專利名稱：抗PirB抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)學病癥。具體而言，本發(fā)明特別涉及髓磷脂 相關(guān)抑制系統(tǒng)的新調(diào)控劑的鑒定及如此鑒定的調(diào)控劑的各種用途。
背景技術(shù)：
髓磷脂和髓磷脂相關(guān)蛋白已知成年哺乳動物CNS神經(jīng)元的軸突在損傷后再生的能力非常有限，而周圍神 經(jīng)系統(tǒng)(PNS)中的軸突再生迅速。已知CNS神經(jīng)元的有限再生能力部分地由于CNS軸突 的內(nèi)在特性，但也是由于不允許的環(huán)境。雖然CNS髓磷脂不是神經(jīng)突向外長出的抑制信 號的唯一來源，但是它含有眾多積極阻斷軸突生長的抑制分子，因此構(gòu)成再生的一個重大 障礙。已經(jīng)鑒定了三種這樣的髓磷脂相關(guān)蛋白(MAP) :Nogo(也稱為NogoA)是具有兩個 跨膜結(jié)構(gòu)域的Reticulon蛋白質(zhì)家族成員；髓磷脂相關(guān)糖蛋白(MAG)是Ig超家族的跨膜 蛋白；和OMgp是具有糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨的富含亮氨酸的重復(fù)(LRR)蛋白。Chen 等，Nature 403 :434-39(2000) ；GrandPre 等，Nature 417 :439-444(2000) ；Prinjha 等， Nature 403 :383-384(2000) ；McKerracher 等，Neuron 13:805-11(1994) ；Wang 等，Nature 417 :941-4(20020 :Kottis 等，J. Neurochem 82 :1566-9 Q002)。Nogo66 是 NogoA 的一部分， 被描述為一種66個氨基酸的胞外多肽，其見于Nogo的所有三種同等型中。盡管結(jié)構(gòu)差異，但是所有三種抑制性蛋白質(zhì)(包括Nogo66)已經(jīng)顯示出結(jié)合相同 的GPI錨定受體，稱為Nogo受體(NgR ；也稱為Nogo受體-1或NgRl)，而且已提出NgR可能 是介導(dǎo) Nogo, MAG 和 OMgp 的抑制作用所需的。Fournier 等，Nature 409 :341-346(2001)。 還鑒定了兩種 NgRl 同系物(NgR2 和 NgR3)。US 2005/0048520 Al (Mrittmatter 等)，公布 于2005年3月3日?？紤]到NgR是一種GPI錨定的細胞表面蛋白，它不太可能是直接的信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)物(Zheng 等，Proc. Natl. Acad. ki. USA 102 1205-1210 (2005)) 另有人提出神經(jīng) 營養(yǎng)因子受體P75N 是NgR的一種共同受體，并且在受體復(fù)合物中提供信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊(Wang 等，Nature 420 :74-78 (2002) ；Wong 等，Nat. Neurosci. 5 1302-1308 (2002))。PirB及人盲向同系物I類主要組織相容性復(fù)合物(MHC)最初鑒定為一個編碼對免疫系統(tǒng)有重要作用 的分子家族的區(qū)域。新近的證據(jù)指出了 I類MHC分子在發(fā)育和成年CNS中具有別的功能。 Boulanger 和 Shatz,Nature Rev Neurosci. 5 :521-531 (2004) ；US 2003/0170690 (Shatz 和 Syken)，公布于2003年9月11日。發(fā)現(xiàn)許多I類MHC成員及其結(jié)合配偶在CNS神經(jīng)元中 表達。新近的遺傳和分子研究集中在CNS I類MHC的生理學功能，而且初始結(jié)果提示I類 MHC分子可能涉及活性依賴性突觸可塑性，即現(xiàn)有突觸連接的強度應(yīng)答因神經(jīng)元活性而增 強或減弱，接著是對回路的長期結(jié)構(gòu)改變的過程。此外，也已在遺傳上將I類MHC編碼區(qū)與 極其多種具有神經(jīng)學癥狀的病癥關(guān)聯(lián)，而且認為I類MHC分子的異常功能引起正常腦發(fā)育 和可塑性的破壞。免疫背景中已知的I類MHC受體之一是PirB，即由KiAagawa等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94:5261-6(1997)首先記載的一種鼠多肽。小鼠PirB具有數(shù)種人直向同系物，它們是白細胞免疫球蛋白樣受體亞家族B(LILRB)的成員，也稱為“免疫球蛋白樣 轉(zhuǎn)錄物”(ILT)。人直向同系物與鼠序列具有顯著同源性，同源性由高到低的次序如下 LILRB3/ILT5, LILRB1/ILT2, LILRB5/ILT3, LILRB2/ILT4，而且正如 PirB —樣，都是抑制性 受體。LILRB3/ILT5 (NP_00685Q 和 LILRB1/ILT2 (ΝΡ_006660)最初記載于 Samaridis 和 Colonna, Eur. J. Immunol. 27(3) :660-665 (1997)。LILRB5/ILT3 (NP_006831)由 Borges 等， J. Immunol. 159(11) :5192-5196(1997)鑒定。LILRB2/IUT4(也稱為 MIR10)是由 Colonna 等，J. Exp. Med. 186 :1809-18(1997)鑒定的。PirB及其人直向同系物顯示出極大程度的結(jié) 構(gòu)可變性。各種可變剪接形式的序列可以自EMBL/GenBank獲得，包括例如人ILT4 cDNA 的以下登錄號ILT4-cllAF009634 ;ILT4-cll7 AF11566 ;ILT4_cl26 AF11565。如上所述， PirB/LILRB多肽是I類MHC (MHCI)抑制性受體，而且已知它們在調(diào)控免疫細胞激活中的作 用(Kubagawa 等，見上文；Hayami 等，J. Biol. Chem. 272 :7320 (1997) ；Takai 等，Immunology 115 :433(2005) ；Takai 等，Immunol. Rev. 181 :215(2001) ；Nakamura 等，Nat. Immunol. 5 623 (2004) ；Liang 等，Eur. J. Immunol. 32 :2418 (2002))。Syken 等(Science 313 :1795-800(2006))的新近研究報告了 PirB 在遍及大腦的 神經(jīng)元子集中表達。在缺乏功能性PirB的突變型小鼠中，皮質(zhì)眼優(yōu)勢(cortical ocular dominance, 0D)可塑性在所有年齡顯著增強，提示PirB在約束視皮層中的活性依賴性可塑 性(activity-dependent plasticity)中的功能。發(fā)明概述使用功能阻斷性抗PirB抗體干擾PirB活性有助于挽救Nogo66和髓磷脂所致的 神經(jīng)突向外生長(neurite outgrowth)的抑制，而且同時阻斷PirB和NgR活性導(dǎo)致近乎完 全解除髓磷脂抑制。一方面，本發(fā)明關(guān)注一種分離的抗PirB/LILRB抗體，其與選自下組的抗體結(jié)合人 PirB (LILRB)上基本上相同的表位YW259. 2、YW259. 9 和 YW259. 12。另一方面，本發(fā)明關(guān)注一種分離的抗PirB/LILRB抗體，其與選自下組的抗體競爭 對人 PirB (LILRB)的結(jié)合:YW259. 2、YW259. 9 和 YW259. 12。又一方面，本發(fā)明關(guān)注一種分離的抗PirB/LILRB抗體，其包含來自選自下組的重 鏈的一個、兩個、或三個高變區(qū)序列YW259. 2重鏈(SEQ ID NO :4或11)、YW259. 9重鏈(SEQ ID NO 5 或 12)、禾口 YW259. 12 重鏈(SEQ ID NO 6 或 13)。在一個實施方案中，該抗體包含YW259. 2抗體重鏈(SEQ ID NO :4或11)的所有高 變區(qū)序列。在另一個實施方案中，該抗體包含YW259. 9抗體重鏈(SEQ ID NO :5或12)的所有
高變區(qū)序列。在又一個實施方案中，該抗體包含YW259. 12抗體重鏈(SEQ ID NO :6或13)的所
有高變區(qū)序列。在一個進一步的實施方案中，該抗體包含輕鏈。在一個又進一步的實施方案中，該抗體包含來自多肽序列SEQ ID NO 7的輕鏈的 一個、兩個或三個高變區(qū)序列。在又一個實施方案中，該抗體包含含有多肽序列SEQ ID NO 7或15的輕鏈的所有 高變區(qū)序列。
在一個具體的實施方案中，該抗體包含重鏈和輕鏈二者，其中所述重鏈包含來自 選自下組的重鏈的一個、兩個、或三個高變區(qū)序列YW259. 2重鏈(SEQ ID N0:4或11)、 YW259. 9 重鏈(SEQ ID NO 5 或 12)、和 YW259. 12 重鏈(SEQ ID NO 6 或 13)，和 / 或所述輕 鏈包含來自多肽序列SEQ ID NO 7或15的輕鏈的一個、兩個或三個高變區(qū)序列。在一個進一步的實施方案中，該抗體選自下組抗體YW259. 2、YW259. 9、和 YW259. 12。又一方面，本發(fā)明關(guān)注一種分離的抗PirB抗體，其中該抗體的全長IgG形式以5nM 或更好或者InM或更好的結(jié)合親和力特異性結(jié)合人PirB。在一個實施方案中，該抗體促進軸突再生，諸如CNS神經(jīng)元再生。在另一個實施方案中，該抗體至少部分挽救Nogo66和髓磷脂所致的神經(jīng)突向外 生長的抑制。在所有方面，該抗體優(yōu)選是單克隆抗體，其可以是例如嵌合抗體、人源化抗體、親 和力成熟的抗體、人抗體、或雙特異性抗體，抗體片段或免疫偶聯(lián)物。又一方面，本發(fā)明關(guān)注編碼本文抗PirB/LILRB抗體的多核苷酸。其它方面，本發(fā)明關(guān)注包含編碼本文抗體的多核苷酸(包括一條或多條抗體鏈的 編碼序列)的載體和宿主細胞。該宿主細胞包括原核、真核和哺乳動物宿主。又一方面，本發(fā)明關(guān)注一種用于制備抗PirB/LILRB抗體的方法，包括(a)在合適 的宿主細胞中表達包含編碼該抗體的核酸的載體，并(b)回收該抗體。還有一方面，本發(fā)明關(guān)注一種組合物，其包含本文抗PirB/LILRB抗體和藥學可接 受賦形劑。任選的是，該組合物包含第二藥物，其中所述抗PirB/LILRB抗體是第一藥物。所 述第二藥物可以是例如NgR抑制劑，諸如抗NgR抗體。在一個不同的方面，本發(fā)明關(guān)注一種試劑盒，其包含本文抗PirB/LILRB抗體。另一方面，本發(fā)明關(guān)注一種用于促進軸突再生的方法，包括對有所需要的受試者 施用有效量的本文抗PirB/LILRB抗體。優(yōu)選的是，所述受試者是人患者。在多個實施方案中，本文治療方法增強神經(jīng)元的存活和/或誘導(dǎo)神經(jīng)元的向外長
出ο又一方面，本發(fā)明關(guān)注一種治療神經(jīng)變性性疾病(neurodegenerativedisease) 的方法，包括對有所需要的受試者施用有效量的本文抗PirB/LILRB抗體。所述神經(jīng)變性 性疾病的特征可以為例如對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的物理損傷(physical damage to the central nervous system)，而且包括但不限于與中風有關(guān)的腦損傷。在一個具體的實施方案中，所述神經(jīng)變性性疾病選自下組三叉神經(jīng)痛 (trigeminal neuralgia),舌咽神經(jīng)痛(glossopharyngeal neuralgia),貝爾氏麻搏 (Bell ‘ s Palsy),重癥肌無力(myasthenia gravis),肌營養(yǎng)不良(musculardystrophy), 月Λ _ 胃 it (amyotrophic lateral sclerosis, ALS)， ^ ^ fi ig it (multiple sclerosis, MS), iiifftlil^^f (progressive muscular atrophy), ^if ftMfSB.7 Cft 月JL妻縮(progressive bulbar inherited muscular atrophy)，身體損傷( 歹Ij女口燒傷、傷 口)或疾病狀態(tài)(諸如糖尿病、腎功能障礙)或由用于治療癌癥和AIDS的化療劑的毒 性作用引起的周圍神經(jīng)損傷，椎間盤成疝、破裂和脫出綜合征(herniated，ruptured or prolapsed invertebrate disk syndromes)，頸椎病(cervical spondylosis),叢病癥(plexus disorders),胸廓出口破壞綜合征(thoracic outlet destruction syndromes), 周圍神經(jīng)病諸如那些由鉛、氨苯砜(dapsone)、蜱螨引起的(peripheral neuropathies such as those caused by lead, dapsone, ticks)，口卜H|木病(prophyria), H-Ei-癥(GulIain-Barre syndrome)，阿爾茨海默氏病(Alzheimer ' s disease)，亨廷頓氏病 (Huntington' s Disease),禾口中白金森氏病(Parkinson' s disease)。本發(fā)明還關(guān)注一種抗獨特型抗體，其特異性結(jié)合本文抗PirB抗體。附圖簡述圖 IA 和 IB 顯示小鼠 PirB 序列(SEQ ID NO 1)和人 LILRB2 序列(SEQ IDNO 2)。圖2A和2B。阻斷PirB逆轉(zhuǎn)AP-Nogo66或髓磷脂上的CGN向外長出抑制。將解離 的小鼠P7CGN在PDL/層粘連蛋白(對照)、AP-Nogo66、或髓磷脂上涂板以測試這些底物所 致抑制。(A)代表性顯微照片，(B)測量來自一項代表性實驗的平均神經(jīng)突長度(士SE)的 圖。培養(yǎng)在PDL/層粘連蛋白、AP-Nogo66、或髓磷脂上生長的神經(jīng)元，有或無針對PirB的功 能阻斷性抗體(aPBl ；50μ g/ml)。aPBl顯著降低任一底物所致抑制(*p < 0. 01 ；比例尺， 50 μ m)。圖3A-3D。阻斷PirB逆轉(zhuǎn)AP-Nogo66或髓磷脂上的CGN向外長出抑制。將解離的 小鼠P7CGN在PDL/層粘連蛋白(對照)、AP-Nogo66、或髓磷脂上涂板以測試這些底物所致 抑制。代表性顯微照片顯示于圖3A和3C，而測量來自一項代表性實驗的平均神經(jīng)突長度 (士SE)的圖顯示于圖:3B和3D。培養(yǎng)在PDL/層粘連蛋白、AP-Nogo66、或髓磷脂上生長的神 經(jīng)元，有或無針對PirB的功能阻斷性抗體(aPBl ；50 μ g/ml)。aPBl顯著降低任一底物所致 抑制(*p < 0. 01 ；比例尺，50 μ m)。圖4A和4B。PirB和NgR 二者是髓磷脂抑制劑介導(dǎo)生長錐塌陷(growthcone collapse)所需要的。將出生后DRG軸突的生長錐用單獨的培養(yǎng)基(對照)、髓磷脂(3 μ g/ ml)、或AP-Nogo66 (IOOnM)處理30分鐘以刺激塌陷，并用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色以顯現(xiàn)生 長錐。㈧代表性顯微照片，⑶測量來自累積實驗的百分比生長錐塌陷(士SEM)的圖。NgR 的遺傳丟失或抗PirB處理所致PirB抑制任一足以單獨阻止髓磷脂或AP-Nogo66的生長錐 塌陷活性。對兩種途徑的抑制也完全阻斷塌陷(比例尺，50 μ m)。圖5A-5D。阻斷PirB部分解除DRG神經(jīng)元中的和底物MAG上的神經(jīng)突向外長出 抑制。代表性顯微照片顯示于圖5A和5C;顯示來自一項代表性實驗的平均神經(jīng)突長度 (士SE)的圖顯示于圖5B和5D。(A)和(B)將解離的P10DRG神經(jīng)元在PDL/層粘連蛋白、 AP-Nogo66、或髓磷脂上涂板，有或無抗PirB。aPBl對AP-Nogo66和髓磷脂的抑制作用有顯 著降低。(C)和(D)將解離的P7CGN培養(yǎng)物在PDL/層粘連蛋白或MAG-Fc上涂板，有或無 aPBl。針對PirB的抗體降低MAG-Fc所致神經(jīng)突向外長出抑制。(*p < 0. 01 ；比例尺，A、B 為 200 μ m 為 50 μ m)。圖 6?？?PirB 抗體 YW259. 2 重鏈的 DNA 序列(SEQ ID NO 8)。圖 7?？?PirB 抗體 YW259. 9 重鏈的 DNA 序列(SEQ ID NO 9)。圖 8?？?PirB 抗體 YW259. 12 重鏈的 DNA 序列(SEQ ID NO 3)。圖9。抗PirB抗體YW259. 2重鏈的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO 4)。

圖10?？筆irB抗體YW259. 9重鏈的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO 5)。圖11?？筆irB抗體YW259. 12重鏈的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO 6)。
圖12。所有YW259抗體的輕鏈蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO 7)。圖13?？筆irB抗體YW259. 2(IgG)抑制帶His標簽的小鼠PirB的活性的能力。圖14?？筆irB抗體YW259. 9(IgG)抑制帶His標簽的小鼠PirB的活性的能力。圖15?？筆irB抗體YW259. 12 (IgG)抑制帶His標簽的小鼠PirB的活性的能力。圖 16。一組抗 PirB 抗體的相對 AP_Nogo66 結(jié)合，包括 YW259. 2、YW259. 9、和 YW259. 12。圖 17A-17C?？?PirB 抗體 YW259. 2 (SEQ ID NO :11)、YW259. 9 (SEQ IDNO 12)和 YW259. 12 (SEQ ID NO 13)的重鏈序列比對。隨同依照Kabat、Chothia和接觸CDR H域的 CDR H 域，框示了 CDR HI、CDR H2 和 CDR H3 序列。Hum III 披露為 SEQ ID NO :10。圖 18A-18C。抗 PirB 抗體 YW259. 2 (SEQ ID NO 15)、YW259. 9 (SEQ IDNO 15)和 YW259. 12 (SEQ ID NO 15)、及 Hu κ I (SEQ ID NO :14)的輕鏈序列比對。隨同依照 Kabat、 Chothia和接觸⑶R L域的⑶R L域，框示了⑶R Li、⑶R L2和⑶R L3序列。Hum III披 露為 SEQ ID NO =IOo圖19。C1QTNF5 (CTRP5 ；ΝΡ_05646)抑制背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的神經(jīng)突向外長出，而 且此抑制在PirB被PirB功能阻斷性抗體YW259. 2阻斷時降低。發(fā)明詳述定義術(shù)語“成對免疫球蛋白樣受體B”和“PirB”在本文中可互換使用，指圖1所示天然 序列的、841個氨基酸的小鼠抑制性蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 1) (NP_035225)，及其在大鼠和其它 非人哺乳動物中的天然序列同源物，包括所有天然存在的變體，諸如可變剪接的等位變體 和同等型，及其可溶形式。進一步的詳情參見KiAagawa et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 94,5261(1997)。術(shù)語“LILRB”、“ILT”和“MIR”在本文中可互換使用，指人“白細胞免疫球蛋白樣 受體亞家族B”的所有成員，包括所有天然存在的變體，諸如可變剪接的等位變體和同等型， 及其可溶形式。LILR受體的這個B型亞家族內(nèi)的各個成員以首字母縮寫后面的數(shù)字命名， 諸如例如 LILRB3/ILT5、LILRB1/ILT2、LILRB5/ILT3、和 ILIRB2/IUT4，除非另有說明，當提 及任何成員個體時也包括提及所有天然存在的變體，諸如可變剪接的等位變體和同等型， 及其可溶形式。如此，例如，“LILRB2”、“LIR2”和“MIR10”在本文中可互換使用，是指SEQ ID NO 2所示的598個氨基酸的多肽(圖1) (NP_005865)，以及其天然存在的變體，諸如可 變剪接的等位變體和同等型，及其可溶形式。進一步的詳情參見Martin et al. , Trends Immunol. 23,81 (2002)。術(shù)語“PirB/LILRB”在本文中用于共同地指相應(yīng)的小鼠和人蛋白及在其它非人哺 乳動物中的天然序列同源物，包括所有天然存在的變體，諸如可變剪接的等位變體和同等 型，及其可溶形式。術(shù)語“髓磷脂相關(guān)蛋白”以最廣義使用，包括抑制神經(jīng)元再生的CNS髓磷脂中存在 的所有蛋白質(zhì)，包括Nogo、MAG和OMgp?！胺蛛x的”，在用于描述本文中所公開的各種蛋白質(zhì)時，意指已經(jīng)鑒定且從其天然 環(huán)境的成分中分離和/或回收的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的天然環(huán)境的污染性成分指通常會干擾其 診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，將蛋白質(zhì)純化至(1)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個殘基的 N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或( 使用考馬斯藍或優(yōu)選銀染色的非還原性或還原性 條件下進行SDS-PAGE，達到同質(zhì)，或C3)根據(jù)質(zhì)譜或肽作圖技術(shù)，達到同質(zhì)。由于所討論蛋 白質(zhì)的天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那么分離的蛋白質(zhì)包括重組細胞內(nèi)的原位蛋白 質(zhì)。然而，分離的蛋白質(zhì)通常通過至少一個純化步驟來制備?！胺蛛x的”核酸分子指已經(jīng)鑒定且與所討論核酸的天然來源中通常與之關(guān)聯(lián)的至 少一種污染性核酸分子分開的核酸分子。分離的核酸分子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時的形 式或背景。分離的核酸分子因此與存在于天然細胞中時的核酸分子有區(qū)別。然而，分離的 核酸分子包括通常表達此類核酸的細胞中所包含的核酸分子，例如當所述核酸分子在所述 細胞中的染色體定位不同于它在天然細胞中的染色體定位時。在用于本文時，術(shù)語“PirB/LILRB拮抗劑”用于指能夠阻斷、中和、抑制、消除、降低 或干擾PirB/LILRB活性的藥劑。特別地，PirB/LILRB拮抗劑干擾髓磷脂相關(guān)抑制活性，由 此增強神經(jīng)突向外長出(neurite outgrowth)、和/或促進神經(jīng)元生長、修復(fù)和/或再生。 在一個優(yōu)選的實施方案中，PirB/LILRB拮抗劑通過結(jié)合PirB/LILRB來抑制PirB/LILRB對 Nogo66和/或MAG和/或OMgp的結(jié)合。PirB/LILRB拮抗劑包括例如針對PirB/LILRB的 抗體及其抗原結(jié)合片段，PirB/LILRB、Nogo 66、MAG或OMgp的能夠隔絕(sequestering) PirB/LILRB 與 Nogo 66 之間、或 PirB/LILRB 與 MAG 之間、或 PirB/LILRB 與 OMgp 之間的結(jié) 合的截短或可溶片段，及PirB/LILRB相關(guān)抑制途徑的小分子抑制物。PirB/LILRB拮抗劑還 包括能夠抑制或降低PirB/LILRB mRNA表達的短干擾RNA(siRNA)分子。一種優(yōu)選的PirB/LILRB拮抗劑是抗PirB/LILRB抗體。術(shù)語“抗體”在本文中以最廣義使用，特別包括完整抗體、單克隆抗體、多克隆抗 體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它 們展現(xiàn)出期望的生物學活性。術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體中獲得的抗體，即 構(gòu)成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變外。單克隆抗 體是高度特異性的，針對單一抗原性位點。此外，與包含針對不同決定簇(表位)的不同 抗體的多克隆抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特 異性以外，單克隆抗體的優(yōu)勢在于它們可以在不受其它抗體污染的情況下合成。修飾語 “單克隆”指示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方 法來生成抗體。例如，在本發(fā)明中使用的單克隆抗體可以通過首次由Kohler等，Nature, 256:495(1975)記載的雜交瘤方法來制備，或者可以通過重組DNA方法來制備(參見例 如美國專利No. 4，816，567)?！皢慰寺】贵w”也可以使用例如Clackson等，Nature, 352 624-628(1991)及Marks 等，J. Mol. Biol.，222 :581-597(1991)中記載的技術(shù)從噬菌體抗體 庫中分離?？贵w特別地包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或 屬于特定抗體類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一 物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段， 只要它們展現(xiàn)出期望的生物學活性(美國專利No. 4，816，567 ；和Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984))。本文中感興趣的嵌合抗體包括包含衍生自非人靈長類動物(例如舊大陸猴類(Old World Monkey)、猿等)的可變域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū) 序列的靈長類化抗體?！翱贵w片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w 片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由 抗體片段形成的多特異性抗體?！巴暾笨贵w指包含抗原結(jié)合可變區(qū)以及輕鏈恒定域(CJ和重鏈恒定域CH1、CH2和 CH3的抗體。恒定域可以是天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列變 體。優(yōu)選的是，完整抗體具有一項或多項效應(yīng)器功能。非人(例如嚙齒類)抗體的“人源化”形式指包含衍生自非人免疫球蛋白的最短 序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘 基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈 長類動物的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR) 殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有 找到的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含 至少一個、通常兩個基本上整個如下的可變域(Fab、Fab'、F(ab' )2、Fabc、Fv)，其中所有 或基本上所有高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR是人免疫 球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免 疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細節(jié)參見Jones等，Nature 321:522-525(1986) ；Riechmann等， Nature 332 :323-329(1988)；和 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)。術(shù)語“高變區(qū)”在用于本文時指抗體可變域中在序列方面高度變化和/或形成結(jié) 構(gòu)確定的環(huán)的區(qū)域。高變區(qū)包含來自“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(即輕鏈可變域 中的殘基24-34,50-56和89-97及重鏈可變域中的殘基31-35,50-65和95-102 ；Kabat等， Sequences of Proteins of Immunologicallnterest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991))和 / 或那些來自“高變環(huán)，，的殘 基(即輕鏈可變域中的殘基沈-32、50-52和91-96及重鏈可變域中的殘基沈_32、53_55和 96-101 ；Chothia 和 Lesk，J. Mol. Biol.，196 :901-917 (1987))。在這兩種情況中，可變域殘 基依照Kabat等(見上文)的方式編號，下文將更詳細地討論?！翱蚣堋被颉癋R”殘基指可變 域中除本文中所定義的高變區(qū)殘基之外的那些殘基?！坝H本抗體”或“野生型”抗體指包含如下氨基酸序列的抗體，所述氨基酸序列與本 文所公開的抗體變體相比缺少一處或多處氨基酸序列改變。如此，親本抗體一般具有至少 一個如下高變區(qū)，所述高變區(qū)在氨基酸序列方面與本文所公開的抗體變體的相應(yīng)高變區(qū)的 氨基酸序列不同。親本多肽可包含天然序列(即天然存在的)抗體(包括天然存在的等位 變體)或具有天然存在序列的預(yù)先存在的氨基酸序列修飾(諸如插入、刪除和/或其它改 變)的抗體。貫穿本公開內(nèi)容，“野生型”、“WT”、“wt”、和“親本”抗體可互換使用。在用于本文時，“抗體變體”或“變體抗體”指具有如下氨基酸序列的抗體，所述氨 基酸序列與親本抗體的氨基酸序列不同。優(yōu)選的是，抗體變體包含具有在自然界中未發(fā)現(xiàn) 的氨基酸序列的重鏈可變域或輕鏈可變域。此類變體必然地與親本抗體具有低于100%的 序列同一性或相似性。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體變體會具有如下的氨基酸序列，所述 氨基酸序列與親本抗體的重鏈或輕鏈可變域的氨基酸序列具有約75%至低于100%，更優(yōu)選約80%至低于100%，更優(yōu)選約85%至低于100%，更優(yōu)選約90%至低于100%，和最優(yōu) 選約95%至低于100%的氨基酸序列同一性或相似性。抗體變體一般是在其一個或多個高 變區(qū)中或附近包含一處或多處氨基酸改變的抗體?！鞍被岣淖儭敝割A(yù)定的氨基酸序列的氨基酸序列中的變化。例示性的改變包括插 入、替代和刪除。“氨基酸替代”指預(yù)定氨基酸序列中的現(xiàn)有氨基酸殘基用另一種不同氨基 酸殘基置換?！爸脫Q”氨基酸殘基指置換或替代氨基酸序列中另一個氨基酸殘基的氨基酸殘基。 置換殘基可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸殘基?！鞍被岵迦搿敝笇⒁粋€或多個氨基酸殘基導(dǎo)入預(yù)定氨基酸序列中。氨基酸插入可 包含“肽插入”，在這種情況中將包含兩個或多個通過肽鍵相連接的氨基酸殘基的肽導(dǎo)入預(yù) 定的氨基酸序列中。若氨基酸插入牽涉肽的插入，則所插入的肽可通過隨機誘變來生成，使 得它具有自然界中不存在的氨基酸序列。“高變區(qū)附近的”氨基酸改變指在高變區(qū)的N末端 和/或C末端導(dǎo)入或替代一個或多個氨基酸殘基，使得至少一個所插入或置換的氨基酸殘 基與所討論高變區(qū)的N端或C端氨基酸殘基形成肽鍵?！疤烊淮嬖诘陌被釟埢敝赣蛇z傳密碼編碼的氨基酸殘基，一般選自丙氨酸 (Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)； 谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；組氨酸(His)；異亮氨酸(Ile)；亮氨酸(Leu)；賴氨酸(Lys)； 甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；絲氨酸(Ser)；蘇氨酸(Thr)；色氨酸 (Trp)；酪氨酸(Tyr)；和纈氨酸(Val)?！胺翘烊淮嬖诘陌被釟埢痹诒疚闹兄干衔乃刑烊淮嬖诎被釟埢酝獾?，能 夠在多肽鏈中與鄰近氨基酸殘基共價結(jié)合的氨基酸殘基。非天然存在氨基酸殘基的例子包 括正亮氨酸、鳥氨酸、正纈氨酸、高絲氨酸和其它氨基酸殘基類似物，諸如那些Ellman等， Meth. Enzym. 202 :301-336(1991)中所記載的。為了生成此類非天然存在氨基酸殘基，可使 用Noren等，ScienceM4 :182(1989)和Ellman等(見上文)的操作程序。簡而言之，這些 操作程序包括用非天然存在氨基酸殘基化學活化阻抑型tRNA，接著體外轉(zhuǎn)錄并翻譯RNA。貫穿本公開內(nèi)容，提到了來自 Kabat，Ε. Α.等，kquences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)禾口 (1991)的編號系統(tǒng)。在這些概要中，Kabat列出了每種亞類的抗體的許多氨基酸序列，而且 列出了該亞類中每個殘基位置的最常見的氨基酸。Kabat使用一種方法給所列序列中的每 個氨基酸指派殘基編號，而且這種用于指派殘基編號的方法已經(jīng)成為該領(lǐng)域的標準。本說 明書遵循Kabat編號方案。為了本發(fā)明的目的，為了給未包括在Kabat概要中的候選抗體氨 基酸序列指派殘基編號，遵循下列步驟。一般而言，將候選序列與Kabat中的任何免疫球蛋 白序列或任何共有序列比對。比對可以手工進行，或者使用普遍接受的計算機程序由計算 機進行；此類程序的一個例子是Align 2程序。可通過使用與大多數(shù)Fab序列共同的一些 氨基酸殘基來推動比對。例如，輕鏈和重鏈各自典型地具有兩個具有相同殘基編號的半胱 氨酸；在\結(jié)構(gòu)域中，這兩個半胱氨酸典型地位于殘基編號23和88處，而在Vh結(jié)構(gòu)域中， 這兩個半胱氨酸殘基典型地編號為22和92?？蚣軞埢话愣强偸蔷哂写笾孪嗤臍埢?數(shù)目，然而，CDR會在大小(size)方面有所變化。例如，在來自候選序列的CDR比與之比對 的Kabat序列中的CDR長的情況中，通常給殘基編號添加后綴以指明額外殘基的插入(見例如圖IB中的殘基IOOabc)。對于例如候選序列與Kabat序列在殘基34和36處比對但在 這兩個殘基之間沒有殘基以與殘基35比對的，就不將編號35指派給殘基。在用于本文時，具有“高親和力”的抗體指具有納摩爾(nM)范圍中的或更好的Kd 或解離常數(shù)的抗體。“納摩爾范圍”中的或更好的Kd可以表示為ΧηΜ，其中X是小于約10的數(shù)?！坝H和力成熟的”抗體指在抗體的一個或多個CDR中具有一處或多處改變、導(dǎo)致該 抗體對抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有所改進的抗體。在一個實施方案， 親和力成熟的抗體具有納摩爾或甚至皮摩爾量級的對靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體 可通過本領(lǐng)域已知規(guī)程來生成。Markset al. ,Bio/Technology 10 :779-783(1992)記載了 通過VH和VL結(jié)構(gòu)域改組進行的親和力成熟。以下文獻記載了 CDR和/或框架殘基的隨機誘 ^ =Barbas et al. ，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 :3809-3813(1994) ；Schier et al. ，Gene 169 :147-155(1995) ；Yelton et al.，J. Immunol. 155 :1994-2004(1995) Jackson et al.， J. Immunol. 154(7) :3310-9(1995)；及 Hawkins et al.，J. Mol. Biol. 226 :889-896 (1992)?？贵w的“功能性抗原結(jié)合位點”指能夠結(jié)合靶抗原的位點。抗原結(jié)合位點的抗原 結(jié)合親和力不必像衍生該抗原結(jié)合位點的親本抗體那樣強，但是結(jié)合抗原的能力必須是使 用已知用于評估抗體對抗原結(jié)合的多種方法之任一可測量到的。具有指定抗體的“生物學特征”的抗體指擁有該指定抗體區(qū)別于其它結(jié)合相同抗 原的抗體的一項或多項生物學特征的抗體。為了篩選能結(jié)合抗原上感興趣抗體所結(jié)合的表位的抗體，可以實施常規(guī)交叉阻 斷測定法，諸如 Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)中所記載的。術(shù)語“絲狀噬菌體”指能夠在其表面上展示異源多肽的病毒顆粒，而且包括但不 限于打、份、卩打、和機3。絲狀噬菌體可包含選擇標志，諸如四環(huán)素(例如“fd-tet”)。多 種絲狀噬菌體展示系統(tǒng)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的(參見例如hcher等，Gene,9 127-140(1980) ；Smith 等，Science，228 :1315-1317(1985)；及 Parmley 和 Smith, Gene, 73 305-318(1988))。術(shù)語“淘選”用于指鑒定和分離攜帶如下化合物(諸如抗體)的噬菌體的多輪篩 選過程，所述化合物對靶物具有高親和力和特異性。術(shù)語“短干擾RNA (SiRNA) ”指干擾基因表達的雙鏈小RNA。siRNA是RNA干擾(雙 鏈RNA沉默同源基因的過程)的媒介物。siRNA典型地由兩條長約15-25個核苷酸、形成 雙鏈體(其可包括單鏈突出端)的單鏈RNA構(gòu)成。酶復(fù)合物(例如聚合酶)對雙鏈RNA的 加工導(dǎo)致切割雙鏈RNA以生成siRNA。RNA干擾(RNAi)沉默復(fù)合物使用siRNA的反義鏈 來引導(dǎo)mRNA切割，由此促進mRNA降解。為了使用siRNA來沉默特定基因，例如在哺乳動 物細胞中，選擇堿基配對區(qū)來避免與無關(guān)mRNA的偶然互補。本領(lǐng)域已經(jīng)鑒定了 RNAi沉默 復(fù)合物諸如 Fire 等，Nature, 391 :806-811(1998)及 McManus 等，Nat. Rev. Genet.，3 (10) 737-47(2002)。術(shù)語“干擾RNA (RNAi) ”在本文中用于指導(dǎo)致特定mRNA的催化性降解，如此可用于 抑制/降低特定基因表達的雙鏈RNA。術(shù)語“多態(tài)性”在本文中用于指基因或其一部分(例如等位變體)具有一種以上形式?；蛑芯哂兄辽賰煞N不同形式的那部分稱為該基因的“多態(tài)性區(qū)域”。位于基因多態(tài) 性區(qū)域的特定遺傳序列為“等位基因”。多態(tài)性區(qū)域可以是在不同等位基因中不同的單個核 苷酸，或者可以長數(shù)個核苷酸。在用于本文時，術(shù)語“病癥” 一般指任何會受益于PirB/LILRB2拮抗劑諸如抗 PirB抗體處理的疾患，包括神經(jīng)系統(tǒng)中預(yù)期會受益于軸突再生療法和/或突觸可塑性 (synaptic plasticity)改善的任何疾患。本文中待治療的病癥的非限制性例子包括但 不限于受益于增強神經(jīng)突向外長出、促進神經(jīng)元生長、修復(fù)或再生的疾病和疾患，包括神經(jīng) 學病癥，諸如物理損傷的神經(jīng)和神經(jīng)退行性疾病。此類病癥明確包括對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的物 理損傷(例如脊髓損傷和頭部外傷)；與中風有關(guān)的腦損傷；和與神經(jīng)變性有關(guān)的神經(jīng)學 病癥，諸如例如三叉神經(jīng)痛、舌咽神經(jīng)痛、貝耳氏(Bell)麻痹、重癥肌無力、肌肉營養(yǎng)不良、 肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、進行性肌萎縮、進行性延髓遺傳性肌萎縮、多發(fā)性硬化(MQ、椎間 盤成疝、破裂和脫出綜合征、頸椎病、叢病癥、胸廓出口破壞綜合征、由身體損傷或疾病狀態(tài) (諸如糖尿病)引起的周圍神經(jīng)損傷、周圍神經(jīng)病諸如那些由鉛、氨苯砜(dapsone)、蜱螨引 起的、P卜啉病、格巴二氏(Gullain-Barre)綜合征、阿耳茨海默氏(Alzheimer)病、亨庭頓氏 (Huntington)病、或帕金森氏(Parkinson)病。術(shù)語“處理”、“治療”和“療法”在用于本文時指治療性處理、預(yù)防性處理、和防范 性處理。連續(xù)治療或施用指以至少每天一次為基礎(chǔ)、期間沒有中斷一天或多天的處理。間 歇治療或施用或者間歇方式的治療或施用指本質(zhì)上并非連續(xù)而是循環(huán)的處理。術(shù)語“預(yù)防神經(jīng)變性”在用于本文時包括(1)在最近診斷為患有神經(jīng)退行性疾病 或有風險發(fā)生新的神經(jīng)退行性疾病的患者中抑制或預(yù)防神經(jīng)變性的能力，和( 在早就患 有神經(jīng)退行性疾病或具有神經(jīng)退行性疾病的癥狀的患者中抑制或預(yù)防進一步神經(jīng)變性的 能力。術(shù)語“哺乳動物”在用于本文時指歸入哺乳類的任何哺乳動物，包括人、高等非人 靈長類、嚙齒類、家畜和牲畜諸如牛、馬、犬和貓。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，哺乳動 物指人。與一種或多種其它治療劑“聯(lián)合”施用包括同時(共同)施用和任何次序的順序 施用?！坝行Я俊敝缸阋詫崿F(xiàn)有益的或期望的治療(包括預(yù)防)結(jié)果的量?？梢栽谝淮位?多次施用中施用有效量。在用于本文時，表述“細胞”、“細胞系”、和“細胞培養(yǎng)物”可互換使用，而且所有這 類名稱都包括后代。如此，詞語“轉(zhuǎn)化子/轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化細胞”包括原代受試細胞及由 其衍生的培養(yǎng)物，不管轉(zhuǎn)移的次數(shù)。還應(yīng)理解，由于有意的或無意的突變，所有后代可能在 DNA內(nèi)容上不是精確相同的。術(shù)語“后代”指初始轉(zhuǎn)化的細胞或細胞系之后每一代的任何和 所有后裔。在最初轉(zhuǎn)化細胞中篩選的具有相同功能或生物學活性的突變后代包括在內(nèi)。若 想做出不同的命名，上下文會有清楚的表述。關(guān)于本文中所鑒定的序列的“百分比(％ )氨基酸序列同一性”定義為對比序列 并在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一 性的一部分，候選序列中與參考序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率?？梢砸?本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式進行序列對比以測定百分比氨基酸序列同一性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可決定測量序列對比的適宜參數(shù)，包括指派對所比較的全長序列獲得最大對比所需的 算法。為了本發(fā)明，可使用序列比較計算機程序ALIGN-2來獲得百分比氨基酸同一性值， ALIGN-2程序由Genentech公司編寫，其源代碼已經(jīng)連同用戶文檔一起提交給美國版權(quán)局 (US Copyright Office，Washington，DC，20559)，并以美國版權(quán)注冊號 TXU510087 注冊。公 眾可通過 Genentech 公司(South San Francisco, California)得到 ALIGN-2 程序。所有 序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定且不變。雜交反應(yīng)的“嚴格性”容易為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所確定，并且通常取決于探針長 度、洗滌溫度和鹽濃度憑經(jīng)驗計算。一般而言，較長的探針需要較高的溫度用于正確的退 火，而較短的探針則需要較低的溫度。當互補鏈存在于低于它們解鏈溫度的環(huán)境中時，雜 交通常取決于變性DNA重新退火的能力。探針和能雜交的序列之間的期望同一性程度越 高，就可使用越高的相對溫度。作為結(jié)果，推出，更高的相對溫度趨向于使反應(yīng)條件更加嚴 格，而更低的溫度則更不嚴格。對于雜交反應(yīng)的嚴格性的補充細節(jié)及解釋參見Ausubel等， Current Protocols in Molecular Biology, Wiley IntersciencePublishers, (1995)。如本文中所定義的，“高嚴格條件”定義為如下的那些(1)對于洗滌使用低離子 強度和高溫；0.015M氯化鈉/0. 0015M檸檬酸鈉/0. 1 %十二烷基硫酸鈉，50°C ； (2)在雜交 期間使用變性劑；50% (ν/ν)甲酰胺及0. 牛血清清蛋白/0. l%Ficoll/0. 聚乙烯吡 咯烷酮/具有750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉的50mM磷酸鈉緩沖液pH 6. 5，42°C，或(3)使 用 50% 甲酰胺，5x SSC (0. 75M NaCl，0. 075M 檸檬酸鈉)，50mM 磷酸鈉(pH6. 8), 0. 焦磷酸 鈉，5xDenhardt氏溶液，超聲處理的鮭精DNA (50 μ g/ml)，0. 1% SDS和10%硫酸右旋糖苷， 42°〇，在421于0. 2x SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)和50%甲酰胺中洗滌，然后在55 °C由含有 EDTA的0. Ix SSC組成的高嚴格洗滌。“中等嚴格條件”可規(guī)定為如 Sambrook 等，Molecular Cloning =ALaboratory Manual, New York : Co Id Spring Harbor Press，1989 所描述的，而且包括在含20% 甲酰 胺、5x SSC(150mM NaCl，15mM 檸檬酸三鈉)、50mM 磷酸鈉(ρΗ7· 6)、5x Denhardt 氏溶液、 10%硫酸右旋糖苷和20mg/ml變性的剪切的鮭精DNA的溶液中于37°C溫育過夜，然后于約 37-50°C在Ix SSC中洗滌濾膜。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)當認識到如何根據(jù)適應(yīng)諸如探針長 度等因素的需要來調(diào)節(jié)溫度、離子強度等。術(shù)語“調(diào)控序列”指在特定宿主生物體中表達可操作連接的編碼序列所必需的DNA 序列。例如，適于原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操縱基因序列、和核糖體結(jié)合位 點。已知真核細胞利用啟動子、多腺苷酸化信號、和增強子。若一段核酸與另一段核酸序列處于功能性相互關(guān)系中，則它是“可操作連接的”。 例如，若前序列(presequence)或分泌前導(dǎo)(secretory leader)的DNA表達成參與多肽分 泌的前蛋白質(zhì)(preprotein)，則它與該多肽的DNA可操作連接；若啟動子或增強子影響編 碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與該序列可操作連接；或者，若核糖體結(jié)合位點的設(shè)置促進翻譯，則它 與編碼序列可操作連接。一般而言，“可操作連接的”意味著相連的DNA序列是相鄰的，而且 在分泌前導(dǎo)的情況中意味著相鄰且處于閱讀狀態(tài)。然而，增強子不必相鄰。連接可以通過 在方便的限制性位點處的連接來實現(xiàn)。若沒有此類位點，則依照常規(guī)實踐使用合成的寡核 苷酸銜接頭或接頭。“小分子”在本文中定義為分子量小于約1000道爾頓，優(yōu)選小于約500道爾頓。
B.抗PirB/LILRB抗體的生成通過本領(lǐng)域已知方法來生成本發(fā)明的抗PirB抗體，包括重組DNA技術(shù)的技術(shù)。i)抗原制備可溶性抗原或其片段(任選偶聯(lián)有其它分子的)可作為免疫原用于生成抗體。對 于跨膜分子，諸如受體，它們的片段(例如受體的胞外結(jié)構(gòu)域)可用作免疫原。或者，表達 跨膜分子的細胞可用作免疫原。此類細胞可衍生自天然來源(例如癌細胞系)，或者可以是 經(jīng)重組技術(shù)轉(zhuǎn)化而表達跨膜分子的細胞。對于制備抗體有用的其它抗原及其形式對于本領(lǐng) 域技術(shù)人員會是顯而易見的。(ii)多克隆抗體多克隆抗體優(yōu)選在動物中生成，通過多次皮下(SC)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原 和佐劑。使用雙功能或衍生化試劑，例如馬來酰亞氨基苯甲?；腔牾啺孵?通過 半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或 R1N = C = NR(其中R和隊是不同的烴基)，將相關(guān)抗原與在待免疫物種中有免疫原性的蛋 白質(zhì)偶聯(lián)可能是有用的，例如匙孔蟲戚血藍蛋白、血清清蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋 白酶抑制劑。通過將例如IOOyg或5yg蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物(分別用于兔或小鼠)與3倍體積的 弗氏完全佐劑混和并將該溶液皮內(nèi)注射于多個部位，將動物針對抗原、免疫原性偶聯(lián)物或 衍生物進行免疫。1個月后，通過多個部位的皮下注射，用弗氏完全佐劑中初始量1/5-1/10 的肽或偶聯(lián)物對動物進行加強免疫。7-14天后，采集動物的血液并測定血清的抗體滴度。 對動物進行加強免疫直到滴度達到平臺(Plateau)。優(yōu)選的是，將動物用相同抗原但與不同 蛋白質(zhì)和/或通過不同交聯(lián)劑偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物進行加強免疫。偶聯(lián)物還可在重組細胞培 養(yǎng)中作為蛋白質(zhì)融合物來制備。同樣，適當使用凝聚劑諸如明礬來增強免疫應(yīng)答。(iii)單克隆抗體單克隆抗體可以使用最初由Kohler等，Nature, 256 :495(1975)記載的雜交瘤方 法來生成，或者可以通過DNA重組方法(美國專利No. 4，816，567)來生成。在雜交瘤方法 中，如上所述免疫小鼠或其它適宜的宿主動物，諸如倉鼠或獼猴，以引發(fā)生成或能夠生成如 下抗體的淋巴細胞，所述抗體將特異性結(jié)合用于免疫的蛋白質(zhì)?；蛘?，可以在體外免疫淋巴 細胞。然后使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成雜交瘤 細胞(Goding, Monoclonal Antibodies Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press,1986)。將如此制備的雜交瘤細胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑 制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，若親本骨髓瘤細胞缺少 次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型的將含有 次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細胞生長。優(yōu)選的骨髓瘤細胞是那些高效融合、支持所選擇的抗體生產(chǎn)細胞穩(wěn)定且高水平 地生成抗體、且對培養(yǎng)基諸如HAT培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細胞 系是鼠骨髓瘤系，諸如那些自可從索爾克研究所細胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA)獲得的 M0PC-21 和 MPC-11 小鼠腫瘤和可 從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanType Culture Collection, Rockville, Md. USA)獲得的SP-2或)(63-Ag8-653細胞。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系也可用于 生成人單克隆抗體(Kozbor，J. Immunol.，133 :3001 (1984) ；Brodeur 等，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications, pp.51—63, Marcel Dekker, Inc., NewYork,1987)?？蓪﹄s交瘤細胞正在其中生長的培養(yǎng)基測定針對抗原的單克隆抗體的生成。優(yōu)選 的是，通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測定法，諸如放射性免疫測定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸 附測定法(ELISA)，測定由雜交瘤細胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。在鑒定出生成具有期望特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后， 所述克隆就可通過有限稀釋操作程序進行亞克隆，并通過標準方法進行培養(yǎng)(Goding， Monoclonal Antibodies Principles and Practice,pp. 59-103,Academic Press,1986)。 適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細胞可在動物 中作為腹水瘤進行體內(nèi)培養(yǎng)。可通過常規(guī)免疫球蛋白純化操作程序，諸如例如蛋白A-kpharose、羥磷灰石層 析、凝膠電泳、透析、或親和層析，將由亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基、腹水或血清適當 分開。編碼單克隆抗體的DNA易于使用常規(guī)操作程序分離和測序(例如通過使用能夠特 異性結(jié)合編碼單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞是此類DNA的 優(yōu)選來源。一旦分離，就可將DNA置于表達載體中，然后將該表達載體轉(zhuǎn)染到不另外生成免 疫球蛋白蛋白質(zhì)的宿主細胞中，諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細 胞或骨髓瘤細胞，以在重組宿主細胞中獲得單克隆抗體的合成。抗體的重組生產(chǎn)在下文中 有更詳細描述。在另一個實施方案中，可從使用McCafferty等，Nature，348 :552-5 (1990)中記 載的技術(shù)構(gòu)建的噬菌體抗體庫中分離抗體或抗體片段。Clackson 等，Nature，352 :624-628 (1991)及 Marks 等，J. Mol. Biol.，222 581-597(1991)分別記載了使用噬菌體文庫進行的鼠和人抗體的分離。后續(xù)出版物記 載了通過鏈改組生成高親和力(nM范圍)的人抗體(Marks等，Bio/Technology 10: 779-783(1992))，以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫的策略 (Waterhouse 等，Nuc. Acids Res. 21 :2265-2266 (1993))。如此，這些技術(shù)是用于分離單克 隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替代方法。也可以修飾DNA，例如通過用人重鏈和輕鏈恒定域的編碼序列替代同源鼠序列 (美國專利 No. 4，816，567 ；Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851 (1984))，或通 過將免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的整個或部分編碼序列共價連接。典型地， 用此類非免疫球蛋白多肽替代抗體的恒定域，或者用它們替代抗體的一個抗原結(jié)合位點的 可變域，以產(chǎn)生嵌合二價抗體，它包含對一種抗原具有特異性的一個抗原結(jié)合位點和對不 同抗原具有特異性的另一個抗原結(jié)合位點。(iv)人源化抗體和人抗體人源化抗體具有一個或多個導(dǎo)入其中的來自非人來源的氨基酸殘基。這些非人氨 基酸殘基常常稱作“輸入”殘基，它們通常取自“輸入”可變域。人源化可基本上遵循Winter 及其同事的方法進行(Jones 等，Nature，321 :522-525(1986) ；Riechmann 等，Nature，332
16323-327(1988) ；Verhoeyen 等，Science，239 :1534-1536 (1988))，即用嚙齒類 CDR 或 CDR 序 列替代人抗體的相應(yīng)序列。因此，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4，816，567)， 其中基本上小于整個人可變域的區(qū)域用來自非人物種的相應(yīng)序列替代。在實踐中，人源化 抗體通常是其中一些CDR殘基以及可能一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位點的殘基 替代的人抗體。用于制備人源化抗體的人可變域的選擇，包括輕鏈和重鏈，對于降低抗原性非常 重要。依照所謂的“最適”(best-fit)法，用嚙齒類抗體的可變域序列對已知的人可變 域序列的整個文庫進行篩選。然后選擇與嚙齒類序列最接近的人序列作為人源化抗體 的人框架(FR) (Sims 等，J. Immunol.，151 :2296 (1993) ；Chothia 等，J. Mol. Biol.，196 901 (1987))。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定 框架。同一框架可被用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :4285 (1992) ；Presta 等，J. Immunol.，151 :2623 (1993))。更為重要的是，抗體在人源化后保持對抗原的高親和力及其它有利的生物學特 性。為了實現(xiàn)這一目的，依照一種優(yōu)選的方法，通過使用親本和人源化序列的三維模型分析 親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是 可獲得的，且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。還可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的 可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機程序。檢查這些顯示圖像能夠分析殘基在候選免疫球蛋白序列 行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可從 受體和輸入序列中選出FR殘基并進行組合，從而獲得期望抗體特征，諸如對靶抗原的親和 力提高。通常，CDR殘基直接且最實質(zhì)的涉及對抗原結(jié)合的影響?；蛘?，現(xiàn)在有可能生成在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫時生成人 抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)描述了嵌合和種系突變小鼠中抗體重 鏈連接區(qū)(JH)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉(zhuǎn) 移人種系免疫球蛋白基因陣列將導(dǎo)致在抗原攻擊時生成人抗體。參見例如Jakobovits等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :2551 (1993) Jakobovits 等，Nature，362 :255-258 (1993)； Bruggermann 等，Yearin Immuno. ,7 :33(1993)；及 Duchosal 等，Nature, 355 :258 (1992)。 還可從噬菌體展示庫衍生人抗體(Hoogenboom等，J. Mol. Biol.，227 :381 (1991) ；Marks等， J. Mol. Biol.，222 :581-597 (1991) ；Vaughan 等，Nature Biotech.，14 :309 (1996))。下文進 一步描述了自抗體噬菌體展示文庫生成人抗體。(ν)抗體片段已經(jīng)開發(fā)了用于生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過蛋白水解消化完整抗 體來衍生這些片段(參見例如 Morimoto 等，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24:107—117(1992)；及 Brennan 等，Science, 229 :81(1985)) 然而，現(xiàn)在可直接 由重組宿主細胞生成這些片段。例如，可以從上文討論的噬菌體抗體庫分離抗體片段。或 者，可直接從大腸桿菌回收Fab' -SH片段并化學偶聯(lián)以形成F(ab' )2片段garter等， Bio/Technology 10 163-167 (199 )。在另一個實施方案中，如下文實施例所述，使用亮氨 酸拉鏈GCN4促進F(ab' )2分子的裝配來形成F(ab‘ )2。依照另一種方法，可直接從重組 宿主細胞培養(yǎng)物分離F(ab' )2片段。用于生成抗體片段的其它技術(shù)對熟練從業(yè)人員將是 顯而易見的。在其它實施方案中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185。
(vi)多特異性抗體多特異性抗體具有對至少兩種不同表位的結(jié)合特異性，其中所述表位通常來自不 同抗原。盡管此類分子通常只會結(jié)合兩種不同表位(即雙特異性抗體，BsAb)，但是此表述 在用于本文時涵蓋具有額外特異性的抗體，諸如三特異性抗體。BsAb的例子包括那些一個 臂針對PirB/LILRB2而另一個臂針對Nogo或MAG或OMgp的抗體。BsAb的另一個例子包括 那些一個臂針對PirB/LILRB2而另一個臂針對NgR的抗體用于構(gòu)建雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn) 基于兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millstein等， Nature, 305 =537-539 (1983)) 0由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤(四源 雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特 異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和層析步驟進行正確分子的純化，這相當麻煩且產(chǎn)物產(chǎn)量低。類似 的操作程序披露于 WO 93/08829 及 Traunecker 等，EMBO J.，10 :3655-3659 (1991)。依照一種不同的方法，將具有期望結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點)的抗體可 變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。優(yōu)選的是，與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫 球蛋白重鏈恒定域進行融合。優(yōu)選在至少一種融合物中存在包含輕鏈結(jié)合所必需的位點 的第一重鏈恒定區(qū)(CHl)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和，在需要時，免疫球蛋白輕鏈的 DNA插入分開的表達載體中，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比 例不等時提供所期望的最佳產(chǎn)量的實施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了 很大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比例表達導(dǎo)致高產(chǎn)量時或在該比例沒有特 別意義時，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入到一個表達載體中。在該方法的一個優(yōu)選實施方案中，雙特異性抗體由一個臂上具有第一結(jié)合特異性 的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特 異性)構(gòu)成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中存在提供了便利的分離途徑， 因此發(fā)現(xiàn)這種不對稱結(jié)構(gòu)便于將期望的雙特異性復(fù)合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分 開。該方法披露于W094/04690。關(guān)于生成雙特異性抗體的進一步詳情參見例如Suresh等， Methodsin Enzymology,121 :210 (1986)。依照W096/27011中記載的另一種方法，可改造一對抗體分子間的界面，以將從重 組細胞培養(yǎng)物回收的異二聚體的百分比最大化。優(yōu)選的界面包含抗體恒定域的至少部分 CH3結(jié)構(gòu)域。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側(cè)鏈用較大側(cè)鏈(例 如酪氨酸或色氨酸)替換。通過將大氨基酸側(cè)鏈用較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨 酸)替換，在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生與大側(cè)鏈相同或相似大小的補償性“空腔”。這提 供了較之其它不想要的終產(chǎn)物諸如同二聚體提高異二聚體產(chǎn)量的機制。雙特異性抗體包括交聯(lián)的或“異源偶聯(lián)的”抗體。例如，可以將異源偶聯(lián)物中 的一種抗體與親合素偶聯(lián)，而將另一種抗體與生物素偶聯(lián)。此類抗體已經(jīng)建議用于例如 將免疫系統(tǒng)細胞靶向不想要的細胞(美國專利No. 4，676，980)和用于治療HIV感染(W0 91/00360,WO 92/200373)。異源偶聯(lián)抗體可以使用任何方便的交聯(lián)方法來制備。合適的交 聯(lián)劑連同許多交聯(lián)技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，而且披露于美國專利No. 4，676，980。文獻中還記載了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化學連接來 制備雙特異性抗體。Brerman等，Science，2 =81(1985)記載了通過蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab' )2片段的操作程序。將這些片段在存在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉的情況下 還原，以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產(chǎn)生的Fab'片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱?代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后將Fab' -TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢 復(fù)成Fab'-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab' -TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。 產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作選擇性固定酶的試劑。也可以從大腸桿菌直接回收Fab' -SH片段，而且可以將這些片段化學偶聯(lián)以形 成雙特異性抗體。Shalaby等，J. Exp. Med.，175 :217-225(1992)記載了完全人源化的雙特 異性抗體F(ab' )2分子的生成。由大腸桿菌分別分泌每種Fab'片段，并在體外進行定向 化學偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。還記載了從重組細胞培養(yǎng)物直接生成和分離雙特異性抗體片段的多種技 術(shù)。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny等，J. Immunol. , 148 (5) 1547-1553(1992)。將來自Fos和Jim蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體 的Fab'部分連接。抗體同二聚體在鉸鏈區(qū)還原以形成單體，然后重新氧化以形成抗體異二 聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。Hollinger等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA,90 6444-6448(1993)記載的“雙抗體”技術(shù)提供了構(gòu)建雙特異性抗體片段的替代機制。該片段 包含通過接頭相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)，所述接頭太短使得同一條鏈上 的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對。因此，迫使一個片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域與另一個片段上的互 補VL和VH結(jié)構(gòu)域配對，由此形成兩個抗原結(jié)合位點。還報道了通過使用單鏈Fv(sFv) 二 聚體構(gòu)建雙特異性抗體片段的另一種策略。參見(iruber等，J. Immunol.，152 :5368(1994)。設(shè)想了具有超過兩個效價的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt等， J. Immunol.，147 :60(1991)。(vii)效應(yīng)器功能工程改造可能希望在效應(yīng)器功能方面修飾本發(fā)明的抗體，從而增強抗體的效力。例如，可向 Fc區(qū)中引入半胱氨酸殘基，從而使得在該區(qū)中形成鏈間二硫鍵。如此生成的同二聚體抗體 可具有改善的內(nèi)在化能力和/或提高的補體介導(dǎo)的細胞殺傷和抗體依賴性細胞的細胞毒 性(ADCC)。參見 Caron 等，J.Exp· Med.，176 :1191-1195(1992)和 Shopes，B.，J. Immunol.， 148 :2918-四22(199幻。具有增強的抗腫瘤活性的同二聚體抗體還可使用異雙功能交聯(lián)劑 來制備，如Wolff等，Cancer Research, 53 =2560-2565(1993)中記載?；蛘?，抗體可改造成 具有雙重Fc區(qū)，由此可具有增強的補體溶解和ADCC能力。參見Mevenson等，Anti-Cancer Drug Design，3 :219-230(1989)。(viii)抗體-補救受體結(jié)合表位融合物在本發(fā)明的某些實施方案中，可能希望使用抗體片段，而非完整抗體，來例如提高 腫瘤穿透。在這種情況中，可能希望修飾抗體片段以延長其血清半衰期。這可通過例如將 補救受體結(jié)合表位摻入抗體片段中來實現(xiàn)(例如通過抗體片段中適宜區(qū)域的突變或通過 將表位摻入肽標簽中然后將該肽標簽融合至抗體片段的任一末端或中部，例如通過DNA或 肽合成來實現(xiàn))。補救受體結(jié)合表位優(yōu)選構(gòu)成這樣一個區(qū)域，其中將來自Fc結(jié)構(gòu)域的一個或兩個 環(huán)的任何一個或多個氨基酸殘基轉(zhuǎn)移至抗體片段的類似位置。甚至更優(yōu)選的是，轉(zhuǎn)移來自 Fc結(jié)構(gòu)域的一個或兩個環(huán)的三個或更多殘基。仍更優(yōu)選的是，表位取自Fc區(qū)(例如IgG的)的CH2結(jié)構(gòu)域并轉(zhuǎn)移至抗體的CH1、CH3、或VH區(qū)，或超過一個此類區(qū)域?；蛘?，表位取 自Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域并轉(zhuǎn)移至抗體片段的CL區(qū)或VL區(qū)或二者。(ix)抗體的其它共價修飾抗體的共價修飾包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如果適用，它們可通過化學合成或者通 過酶促或化學切割抗體來生成。抗體的其它類型共價修飾如下引入分子，即通過使抗體的 目標氨基酸殘基與能夠與選定側(cè)鏈或N-末端或C-末端的殘基反應(yīng)的有機衍生化試劑起反 應(yīng)。共價修飾的例子記載于美國專利No. 5，534，615，明確引入本文作為參考。一類優(yōu)選的 抗體共價修飾包括將抗體連接至多種非蛋白質(zhì)性質(zhì)聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇、 或聚氧化烯，以美國專禾U No. 4，640,835 ；4，496，689 ；4，301，144 ；4，670，417 ；4，791，192 ； 或4，179，337所列方式。(χ)從合成的抗體噬菌體文庫中產(chǎn)生抗體在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供利用獨特的噬菌體展示法來產(chǎn)生和挑選新 的抗體的方法。該方法包括基于單個框架模板產(chǎn)生合成抗體噬菌體文庫，設(shè)計可變域內(nèi)的 足夠的多樣性，展示具有多樣化可變域的多肽，選擇對靶抗原具有高親和力的候選抗體，和 分離所選的抗體。噬菌體展示方法的詳情可在例如2003年12月11日公開的W003/102157 中找到，將其完整公開內(nèi)容明確引入本文作為參考。在一個方面，本發(fā)明中所用的抗體文庫可通過突變抗體可變域的至少一個⑶R中 溶劑可及的和/或高度多變的位置來產(chǎn)生。一些或全部CDR可用本文提供的方法來突變。 在一些實施方案中，優(yōu)選突變⑶RHl、⑶RH2和⑶RH3中的位置以形成單個文庫或突變⑶RL3 和⑶RH3中的位置以形成單個文庫或突變⑶RL3和⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3中的位置以形成 單個文庫，由此產(chǎn)生多樣的抗體文庫。例如，可產(chǎn)生這樣的抗體可變域文庫，其在⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3中溶劑可及的和 /或高度多變的位置上有突變。產(chǎn)生的另一種文庫在⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3中有突變。這 些文庫也可互相結(jié)合使用以產(chǎn)生具有期望親和力的結(jié)合物。例如，在一輪或多輪選擇對靶 抗原結(jié)合的重鏈文庫后，在其它輪次的選擇中可將輕鏈文庫替換入重鏈結(jié)合物群中以提高 結(jié)合物的親和力。文庫優(yōu)選通過用重鏈序列可變區(qū)⑶RH3區(qū)中的變異氨基酸替代原始氨基酸來產(chǎn) 生。所得文庫可包含多種抗體序列，其中序列多樣性主要位于重鏈序列的⑶RH3區(qū)中。在一個方面，文庫在人源化抗體4D5序列、或人源化抗體4D5序列的框架氨基酸序 列的背景中產(chǎn)生。文庫優(yōu)選通過用DVK密碼子集編碼的氨基酸至少替代重鏈殘基95-lOOa 來產(chǎn)生，其中DVK密碼子集用于編碼這些位置中每個位置的變異氨基酸集。可用于產(chǎn)生這 些替代的寡核苷酸子集的例子包括序列(DVK) 7。在一些實施方案中，文庫通過用DVK和NNK 兩個密碼子集編碼的氨基酸至少替代殘基95-lOOa來產(chǎn)生?？捎糜诋a(chǎn)生這些替代的寡核苷 酸子集的例子包括序列(DVK)6(NNK)15在另一個實施方案中，文庫通過用DVK和NNK兩個 密碼子集編碼的氨基酸替代殘基95-lOOa來產(chǎn)生。可用于產(chǎn)生這些替代的寡核苷酸子集的 例子包括序列(DVK)5(NNK)15可用于產(chǎn)生這些替代的寡核苷酸子集的另一個例子包括序列 (NNK)6。根據(jù)本文所述標準，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定合適寡核苷酸序列的其它例子。在另一個實施方案中，利用不同的CDRH3設(shè)計來分離高親和力結(jié)合物和分離針對 各種表位的結(jié)合物。該文庫中產(chǎn)生的CDRH3的長度范圍是11至13個氨基酸，盡管也可產(chǎn)生不同于此的長度。通過用NNK、DVK和NVK密碼子集也可拓展H3的多樣性，以及在N和/ 或C-末端處的更有限的多樣性。⑶RHl和⑶RH2中也可產(chǎn)生多樣性。⑶R-Hl和H2多樣性的設(shè)計遵循目標為模擬 所述帶有如下修飾的天然抗體全集的策略，所述修飾使多樣性較前述設(shè)計更緊密地與天然 多樣性相匹配。對于CDRH3中的多樣性，可分別構(gòu)建具有不同長度的H3的多個文庫，然后組合起 來以選擇針對靶抗原的結(jié)合物?？珊喜⒍鄠€文庫并用前述和本文下述的固體支持物選擇和 溶液分選法來選擇。可采用多種選擇策略。例如，一種變化涉及在結(jié)合至固相的靶物上選 擇，然后分選可能在融合多肽上存在的標簽(例如抗gD標簽)，然后再一次在結(jié)合至固相的 靶物上分選?；蛘撸膸炜墒紫仍诮Y(jié)合至固體表面的靶物上選擇，然后用靶抗原濃度逐漸降 低的溶液相結(jié)合來分選所洗脫的結(jié)合物。利用不同分選方法的組合來最低限度地只選擇高 度表達的序列并選擇許多不同的高親和力克隆。針對靶抗原的高親和力結(jié)合物可由文庫分離。H1/H2區(qū)中的有限多樣性可降低簡 并性約IO4至IO5倍，而允許更大的H3多樣性提供了更多高親和力結(jié)合物。利用在CDRH3 中具有不同類型多樣性的文庫(例如利用DVK或NVT)可分離能與靶抗原的不同表位結(jié)合 的結(jié)合物。對于從如上所述合并的文庫中分離的結(jié)合物，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可通過提供輕鏈中的有限 多樣性來進一步提高親和力。在該實施方案中，輕鏈多樣性如下產(chǎn)生，在CDRLl中第觀位 氨基酸由RDT編碼；第四位氨基酸由RKT編碼；第30位氨基酸由RVW編碼；第31位氨基酸 由ANW編碼；第32位氨基酸由THT編碼；任選的，第33位氨基酸由CTG編碼；在CDRL2中 第50位氨基酸由KBG編碼 ’第53位氨基酸由AVC編碼；任選的，第55位氨基酸由GMA編 碼；在CDRL3中第91位氨基酸由TMT或SRT或這兩者編碼；第92位氨基酸由DMC編碼； 第93位氨基酸由RVT編碼；第94位氨基酸由NHT編碼；和第96位氨基酸由TWT或YKG或 這兩者編碼。在另一個實施方案中，產(chǎn)生在⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3的區(qū)域中具有多樣性的一個 或多個文庫。在該實施方案中，用各種長度的H3區(qū)并主要用密碼子集XYZ和NNK或NNS來 產(chǎn)生CDRH3中的多樣性?？捎酶鞴押塑账嵝纬晌膸觳⒑喜?，或者可合并寡核苷酸來形成文 庫子集。該實施方案的文庫可針對結(jié)合至固體的靶物進行分選。分離自多次分選的克隆可 利用ELISA測定法來篩選特異性和親和力。對于特異性，克隆可以針對期望靶抗原以及其 它非靶抗原進行篩選。然后，在溶液結(jié)合競爭ELISA測定法或點競爭測定法中對那些針對 靶抗原的結(jié)合物篩選親和力?？梢杂萌缟纤鲋苽涞腗Z密碼子集從文庫中分離高親和力 結(jié)合物?？煞奖愕卦诩毎囵B(yǎng)中以高產(chǎn)率將這些結(jié)合物制備成抗體或抗原結(jié)合片段。在一些實施方案中，可能希望產(chǎn)生在⑶RH3區(qū)長度方面具有更大多樣性的文庫。 例如，可能希望產(chǎn)生⑶RH3區(qū)的長度范圍為約7至19個氨基酸的文庫。由這些實施方案中的文庫分離的高親和力結(jié)合物可方便地在細菌和真核細胞培 養(yǎng)中以高產(chǎn)率產(chǎn)生?？稍O(shè)計載體以方便地去除如下序列諸如gD標簽、病毒外殼蛋白成分序 列，和/或增加恒定區(qū)序列來高產(chǎn)率地產(chǎn)生全長抗體或抗原結(jié)合片段?？梢詫ⅱ荝H3中有突變的文庫與包含不同型式的其它⑶R(例如⑶RL1、⑶RL2、 ⑶RL3、⑶RHl和/或⑶Rffi)的文庫組合。因此，例如，在一個實施方案中，將⑶RH3文庫與⑶RL3文庫組合，所述⑶RL3文庫用預(yù)先確定的密碼子集在第觀、29、30、31、和/或32位有 變異氨基酸的人源化4D5抗體序列的背景中產(chǎn)生。在另一個實施方案中，可將CDRH3有突變 的文庫與包含變異⑶RHl和/或⑶RH2重鏈可變域的文庫組合。在一個實施方案中，⑶RHl 文庫用第觀、30、31、32和33位有變異氨基酸的人源化抗體4D5序列產(chǎn)生。⑶RH2文庫可用 預(yù)先確定的密碼子集以及第50、52、53、54,56和58位有變異氨基酸的人源化抗體4D5序列 來產(chǎn)生。(xi)抗體突變體可進一步修飾噬菌體文庫產(chǎn)生的新抗體以產(chǎn)生抗體突變體，所述抗體突變體具有 比親本抗體改善了的物理、化學和/或生物學性質(zhì)。當所用的測定法是生物學活性測定法 時，優(yōu)選抗體突變體在所選測定法中的生物學活性比親本抗體在該測定法中的生物學活性 好至少約10倍，優(yōu)選好至少約20倍，更優(yōu)選好至少約50倍，有時好至少約100倍或200倍。 例如，優(yōu)選抗PirB/LILRB抗體突變體針對PirB/LILRB的結(jié)合親和力比親本抗體的結(jié)合親 和力強至少約10倍，優(yōu)選強至少約20倍，更優(yōu)選強至少約50倍，有時強至少約100倍或 200 倍。為了產(chǎn)生抗體突變體，在親本抗體的一個或多個高變區(qū)中導(dǎo)入一處或多處氨基酸 改變(例如替代)?；蛘?另外，可將框架區(qū)殘基的一處或多處改變(例如替代)導(dǎo)入親本抗 體，這些改變導(dǎo)致抗體突變體針對來自第二哺乳動物物種的抗原的結(jié)合親和力有所改善。 要修飾的框架區(qū)殘基的實例包括那些直接非共價結(jié)合抗原的殘基(Amit等(1986)SCienCe 233 :747-753)；相互作用于 / 影響 CDR 構(gòu)象的殘基(Chothia 等(1987) J. Mol. Biol. 196 901-917)；和/或參與Vf Vh界面的(EP 239 400B1)殘基。在某些實施方案中，一個或多個 這類框架區(qū)殘基的修飾導(dǎo)致抗體針對來自第二哺乳動物物種的抗原的結(jié)合親和力有所增 強。例如，在本發(fā)明的該實施方案中，可改變約1個至約5個框架殘基。有時，這可足以產(chǎn) 生適用于臨床前試驗中的抗體突變體，甚至其中沒有高變區(qū)殘基被改變?？墒峭ǔ?，抗體突 變體將包含別的高變區(qū)改變。被改變的高變區(qū)殘基可以是隨機變化的，尤其是在親本抗體的起始結(jié)合親和力之 處，使得這類隨機產(chǎn)生的抗體突變體可方便地被篩選出來?？捎糜谏纱祟惪贵w突變體的一種方法稱作“丙氨酸掃描誘變”(Cunningham和 Wells (1989) Science 244 :1081-1085)。這里，一個或多個高變區(qū)殘基用丙氨酸或多丙氨酸 殘基替代，以影響氨基酸與來自第二哺乳動物物種的抗原的相互作用。然后通過在或?qū)μ?代位點引入更多或其它的突變，推敲那些對替代表現(xiàn)出功能敏感性的高變區(qū)殘基。如此，雖 然引入氨基酸序列變異的位點是預(yù)先決定的，但是突變本身的性質(zhì)不需要預(yù)先決定。如本 文所述對如此生成的丙氨酸突變體篩選它們的生物學活性。通常，從保守替代諸如下文顯示在標題“優(yōu)選替代”下的那些開始。如果此類替代 導(dǎo)致生物學活性(例如結(jié)合親和力)的改變，那么引入下表中稱為“例示替代”的或如下文 中關(guān)于氨基酸種類的進一步描述的更實質(zhì)性改變，并篩選產(chǎn)物。優(yōu)選替代
權(quán)利要求
1.一種分離的抗PirB/LILRB抗體，其與選自下組的抗體結(jié)合人PirB (LILRB)上相同的 表位YW259. 2、YW259. 9 和 YW259. 12。
2.一種分離的抗PirB/LILRB抗體，其與選自下組的抗體競爭對人PirB (LILRB)的結(jié) 合:YW259. 2、YW259. 9 和 YW259. 12。
3.一種分離的抗PirB/LILRB抗體，其包含來自選自下組的重鏈的一個、兩個、或三個 高變區(qū)序列YW259. 2 重鏈(SEQ ID NO :4 或 11)、YW259. 9 重鏈(SEQ ID NO :5 或 12)、和 YW259. 12 重鏈(SEQ ID NO :6 或 13)。
4.權(quán)利要求3的抗體，其中該抗體包含YW259.2抗體重鏈(SEQ ID NO 4或11)的所 有高變區(qū)序列。
5.權(quán)利要求3的抗體，其中該抗體包含YW259.9抗體重鏈(SEQ ID NO 5或12)的所有高變區(qū)序列。
6.權(quán)利要求3的抗體，其中該抗體包含YW259.12抗體重鏈(SEQ ID NO 6或13)的所 有高變區(qū)序列。
7.權(quán)利要求3-6任一項的抗體，其進一步包含輕鏈。
8.權(quán)利要求7的抗體，其中所述輕鏈包含多肽序列SEQID NO: 15的一個、兩個或三個高變序列。
9.權(quán)利要求7的抗體，其中所述輕鏈包含多肽序列SEQID NO :7或15的所有高變區(qū) 序列。
10.權(quán)利要求3的抗體，選自下組抗體YW259.2、YW259. 9、和YW259. 12。
11.一種分離的抗PirB/LILRB抗體，其中該抗體的全長IgG形式以5nM或更好的結(jié)合 親和力特異性結(jié)合人PirB(LILRB)。
12.—種分離的抗PirB/LILRB抗體，其中該抗體的全長IgG形式以InM或更好的結(jié)合 親和力特異性結(jié)合人PirB(LILRB)。
13.權(quán)利要求1-12任一項的抗體，其促進軸突再生。
14.權(quán)利要求1-12任一項的抗體，其促進CNS神經(jīng)元再生。
15.權(quán)利要求1-12任一項的抗體，其至少部分挽救Nogo66和髓磷脂所致的神經(jīng)突向外 生長的抑制。
16.權(quán)利要求1-12任一項的抗體，其中該抗體是單克隆抗體。
17.權(quán)利要求1-12任一項的抗體，其中該抗體選自下組嵌合抗體、人源化抗體、親和 力成熟的抗體、人抗體、和雙特異性抗體。
18.權(quán)利要求1-12任一項的抗體，其中該抗體是抗體片段。
19.權(quán)利要求1-12任一項的抗體，其中該抗體是免疫偶聯(lián)物。
20.一種多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1-12任一項的抗體或其重鏈或輕鏈。
21.一種載體，其包含權(quán)利要求20的多核苷酸。
22.權(quán)利要求21的載體，其中該載體是表達載體。
23.一種宿主細胞，其包含權(quán)利要求21的載體。
24.權(quán)利要求23的宿主細胞，其中該宿主細胞是原核的。
25.權(quán)利要求23的宿主細胞，其中該宿主細胞是真核的。
26.權(quán)利要求25的宿主細胞，其中該宿主細胞是哺乳動物的。
27.一種用于制備抗PirB/LILRB抗體的方法，所述方法包括(a)在合適的宿主細胞中 表達權(quán)利要求22的載體，并(b)回收該抗體。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述宿主細胞是原核的。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述宿主細胞是真核的。
30.一種組合物，其包含權(quán)利要求1-12任一項的抗PirB/LILRB抗體和藥學可接受賦形劑。
31.權(quán)利要求30的組合物，其中該組合物進一步包含第二藥物，其中所述抗PirB/ LILRB抗體是第一藥物。
32.權(quán)利要求31的組合物，其中所述第二藥物是NgR抑制劑。
33.權(quán)利要求32的組合物，其中所述NgR抑制劑是抗NgR抗體。
34.一種試劑盒，其包含權(quán)利要求1-12任一項的抗PirB/LILRB抗體。
35.一種用于促進軸突再生的方法，包括對有所需要的受試者施用有效量的權(quán)利要求 1-12任一項的抗PirB/LILRB抗體。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述受試者是人患者。
37.權(quán)利要求36的方法，其中神經(jīng)元的存活得到增強。
38.權(quán)利要求36的方法，其中神經(jīng)元的向外長出得到誘導(dǎo)。
39.一種治療神經(jīng)變性性疾病的方法，包括對有所需要的受試者施用有效量的權(quán)利要 求1-12任一項的抗PirB/LILRB抗體。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述神經(jīng)變性性疾病的特征為對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的物理損傷。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述神經(jīng)變性性疾病是與中風有關(guān)的腦損傷。
42.權(quán)利要求39的方法，其中所述神經(jīng)變性性疾病選自下組三叉神經(jīng)痛，舌咽神經(jīng) 痛，貝爾氏麻痹，重癥肌無力，肌營養(yǎng)不良，肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)，多發(fā)性硬化(MQ，進行 性肌萎縮，進行性延髓繼承性肌萎縮，身體損傷(例如燒傷、傷口)或疾病狀態(tài)(諸如糖尿 病、腎功能障礙)或由用于治療癌癥和AIDS的化療劑的毒性作用引起的周圍神經(jīng)損傷，椎 間盤成疝、破裂和脫出綜合征，頸椎病，叢病癥，胸廓出口破壞綜合征，周圍神經(jīng)病諸如那些 由鉛、氨苯砜、蜱螨引起的，嚇啉病，格巴二氏綜合癥，阿爾茨海默氏病，亨廷頓氏病，和帕金 森氏病。
43.一種抗獨特型抗體，其特異性結(jié)合權(quán)利要求1-12任一項的抗PirB/LILRB抗體。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)學病癥。本發(fā)明具體關(guān)注髓磷脂相關(guān)抑制系統(tǒng)的新調(diào)控劑的鑒定及如此鑒定的拮抗劑的各種用途。
文檔編號A61P25/28GK102089327SQ200980126524
公開日2011年6月8日 申請日期2009年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月13日
發(fā)明者吳雁, 賈斯文德·阿塔瓦爾, 馬克·特西爾-拉維格尼 申請人:健泰科生物技術(shù)公司