溫度敏感Iti酵母，待遞送化合物可以是常量營養(yǎng)物?；蛘撸⑸锟梢允菧囟让舾蠭ti酵母，待遞送化合物可以是微量營養(yǎng)物。微生物可以是溫度敏感Iti酵母，待遞送化合物可以是礦物質(zhì)，例如鐵、硒、鋅、鉻 或銅，例如鐵?；蛘撸⑸锟梢允菧囟让舾蠭ti酵母，待遞送化合物可以是維生素，優(yōu)選葉酸、 煙酸或維生素C。另外或者，微生物可以是溫度敏感Iti酵母，待遞送化合物可以是植物多酚，優(yōu)選 兒茶素、綠原酸或異黃酮。另外或者，微生物可以是溫度敏感Iti酵母，待遞送化合物可以是類胡蘿卜素，優(yōu) 選β-胡蘿卜素、蝦青素、玉米黃素或番茄紅素。另外或者，微生物可以是溫度敏感Iti酵母，待遞送化合物可以是生物堿，例如咖 啡因。微生物以消費者可接受的產(chǎn)品形式便利地遞送，所述形式例如分別是可攝取的介質(zhì)或支持物。本發(fā)明的用途制備的組合物可以是預定用于人或動物用途的任何組合物。優(yōu)選地，組合物預定用于人、寵物、伴侶動物和/或家畜。組合物可以是食品組合物、膳食補充劑、營養(yǎng)劑(nutraceutical)、飲料、動物飼料 組合物、化妝品組合物或藥物組合物。典型的化妝品組合物包含例如美容補充劑，例如營養(yǎng)美容補充劑、營養(yǎng)化妝品、口 部化妝品、營養(yǎng)補充劑、口部補充劑和口部皮膚和/或毛發(fā)護理產(chǎn)品。典型的食物組合物可選自谷物產(chǎn)品，例如谷物條、兒童谷物和嬰兒谷物或者冷藏 乳制品例如奶酪、奶、發(fā)酵乳飲料、基于乳的發(fā)酵產(chǎn)品、凝乳、冰淇淋、酸牛乳、奶粉和加強 粉末飲料例如嬰兒配方奶和成長奶、飲料、運動營養(yǎng)品和飲料組合物、湯、廚房產(chǎn)品、寵物 食品、片劑、液體細菌懸液、干的口服補充劑、濕的口服補充劑、用于干管喂飼(dry tube feeding)的組合物和/或用于濕管喂飼(wet tube feeding)的組合物。這些組合物可以通過選擇已經(jīng)含有一種或多種待遞送物質(zhì)或者將修飾從而提供 足夠量的這類或這些物質(zhì)的微生物來制備。一旦選擇以及任選地預處理微生物，則根據(jù)待遞送物質(zhì)的性質(zhì)和各個微生物中 所含物質(zhì)的量，該微生物可以下述量包含在上述產(chǎn)品中，該量在非液體組合物的情況為 104-1012cfu/g組合物干重，在液體組合物的情況為104-1012cfu/ml組合物。然后，可通過本領(lǐng)域中已知的方法，例如用于益生菌的方法，將所含微生物引入食 物基質(zhì)。例如，可通過將富含鐵的酵母生物質(zhì)加入發(fā)酵的白色基層制備含有本發(fā)明所用微 生物的酸牛乳?？赏ㄟ^將干谷物與干酵母粉末共同混合制備包含本發(fā)明所用微生物的嬰兒 谷物制品。組合物還可含有保護性水狀膠體(hydrocolloid)(例如樹膠、蛋白質(zhì)、改性淀 粉)、粘合劑、成膜劑、包封劑/材料、壁/殼材料、基質(zhì)化合物、涂層、乳化劑、表面活性劑、 增溶劑(油類、脂肪、蠟、卵磷脂等)、吸附劑、介質(zhì)、填料、共同化合物、分散劑、潤濕劑、處理 助劑(溶劑)、流動活性劑(flowing agent)、掩味劑、增重劑、膠凝劑、成膠劑(jellifying agent)、抗氧化劑和抗微生物。它們也可含有常規(guī)藥物補充劑和佐劑、賦形劑和稀釋劑，包括但不限于水、任何 來源的明膠、植物樹膠、磺酸木質(zhì)素(1 igninsulfonate)、滑石、糖類、淀粉、阿拉伯樹膠、植 物油、聚亞烷基二醇、調(diào)味劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、緩沖劑、潤滑劑、著色劑、潤濕劑、填料等。另外，它們可含有適于口服或經(jīng)腸施用的有機或無機的介質(zhì)物質(zhì)，以及維生素、礦 物微量元素及其他根據(jù)政府機構(gòu)例如USRDA推薦的微量營養(yǎng)物。本發(fā)明的組合物可含有蛋白質(zhì)來源、脂肪來源和/或糖類來源，可以預定用于口、 腸、腸胃外或局部施用。如果組合物包含脂肪來源，脂肪來源更優(yōu)選地提供5%至40%的組合物能量，例 如20%至30%的能量?？商砑覦HA?？墒褂貌俗延?、玉米油和高油酸葵花籽油的混合物獲 得合適的脂肪分布。糖類來源可優(yōu)選地提供40%至80%的組合物能量?？梢允褂萌魏魏线m的糖類，例 如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖漿固體、麥芽糖糊精和其混合物。
可使用任何合適的膳食蛋白質(zhì)，例如動物性蛋白質(zhì)(例如乳蛋白質(zhì)、肉蛋白質(zhì)和 卵蛋白類)；植物蛋白(例如大豆蛋白質(zhì)、小麥蛋白質(zhì)、稻蛋白質(zhì)和豌豆蛋白質(zhì))；游離氨基 酸的混合物；或其組合。乳蛋白質(zhì)例如酪蛋白和乳清，以及大豆蛋白質(zhì)是特別優(yōu)選的。本發(fā)明組合物還可含有益生元(prebiotics)?！耙嫔北硎敬龠M腸中益生菌生長的食物物質(zhì)。它們在胃和/或上腸道中不分 解或者在攝取它們的人的胃腸道中吸收，但是它們由胃腸微生物區(qū)系和/或益生菌發(fā)酵 (Gibson禾口Roberfroid，(1995),Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota Introducing the Concept of Prebiotics，J· Nutr· 125 :1401-1412)?！耙嫔北硎緦λ拗鞯慕】祷虬矊幘哂杏幸孀饔玫奈⑸锛毎苿┗蛭⑸锛?胞的成分° (Salminen S 等，(1999), Probiotics :how should they be defined. Trends Food Sci. Technol. 10 :107-10)?？捎糜诒景l(fā)明范圍的一些微生物具有益生菌的資格。益生元的存在將支持溫度敏感微生物存活直至它們受到高于32攝氏度的溫度。可用于本發(fā)明的益生元沒有特別限制，包括所有促進益生菌生長的食物物質(zhì)。優(yōu) 選地，其可選自寡糖類，任選地含有果糖、半乳糖、甘露糖；膳食纖維，特別是可溶性纖維、大 豆纖維；菊粉；或其混合物。優(yōu)選的益生元有果寡糖(F0Q、半乳寡糖(G0Q、異麥芽寡糖、木 寡糖(XOS)、大豆寡糖、葡萄糖基蔗糖(glycosylsucrose，GQ、乳糖基蔗糖(lactosucrose， LS)、乳酮糖(LA)、巴拉金糖寡糖(palatinose-oligosaccharides，ΡΑ0)、麥芽糖寡糖 (MOS)、樹膠和/或其水解產(chǎn)物、果膠和/或其水解產(chǎn)物。因此，可利用微生物和上述產(chǎn)品支持個體的安寧和/或治療和/或預防疾病。本發(fā)明的用途所制備的組合物還可用于改善營養(yǎng)物的穩(wěn)定性，例如在生產(chǎn)或存儲 期間。其也可用來降低待遞送化合物例如營養(yǎng)物對組合物味道的可能的有害影響。將目的化合物引入如上所述微生物內(nèi)還會避免化合物與其他化合物相接觸，例如 食物基質(zhì)中的，并由此防止不希望的相互作用。另外，在使用本發(fā)明教導時化合物的溫度依賴性釋放會使得能夠?qū)崿F(xiàn)化合物例如 營養(yǎng)物的靶向釋放，優(yōu)選在腸中或者消化道的特定位置。另外，本發(fā)明的用途使其能夠改善待遞送化合物的生物接近性和/或生物利用率。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，它們可自由地組合本文所述本發(fā)明的全部特征，而不脫 離所公開的本發(fā)明范圍。由下列實施例和附圖顯示本發(fā)明的其他優(yōu)點和特征。圖IA顯示在釀酒酵母裂解突變體中和野生型面包酵母中，當37攝氏度引發(fā)細 胞裂解時，通過測量595nm處的相對發(fā)光單位(RLU)測得的胞內(nèi)腺苷酸激酶(AK)釋放 (Levure Boulangere Bleue (LBB)，ex. Lesaffre, Marcq en Baroeul，法國)。圖IB顯示在馬克斯克魯維酵母裂解突變體中和野生型(L46)中，當37攝氏度引 發(fā)細胞裂解時，通過測量595nm處的相對發(fā)光單位(RLU)測得的胞內(nèi)AK釋放。圖IC顯示在粟酒裂殖酵母裂解突變體(Spl3》中和野生型對照(Sp968)中，37攝 氏度下通過測量595nm處的相對發(fā)光單位(RLU)測得的胞內(nèi)AK釋放。
圖2顯示在非許可溫度(37攝氏度)下，模擬十二指腸液中野生型和突變體釀酒 酵母菌株的活細胞滴度和鐵釋放測量。圖3顯示胃和小腸多區(qū)室模型示意圖(a)胃區(qū)室；(b)十二指腸區(qū)室；(C)空腸 區(qū)室；(d)回腸區(qū)室；(e)基本單元；(f)玻璃套；(g)柔性壁；(h)旋轉(zhuǎn)泵；(i)水??；(j) 蠕動泵；(1，m)pH電極；(η，ο)注射器泵；(ρ)中空纖維裝置。(來自Larrsson等(1997) Estimation of the bioavailability of phosphorus in cereals using a dynamic in vitro gastrointestinal model J. Sci. Food Agric.，74 :99-106)。圖4顯示動態(tài)胃腸模型中添加了 1. 6%野生型或細菌裂解突變酵母的原味酸牛乳 消化后，活釀酒酵母的百分比。
實施例實施例1 細胞裂解酵母菌株的開發(fā)a)釀酒酵母Hartwell(Hartwel1, L. H. (1967)MacromoIecuIe synthesis in temperature sensitive mutants of yeast J. Bact. ,93 ,662-1670) Ijf W ^ I ^ ^ # (clyl M cly8)(表 1)獲得自 Yeast Genetic Stock Centre (UCLA Berkeley),現(xiàn)在并入到了 ATCC(Rockville, Maryland, USA)。表1 單倍體釀酒酵母細胞裂解菌株初始細胞裂解突變體(ex. YGSC)YGSC突變體基因型
269aadelade2uralhis7lys2 tyrlgallclyl-1
315aadelade2uralhis7lys2 tyrlgallade9 cly2_l
X3124-4Baarg4lys7 trplgallcly3-l
233aadelade2uralhis7lys2 tyrlgallade cly4-l
254aadelade2uralhis7lys2 tyrlgallcly5-l
308aadelade2uralhis7lys2 tyrlgallcly6-l
X3119-2Bauralleu2aro7gallade2 his2Iys cly7-l
197aadelade2uralhis7lys2 tyrlgallade6 cly8_l帶有一系列營養(yǎng)突變型的這些菌株分別連續(xù)回交野生型菌株接合型 a(X2180-lA)或α (Χ2180-1Β)(由Thomas R. Manney惠贈)，以異型雜交所有營養(yǎng)突變型。具有初始溫度敏感性cly突變的原養(yǎng)分離子與帶有相反接合型的樣品純合重構(gòu) 為二倍體(表2)。表2 二倍體釀酒酵母細胞裂解菌株cly2 CNCM 1-4000 a/α cly2/cly2cly3 CNCM 1-4001 a/α cly3/cly3cly4 CNCM 1-4002 a/α cly4/cly4
cly5 CNCM 1-4003 a/α cly5/cly5cly6 CNCM 1-4004 a/α cly6/cly6cly8 CNCM 1-4005 a/α cly8/cly8二倍體 cly4/lti 和 cly8/lti 雙突變體為了將細胞裂解(Cly)表型與低溫失活(Lti)表型相組合，將帶有初始溫度敏感 型cly4或cly8突變的原養(yǎng)單倍體分離子與相反接合型的帶有低溫失活突變的單倍體菌株 雜交。使得此二倍體合子形成孢子，分離同時具有兩種突變的后代孢子，帶有相反接合 型的分離株重構(gòu)形成帶有cly和Iti突變的純合二倍體，由此同時顯示(Cly和Lti)表型。此系列的保藏菌株-DCL445基因型a/acly4/cly4lti//lti(CNCM I-4167)-DCL448基因型a/acly4/cly4lti/ati(CNCM I-4168)-DCL814基因型a/acly8/cly8lti/ati(CNCM I-4165)-DCL869基因型a/acly8/cly8lti/ati(CNCM I-4166)根據(jù)專利EP 1 148 121中所述的方法，將具有初始溫度彳敏感性cly突變的原養(yǎng)分
離子用于產(chǎn)生四倍體菌株，該專利的公開通過引用并入本文。為了將細胞裂解(Cly)表型和低溫失活(Lti)表型相組合，將對于交配型和cly 突變來說純合的二倍化原養(yǎng)分離子與如EP 1 148 121所述帶有純合低溫失活突變且相反 接合型純合的二倍體分離子雜交。使得此四倍體合子形成孢子，分離顯示Cly表型和Lti 表型的二倍體分離子，帶有相反接合型的分離株重構(gòu)形成帶有cly和Iti突變的純合四倍 體，由此同時顯示(Cly和Lti)表型。(表3)表3 四倍體釀酒酵母細胞裂解菌株CNCM 1-4006 a/a/α /α cly5/cly5/cly5/cly5CNCM 1-4007 a/a/α / α cly5/cly5/cly5/cly5 lti/lti/lti/ltib)馬克斯克魯維酵母誘變馬克斯克魯維酵母菌株L46(CNCM 1-4008)(來自Nestl6菌株庫的天然分 離株)在攪拌OOO轉(zhuǎn)/分鐘)的5ml YPD(1% Difco Bacto酵母提取物、2% Difco Bacto 蛋白胨、2%葡萄糖)中25攝氏度下預培養(yǎng)16小時。通過離心收獲細胞，用無菌水清洗兩 遍。將細胞懸于5ml無菌水，在計數(shù)板(BUrki-TUrk chamber,來自Assistent (Sondheim,德 國))的幫助下確定細胞濃度。將含有^clOS細胞的等分試樣轉(zhuǎn)移到微離心管，通過離心沉 淀細胞，懸于Iml pH7的IOOmM磷酸鈉緩沖液中。加入30 μ 1的甲磺酸乙酯(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs，瑞士 )目錄號M-0880)，將管在30攝氏度下保持攪拌1小時。再次沉淀細胞，用Iml水洗一遍，用Iml 5%五水合硫代硫酸鈉(Fluka，BuchsJ^ 士)目錄號72048洗兩遍。將存活細胞涂布于YPD平板(1% Difco Bacto酵母提取物、2% Difco Bacto蛋白胨、2%葡萄糖，由2% Difco Bacto瓊脂固化)并培養(yǎng)產(chǎn)生菌落。將之復 印到新的YPD平板，在37攝氏度下孵育，分離溫度敏感克隆(在37攝氏度顯示不生長)用于實施例2中所述的細胞裂解測定(表4)。表4 馬克斯克魯維酵母野生型和細胞裂解菌株初始馬克斯克魯維酵母分離株L46在細胞裂解測定中顯示陽性反應的溫度敏感性(ts)突變體例如CNCM 1-4009CNCM 1-4010CNCM 1-4011馬克斯克魯維酵母cly/lti雙突變體為了將細胞裂解(Cly)表型與低溫失活(Lti)表型相組合，將實施例IB中所述 的馬克斯克魯維酵母細胞裂解菌株CNCM 1-4009在攪拌QOO轉(zhuǎn)/分鐘)的5ml YPD (1 % Difco Bacto酵母提取物、2% Difco Bacto蛋白胨、2%葡萄糖)中25攝氏度下預培養(yǎng)16小 時。通過離心收獲細胞，用無菌水清洗兩遍。將細胞懸于5ml無菌水，在計數(shù)板(BUrki-TUrk chamber，來自Assistent (Sondheim，德國))的幫助下確定細胞濃度。將含有&108細胞的 等分試樣轉(zhuǎn)移到微離心管，通過離心沉淀細胞，懸于Iml pH7的IOOmM磷酸鈉緩沖液中。加 入 30μ1 的甲磺酸乙酯(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Buchs，瑞士)目錄號 M-0880)，將管 在30攝氏度下保持攪拌1小時。再次沉淀細胞，用Iml水洗一遍，用Iml 5%五水合硫代硫 酸鈉(Fluka，BuchS，瑞士)目錄號72048洗兩遍。將存活細胞涂布于YPD平板(1 % Difco Bacto酵母提取物、2% Difco Bacto蛋白胨、2%葡萄糖，由2% Difco Bacto瓊脂固化)并 培養(yǎng)產(chǎn)生菌落。將之復印到新的YPD平板，在8攝氏度下孵育，分離低溫失活克隆(在8攝 氏度下3周顯示不生長，但是轉(zhuǎn)移到25攝氏度時恢復生長)，再次檢查以下兩者的存在37 攝氏度下細胞裂解和低溫失活表型。此系列的保藏菌株KM5-L3(CNCM 1-4160)KM5-L7(CNCM 1-4161)KM5-L15(CNCM 1-4162)KM5-L18(CNCM 1-4163)KM5-L23(CNCM 1-4164)c)粟酒裂殖酵母粟酒裂殖酵母野生型菌株968 (接合型h90)由P. Munz ( Universitat Bern, Berne,瑞士)惠贈；裂解菌株 Sp 132 (mat h-cwgl-1 leul-32) (Ribas, J. C 等(1991) Isolation and Characterization of Schizosaccharomycespombe. Mutants Defective in Cell Wall(1-3) β -D-Glucan, J. Bact. 173 :3456-3462)由 J. C. Ribas，Universidad de Salamanca, Salamanca, Spain ；實施例2 通過腺苷酸激酶活性測量檢測細胞裂解表型為了評估非許可溫度下的細胞裂解，我們使用了市售ToxiLight測定(Cambrex Bio Science, Rockland, ME USA)，其定量測定裂解細胞在上清中釋放的細胞內(nèi)腺苷酸激酶 (AK)。將酵母菌株在40ml YD培養(yǎng)基(0. 5% Difco Bacto酵母提取物、1. 5%葡萄糖)中 預培養(yǎng)至600nm的光密度(OD)約為0. 5-4. O。
通過離心收獲細胞，懸于MV(0. 67%無氨基酸酵母氮源Difco(Difco Yeast Nitrogen Base w/o amino acid)、2%葡萄糖、2%琥珀酸鈉)至 600nm 的 OD 為 1. 0。在 IOOml錐形瓶中37攝氏度下攪拌(120轉(zhuǎn)/分鐘)孵育20ml此懸液。在所需的時間點，將 20 μ 1培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到與發(fā)光相容的96孔平板，在565nm讀取發(fā)光，其與釋放的AK量成正比。 37攝氏度下來自裂解和對照菌株的AK釋放顯示于

圖1A-1C。值得注意地，不同突變導致不 同的細胞裂解速率，使得能夠?qū)崿F(xiàn)沿消化道不同位置的化合物靶向釋放。實施例3 分批發(fā)酵的釀酒酵母和馬克斯克魯維酵母中的鐵累積富含鐵的生物質(zhì)獲得自在1L，0. 5% bacto酵母提取物(Difco)，1. 5 %葡萄糖 (Merck)，和5、10、15、20和25mM檸檬酸鐵(Sigma)中培養(yǎng)的酵母。在25攝氏度下3天后， 收獲細胞，在冷蒸餾水中清洗3遍，以除去未結(jié)合的鐵鹽。通過對灰分的ICP-AES(感應耦 合等離子體原子發(fā)射光譜)確定鐵負荷。通過在馬弗爐中550攝氏度下8小時破壞有機物 獲得灰分。使用培養(yǎng)基中不同檸檬酸鐵濃度的培養(yǎng)所導致的結(jié)合鐵的值在表5中顯示。表5 補充檸檬酸鐵培養(yǎng)基中分批條件下釀酒酵母野生型和突變株以及克魯維酵 母中的鐵積累
權(quán)利要求
1.在約32至45攝氏度的溫度范圍中至少部分裂解的溫度敏感微生物的用途，其用作 制備遞送化合物，特別是營養(yǎng)物到身體的部分，特別是胃腸道的組合物的載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中微生物是酵母，例如低溫誘導的酵母，優(yōu)選食品級酵 母，其選自半子囊菌綱酵母物種、子囊菌亞門或半知菌亞門，更優(yōu)選地，酵母選自德巴利酵 母屬、裂殖酵母屬、克魯維酵母屬、酵母屬、耶氏酵母屬、接合酵母屬、假絲酵母屬和紅酵母 屬，優(yōu)選地酵母可以是釀酒酵母(面包酵母)，更優(yōu)選溫度敏感釀酒酵母菌株CNCM 1-4000、 CNCM 1-4001、CNCM 1-4002、CNCM 1-4003、CNCMI-4004、CNCM 1-4005、CNCM 1-4006、CNCM 1-4007、CNCM 1-4165、CNCM 1-4166、CNCM 1-4167 和 / 或 CNCM 1-4168，或者溫度敏感馬克 斯克魯維酵母菌株 CNCM 1-4009、CNCM 1-4010、CNCM 1-4011、CNCM 1-4160、CNCM 1-4161、 CNCM 1-4162、CNCM 1-4163和/或CNCM 1-4164 ；或者細菌，特別選自乳酸菌，特別是乳桿 菌屬和/或雙歧桿菌屬，更優(yōu)選約氏乳桿菌、儒氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、類干酪乳桿菌、 干酪乳桿菌、兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、長雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、乳酸雙歧桿菌、嬰兒 雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、假小鏈雙歧桿菌、鏈狀雙歧桿菌或其混合物，最優(yōu)選是來源于 約氏乳桿菌菌株NCC 533 (CNCM 1-1225)、類干酪乳桿菌NCC2461 (CNCM 1-2116)、鼠李糖 乳桿菌NCC4007(CGMC 1. 37 )、青春雙歧桿菌NCC 251 (CNCM 1-2168)、長雙歧桿菌NCC 490 (CNCM 1-2170)、NCC 2705 (CNCM 1-2618)和 NCC 3001 (ATCC BAA-999)、乳酸雙歧桿菌 NCC 2818 (CNCM 1-3446)、短雙歧桿菌 NCC 2950 (CNCM 1-3865)、NCC 466 (CNCM 1-3914)的 溫度敏感性細菌或其混合物。
3.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的用途，其中溫度敏感微生物由自然選擇獲得。
4.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的用途，其中酵母由于pkcl基因中的突變而溫度敏感。
5.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的用途，其中溫度敏感釀酒酵母選自下列突變株遺傳互 補組 cly Ucly 2、cly 3、cly 4、cly 5、cly 6、cly 7、cly 8 或其組合。
6.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的用途，其中酵母是釀酒酵母并且由于調(diào)節(jié)極性生長、 分隔和/或細胞壁完整性維持的基因中的變化而溫度敏感，其中所述基因優(yōu)選選自BCK1、 CDC12、CDC15、CDC31、CDC24、GLC7、GP17、HSF1、IQG1、KIC1、LST8、MID2、WSC1、M0T2、MPK1、 MPT5、SSDl、MSS4、NUDl、PKCl、PMT2、PMT4、PPH22、PPZl、PPZ2、RH03 禾P RH04、ROMl、R0M2、 SRBl、SWI4、SWMl、TIF51A、TSCl1、TORI、TC089、TAP42、T0R2、BIGl、TUSl、VIG9、WSCl、WSC2、 WSC3、YPKU YPK2、YPKU YKR2.7個酵母天冬酶及其組合，和/或其中酵母是粟酒裂殖酵母 且由于調(diào)節(jié)極性生長、分隔和/或細胞壁完整性維持的基因中的變化而溫度敏感，其中所 述基因優(yōu)選選自 agsl、bgs3、bgs4、cwgl、orbll、cpsl、cwgl、cwg2> ehsl、PP2C、psul、rgfl、 rgf3、rhol、sidl、sid2、sid4、spgl 和 mobl 以及其組合。
7.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的用途，其中溫度敏感微生物是Iti酵母。
8.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的用途，其中營養(yǎng)物選自礦物質(zhì)，優(yōu)選鐵、硒、鋅、鉻、銅； 維生素，優(yōu)選葉酸、煙酸、維生素C;植物多酚，優(yōu)選兒茶精素、綠原酸、異黃酮；類胡蘿卜素， 優(yōu)選β-胡蘿卜素、蝦青素、玉米黃素、番茄紅素；生物堿，優(yōu)選咖啡因；氨基酸，優(yōu)選半胱氨 酸、必需氨基酸例如異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、纈氨酸 和苯丙氨酸；抗氧化劑；芳香族化合物，優(yōu)選檸檬油、橙皮油、百里香、迷迭香油、牛至油；脂 質(zhì)，優(yōu)選多不飽和脂肪酸、長鏈多不飽和脂肪酸、脂肪酰胺、甘油磷脂、甘油酯；酶和/或輔 酶，優(yōu)選輔酶Q10、半乳糖苷酶；非分泌性異源蛋白質(zhì)，優(yōu)選疫苗或其混合物。
9.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的用途，其中通過將酵母在富含化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)和 /或通過酵母自身合成化合物將這些化合物特別是營養(yǎng)物引入酵母。
10.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的用途，其改善化合物的穩(wěn)定性，特別是營養(yǎng)物的穩(wěn)定 性，和/或減少化合物，特別是營養(yǎng)物對味道的有害影響。
11.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的用途，其限制化合物特別是營養(yǎng)物與其他化合物的相 互作用。
12.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的用途，其實現(xiàn)化合物特別是營養(yǎng)物的靶向釋放，優(yōu)選靶 向釋放到腸，或者靶向釋放到消化道中特定位置。
13.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的用途，其改善化合物特別是營養(yǎng)物的生物接近性和/ 或生物利用率。
14.酵母菌株，其選自CNCM1-4000、CNCM 1-4001、CNCM 1-4002、CNCM 1-4003、 CNCM 1-4004、CNCM 1-4005、CNCM 1-4006、CNCM 1-4007、CNCM 1-4165、CNCM 1-4166、 CNCM 1-4167、CNCM 1-4168、CNCM 1-4009、CNCM 1-4010、CNCM 1-4011、CNCM 1-4160、CNCM 1-4161、CNCM 1-4162、CNCM 1-4163 和 CNCM 1-4164。
15.包含權(quán)利要求14的一個或多個酵母菌株的食物組合物。
全文摘要
本發(fā)明大體上涉及健康和安寧領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及溫度敏感微生物以及其用作制備遞送化合物例如營養(yǎng)物到身體特定區(qū)域的組合物之載體的用途。
文檔編號A61K35/66GK102123615SQ200980126070
公開日2011年7月13日 申請日期2009年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月3日
發(fā)明者C·吉斯勒, C·沙費爾-勒卡特, N·帕日, P·尼德爾伯格 申請人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司