專(zhuān)利名稱(chēng)：癌的治療及預(yù)防用藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對(duì)CD179b的抗體或其片段作為癌的治療及/或預(yù)防劑等的新型藥 物用途。
背景技術(shù)：
癌癥是占據(jù)所有死亡原因第一位的疾病，目前進(jìn)行的治療以手術(shù)療法為主，組合 使用放射治療和化學(xué)療法。近年來(lái)，盡管開(kāi)發(fā)了新的手術(shù)方法并發(fā)現(xiàn)了新的抗癌劑，但現(xiàn)狀 是除了一部分的癌癥之外，癌的治療效果仍未見(jiàn)提高。近年來(lái)，由于分子生物學(xué)和癌免疫學(xué) 的進(jìn)步，能夠鑒定出與癌特異反應(yīng)的抗體類(lèi)、被細(xì)胞毒性T細(xì)胞所識(shí)別的癌抗原類(lèi)及編碼 癌抗原的基因類(lèi)等，對(duì)針對(duì)癌抗原類(lèi)的特異的癌治療法的期待日漸提高(非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。在癌治療法中，為了減輕副作用，期望作為其抗原被識(shí)別的肽、多肽或蛋白質(zhì)在正 常細(xì)胞中幾乎不存在，而特異性地存在于癌細(xì)胞中。1991年，比利時(shí)Ludwig研究所的Boon 等人通過(guò)使用自身癌細(xì)胞株和癌反應(yīng)性T細(xì)胞的cDNA表達(dá)克隆法，分離出CD8陽(yáng)性T細(xì)胞 識(shí)別的人黑色素瘤抗原MAGEl (非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。之后，報(bào)道了采用基因表達(dá)克隆的方法鑒別 在癌癥患者體內(nèi)與自身的癌反應(yīng)產(chǎn)生的抗體所識(shí)別的腫瘤抗原，即SEREX法(serological identifications ofantigens by recombinant expression cloning) (與一專(zhuān)禾ll文獻(xiàn) 3 ; 專(zhuān)利文獻(xiàn)1)，利用該方法，分離出在正常細(xì)胞中幾乎不表達(dá)、在癌中特異性表達(dá)的一些癌抗 原(非專(zhuān)利文獻(xiàn)4 9)。進(jìn)而，以其一部分作為靶，進(jìn)行了下述臨床試驗(yàn)使用與癌抗原特 異性反應(yīng)的免疫細(xì)胞的細(xì)胞療法及含有癌抗原的疫苗等的癌特異性免疫療法。另一方面，近年來(lái)，以癌細(xì)胞上的抗原蛋白質(zhì)為靶的、用于治療癌癥的各種抗體藥 物開(kāi)始出現(xiàn)。作為癌特異性治療藥可以獲得一定的藥效而受到關(guān)注，但是，大部分目標(biāo)抗原 蛋白質(zhì)在正常細(xì)胞中也表達(dá)，給與抗體的結(jié)果存在下述問(wèn)題不僅損傷了癌細(xì)胞，也損傷了 抗原表達(dá)的正常細(xì)胞，結(jié)果產(chǎn)生副作用。因此，鑒定在癌細(xì)胞表面特異性表達(dá)的癌抗原，如 果可以使用以其為靶的抗體作為藥物，則可以期待使用副作用更少的抗體藥物進(jìn)行治療。已知⑶179b是免疫球蛋白的替代輕鏈的一部分，且在B細(xì)胞的前體細(xì)胞(前B細(xì) 胞及原B細(xì)胞)的膜表面表達(dá)。伴隨B細(xì)胞的分化而消失，在成熟的B細(xì)胞中不表達(dá)。但 是，已知CD179b在前B細(xì)胞癌變的白血病(前B細(xì)胞性白血病)細(xì)胞中表達(dá)(非專(zhuān)利文獻(xiàn) 10、11)。另外，已知⑶179b在前B細(xì)胞癌變的淋巴瘤(前B細(xì)胞性淋巴瘤)細(xì)胞中也表 達(dá)，且可以作為前B細(xì)胞性淋巴瘤的診斷標(biāo)記物使用(非專(zhuān)利文獻(xiàn)12)。但是，沒(méi)有報(bào)道其 在前B細(xì)胞性白血病細(xì)胞以外的白血病細(xì)胞、前B細(xì)胞性淋巴瘤以外的淋巴瘤及乳癌細(xì)胞 等中特異性表達(dá)。另外，沒(méi)有報(bào)道暗示針對(duì)CD179b的抗體對(duì)癌的治療及/或預(yù)防有用。專(zhuān)利文獻(xiàn)1 美國(guó)專(zhuān)利第5698396號(hào)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1 秋吉毅，“癌與化學(xué)療法”，1997年，第M卷，P551-519非專(zhuān)利文獻(xiàn)2 =Bruggen P. et al.，Science, 254 :1643-1647(1991)非專(zhuān)利文獻(xiàn)3 :Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92 :11810-11813(1995)非專(zhuān)利文獻(xiàn)4 Int. J. Cancer，72 :965-971(1997)
非專(zhuān)利文獻(xiàn) 5 =Cancer Res.，58 1034-1041 (1998)非專(zhuān)利文獻(xiàn)6 Int. J. Cancer, 29 :652-658 (1998)非專(zhuān)利文獻(xiàn)7 :Int. J. Oncol.，14 :703-708 (1999)非專(zhuān)利文獻(xiàn)8 =Cancer Res.，56 :4766-4772 (1996)非專(zhuān)利文獻(xiàn)9 :Hum. Mol. Genet6 :33-39(1997)非專(zhuān)利文獻(xiàn)10 :Adv. Immunol. ,63 :1-41(1996)非專(zhuān)利文獻(xiàn)11 :Blood,92 :4317-4324(1998)非專(zhuān)利文獻(xiàn)12 =Modern Pathology, 17 :423-429(2004)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于鑒定在癌細(xì)胞的表面特異性表達(dá)的癌抗原蛋白質(zhì)，并提供以其 為靶的抗體作為癌的治療及/或預(yù)防劑的用途。本發(fā)明人等經(jīng)過(guò)深入研究，結(jié)果通過(guò)使用來(lái)自犬乳癌組織的cDNA文庫(kù)和同一罹 癌犬血清的SEREX法，獲得cDNA，所述cDNA編碼與來(lái)自罹癌生物體的血清中存在的抗體相 結(jié)合的蛋白質(zhì)，并以獲得基因的人同源基因?yàn)榛A(chǔ)，制作具有序列號(hào)3表示的氨基酸序列 的人⑶179b。發(fā)現(xiàn)⑶179b在正常組織中幾乎不表達(dá)，另一方面，在乳癌、白血病及淋巴瘤細(xì) 胞中特異性表達(dá)。而且，發(fā)現(xiàn)針對(duì)上述⑶179b的抗體損傷表達(dá)⑶179b的癌細(xì)胞，從而完成 了本發(fā)明。因此，本發(fā)明具有以下的特征。本發(fā)明提供一種用于癌的治療及/或預(yù)防的藥物組合物，其特征在于，含有抗體 或其片段作為有效成分，所述抗體具有與CD179b蛋白質(zhì)或其含有7個(gè)以上連續(xù)的氨基酸的 片段的免疫反應(yīng)性，所述CD179b蛋白質(zhì)包含序列號(hào)3表示的氨基酸序列、或具有與該氨基 酸序列為60%以上的序列同源性的氨基酸序列。在上述實(shí)施方式中，上述癌為表達(dá)⑶179b基因的癌。在其他實(shí)施方式中，上述癌為乳癌、白血病或淋巴瘤。在其他實(shí)施方式中，抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。在其他實(shí)施方式中，抗體為人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、或雙重特異 性抗體。在其他實(shí)施方式中，上述抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，且具有與⑶179b蛋 白質(zhì)的免疫反應(yīng)性，所述重鏈可變區(qū)含有序列號(hào)103、104及102的氨基酸序列，所述輕鏈可 變區(qū)含有序列號(hào)106、107及108的氨基酸序列。在其他實(shí)施方式中，上述抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，且具有與⑶179b蛋 白質(zhì)的免疫反應(yīng)性，所述重鏈可變區(qū)含有序列號(hào)105的氨基酸，所述輕鏈可變區(qū)含有序列 號(hào)109的氨基酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供以下抗體。(i)抗體，包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，且具有與⑶179b蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)性， 所述重鏈可變區(qū)含有序列號(hào)103、104及102的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)含有序列號(hào) 106、107及108的氨基酸序列。(ii)抗體，包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，且具有與⑶179b蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)性，所述重鏈可變區(qū)含有序列號(hào)105的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)含有序列號(hào)109的氨基 酸序列。(iii)如上述(i)及(ii)所述的抗體，所述抗體具有細(xì)胞毒性。(iv)上述(i)及(ii)所述的抗體，所述抗體為人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體或 雙重特異性抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供以下多肽或DNA。(ν)多肽或編碼該多肽的DNA，所述多肽含有序列號(hào)105的氨基酸序列。(vi)多肽或編碼該多肽的DNA，所述多肽含有序列號(hào)109的氨基酸序列。(vii) DNA，含有序列號(hào)110的堿基序列。(viii) DNA，含有序列號(hào)111的堿基序列。(ix)重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)多肽或編碼該多肽的DNA，所述多肽選自序列號(hào)103、 104及102的氨基酸序列。(χ)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)多肽或編碼該多肽的DNA，所述多肽選自序列號(hào)106、 107及108的氨基酸序列。本發(fā)明中使用的針對(duì)⑶179b的抗體損傷癌細(xì)胞。因此，針對(duì)⑶179b的抗體對(duì)癌 的治療和預(yù)防有用。


[圖1]為表示編碼CD179b蛋白的基因在正常組織及腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)譜的圖。 標(biāo)號(hào)1 編碼⑶179b蛋白的基因的表達(dá)譜；標(biāo)號(hào)2 表示GAPDH基因的表達(dá)譜。[圖2]為表示針對(duì)⑶179b的抗體(抗⑶179b單克隆抗體#8)對(duì)裸鼠的抗腫瘤效 果的圖，所述裸鼠移植了表達(dá)⑶179b的人癌細(xì)胞株Namalwa。標(biāo)號(hào)3 表示給與抗⑶179b 單克隆抗體#8的小鼠腫瘤的大??；標(biāo)號(hào)4 給與PBS(-)的小鼠腫瘤的大小。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開(kāi)的序列表中序列號(hào)3表示的氨基酸序列，是通過(guò)使用與來(lái)自犬乳腺癌 的cDNA文庫(kù)同一患癌犬的血清的SEREX法，作為與來(lái)自罹癌犬的血清中特異性存在的抗體 相結(jié)合的多肽的人同源因子(同源物)被分離的CD179b的氨基酸序列(參見(jiàn)實(shí)施例1)。 本發(fā)明中使用的針對(duì)CD179b的抗體可以為任何種類(lèi)的抗體，只要能發(fā)揮抗腫瘤活性即可， 例如包括單克隆抗體、多克隆抗體、合成抗體、多重特異性抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合 抗體、單鏈抗體(scFv)、抗體片段例如Fab或F(ab’)2等。上述抗體及其片段可以通過(guò)本 領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行制備。在本發(fā)明中，優(yōu)選能夠與CD179b蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的 的抗體，另外，受試者為人時(shí)，為了避免或抑制排斥反應(yīng)，優(yōu)選人抗體或人源化抗體。此處，所謂“與⑶179b蛋白質(zhì)特異性結(jié)合”，是指與⑶179b蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，與 除此之外的蛋白質(zhì)實(shí)質(zhì)上不結(jié)合。在本發(fā)明中，針對(duì)⑶179b的抗體也可以使用市售的抗體。作為針對(duì)人⑶179b的 抗體能夠購(gòu)買(mǎi)，例如已知 GA170、H-60、HP6054、A-19、C-16、SLC1、SLC2、SLC3、SLC4 及 HSLll 等的克隆。本發(fā)明中可以使用的抗體的抗腫瘤活性可以如下所述地進(jìn)行評(píng)價(jià)，即對(duì)于在生物體外表達(dá)該多肽的腫瘤細(xì)胞，通過(guò)考察抗體是否顯示通過(guò)免疫細(xì)胞或補(bǔ)體的細(xì)胞毒性。進(jìn)而，作為本發(fā)明中的癌的治療及/或預(yù)防對(duì)象的受試者，為人、寵物、家畜類(lèi)、競(jìng) 技用動(dòng)物等哺乳動(dòng)物，優(yōu)選受試者為人。需要說(shuō)明的是，本說(shuō)明書(shū)中使用的所謂“癌”及“腫瘤”的術(shù)語(yǔ)表示惡性腫瘤，可以
互換使用。以下，針對(duì)本發(fā)明相關(guān)的抗原的制備、抗體的制備、及藥物組合物進(jìn)行說(shuō)明。<抗體制備用抗原的制備>作為用于獲得針對(duì)本發(fā)明中使用的CD179b的抗體的敏化抗原而使用的蛋白質(zhì)或 其片段，可以來(lái)自人、犬、牛、小鼠、大鼠等，對(duì)于成為其來(lái)源的動(dòng)物種類(lèi)沒(méi)有限制。但是優(yōu)選 考慮與細(xì)胞融合中使用的母細(xì)胞的適合性進(jìn)行選擇，通常優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物的蛋白質(zhì)，特 別優(yōu)選來(lái)自人的蛋白質(zhì)。例如，⑶179b為人⑶179b時(shí)，可以使用人⑶179b蛋白質(zhì)或其部 分肽、表達(dá)人⑶179b的細(xì)胞等。人⑶179b及其同源物的堿基序列及氨基酸序列，例如可以通過(guò)訪問(wèn)GenBank (美 國(guó) NCBI)，利用 BLAST、FASTA 等算法(Karlinand Altschul，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 87 :2264-2268,1993 ；Altschul et al.，Nucleic Acids Res. ,25 :3389-3402,1997)獲得。 需要說(shuō)明的是，CD179b也可以稱(chēng)作λ 5、IGLLU Vpreb2、L0C608248等，但本說(shuō)明書(shū)中，以 "CD 179b"為代表使用。例如，人CD 179b例如以NM_152855、NM_020070等序號(hào)注冊(cè)，小鼠 Vpreb2例如以NM_016983等序號(hào)注冊(cè)，犬L0C608248例如以XM_845215等序號(hào)注冊(cè)。本發(fā)明中，以人CD179b的堿基序列或氨基酸序列為基準(zhǔn)時(shí)，包含以下序列的核酸 或蛋白質(zhì)為目標(biāo)，所述序列與序列號(hào)1或3表示的序列有50 % 100 %、優(yōu)選60 % 100 %、 較優(yōu)選80% 100%、更優(yōu)選90% 100%、最優(yōu)選95% 100 %的序列同源性，例如為 97% 100%,98%~ 100%,99%~ 100%或 99. 5%~ 100%的序列同源性。此處，“序列 同源性百分比”是指通過(guò)導(dǎo)入空位或不導(dǎo)入空位，比對(duì)(對(duì)齊)2個(gè)序列，使2個(gè)序列為最大 相似度時(shí)，同源的氨基酸(或堿基)相對(duì)于氨基酸(或堿基)總數(shù)的百分比(％ )。CD179b蛋白質(zhì)片段具有從抗體所識(shí)別的最小單元的抗原決定部位(抗原決定簇) 的氨基酸長(zhǎng)度，到小于該蛋白質(zhì)的總長(zhǎng)度的長(zhǎng)度?？乖瓫Q定部位的長(zhǎng)度通常在連續(xù)的7 12個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)。上述人⑶179b蛋白質(zhì)或含有其部分肽的多肽，可以通過(guò)例如Fmoc法(芴甲氧羰 基法)、tBoc法(叔丁氧基羰基法)等化學(xué)合成法合成。另外，還可以利用各種市售的肽合 成儀，通過(guò)常規(guī)方法合成。另外，可以使用公知的基因工程學(xué)方法，制備編碼上述多肽的多 核苷酸，通過(guò)將該多核苷酸參入表達(dá)載體而導(dǎo)入宿主細(xì)胞，在該宿主細(xì)胞中生產(chǎn)多肽，由此 得到目標(biāo)多肽。編碼上述多肽的多核苷酸，可以通過(guò)采用公知的基因工程學(xué)方法或使用市售的核 酸合成儀的常規(guī)方法容易地制備。例如，含有序列號(hào)1的堿基序列的DNA可以通過(guò)如下制 備使用人染色體DNA或cDNA文庫(kù)作為模板，使用設(shè)計(jì)好的一對(duì)引物，進(jìn)行PCR，使其擴(kuò)增 序列號(hào)1表示的堿基序列。PCR的反應(yīng)條件可以適當(dāng)設(shè)定，例如可以舉出將在94°C下30秒 (變性)、在下30秒 1分鐘(退火)、在72°C下2分鐘(伸展)構(gòu)成的反應(yīng)過(guò)程作 為1個(gè)循環(huán)，例如進(jìn)行了 30個(gè)循環(huán)后，在72°C下反應(yīng)7分鐘的條件等，但并不限定于這些條 件。另外，基于本說(shuō)明書(shū)中的序列表的序列號(hào)1及序列號(hào)3分別表示的堿基序列及氨基酸序列的信息，制備合適的探針或引物，使用探針或引物篩選人等的cDNA文庫(kù)，由此可以分 離所期望的DNA。cDNA文庫(kù)優(yōu)選由表達(dá)序列號(hào)3的蛋白質(zhì)的細(xì)胞、器官或組織制備。上述細(xì)胞或組 織的例子包括骨髓、白血病細(xì)胞、乳癌細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞等。上述探針或引物的制備、cDNA 文庫(kù)的構(gòu)筑、cDNA文庫(kù)的篩選、及目標(biāo)基因的篩選等操作，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知 的，例如可以基于 Sambrook et al. , Molecular Cloning,第 2 版，Current protocols in Molecular Biology (1989)等中記載的方法進(jìn)行。從如上所述得到的DNA中，可以得到編碼 人⑶179b蛋白質(zhì)或其部分肽的DNA。作為上述宿主細(xì)胞，只要是能夠表達(dá)上述多肽的細(xì)胞即可，可以為任何細(xì)胞，作為 原核細(xì)胞例子可以舉出大腸桿菌等，作為真核細(xì)胞的例子可以舉出猴腎細(xì)胞COS 1、中國(guó)倉(cāng) 鼠卵巢細(xì)胞CH0、人胎兒腎細(xì)胞株HEK四3、小鼠胚胎皮膚細(xì)胞株OTH3T3等哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì) 胞；芽殖酵母、裂殖酵母等酵親細(xì)胞；蠶細(xì)胞；非洲爪蟾卵細(xì)胞等，但并不限定于這些細(xì)胞。使用原核細(xì)胞作為宿主細(xì)胞時(shí)，作為表達(dá)載體，使用在原核細(xì)胞中具有復(fù)制起點(diǎn)、 啟動(dòng)子、核糖結(jié)合部位、多克隆部位、終止子、抗藥基因、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充基因等的表達(dá)載體，作為 大腸桿菌用表達(dá)載體，可以舉出PUC系列、pBluescript II、pET表達(dá)系統(tǒng)、pGEX表達(dá)系統(tǒng) 等。將編碼上述多肽的DNA參入到上述表達(dá)載體中，用該載體轉(zhuǎn)化原核宿主細(xì)胞后，培養(yǎng)所 得的轉(zhuǎn)化體時(shí)，可以在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)上述DNA編碼的多肽。此時(shí)，也可以使該多肽以 與其他蛋白質(zhì)(例如，綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)等)的融合蛋白質(zhì) 的形式進(jìn)行表達(dá)。使用真核細(xì)胞作為宿主細(xì)胞時(shí)，作為表達(dá)載體，使用具有啟動(dòng)子、剪接區(qū)域、 poly-(A)附加位點(diǎn)等的真核細(xì)胞用表達(dá)載體。作為上述表達(dá)載體，可以舉出pKAl、pCDM8、 pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV 載體、pRS、pcDNA3、pMSG、pYES2 等。與上述同 樣地，將編碼上述多肽的DNA參入到上述表達(dá)載體中，用該載體轉(zhuǎn)化真核宿主細(xì)胞后，培養(yǎng) 所得的轉(zhuǎn)化體時(shí)，可以使上述DNA編碼的多肽在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)。使用pIND/V5-His、 pFLAG-CMV-2、pEGFP-Nl、pEGFP-Cl等作為表達(dá)載體時(shí)，能夠以附加有Hi s標(biāo)簽(例如 (His)6 (His)ltl)、FLAG標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、HA標(biāo)簽、GFP等各種標(biāo)簽的融合蛋白質(zhì)的形式，表 達(dá)上述多肽。將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，可以使用電穿孔法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、DEAE葡聚糖 法、顯微注射等眾所周知的方法。為了從宿主細(xì)胞分離純化目標(biāo)多肽，可以組合公知的分離操作進(jìn)行。例如，可以舉 出利用尿素等改性劑或表面活性劑進(jìn)行的處理、超聲波處理、酶消化、鹽析或溶劑分步沉淀 法、透析、離心分離、超濾、凝膠過(guò)濾、SDS-PAGE、等電聚焦電泳、離子交換色譜法、疏水色譜 法、親和色譜法、反相色譜法等，但并不限定于此。<抗體的結(jié)構(gòu)>抗體通常為至少含有2條重鏈及2條輕鏈的雜聚糖蛋白。除IgM之外，為由2條 相同的輕(L)鏈及2條相同的重(H)鏈構(gòu)成的約150kDa的異四聚糖蛋白。典型地各輕鏈 通過(guò)1個(gè)二硫共價(jià)鍵連接到重鏈上，但各種免疫球蛋白同種型重鏈間的二硫鍵的數(shù)量會(huì)有 所變動(dòng)。各重鏈及輕鏈也具有鏈內(nèi)二硫鍵。各重鏈在一端具有可變域(VH區(qū))，與其連接的 是一些恒定區(qū)。各輕鏈具有可變域(VL區(qū))，在其相反的一端具有1個(gè)恒定區(qū)。輕鏈的恒定
7區(qū)與重鏈的最初的恒定區(qū)對(duì)齊，且輕鏈可變域與重鏈的可變域?qū)R?？贵w的可變域的特定 的區(qū)域顯示被稱(chēng)作互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的特定的可變性，賦予與抗體的結(jié)合特異性?？勺儏^(qū) 的相對(duì)被保存的部分稱(chēng)作構(gòu)架區(qū)(FR)。完全的重鏈及輕鏈的可變區(qū)分別包含通過(guò)3個(gè)CDR 連接的4個(gè)FR。3個(gè)⑶R在重鏈中從其N(xiāo)末端開(kāi)始依次被稱(chēng)作⑶RH1、⑶RH2、⑶RH3，同樣 地在輕鏈中被稱(chēng)作⑶RL1、⑶RL2、⑶RL3。在抗體與抗原的結(jié)合特異性中，⑶RH3是最重要 的。另外，各鏈的CDR通過(guò)FR區(qū)在接近的狀態(tài)下保持在一起，與來(lái)自其他鏈的CDR—同有 助于抗體的抗原結(jié)合部位的形成。恒定區(qū)雖然不直接有助于抗體與抗原的結(jié)合，但也顯示 了各種效應(yīng)子功能，例如與抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用(antibody-cbpendent cell-mediated cytotoxicity) (ADCC)有關(guān)、通過(guò)與Fc γ受體結(jié)合的吞噬作用、通過(guò)新生兒Fc受體(Fcfoi) 的半衰期/清除率、通過(guò)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的Clq結(jié)構(gòu)要素的補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)。<抗體的制備>本發(fā)明中的所謂抗CD179b抗體，是指具有與CD179b蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)或片段的免疫 反應(yīng)性的抗體。此處，所謂“免疫反應(yīng)性”，是指在生物體內(nèi)抗體與CD179b抗原相結(jié)合的特 性，通過(guò)上述結(jié)合可以發(fā)揮損傷腫瘤(例如死亡、抑制或退化)的功能。即，在本發(fā)明中使 用的抗體，只要與CD179b蛋白質(zhì)結(jié)合、且可以損傷腫瘤，例如白血病、淋巴瘤及乳癌即可， 可以不論其種類(lèi)如何?？贵w的例子，包括單克隆抗體、多克隆抗體、合成抗體、多重特異性抗體、人抗體、 人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、抗體片段(例如Fab或(Aab’ )2)等。另外，抗體為免疫 球蛋白分子的任意類(lèi)型，例如為lgG、IgE、IgM、lgA、lgD及l(fā)gY，或任意的亞型，例如為lgGl、 lgG2、lgG3、IgG4、IgAU IgA2 等。抗體也可以進(jìn)一步通過(guò)糖基化、乙?；?、甲?；Ⅴ０坊?、磷酸化、聚乙二醇(PEG) 化等被修飾。以下表示各種抗體的制備例?？贵w為單克隆抗體時(shí)，例如可以如下制備，S卩，給與小鼠表達(dá)⑶179b的白血病細(xì) 胞株Namalwa，進(jìn)行免疫，從同一小鼠取出脾臟，分離細(xì)胞，除此之外，使該細(xì)胞與小鼠骨髓 瘤細(xì)胞融合，從得到的融合細(xì)胞(雜交瘤)中選擇產(chǎn)生具有癌細(xì)胞增殖抑制作用的抗體的 克隆。分離具有癌細(xì)胞增殖抑制作用的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤，培養(yǎng)該雜交瘤，采用一般 的親和純化法從培養(yǎng)上清中純化抗體。產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤，例如也可以如下所述地進(jìn)行制備。首先，按照公知的方法，用敏化抗原免疫動(dòng)物。作為一般的方法，通過(guò)對(duì) 哺乳動(dòng)物的腹腔內(nèi)或皮下注射敏化抗原來(lái)進(jìn)行。具體而言，用PBS(磷酸緩沖鹽 (Phosphate-Buffered Saline))或生理鹽水等將敏化抗原稀釋、懸浮成適當(dāng)量，根據(jù)期望 向上述物質(zhì)中適量混合通常的佐劑、例如弗氏完全佐劑，乳化后，每4 21日多次給與哺乳 動(dòng)物。另外，在敏化抗原免疫時(shí)也可以使用適當(dāng)?shù)妮d體。如上所述免疫哺乳動(dòng)物，確認(rèn)到在血清中期望的抗體水平上升后，從哺乳動(dòng)物收 集免疫細(xì)胞，用于細(xì)胞融合，作為優(yōu)選的免疫細(xì)胞，可以特別舉出脾細(xì)胞。作為與上述免疫細(xì)胞融合的其他的母細(xì)胞，使用哺乳動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞。所述 骨髓瘤細(xì)胞，優(yōu)選使用公知的各種細(xì)胞株，例如P3U1 (P3-X63Ag8Ul)、P3 (P3x63Ag8. 653) (J.Immnol. (1979) 123,1548-1550) > P3x63Ag8U. 1(Current Topics in MicrobiologyandImmunology(1978)81,1-7) > NS-I (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immno 1. (1976)6， 511-519)、MPC-Il(Margulies. D. H.etal.，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman, Μ. et al.，Nature (1978) 276，269-270)、F0(deSt. Groth, S. F. et al.，J. Immunol. Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148,313-323)、 R210(Galfre, G. et al.，Nature (1979) 277，131-133)等。上述免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合基本上可以基于公知的方法進(jìn)行，例如 Kohler 和 Milsteln 的方法(Kohler. G. and Milstein, C.，Methods Enzymo 1. (1981)73， 3-46)等。更具體而言，上述細(xì)胞融合，例如在細(xì)胞融合促進(jìn)劑的存在下，在通常的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng) 液中進(jìn)行。作為融合促進(jìn)劑，例如可以使用聚乙二醇(PEG)、仙臺(tái)病毒(HVJ)等，為了進(jìn)一步 提高融合效率，也可以根據(jù)期望，添加二甲基亞砜等輔助劑。免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的使用比例可以任意設(shè)定。例如，優(yōu)選相對(duì)于骨髓瘤細(xì)胞 設(shè)定免疫細(xì)胞為1 10倍。作為上述細(xì)胞融合中使用的培養(yǎng)液，例如，可以使用上述骨髓 瘤細(xì)胞株的增殖中優(yōu)選的RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液，除此之外，也可以使用在該種類(lèi)的 細(xì)胞培養(yǎng)中使用的通常的培養(yǎng)液，進(jìn)而，還可以并用胎牛血清(FCS)等血清補(bǔ)液。進(jìn)行細(xì)胞融合時(shí)，在上述培養(yǎng)液中，充分地混合規(guī)定量的上述免疫細(xì)胞與骨髓瘤 細(xì)胞，通常以30-60% (w/v)的濃度加入預(yù)先加熱到37°C左右的PEG溶液(例如平均分子 量1000 6000左右)，混合，由此形成目標(biāo)雜交瘤。接著，依次添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液，離心并 除去上清液，通過(guò)重復(fù)進(jìn)行上述操作，除去不利于雜交瘤生長(zhǎng)的細(xì)胞融合劑。如上所述得到的雜交瘤，通過(guò)在通常的選擇培養(yǎng)液、例如HAT培養(yǎng)液(含有次黃嘌 呤、氨基蝶呤及胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)液)中培養(yǎng)來(lái)選擇。上述HAT培養(yǎng)液中的培養(yǎng)，持續(xù)對(duì) 于除目標(biāo)雜交瘤之外的細(xì)胞(非融合細(xì)胞)凋亡所需充分的時(shí)間(通常為數(shù)日 數(shù)周)。 接著，施行通常的有限稀釋法，進(jìn)行產(chǎn)生目標(biāo)抗體的雜交瘤的篩選及單克隆。另外，除用抗原對(duì)人以外的動(dòng)物進(jìn)行免疫得到上述雜交瘤之外，還可以如下得到 雜交瘤，即，在體外用蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)表達(dá)細(xì)胞或其溶解物致敏人淋巴細(xì)胞，所述淋巴細(xì)胞 例如為用EB病毒感染的人淋巴細(xì)胞，使致敏淋巴細(xì)胞與來(lái)自人的具有永久分裂能力的骨 髓瘤細(xì)胞例如似66(注冊(cè)編號(hào)TIB196)融合，得到產(chǎn)生具有所期望活性(例如細(xì)胞增殖抑 制活性)的人抗體的雜交瘤。如上所述制備的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以在通常的培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)，另 外，可以在液態(tài)氮中長(zhǎng)期保存。S卩，使用所期望的抗原或表達(dá)所期望抗原的細(xì)胞作為敏化抗原，按照通常的免疫 方法對(duì)其進(jìn)行免疫，利用通常的細(xì)胞融合法將得到的免疫細(xì)胞與公知的母細(xì)胞融合，采用 通常的的篩選法篩選單克隆的抗體產(chǎn)生細(xì)胞(雜交瘤)，由此可以制備。本發(fā)明中能夠使用的抗體的其他例子是多克隆抗體。多克隆抗體例如可以如下所 述得到。用天然的CD179b蛋白質(zhì)、或作為與GST的融合蛋白質(zhì)在大腸桿菌等微生物中表達(dá) 的重組CD179b蛋白質(zhì)、或其部分肽對(duì)小鼠、產(chǎn)生人抗體的小鼠、兔子等小動(dòng)物進(jìn)行免疫，得 到血清。多克隆抗體例如可以如下制備，即，使用硫酸銨沉淀、蛋白質(zhì)A柱、蛋白質(zhì)G柱、DEAE 離子交換色譜法、偶聯(lián)有CD179b蛋白質(zhì)或合成肽的親和柱等進(jìn)行純化。
此處，作為產(chǎn)生人抗體的小鼠，例如已知有KM小鼠(KirinWiarma/Medarex)及 Xeno小鼠(Amgen)。用⑶179b蛋白質(zhì)或其片段免疫上述小鼠時(shí)，可以從血液得到完全人多 克隆抗體。另外，通過(guò)從免疫后的小鼠取出脾細(xì)胞，利用與骨髓瘤細(xì)胞的融合法，可以制備 人型單克隆抗體。抗原的制備，例如可以基于使用動(dòng)物細(xì)胞的方法(日本特表2007-530068)或使用 桿狀病毒的方法(例如W098/46777等)等進(jìn)行?？乖拿庖咴缘蜁r(shí)，可以與白蛋白等具 有免疫原性的巨大分子結(jié)合，進(jìn)行免疫。進(jìn)而，也可以使用基因重組抗體，所述基因重組抗體是通過(guò)由雜交瘤克隆抗體基 因，參入適當(dāng)?shù)妮d體，從而將其導(dǎo)入宿主，使用基因重組技術(shù)而產(chǎn)生的(例如參見(jiàn)Carl， Α. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published inthe United Kingdom by MCMILLAN PUBLISHERS LTD,1990)。具體而言，使用逆轉(zhuǎn)錄酶由雜交瘤的mRNA合成抗體可變區(qū)(V區(qū))的cDNA。得到 編碼目標(biāo)抗體的V區(qū)的DNA后，將其與編碼所期望的抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA連接，將其 參入表達(dá)載體?；蛘撸部梢詫⒕幋a抗體V區(qū)的DNA參入含有抗體C區(qū)的DNA的表達(dá)載體。 參入在表達(dá)控制區(qū)，例如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子的控制下表達(dá)的表達(dá)載體中。接著，可以利用該表 達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，使抗體表達(dá)。本發(fā)明的抗CD179b抗體優(yōu)選為單克隆抗體。但是，也可以為多克隆抗體、基因修 飾抗體(嵌合抗體、人源化抗體等)等。單克隆抗體中，包括人單克隆抗體、非人動(dòng)物單克隆抗體(例如小鼠單克隆抗體、 大鼠單克隆抗體、雞單克隆抗體等)等。單克隆抗體可以通過(guò)培養(yǎng)雜交瘤制備，所述雜交瘤 是通過(guò)將來(lái)自用CD179b蛋白質(zhì)免疫的非人哺乳動(dòng)物(例如小鼠、產(chǎn)生人抗體的小鼠等)的 脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合得到的。在下述實(shí)施例中，制備了小鼠單克隆抗體#8，確認(rèn)到抗 腫瘤效果。上述抗體#8包含具有序列號(hào)105的氨基酸序列的重鏈可變(VH)區(qū)，及具有序 列號(hào)109的氨基酸序列的輕鏈可變(VL)區(qū)，此處，該VH區(qū)中包含序列號(hào)103(CDR1)、序列 號(hào)104(CDR2)及序列號(hào)102(CDR3)的氨基酸序列，該VL區(qū)中包含序列號(hào)106 (CDRl)、序列號(hào) 107 (CDM)及序列號(hào)108(CDR3)的氨基酸序列。嵌合抗體是將來(lái)自不同動(dòng)物的序列組合制備的抗體，例如為由小鼠抗體的重鏈、 輕鏈可變區(qū)和人抗體的重鏈、輕鏈恒定區(qū)組成的抗體等。嵌合抗體的制備可以使用公知的 方法進(jìn)行，例如可以將編碼抗體V區(qū)的DNA與編碼人抗體C區(qū)的DNA連接，將其參入表達(dá)載 體導(dǎo)入宿主而產(chǎn)生，由此得到嵌合抗體。多克隆抗體中，包括用CD179b蛋白質(zhì)免疫產(chǎn)生人抗體的動(dòng)物(例如小鼠)得到的 抗體。人源化抗體是也被稱(chēng)作重構(gòu)(reshaped)人抗體的修飾抗體。人源化抗體是將來(lái) 自免疫動(dòng)物的抗體的CDR移植到人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)而構(gòu)筑的。還已知其通常的基因重組方法。具體而言，利用PCR法由多個(gè)寡核苷酸合成DNA序列，所述DNA序列是使小鼠抗體 的CDR與人抗體的構(gòu)架區(qū)(frameworkregion ；FR)以連接的方式而設(shè)計(jì)的，所述寡核苷酸是 以在末端部具有重疊的部分的方式而制備的。將得到的DNA與編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連 接，接著，參入表達(dá)載體中，將其導(dǎo)入宿主產(chǎn)生，由此得到人抗體(參見(jiàn)歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)EP 239400、國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)W096/02576)。通過(guò)CDR連接的人抗體的FR，選擇互補(bǔ)性 決定區(qū)形成良好的抗原結(jié)合部位的FR。也可以根據(jù)需要，取代抗體的可變區(qū)中的構(gòu)架區(qū)的 氨基酸，使重構(gòu)人抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)形成適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合部位(Sato，K. et al.，Cancer Res. (1993)53,851-856)。另外，也可以取代為來(lái)自各種人抗體的構(gòu)架區(qū)(參見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利申 請(qǐng)公開(kāi)號(hào)W099/51743)。通過(guò)CDR連接的人抗體的構(gòu)架區(qū)選擇互補(bǔ)性決定區(qū)形成良好的抗原結(jié)合部位的 構(gòu)架區(qū)。也可以根據(jù)需要，取代抗體可變區(qū)中的構(gòu)架區(qū)的氨基酸，使重構(gòu)人抗體的互補(bǔ)決定 區(qū)形成適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合部位(Sato, K. et al.，Cancer Res. (1993)53,851-856)。制備嵌合抗體或人源化抗體后，也可以將可變區(qū)(例如FR)和恒定區(qū)中的氨基酸 用其他氨基酸取代等。氨基酸的取代例如為小于15個(gè)、小于10個(gè)、8個(gè)以下、7個(gè)以下、6個(gè)以下、5個(gè)以 下、4個(gè)以下、3個(gè)以下、或2個(gè)以下氨基酸的取代，優(yōu)選1 5個(gè)氨基酸，較優(yōu)選1個(gè)或2個(gè)氨 基酸的取代，取代抗體應(yīng)與未取代抗體在功能上等同。取代優(yōu)選保守氨基酸取代，所述取代 為電荷、側(cè)鏈、極性、芳香性等性質(zhì)的類(lèi)似的氨基酸間的取代。性質(zhì)類(lèi)似的的氨基酸可以如 下分類(lèi)，例如堿性氨基酸(精氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸)、酸性氨基酸(天門(mén)冬氨酸、谷氨酸)、 無(wú)電荷極性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸)、非 極性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸)、支 鏈氨基酸(蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)、芳香族氨基酸(苯基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、組氨 酸)等。作為抗體修飾物，例如可以舉出與聚乙二醇(PEG)等各種分子相結(jié)合的抗體。在 本發(fā)明的抗體修飾物中，被結(jié)合的物質(zhì)沒(méi)有限定。為了得到上述抗體修飾物，可以通過(guò)對(duì)所 得的抗體進(jìn)行化學(xué)修飾得到。上述方法在該領(lǐng)域中已經(jīng)被確立。此處，所謂“功能等同”，是指對(duì)象抗體具有與本發(fā)明的抗體同樣的生物學(xué)或生物 化學(xué)活性，具體而言，具有損傷腫瘤的功能，應(yīng)用于人時(shí)本質(zhì)上不引起排斥反應(yīng)等。作為上 述活性，例如可以舉出細(xì)胞增殖抑制活性、或結(jié)合活性。作為用于制備與某種多肽功能等同的多肽的本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，已 知有向多肽中導(dǎo)入變異的方法。例如對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以使用位點(diǎn)定向誘 ^ (Hashimoto-Gotoh, Τ. et al. (1995)Gene 152,271-275> Zoller, MJ, and Smith, Μ. (1983)MethodsEnzymol. 100,468-500 ；Kramer, W. et al. (1984)Nucleic Acids Res. 12, 944卜9456、Kramer, W. and Fritz HJ (1987)Methods. Enzymol. 154,350-367、Kunkel, TA (1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82，488-492、Kunkel (1988)Methods Enzymol. 85, 2763-2766)等，向本發(fā)明的抗體中導(dǎo)入合適的變異，由此制備與該抗體功能等同的抗體。識(shí)別上述抗⑶179b抗體所識(shí)別的⑶179b蛋白質(zhì)的抗原決定部位的抗體，可以根 據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法得到。例如可以通過(guò)下述方法得到根據(jù)通常的方法(例如 抗原決定部位作圖等)確定抗CD179b抗體所識(shí)別的CD179b蛋白質(zhì)的抗原決定部位，將具 有該抗原決定部位中含有的氨基酸序列的多肽作為免疫原制備抗體的方法；或確定利用通 常的方法制備的抗體的抗原決定部位，抗CD179b抗體與抗原決定部位通過(guò)選擇同樣抗體 的方法等。此處，“抗原決定部位”是指在哺乳動(dòng)物、優(yōu)選在人中，具有抗原性或免疫原性的 多肽片段，其最小單位由約7 12個(gè)氨基酸構(gòu)成。
本發(fā)明抗體的親和常數(shù)Ka(k。n/k。ff)，優(yōu)選至少為ΙΟΙ1、至少為ΙΟΙ1、至少為 δΧΙΟ 1、至少為ΙΟ^Γ1、至少為δΧΙΟ 1、至少為ΙΟ^Τ1、至少為5 X IOiqIT1、至少為IO11M"1, 至少為5 X IO11ITi、至少為IO12IT1、至少為IO13IT1tj本發(fā)明的抗體可以與抗腫瘤劑結(jié)合?？贵w與抗腫瘤劑的結(jié)合，可以通過(guò)具有與氨 基、羧基、羥基、巰基等反應(yīng)性基團(tuán)(例如琥珀酰亞胺基、甲?；?、2-吡啶基二硫基、馬來(lái)酰 亞胺、烷氧基羰基、羥基等)的間隔進(jìn)行?？鼓[瘤劑的例子，包括文獻(xiàn)等中公知的下述抗腫瘤劑，即，紫杉醇、阿得里亞霉 素、柔紅霉素、環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、噻替派(Thiotepa)、白消安(Busulfan)、 胃丙 Λ (Improsulfan)、P秦消安(Piposulfan)、Benzodopa、卡波酉昆(Carboquone)、 Meturedopa、Uredopa、六甲蜜胺(Altretamine)、曲他胺(Triethylenemelamine)、三亞 乙基憐酉先胺(Triethylenephosphoramide)、Triethiylenethiophosphoramide、三輕甲
月安(trimethylolomelamine) >(Bullatacin) > ^iiftk^SI (Bullatacinone) >
喜 W M (Camptothecin) > ^r Il素(Bryostatin) > Callystatin> CryptophycinK Cryptophycin 8、多拉司他t丁 (Dolastatin)、Duocarmycin、軟珊王胡醇(Eleutherobin) > 水鬼蕉堿(Pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(Sarcodictyin)、海綿素(Spongistatin)、 苯丁酸氮芥、萘氮芥(Chlornaphazine)、氯代磷酰胺(Cholophosphamide)、雌莫司 汀(Estramustine)、異環(huán)磷酰胺(Ifosfamide)、氮芥(Mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥 (Mechlorethamine oxyhydrochloride)、美法倉(cāng)(Melphalan)、新氮芥(Novembichin)、膽 甾醇對(duì)苯乙酸氮芥(Phenesterine)、潑尼氮芥(Prednimustine)、曲磷胺(Trofosfamide)、 烏拉莫司汀(Uracil mustard)、卡氮芥(Carmustine)、氯服菌素(Chlorozotocin)、 福莫司汀(Fotemustine)、洛莫司汀(Lomustine)、尼莫司汀(Nimustine)、雷莫司 汀(Ranimustine)、加里剎霉素(Calicheamicin)、達(dá)內(nèi)霉素(Dynemicin)、氯磷酸鹽 (Clodronate)、埃其Jf培拉霉素(Esperamicin)、阿克拉霉素(Aclacinomycin)、方文線菌 素(Actinomycin)、Authramycin> 重氮絲氨酸(Azaserine)、博來(lái)霉素(Bleomycin)、 M ^ M M C(Caotinomycin) > Carabicin> ψ iL 9 M (Carminomycin) > ^ fM M (Carzinophilin)、色霄素(Chromomycin)、放線菌素 D (Dactinomycin)、Detorbioin、 6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(ADRIAMYCIN)、表柔比星(Epirubicin)、依索比 星^sorubicin)、去甲氧基柔紅霉素(Idarubicin)、麻西羅霉素(Marcellomycin)、絲 裂霉素 C(MitomycinC)、霉酚酸(Mycophenolic acid)、諾加霉素(Nogalamycin)、橄欖 霉素(Olivomycins)、培洛霉素(Peplomycin)、Potfiromycin、口票呤霉素(Puromycin)、 三鐵阿霉素(Quelamycin)、羅多比星(Rodorubicin)、鏈黑菌素(Sti^ptonigrin)、鏈 佐星(Sti^ptozocin)、殺結(jié)核菌素(Tubercidin)、烏本美司(Ubenimex)、凈司他丁 (Zinostatin)、佐柔比星(Zorubicin)、二 甲葉酸(Denopterin)、蝶羅呤(Pteropterin)、 三甲曲沙(Trimetrexate)、氟達(dá)拉濱(Fludarabine)、6_ 巰基口票呤(6_mercaptopurine)、 硫咪嘌呤(Thiamiprine)、硫鳥(niǎo)嘌呤(Thioguanine)、安西他濱(Ancitabine)、阿 扎胞苷(Azacitidine)、6_ 氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(Carmofur)、阿糖胞苷 (Cytarabine)、雙月兌氧尿^f (Dideoxyuridine)、去氧氣尿^f (Doxifluridine)、伊諾他 賓 (Enocitabine)、氟尿苷(Floxuridine)；雄激素類(lèi)，包括例如卡魯睪酮(Calusterone)、 屈他雄麗丙酸酉旨(Dromostanolone propionate)、環(huán) ψι 雄醇(Epitiostanol)、美雄燒(M印itiostane)、睪內(nèi)酯 CTestolactone)、氨魯米特(Aminoglutethimide)、米托坦 (Mitotane)、曲洛司坦(Trilostane)、Frolinic acid、醋葡酸內(nèi)酯(Aceglatone)、酸磷酰 胺苷(Aldophosphamide glycoside)、5-氨基酮戊酸(Aminolevulinicacid)、恩尿嘧啶 (Eniluracil)、安 口丫 PjS (Amsacrine)、Bestrabuci 1> 比生群(Bisantrene)、Edatraxate> Defofamine,秋水仙胺(Demecolcine)、地吖醌(Diaziquone)、Elfornithine,依利醋 銨(Elliptinium acetate)、埃博霉素(Epothilone)、依托格魯(Etoglucid)、香菇多糖 (Lentinan)、氯尼達(dá)明(Lonidamine)、美登素(Maytansine)、柄型菌素(Ansamitocine)、 米托月瓜月宗(Mitoguazone)、米托惠酉昆(Mitoxantrone)、MopidanmoU Nitraerine> 噴 司他丁 (Pentostatin)、蛋氨氮芥(Phenamet)、吡柔比星(Pirarubicin)、洛索蒽醌 (Losoxantrone)、鬼白酸(Podophyllinic acid)、2_ 乙月井(2~ethylhydrazide)、甲基節(jié) 餅(Procarbazine)、雷佐生(Razoxane)、根霉素(Rhizoxin)、裂裥菌素(Schizophyllan)、 鍺螺胺(Spirogermanium)、細(xì)格孢氮雜酸(Tenuazonic acid)、三亞胺醌(Triaziquone)、 Roridine A、蛇形菌素(Anguidine)、尿烷(Urethane)、長(zhǎng)春地辛(Vindesine)、達(dá)卡 巴嗪(Dacarbazine)、甘露莫司汀(Mannomustine)、二溴甘露醇(Mitobronitol)、二 漠衛(wèi)矛醇(Mitolactol)、喊泊漠燒(Pipobroman)、Gacytosine、Doxetaxel、苯丁酸 氮芥(Chlorambucil)、吉西他濱(Gemcitabine)、6_ 硫鳥(niǎo)嘌呤(6-thioguanine)、巰 基嘌呤(Mercaptopurine)、順鉬、奧沙利鉬(Oxaliplatin)、卡鉬、長(zhǎng)春堿、依托泊苷 (Etoposide)、異環(huán)磷酰胺、米托蒽醌、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞濱、諾消靈(Novantrone)、替尼泊 苷(Teniposide)、依達(dá)曲沙(Edatrexate)、柔紅霉素(Daunomycin)、氨基蝶呤、適羅達(dá) (Xeloda)、伊班膦酸鹽abandronate)、伊立替康(Irinotecan)、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、二氟 甲基鳥(niǎo)氨酸(DMFO)、維甲酸、卡培他濱(Capeoitabine)、及它們藥學(xué)上能夠接受的鹽或衍 生物。或者，本發(fā)明的抗體中，也可以結(jié)合文獻(xiàn)等中公知的At211、Im、I125、Y9°、Re186、Re188、 Sm153、Bi212、P32、Lu等放射性同位素。放射性同位素優(yōu)選用于腫瘤的治療或診斷有效的物質(zhì)。本發(fā)明的抗體是具有與CD179b免疫反應(yīng)性的抗體，或特異性識(shí)別CD179b的抗體。 該抗體應(yīng)該為具有如下結(jié)構(gòu)的抗體，即，給與該抗體的對(duì)象動(dòng)物中可以幾乎或全部地避免 排斥反應(yīng)。作為上述抗體，例如對(duì)象動(dòng)物為人時(shí)，可以舉出人抗體、人源化抗體、嵌合抗體 (例如人-小鼠嵌合抗體)、單鏈抗體、雙重特異性抗體等。上述抗體為下述重組型抗體重 鏈及輕鏈的可變區(qū)來(lái)自人抗體；或包含重鏈及輕鏈的可變區(qū)為來(lái)自非人動(dòng)物抗體的互補(bǔ)性 決定區(qū)(CDR1、CDR2及CDR3)及來(lái)自人抗體的構(gòu)架區(qū)；或重鏈及輕鏈的可變區(qū)來(lái)自非人動(dòng)物 抗體、且重鏈及輕鏈的恒定區(qū)為來(lái)自人抗體的重組型抗體。優(yōu)選的抗體為前2種抗體。上述重組型抗體可以如下所述地制備。從雜交瘤等產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，克隆編碼 針對(duì)人CD179b的單克隆抗體(例如，人單克隆抗體、小鼠單克隆抗體、大鼠單克隆抗體、 雞單克隆抗體等)的DNA，將其作為模板，采用RT-PCR法等制備編碼該抗體的輕鏈可變 區(qū)及重鏈可變區(qū)的DNA，基于Kabat EU編號(hào)系統(tǒng)(Kabat et al. , Sequencesof Proteins of Immunological Interest,5Th Ed.Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991))，確定輕鏈及重鏈的各可變區(qū)的序列或各CDR1、CDR2、 CDR3的序列。進(jìn)而，利用基因重組技術(shù)(Sambrook et al.，Molecular Cloning，第2版， CcrrentProtocols in Molecular Biology (1 989))或DNA合成儀，制備編碼所述各可變區(qū)的DNA或編碼各CDR的DNA。此處，上述產(chǎn)生人單克隆抗體的雜交瘤可以如下制備，即，用 人CD179免疫產(chǎn)生人抗體的動(dòng)物(例如小鼠)后，使從該免疫動(dòng)物切除的脾細(xì)胞與骨髓瘤 細(xì)胞融合。除此之外，根據(jù)需要，使用基因重組技術(shù)或DNA合成儀，制備編碼來(lái)自人抗體的 輕鏈或重鏈可變區(qū)及恒定區(qū)的DNA。為人源化抗體的情況下，編碼人源化抗體的DNA可以如下制備將編碼來(lái)自人抗 體的輕鏈或重鏈可變區(qū)的DNA中的CDR序列，用與其對(duì)應(yīng)的、來(lái)自人以外的動(dòng)物(例如小 鼠、大鼠、雞等)的抗體的CDR序列所取代，制備上述得到的DNA，將由此得到的DNA分別與 編碼來(lái)自人抗體的輕鏈或重鏈恒定區(qū)的DNA連接。為嵌合抗體的情況下，編碼嵌合抗體的DNA可以如下制備將編碼來(lái)自人以外的 動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、雞等)的抗體的輕鏈或重鏈可變區(qū)的DNA，分別與編碼來(lái)自人抗體的 輕鏈或重鏈恒定區(qū)的DNA連接。為單鏈抗體的情況下，上述抗體為將重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)通過(guò)連接體以線狀 連接得到的抗體，編碼單鏈抗體的DNA可以如下制備將編碼重鏈可變區(qū)的DNA、編碼連接 體的DNA、及編碼輕鏈可變區(qū)的DNA連接。此處，重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)均來(lái)自人抗體，或 來(lái)自?xún)HCDR被來(lái)自人以外的動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、雞等)的抗體的CDR取代的人抗體。另 外，連接體由12 19個(gè)氨基酸組成，例如，可以舉出15個(gè)氨基酸的(G4S) 3 (Kim, GB. et al.， ProteinEngineering Design and Selection 2007,20(9) :425-432)。為雙重特異性抗體(diabody)的情況下，上述抗體為可以與2個(gè)不同的抗原決定 部位特異性連接的抗體，制備編碼雙重特異性抗體的DNA例如可以如下制備將編碼重鏈 可變區(qū)A的DNA、編碼輕鏈可變區(qū)B的DNA、編碼重鏈可變區(qū)B的DNA、及編碼輕鏈可變區(qū)A 的DNA，按照該述順序連接(其中，編碼輕鏈可變區(qū)B的DNA與編碼重鏈可變區(qū)B的DNA，通 過(guò)編碼如上所述的連接體的DNA被連接。)。此處，重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)均來(lái)自人抗體， 或來(lái)自?xún)HCDR被來(lái)自人以外的動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、雞等)的抗體的CDR取代的人抗體。重組型抗體可以如下制備將如上所述制備的重組DNA參入1個(gè)或多個(gè)適當(dāng)?shù)妮d 體中，將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等)中，使它們(共)表 達(dá)(P. J. Delves. ,ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.，1997WILEY ；P.Shepherd and C. Dean.，Monoclonal Antibodies.，20000XF0RD UNIVERSITY PRESS ;J. W. Goding., MonoclonalAntibodies :principles and practice. ,1993ACADEMIC PRESS)。通過(guò)上述方法制備的本發(fā)明的抗體例如為下述抗體在重鏈可變區(qū)含有序列號(hào) 103、104及102的氨基酸序列、且在輕鏈可變區(qū)含有序列號(hào)106、107及108的氨基酸序列。 此處，序列號(hào)103、104及102的氨基酸序列分別為小鼠抗體重鏈可變區(qū)的⑶R1、⑶R2及 ⑶R3，另外，序列號(hào)106、107及108的氨基酸序列分別為小鼠抗體輕鏈可變區(qū)的⑶R1、⑶R2 及CDR3。因此，本發(fā)明的人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體或雙重特異性抗體例如為以下抗 體。(i)抗體，重鏈可變區(qū)含有序列號(hào)103、104及102的氨基酸序列及來(lái)自人抗體的構(gòu) 架區(qū)的氨基酸序列，且輕鏈可變區(qū)含有序列號(hào)106、107及108的氨基酸序列及來(lái)自人抗體 的構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列。(ii)抗體，重鏈可變區(qū)含有序列號(hào)103、104及102的氨基酸序列及來(lái)自人抗體的 構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列，且重鏈恒定區(qū)含有來(lái)自人抗體的氨基酸序列，并且輕鏈可變區(qū)含有序列號(hào)106、107及108的氨基酸序列及來(lái)自人抗體的構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列，且輕鏈恒定區(qū) 含有來(lái)自人抗體的氨基酸序列。(iii)抗體，在重鏈可變區(qū)含有序列號(hào)105的氨基酸序列，且在輕鏈可變區(qū)含有序 列號(hào)109的氨基酸序列。(iv)抗體，重鏈可變區(qū)含有序列號(hào)105的氨基酸序列，且重鏈恒定區(qū)含有來(lái)自人 抗體的氨基酸序列，并且輕鏈可變區(qū)含有序列號(hào)109的氨基酸序列，且輕鏈恒定區(qū)含有來(lái) 自人抗體的氨基酸序列。需要說(shuō)明的是，人抗體重鏈及輕鏈恒定區(qū)及可變區(qū)的序列例如可以購(gòu)自NCBI (美 國(guó)=GenBanK UniGene等)，例如關(guān)于人IgGl重鏈恒定區(qū)可以參見(jiàn)注冊(cè)編號(hào)J002^，關(guān)于 人IgG2重鏈恒定區(qū)可以參見(jiàn)注冊(cè)編號(hào)J00230，關(guān)于人IgG3重鏈恒定區(qū)可以參見(jiàn)注冊(cè)編號(hào) X03604，關(guān)于人IgG4重鏈恒定區(qū)可以參見(jiàn)注冊(cè)編號(hào)K01316，關(guān)于人輕鏈κ恒定區(qū)可以參 見(jiàn)注冊(cè)編號(hào)V00557、X64135、)(64133等，關(guān)于人輕鏈λ恒定區(qū)可以參見(jiàn)注冊(cè)編號(hào))(64132、 Χ64134等序列。優(yōu)選上述抗體具有細(xì)胞毒性，由此可以發(fā)揮抗腫瘤效果。另外，上述抗體中的重鏈及輕鏈可變區(qū)和CDR的特定序列僅用作舉例說(shuō)明，很明 顯并不限定于特定的序列。制備能產(chǎn)生針對(duì)人CD179b的其他人抗體或非人動(dòng)物抗體(例 如小鼠抗體)的雜交瘤，回收雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體，以與人CD179b的免疫結(jié)合性及細(xì) 胞毒性作為指標(biāo)，判定是否為目標(biāo)抗體。由此識(shí)別產(chǎn)生目標(biāo)單克隆抗體的雜交瘤后，如上所 述，由該雜交瘤制備編碼目標(biāo)抗體的重鏈及輕鏈可變區(qū)的DNA，確定序列，將該DNA用于其 他抗體的制備。進(jìn)而，本發(fā)明的上述抗體，只要具有特異性識(shí)別⑶179b的特異性，可以從上述 ⑴ (iv)的各抗體的特別是構(gòu)架區(qū)的序列及/或恒定區(qū)的序列中，存在1個(gè)或多個(gè)(優(yōu) 選1個(gè)或2個(gè))氨基酸的取代、缺失或附加。此處所謂多個(gè)，是指2 5個(gè)、優(yōu)選2個(gè)或3 個(gè)。本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼本發(fā)明的上述抗體的DNA、或編碼上述抗體的重鏈或輕鏈 的DNA、或編碼上述抗體的重鏈或輕鏈可變區(qū)的DNA。上述DNA例如包括編碼重鏈可變區(qū)的 DNA及編碼輕鏈可變區(qū)的DNA等，所述重鏈可變區(qū)含有編碼序列號(hào)103、104及102的氨基酸 序列的堿基序列，所述輕鏈可變區(qū)含有編碼序列號(hào)106、107及108的氨基酸序列的堿基序 列。由上述序列的DNA編碼的互補(bǔ)性決定區(qū)(OTR)為決定抗體的特異性的區(qū)域，因此， 編碼抗體的除此之外區(qū)域(即，恒定區(qū)及構(gòu)架區(qū))的序列也可以來(lái)自其他抗體。此處，所謂 其他抗體也包含來(lái)自除人之外的生物的抗體，但從降低副作用的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選來(lái)自人的 抗體。即，上述DNA中，優(yōu)選編碼重鏈及輕鏈的各構(gòu)架區(qū)及各恒定區(qū)的區(qū)域含有編碼與來(lái)自 人抗體對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的堿基序列。進(jìn)而，編碼本發(fā)明抗體的DNA的其他例子，包括編碼重鏈可變區(qū)的DNA，所述重鏈 可變區(qū)含有編碼序列號(hào)105的氨基酸序列的堿基序列；編碼輕鏈可變區(qū)的區(qū)域?yàn)楹芯幋a 序列號(hào)109的氨基酸序列的堿基序列的DNA等。此處，編碼序列號(hào)105的氨基酸序列的堿 基序列的例子，為序列號(hào)110的堿基序列。另外，編碼序列號(hào)109的氨基酸序列的堿基序列 的例子，為序列號(hào)111的堿基序列。即使在上述DNA中，也優(yōu)選編碼重鏈及輕鏈各恒定區(qū)的區(qū)域含有編碼與來(lái)自人抗體對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的堿基序列。本發(fā)明的DNA例如可以采用上述方法或以下方法得到。首先，由與本發(fā)明相關(guān)的 雜交瘤，使用市售的RNA提取試劑盒制備總RNA，使用隨機(jī)引物等，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。 接著，利用PCR法，使編碼抗體的cDNA擴(kuò)增，所述PCR法使用在已知的小鼠抗體重鏈基因及 輕鏈基因的各可變區(qū)中分別具有被保存的序列的寡核苷酸作為引物。對(duì)于編碼恒定區(qū)的序 列，可以通過(guò)用PCR法擴(kuò)增已知的序列得到。DNA的堿基序列可以通過(guò)常規(guī)方法確定，例如 將序列參入序列確定用質(zhì)?；蚴删w中等。本發(fā)明中使用的抗⑶179b抗體對(duì)于⑶179b表達(dá)癌細(xì)胞的抗腫瘤效果，認(rèn)為是由 以下機(jī)制引起的。效應(yīng)細(xì)胞對(duì)⑶179b表達(dá)細(xì)胞的抗體性依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)；對(duì)⑶179b表達(dá)細(xì)胞的補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(⑶C)。因此，本發(fā)明中使用的抗CD179b抗體的活性評(píng)價(jià)，如以下實(shí)施例中具體列舉，對(duì) 于在生物體外表達(dá)⑶179b的癌細(xì)胞，可以通過(guò)測(cè)定上述ADCC活性或⑶C活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。本發(fā)明中使用的抗⑶179b抗體與癌細(xì)胞上的⑶179b蛋白質(zhì)相結(jié)合，由于上述活 性顯示抗腫瘤作用，所以認(rèn)為對(duì)癌的治療或預(yù)防有用。即，本發(fā)明提供一種以抗CD179b抗 體為有效成分的、用于癌的治療及/或預(yù)防的藥物組合物。出于將抗CD179b抗體給與人體 的目的(抗體治療)進(jìn)行使用時(shí)，由于使免疫原性降低，所以?xún)?yōu)選人抗體或人源化抗體。需要說(shuō)明的是，抗⑶179b抗體與癌細(xì)胞表面上的⑶179b蛋白質(zhì)的結(jié)合親和性越 高，可以得到由抗CD179b抗體引起的抗腫瘤活性越強(qiáng)。因此，如果可以獲得與CD179b蛋 白質(zhì)具有高結(jié)合親和力的抗CD179b抗體，則可以期待更強(qiáng)的抗腫瘤效果，可以作為以癌的 治療及/或預(yù)防為目的的藥物組合物應(yīng)用。如上所述，作為高結(jié)合親和力，優(yōu)選親和常數(shù) Ka(k。n/k。ff)至少為ΙΟΙ1、至少為ΙΟ^Γ1、至少為δΧΙΟ 1、至少為ΙΟΙ1、至少為5X IO9M"1, 至少為IOicT1.至少為δΧΚΓΜ—1、至少為10"Μ_\至少為5Χ10"Μ_\至少為IO1^T1.至少為 IO13M-1O〈藥物組合物〉本發(fā)明的用于癌的治療及/或預(yù)防的藥物組合物的目標(biāo)，只要為表達(dá)CD179b基 因的癌(細(xì)胞)即可，沒(méi)有特別的限定，優(yōu)選選自白血病、淋巴瘤、乳癌的癌(細(xì)胞)，上述 癌中，例如也包括乳腺癌、復(fù)合型乳腺癌、乳腺惡性混合腫瘤、乳管內(nèi)乳頭狀腺癌、肥大細(xì)胞 瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、消化管淋巴瘤、消化器官淋巴瘤、小 中細(xì)胞型淋巴瘤等。另外，本發(fā)明中使用的抗體或其片段，可以用于上述記載的癌治療及/或預(yù)防方 法中。使用本發(fā)明中使用的抗體作為藥物組合物時(shí)，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方 法將其制劑化。例如可以與水或除此之外的藥學(xué)上可以接受的液體形成的無(wú)菌溶液或懸浮 液以注射劑的形式非口服使用。例如認(rèn)為與藥理學(xué)上可接受的載體或介質(zhì)適當(dāng)組合，具體 而言，包括滅菌水或生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、調(diào)味劑、賦形 劑、載體、防腐劑、粘合劑等，通過(guò)以通常認(rèn)為的制藥方法中所要求的單位用量形式混來(lái)進(jìn) 行制劑化。上述制劑中的有效成分量為可得到規(guī)定范圍的適當(dāng)?shù)娜萘?。用于注射的無(wú)菌組合物，可以使用注射用蒸餾水之類(lèi)載體，按照通常的制劑方法 形成處方。
作為注射用水溶液，例如可以舉出含有生理鹽水、葡萄糖或其他輔助劑的等滲溶 液，例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化鈉，也可以并用適當(dāng)?shù)闹軇?，例?醇，具體而言為乙醇；多元醇，例如丙二醇、聚乙二醇；非離子表面活性劑，例如聚山梨酸酯 80( ￥)、HC0-60。作為油性液體，可以舉出芝麻油、大豆油，作為助溶劑，也可以與苯甲酸芐酯、芐醇 合用。另外，也可以與下述物質(zhì)配合緩沖劑，例如磷酸鹽緩沖液、乙酸鈉緩沖液；鎮(zhèn)痛劑， 例如鹽酸普魯卡因；穩(wěn)定劑，例如芐醇、苯酚；抗氧化劑。制備的注射液通常被填充到適當(dāng) 的安瓿中。給藥可以口服或非口服，優(yōu)選非口服給藥，具體而言，可以舉出注射劑型、經(jīng)鼻給 藥型、經(jīng)肺給藥劑型、經(jīng)皮給藥型等。作為注射劑的例子，例如可以通過(guò)靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi) 注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射等全身或局部給藥。另外，可以根據(jù)患者的年齡、癥狀、性別等，適當(dāng)選擇給藥方法。作為含有抗體或其 片段的藥物組合物的給藥量，例如可以在每1次每Ikg體重0. OOOlmg IOOOmg的范圍內(nèi) 選擇?；蛘撸缈梢栽诿?個(gè)患者0. 001 lOOOOOmg/body的范圍內(nèi)選擇給藥量，但并不 一定限制于所述數(shù)值。給藥量及給藥方法根據(jù)患者的體重或年齡、癥狀等改變，對(duì)于本領(lǐng)域 技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以適當(dāng)選擇。〈多肽及DNA>本發(fā)明進(jìn)一步提供與上述抗體相關(guān)的以下多肽及DNA。(i)多肽及編碼該多肽的DNA，所述多肽含有序列號(hào)105的氨基酸序列。(ii)多肽及編碼該多肽的DNA，所述多肽含有序列號(hào)109的氨基酸序列。(iii)DNA，含有序列號(hào)110的堿基序列。(iv)DNA，含有序列號(hào)111的堿基序列。(ν)重鏈⑶R多肽及編碼該多肽的DNA，所述多肽選自序列號(hào)103、104及102的氨
基酸序列。(vi)輕鏈⑶R多肽及編碼該多肽的DNA，所述多肽選自序列號(hào)106、107及108的
氨基酸序列。如上所述，上述多肽及DNA可以使用基因重組技術(shù)進(jìn)行制備。實(shí)施例以下，基于實(shí)施例，更具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍并不限定于所述的具體 例。實(shí)施例1 采用SEREX法鑒定新型癌抗原蛋白(1)構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)利用酸-胍-酚-氯仿法(Acid guanidium-Phenol-Chloroform法)從通過(guò)手術(shù) 摘除的犬的乳腺癌組織中提取總RNA，使用01igotex-dT30mRNA purification Kit (寶酒造 公司制)，按照試劑盒附帶的說(shuō)明書(shū)純化聚A RNA。使用該得到的mRNA (5 μ g),合成來(lái)自犬乳腺癌的cDNA噬菌體文庫(kù)。構(gòu)建cDNA噬 菌體文庫(kù)時(shí)，使用 cDNA Synthesis Kit、ZAP_cDNA Synthesis Kit、ZAP_cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE公司制)，按照試劑盒附帶的說(shuō)明書(shū)構(gòu)建文庫(kù)。構(gòu)建的cDNA 噬菌體文庫(kù)的大小為2. 99X 105pfu/ml。
(2)利用血清篩選cDNA文庫(kù)使用上述構(gòu)建的來(lái)自犬乳腺癌的cDNA噬菌體文庫(kù)，進(jìn)行免疫篩選。具體而言， 在Φ90X 15mm的NZY瓊脂糖平板中，感染宿主大腸桿菌(XLl-Blue MRF，)，使其為2340 克隆，在42°C下培養(yǎng)3 4小時(shí)，形成溶菌斑(plaque)，在37°C下，用浸透了 IPTG(異丙 基-β-D-半乳糖苷)的硝酸纖維素濾膜(Hybond C Extra =GEHealthcare Bio-Science 公 司制)，覆蓋平板4小時(shí)，由此誘導(dǎo) 表達(dá)蛋白質(zhì)，并使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到膜上。之后，回收膜，將 其浸泡在含有0. 5%脫脂奶粉的TBS(IOmM Tris-HCl，150mM NaCl ρΗ7· 5)中，在4°C下振蕩 一晚，由此抑制非特異性反應(yīng)。在室溫下使上述過(guò)濾器與稀釋了 500倍的患病犬血清反應(yīng) 2 3小時(shí)。作為上述患病犬血清，分別使用從摘除了上述乳腺癌的同一患病犬及其他乳腺癌 患病犬收集的共3個(gè)血清樣本。上述血清在_80°C下保存，在即將使用之前進(jìn)行前處理。血 清的前處理方法采用以下的方法。即，用未插入外來(lái)基因的λ ZAP Express噬菌體感染宿主 大腸桿菌(XLl-Blue MRF’)后，在37°C下，在NZY平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)一晚。接著，向平板中 加入含有0. 5M NaCl的0. 2M NaHC03pH8. 3的緩沖液，在4°C下靜置15小時(shí)后，回收上清液 作為大腸桿菌/噬菌體提取液。接著，將回收的大腸桿菌/噬菌體提取液通過(guò)NHS-柱(GE Healthcare Bio-Science公司制)，固定化來(lái)自大腸桿菌 噬菌體的蛋白質(zhì)。在該蛋白固 定化柱中使患病犬血清通過(guò)·反應(yīng)，從血清中除去吸附在大腸桿菌及噬菌體上的抗體。用 含有0.5%脫脂奶粉的TBS將僅僅只是通過(guò)柱子的血清餾分稀釋500倍，將其作為免疫篩選 的材料。將經(jīng)上述處理血清與上述融合蛋白質(zhì)印記的膜用TBS-T(0. 05% Tween20/TBS)清 洗4次后，將用含有0.5%脫脂奶粉的TBS稀釋5000倍的山羊抗犬IgG(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated ；BETHYL Laboratories公司制)作為二次抗體，在室溫下使其 反應(yīng)1小時(shí)。使用NBT/BCIP反應(yīng)液(Roche公司制)通過(guò)酶顯色反應(yīng)檢測(cè)，從Φ90Χ 15mm 的NZY瓊脂糖平板上收集與顯色反應(yīng)陽(yáng)性部位相同的菌落，使其溶解在500 μ 1 SM緩沖液 (IOOmM NaClUOmMMgClSO4,50mM Tris_HCl、0. 01 % 明膠pH7. 5)中。用與上述同樣將顯色反 應(yīng)陽(yáng)性的菌落重復(fù)篩選兩次、三次，直到菌落單一化，篩選出與血清中的IgG反應(yīng)的92820 個(gè)噬菌體克隆，分離45個(gè)陽(yáng)性克隆。(3)分離抗原基因的同源性檢索為了將用上述方法分離得到的45個(gè)陽(yáng)性克隆用于堿基序列解析，進(jìn)行操作從噬 菌體載體轉(zhuǎn)換為質(zhì)粒載體。具體而言，將宿主大腸桿菌(XLl-Blue MRF’)制成吸光度0D_ 為1.0的溶液，將上述溶液200 μ 1與250 μ 1經(jīng)純化的噬菌體溶液以及1μ 1 ExAssist helperphage (STRATAGENE公司制)混合后，在37°C下反應(yīng)15分鐘后，加入:3ml LB培養(yǎng)基， 在37°C下進(jìn)行培養(yǎng)2. 5 3小時(shí)，立刻在70°C的水浴中保持溫度20分鐘后，在4°C下以 IOOOXg離心15分鐘，回收上清作為噬菌粒溶液。接著，將噬粒宿主大腸桿菌(SOLR)制成 吸光度0D_為1. 0的溶液，將上述溶液200 μ 1與10 μ 1經(jīng)純化的噬菌體溶液混合后，在 37°C下反應(yīng)15分鐘，取50 μ 1播于含有氨芐青霉素(終濃度50μ g/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基 中，在37°C下培養(yǎng)一晚。收集經(jīng)轉(zhuǎn)化的SOLR單菌落，在37°C下，用含有氨芐青霉素(終濃 度50 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，使用QIAGEN plasmid Minipr印Kit (QIAGEN公司制)， 純化含有目標(biāo)插入片段的質(zhì)粒DNA。
純化的質(zhì)粒，使用序列號(hào)94所記載的T3引物和序列號(hào)95所記載的T7引物，根據(jù) 引物步移法(primer-walking)來(lái)解析插入片段全長(zhǎng)序列。通過(guò)上述序列解析獲得序列號(hào) 4 92的偶數(shù)號(hào)所記載的基因序列。使用該基因的堿基序列及氨基酸序列(序列號(hào)5 93 的奇數(shù)號(hào))，進(jìn)行同源性檢索程序BLAST搜索(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)，進(jìn) 行與已知基因同源性的檢索，結(jié)果表明得到的45個(gè)基因均為編碼CD179b的基因。45個(gè)基 因間的同源性為堿基序列94 99%、氨基酸序列96 99%。該基因與編碼人同源因子的 基因間的同源性，在被翻譯成蛋白質(zhì)的區(qū)域?yàn)閴A基序列62 82%、氨基酸序列69 80%。 人同源因子的堿基序列如序列號(hào)1所示，氨基酸序列如序列號(hào)2及3所示。(4)在各組織中的基因表達(dá)解析對(duì)于通過(guò)上述方法得到的基因，利用RT-PcR(ReversejTranscription-PCR)法研 究其在犬及人的正常組織及各種細(xì)胞株中的表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)如下進(jìn)行。即，使用TRIZOL 試劑(invitrogen公司制)按照附帶的說(shuō)明書(shū)從50 IOOmg各組織及5 IOXlO6個(gè) 各細(xì)胞株的細(xì)胞提取總 RNA。通過(guò) Superscript First-Strand SynthesisSystem for RT-PCR(invitrogen公司制)，按照附帶的說(shuō)明書(shū)用上述總RNA合成cDNA。人正常組 織(腦、海馬、睪丸、結(jié)腸、胎盤(pán))的cDNA，使用Gene Pool cDNA (invitrogen公司制)、 QUICK-ClonecDNA (CL0NETECH 公司制)及 Large-Insert cDNA Library (CL0NETECH 公司 制)。PCR反應(yīng)使用對(duì)獲得的犬基因具有特異性的引物(序列號(hào)96及97所記載)及對(duì)其人 同源基因具有特異性的引物(序列號(hào)98及99所記載)如下進(jìn)行。即，加入各試劑和附加 緩沖液使總量為25μ 1，其中使通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備得到的試樣為0. 25μ 1，上述引物各為 2口] ，各(1^13為0.21111工1139聚合酶(寶酒造公司制)為 0. 65U，使用 Thermal Cycler (BIO RAD公司制)，以94°C -30秒、60°C -30秒、72°C -30秒為1循環(huán)，將該循環(huán)重復(fù)進(jìn)行30次。 需要說(shuō)明的是，對(duì)具有上述序列號(hào)96及97中所示堿基序列的基因具有特異性的引物，是擴(kuò) 增下述區(qū)域的引物，所述區(qū)域是序列號(hào)4所示的堿基序列中的32號(hào) 341號(hào)、序列號(hào)4 92的偶數(shù)號(hào)表示的全部犬CD179b基因中共同的區(qū)域。另外，對(duì)具有序列號(hào)98及99所示的 堿基序列的基因具有特異性的引物，擴(kuò)增序列號(hào)1所示的堿基序列中的216號(hào) 738號(hào)堿 基的區(qū)域。為了比較對(duì)照，同時(shí)也使用GAPDH特異性的引物(如序列號(hào)100及101所示)。 其結(jié)果如圖1所示，發(fā)現(xiàn)獲得的犬基因在健康的犬組織中完全不表達(dá)，另一方面，發(fā)現(xiàn)在犬 乳癌組織中有強(qiáng)表達(dá)。人同源基因的表達(dá)中，可以確認(rèn)到人正常組織中表達(dá)的只有骨髓，在 人癌細(xì)胞中，檢測(cè)到白血病細(xì)胞株及乳癌細(xì)胞株表達(dá)，確認(rèn)到CD179b在白血病細(xì)胞株及乳 癌細(xì)胞株中特異性表達(dá)。需要說(shuō)明的是，圖1中，縱軸的標(biāo)號(hào)1表示上述鑒定的基因的表達(dá)譜，標(biāo)號(hào)2表示 比較對(duì)照的GAPDH基因的表達(dá)譜。(5)癌細(xì)胞上的抗原蛋白的表達(dá)解析接著，對(duì)于確認(rèn)到⑶179b基因的表達(dá)的各癌細(xì)胞株，研究在其細(xì)胞表面上⑶179b 蛋白是否表達(dá)。上述確認(rèn)到基因表達(dá)的各人癌細(xì)胞株106個(gè)細(xì)胞，分別用1.5ml的微 量離心管離心。向離心管中加入5ul小鼠抗人⑶179b抗體(克隆名GA170 ;Santa CruzBiotechnoloy公司制)，進(jìn)而用含有95 μ 1的0. 胎牛血清的PBS懸浮后，在冰上靜 置1小時(shí)。用PBS清洗后，用5 μ 1 FITC標(biāo)記兔抗小鼠IgGh單克隆抗體(BD Pharmingen 公司制)及含有95μ1 0.1%胎牛血清的PBS懸浮，在冰上靜置1小時(shí)。用PBS清洗后，用BecktonDickinson株式會(huì)社的FACS Calibur測(cè)定熒光強(qiáng)度。另一方面，采用與上述同樣的 操作，用小鼠IgG^i Isotype control (MBL公司制)代替小鼠抗人CD179b抗體制備細(xì)胞作 為對(duì)照。結(jié)果，添加有抗人CD179b抗體的細(xì)胞與對(duì)照相比，熒光強(qiáng)度均強(qiáng)出10%以上，由此 確認(rèn)了 CD179b蛋白在上述人癌細(xì)胞株的細(xì)胞膜表面上表達(dá)。實(shí)施例2 針對(duì)⑶179b的抗體對(duì)癌細(xì)胞的抗腫瘤效果(I)ADCC 活性接著，研究針對(duì)⑶179b的抗體是否可以損壞表達(dá)⑶179b的腫瘤細(xì)胞。使用市售 的針對(duì)人CD179b的小鼠抗體(克隆名GA170)進(jìn)行評(píng)價(jià)。在實(shí)施例1 (5)中，分別收集IO6 個(gè)確認(rèn)到CD179b的表達(dá)的3種人白血病細(xì)胞即Namalwa、BDCM及RPMI 1788 (均購(gòu)自ATCC) 的細(xì)胞到50ml容量的離心管中，加入100 μ Ci鉻51，在37°C下培育2小時(shí)。之后，用含有 10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基清洗3次，添加到96孔V底板上，使每孔為IO3個(gè)。向每孔中分 別添加1 μ gGA170,進(jìn)一步分別添加2 X IO5個(gè)從小鼠的脾分離出的淋巴細(xì)胞，在37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)后，測(cè)定由受損傷的腫瘤細(xì)胞釋放的培養(yǎng)上清中的鉻51的 量，通過(guò)GA170算出針對(duì)各癌細(xì)胞的ADCC活性。結(jié)果，對(duì)于Namalwa、BDCM及RPMI1788，確 認(rèn)了 ADCC活性分別為32. 6%、32. 3%及觀.3%。另一方面，使用GA170的同種型對(duì)照(克 隆名泊H3)進(jìn)行同樣的操作，結(jié)果沒(méi)有檢測(cè)出上述活性。因此，表明利用使用針對(duì)CD179b的 抗體的ADCC活性，可以損傷表達(dá)⑶179b的腫瘤細(xì)胞。需要說(shuō)明的是，如上所述，細(xì)胞毒性為下述結(jié)果混合本發(fā)明中使用的針對(duì) CD179b的抗體、小鼠淋巴細(xì)胞及IO3個(gè)參入了鉻51的各白血病細(xì)胞株，培養(yǎng)4小時(shí)，培養(yǎng)后 測(cè)定釋放到培養(yǎng)基中的鉻51的量，以下表示根據(jù)計(jì)算式*算出的針對(duì)各白血病細(xì)胞株的細(xì) 胞毒性的結(jié)果。*式細(xì)胞毒性(％)=由加入了針對(duì)⑶179b的抗體及小鼠淋巴細(xì)胞時(shí)的 Namalwa, BDCM及RPMI1788釋放的鉻51游離量+由加入了 IN鹽酸的靶細(xì)胞釋放的鉻51 游離量X 100。(2) CDC 活性將從兔采集的血液放入Eppendorf管中，在室溫下靜置60分鐘后，以3000rpm離 心分離5分鐘，由此制備⑶C活性測(cè)定用血清。將106個(gè)3種人白血病細(xì)胞即Namalwa、 BDCM及RPMI1788分別收集到50ml容量的離心管中，加入100 μ Ci鉻51，在37°C下培育2 小時(shí)后，用含有10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基清洗3次。之后，用含有50%的PRMI培養(yǎng)基 懸浮上述制備的兔血清，添加到96孔V底板上，使每孔為IO3個(gè)。向每孔中分別加入1 μ g GA170，在37°C、5%C02的條件下培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)后，測(cè)定由受到損傷的腫瘤細(xì)胞釋放的培 養(yǎng)上清中的鉻51的量，通過(guò)GA170算出針對(duì)癌細(xì)胞的⑶C活性。結(jié)果，對(duì)于Namalwa、BDCM 及RPMI1788，確認(rèn)了 CDC活性分別為30. 5%,21. 2%及30. 5%0另一方面，使用GA170的同 種型對(duì)照(對(duì)照名泊H3)進(jìn)行同樣的操作，結(jié)果沒(méi)有檢測(cè)出上述活性。因此，表明利用使用 針對(duì)⑶179b的抗體的⑶C活性，可以損傷表達(dá)⑶179b的腫瘤細(xì)胞。需要說(shuō)明的是，細(xì)胞毒性與上述(1)同樣，以下表示根據(jù)計(jì)算式*算出的針對(duì)各白 血病細(xì)胞株的細(xì)胞毒性的結(jié)果。*式細(xì)胞毒性(％ )=由加入了針對(duì)⑶179b的抗體及兔血清時(shí)的Namalwa、BDCM 及RPMI1788釋放的鉻51游離量+由加入了 IN鹽酸的靶細(xì)胞釋放的鉻51游離量X 100。
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實(shí)施例3 單克隆抗體的制備(1)抗原蛋白的制備通過(guò)對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法制備人⑶179b蛋白。通過(guò)限制切酶位點(diǎn)BioI及 BamHI，將人⑶179b基因(序列號(hào)22)導(dǎo)入編碼人IgGlFc區(qū)的載體即SRaIgGlFc載體。 SRaIgGlFc載體是將人IgGlFc區(qū)的基因?qū)雙CDL_SRa296載體(DNAX公司制)得到的載 體。接著，將24 μ g質(zhì)粒與60 μ 1 Lipofectamine2000 (Invitrogen公司制)混合，進(jìn)而加 入OPTI-MEManvitrogen公司制)，制備使總量為:3ml，在室溫下靜置20分鐘以上。向預(yù)先 制備成2 X IO6細(xì)胞/12ml0PTI MEM的CH0-K1細(xì)胞中加入3ml上述質(zhì)粒的混合液，在37°C、 5% CO2條件下培養(yǎng)8小時(shí)，置換成IOml CHO-S-SFM培養(yǎng)基Gnvitrogen公司制)，培養(yǎng)4 5天。使用I^roteinA sepharose HP (GEHealthcare公司制)純化在所得培養(yǎng)上清中生產(chǎn)的 抗原蛋白。用20mM磷酸緩沖液(pH7. 4)/0. 15M NaCl (平衡緩沖液 清洗緩沖液)充分地平 衡ftOteinA sepharose HP，向培養(yǎng)上清液中導(dǎo)入以1 1比例混合有平衡緩沖液的溶液。 接著，用清洗緩沖液充分地清洗后，用0. 2M甘氨酸緩沖液(pH2. 5)進(jìn)行洗脫。向洗脫液中 加入IM Tris (pH9)進(jìn)行中和，進(jìn)一步通過(guò)超濾，使用20mM磷酸緩沖液(pH7. 4)/0. 15MNaCl 進(jìn)行緩沖液交換操作，制備人CD179b蛋白。(2)雜交瘤的獲得將(1)中制備的100 μ g抗原蛋白(人CD179b蛋白)與等量的MPL+TDM佐劑(Sigma 公司制)混合，將其作為每1只小鼠的抗原溶液。對(duì)6周大Balb/c小鼠(日本SLC公司 制)的腹腔內(nèi)給與抗原溶液后，進(jìn)而每1周進(jìn)行3次給與，完成免疫。將從最終的免疫起3 日后摘除的脾臟夾在經(jīng)滅菌的2張載玻片中并磨碎，重復(fù)3次下述的操作，得到脾細(xì)胞使 用PBS(-)(日水公司制)洗滌，在1500rpm下離心10分鐘，除去上清。將得到的脾細(xì)胞與 小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0 (購(gòu)自ATCC)以10 1的比率混合，向其中混合200 μ 1加熱到37°C 的含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基和800 μ 1PEG1500 (Boehringer公司制)，加入制 備得到的PEG溶液，靜置5分鐘，進(jìn)行細(xì)胞融合。在1700rpm下離心5分鐘，除去上清后，用 150ml RPMI1640培養(yǎng)基(HAT選擇培養(yǎng)基)懸浮細(xì)胞，所述RPMI1640培養(yǎng)基含有加入了 2% 當(dāng)量Gibco公司制的HAT溶液的15%胎牛血清，將其接種到15張96孔板(Nunc公司制) 上，使每1個(gè)孔為100 μ 1。通過(guò)在37°C、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)7日，得到脾臟細(xì)胞與骨髓瘤 細(xì)胞融合的雜交瘤。(3)雜交瘤的選擇以制備的雜交瘤所產(chǎn)生的抗體與人CD179b蛋白的結(jié)合親和性為指標(biāo)，選擇雜交 瘤。向96孔板的每1個(gè)孔中加入100 μ 1的1 μ g/ml上述(1)中制備的人⑶179b蛋白溶液， 在4°C下靜置18小時(shí)。用PBS-T清洗各孔3次后，向每1個(gè)孔中添加400 μ 1 0.5% BSA(牛 血清白蛋白(Bovine Serum Albumin))溶液(Sigma公司制)，在室溫下靜置3小時(shí)。除去 溶液，將每1個(gè)孔用400 μ 1 PBS-T清洗3次后，向每1個(gè)孔中加入100 μ 1上述(2)中得到 的雜交瘤的各培養(yǎng)上清，在室溫下靜置2小時(shí)。用PBS-T清洗各孔3次后，向每1個(gè)孔中加 入100 μ 1用PBS稀釋了 5000倍的HRP標(biāo)記抗小鼠IgG (H+L)抗體(Invitrogen公司制)， 在室溫下靜置1小時(shí)。用PBS-T清洗孔3次后，向每1個(gè)孔中加入100 μ 1 TMB基質(zhì)溶液 (Thermo公司制)，靜置15 30分鐘，進(jìn)行顯色反應(yīng)。顯色后，向每1個(gè)孔中加入100 μ 1 IN硫酸，使反應(yīng)停止，使用分光分光計(jì)測(cè)定450nm-595nm處的吸光度值。結(jié)果，選擇了產(chǎn)生吸光度值最高的抗體的雜交瘤。向板中加入選擇得到的雜交瘤，使96孔板的每1個(gè)孔中為0. 5個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。 1周后，觀察到在孔中形成單一菌落的雜交瘤。進(jìn)一步培養(yǎng)上述孔的細(xì)胞，得到60個(gè)被克隆 的雜交瘤株。接著，以上述60個(gè)雜交瘤株所產(chǎn)生的抗體與白血病細(xì)胞的結(jié)合親和性為指標(biāo)，選 擇雜交瘤株。向96孔板中加入lmg/ml多聚-L-賴(lài)氨酸(Sigma公司制)-PBS溶液，使每1 個(gè)孔為100 μ 1，在室溫下靜置30分鐘。除去多聚-L-賴(lài)氨酸-PBS溶液，各孔用滅菌蒸餾 水充滿并丟棄，重復(fù)上述操作3次，之后，在凈化臺(tái)內(nèi)將板風(fēng)干。將確認(rèn)到CD179b表達(dá)的人 白血病細(xì)胞株Namalwa懸浮在PBS(-)中，使其為IO6個(gè)/ml，向上述板的每1個(gè)孔中加入 100 μ 1上述懸浮液，在室溫下靜置15分鐘。在1700rpm離心5分鐘后，除去上清，向每1個(gè) 孔中加入100 μ 1 0.05%戊二醛(Sigma公司制)-PBS溶液，在室溫下靜置10分鐘，用PBS-T 清洗孔3次后，向每1個(gè)孔中加入300 μ 1 0.5% BSA溶液，在4°C下靜置18小時(shí)。用PBS-T 清洗孔3次后，向每1個(gè)孔中加入100 μ 1上述得到的60個(gè)雜交瘤株的各培養(yǎng)上清，在室溫 下靜置2小時(shí)。除去上清，用PBS-T清洗孔3次后，向每1個(gè)孔中加入100μ 1用PBS稀釋 了 5000倍的HRP標(biāo)記抗小鼠IgG(H+L)抗體，在室溫下靜置1小時(shí)。用PBS-T清洗孔3次 后，向每1個(gè)孔中加入100 μ 1 TMB基質(zhì)溶液(Thermo公司制)，靜置30分鐘，進(jìn)行顯色反 應(yīng)。顯色后，向每1個(gè)孔中加入100 μ 1 IN硫酸，使反應(yīng)停止，使用分光光度計(jì)測(cè)定450nm 595nm處的吸光度值。結(jié)果，選擇了產(chǎn)生吸光度值最高、即與細(xì)胞結(jié)合最強(qiáng)的單克隆抗體的 雜交瘤株#8。利用ELISA法確定上述選擇的雜交瘤株#8所產(chǎn)生的抗⑶179b單克隆抗體#8的 同種型。利用亞同種型試劑盒(sub-isotyping kit) (C0DM0 BIO公司制)，按照其附帶的說(shuō) 明書(shū)，評(píng)價(jià)雜交瘤株#8的培養(yǎng)上清液，結(jié)果判斷抗CD179b單克隆抗體#8為IgG3。實(shí)施例4 抗⑶179b單克隆抗體#8的抗腫瘤效果(1)抗CD179b單克隆抗體#8的制備利用雜交瘤SFMdnvitrogen公司制)培養(yǎng)雜交瘤株#8。將培養(yǎng)液在1500rpm下 離心IOmin后，通過(guò)0.22 μ m的過(guò)濾器系統(tǒng)?？贵w的純化使用Hitrap ProteinA Sepharose FF(GE Healthcare公司制)柱。用PBS清洗柱子，平衡。接著，將培養(yǎng)上清導(dǎo)入柱子，之后 用PBS進(jìn)行清洗。用0. IM甘氨酸-HCl (pH2. 5)進(jìn)行洗脫，得到純化抗體。(2)生物體外(細(xì)胞水平)的抗腫瘤效果ADCC 活性研究了抗⑶179b單克隆抗體#8是否能夠損傷表達(dá)人⑶179b的腫瘤細(xì)胞。將IO6 個(gè)確認(rèn)到人⑶179b表達(dá)的人白血病細(xì)胞即Namalwa收集至50ml容量的離心管中，加入 100 μ Ci鉻51，在37°C下培育2小時(shí)。之后，用含有10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基清洗3次， 向96孔V底板的每1個(gè)孔中各加入IO3個(gè)。向孔中加入2μ g抗⑶179b單克隆抗體#8， 進(jìn)一步分別加入2X IO5個(gè)從小鼠的脾臟分離得到的淋巴細(xì)胞，在37°C、5% CO2的條件下培 養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)后，測(cè)定由受到損傷的腫瘤細(xì)胞釋放的培養(yǎng)上清中的鉻51的量，算出由抗 ⑶179b單克隆抗體#8產(chǎn)生的對(duì)于Namalwa細(xì)胞的ADCC活性。結(jié)果，確認(rèn)了對(duì)于Namalwa 的ADCC活性分別為60.6%。另一方面，使用同種型對(duì)照(克隆名ME07)進(jìn)行同樣的操作， 結(jié)果沒(méi)有檢測(cè)出上述活性。因此，表明抗CD179單克隆抗體#8因ADCC活性而可以損傷表達(dá)⑶179b的腫瘤細(xì)胞。CDC 活性將從兔采集的血液放入Eppendorf管中，在室溫下靜置60分鐘后，在3000rpm下 離心分離5分鐘，由此制備測(cè)定⑶C活性用血清。將IO6個(gè)人白血病細(xì)胞即Namalwa收集 到50ml容量的離心管中，加入100 μ Ci鉻51，在37°C下培育2小時(shí)后，用含有10%胎牛血 清的RPMI培養(yǎng)基清洗3次。之后，將其用含有50%上述制備的兔血清的RPMI培養(yǎng)基懸浮， 向96孔V底板的每1個(gè)孔中各加入IO3個(gè)。向孔中加入2 μ g抗⑶179b單克隆抗體#8，在 37°C,5% CO2的條件下培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)后，測(cè)定由受到損傷的腫瘤細(xì)胞釋放的培養(yǎng)上清 中的鉻51的量，算出由抗⑶179b單克隆抗體#8產(chǎn)生的對(duì)于Namalwa細(xì)胞的⑶C活性。結(jié) 果，確認(rèn)了對(duì)于Namalwa的⑶C活性為30. 5%。另一方面，使用同種型對(duì)照(克隆名ME07) 進(jìn)行同樣的操作，結(jié)果沒(méi)有檢測(cè)出上述活性。因此，表明抗CD179b單克隆抗體#8因CDC活 性而可以損傷表達(dá)⑶179b的腫瘤細(xì)胞。(3)小鼠生物體內(nèi)的抗腫瘤效果評(píng)價(jià)抗CD179b單克隆抗體#8在罹癌小鼠生物體內(nèi)的抗腫瘤活性。使用的抗體與 上述同樣地，使用柱純化雜交瘤株#8的培養(yǎng)上清的抗體。使用移植了表達(dá)⑶179b的來(lái)自人的癌細(xì)胞株的罹癌小鼠，評(píng)價(jià)抗⑶179b單克隆 抗體#8的抗腫瘤活性。向20只裸鼠(BALB/c Slc-nu/nu,來(lái)自日本SLC公司)的背部皮 下移植Namalwa細(xì)胞，每1只IO6個(gè)，使腫瘤生長(zhǎng)直到直徑變?yōu)?mm左右的大小。其中，對(duì) 于10只罹癌小鼠，每1只分別尾靜脈給與從BALB/c小鼠(BALB/c Cr Slc，來(lái)自日本SLC公 司)的末梢血分離的IO7個(gè)淋巴細(xì)胞，及300yg抗⑶179b單克隆抗體#8。之后，對(duì)各罹癌 小鼠尾靜脈給與等量的小鼠淋巴細(xì)胞及抗體，2日共3次，每天測(cè)量腫瘤的大小，由此評(píng)價(jià) 抗腫瘤效果。另一方面，對(duì)于剩余10只罹癌小鼠，給與PBS (-)來(lái)代替上述抗體，將其作為對(duì) 照組。本研究的結(jié)果為給與抗CD179b抗體的組，設(shè)定開(kāi)始給與抗體時(shí)的腫瘤體積為100% 時(shí)，第8天腫瘤縮小到65%，在第11天、第17天、第20天，腫瘤分別縮小到52^^45^^35% (參見(jiàn)圖2、。另一方面，在對(duì)照組中，在第8天、第11天、第17天、第20天，腫瘤分別增大 到約180%、220%、350%、420% (參見(jiàn)圖2)。該結(jié)果表明獲得的抗CD179b單克隆抗體#8 對(duì)表達(dá)CD179b的癌細(xì)胞在生物體內(nèi)發(fā)揮了強(qiáng)的抗腫瘤效果。需要說(shuō)明的是，腫瘤的大小使 用長(zhǎng)徑X短徑X短徑X0. 5的計(jì)算式，算出體積。實(shí)施例5 抗⑶179b單克隆抗體#8的可變區(qū)基因的克隆從雜交瘤株#8中提取mRNA，通過(guò)使用對(duì)小鼠·前導(dǎo)序列及IgG3的抗體恒定區(qū)具 有特異性的引物的RT-PCR法，獲得抗⑶179b單克隆抗體#8的重鏈可變(VH)區(qū)及輕鏈可 變(VL)區(qū)的基因。為了確定序列，將上述基因克隆到pCR2. 1載體anvitrogen公司制) 上。(I)RT-PCR使用mRNA micro purification kit (GE Healthcare 公司制)，由 IO6 個(gè)雜交瘤株 #8 制備mRNA，使用 Superscript II 1st strandsynthesis kit (Invitrogen 公司制)，逆轉(zhuǎn) 錄得到的mRNA，合成cDNA。所述操作按照各試劑盒附帶的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。使用得到的cDNA，利用PCR法進(jìn)行抗體基因的擴(kuò)增。為了獲得VH區(qū)的基因，使用 對(duì)小鼠 前導(dǎo)序列具有特異性的引物(序列號(hào)112)及對(duì)小鼠IgG3恒定區(qū)具有特異性的引物(序列號(hào)113)。另外，為了獲得VL區(qū)的基因，使用對(duì)小鼠·前導(dǎo)序列具有特異性的引物 (序列號(hào)114)及對(duì)小鼠κ鏈恒定區(qū)具有特異性的引物(序列號(hào)115)。上述引物參考Jones ST and Bending MM Bio/technology9,88-89 (1991)設(shè)計(jì)。PCR使用 Εχ-taq (TAKARA BIO 公 司制)。向 5μ 110ΧΕΧ Taq Buffer, 4 μ 1 dNTP Mixture O. 5mM)、各 2 μ 1 引物(1· 0 μ Μ)、 0. 25μ 1 Ex taq(5units/y 1)中加入cDNA試樣，用滅菌水加到總量為50 μ 1。在94°C下處 理2分鐘后，在30個(gè)下述循環(huán)的條件下進(jìn)行，所述循環(huán)為在94°C變性1分鐘、在58°C退火 30秒、在72°C延伸反應(yīng)1分鐘的組合。(2)克隆使用上述所得的各PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，切除VH區(qū)及VL區(qū)的各DNA 帶。DNA片段使用QIAquick Gel purification kit (QIAGEN公司制)，按照其附帶的說(shuō)明 書(shū)進(jìn)行。使用TA克隆試劑盒anvitrogen公司制)將經(jīng)純化的各DNA克隆到pCR2. 1載體 上。按照常規(guī)方法將連接的載體用于進(jìn)行DHfe感受態(tài)細(xì)胞(Τ0Υ0Β0公司制)的轉(zhuǎn)化。在 37°C下，將各轉(zhuǎn)化體的10個(gè)克隆分別在培養(yǎng)基(100yg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)一晚后，使 用 Qiaspin Miniprep kit (QIAGEN 公司制)純化各質(zhì)粒 DNA。(3)序列確定VH區(qū)及VL區(qū)的基因序列解析如下進(jìn)行使用M13正向引物(序列號(hào)116)及M13 反向引物(序列號(hào)117)解析O)的質(zhì)粒DNA，利用熒光序列分析儀(ABI公司制DNA序列 分析儀3130XL)，使用ABI公司制的BigDye終止子ver3. 1循環(huán)測(cè)序試劑盒，按照其附帶的 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。結(jié)果，確定了各個(gè)基因序列(在各10克隆中一致)?？笴D179b單克隆抗體 #8VH區(qū)的氨基酸序列如序列號(hào)105所示，VL區(qū)的氨基酸序列如序列號(hào)109所示。產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明的抗體對(duì)癌的治療及/或預(yù)防有用。序列表正文序列號(hào)94、96 99 引物序列號(hào)95:T7引物序列號(hào)100及101 =GAPDH引物序列號(hào)116及117 引物
權(quán)利要求
1.一種用于癌的治療及/或預(yù)防的藥物組合物，其特征在于，含有抗體或其片段作為 有效成分，所述抗體具有與CD179b蛋白質(zhì)或其含有7個(gè)以上連續(xù)的氨基酸的片段的免疫反 應(yīng)性，所述CD179b蛋白質(zhì)包含序列號(hào)3表示的氨基酸序列、或與所述氨基酸序列有60%以 上序列同源性的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中，所述癌為乳癌、白血病或淋巴瘤。
3.如權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物，其中，所述抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中，所述抗體為人抗體、人源化抗 體、嵌合抗體、單鏈抗體或雙重特異性抗體。
5.一種抗體，包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，且具有與⑶179b蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)性， 所述重鏈可變區(qū)含有序列號(hào)103、104及102的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)含有序列號(hào) 106、107及108的氨基酸序列。
6.一種抗體，包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，且具有與⑶179b蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)性， 所述重鏈可變區(qū)含有序列號(hào)105的氨基酸，所述輕鏈可變區(qū)含有序列號(hào)109的氨基酸。
7.如權(quán)利要求5或6所述的抗體，為人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體或雙重特異性抗體。
8.如權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中，所述抗體為權(quán)利要求5 7中 任一項(xiàng)所述的抗體
9.一種使用權(quán)利要求5 7中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段治療及/或預(yù)防癌的方法， 所述抗體具有與CD179b蛋白質(zhì)或其含有7個(gè)以上連續(xù)的氨基酸的片段的免疫反應(yīng)性，所述 CD179b蛋白質(zhì)包含序列號(hào)3表示的氨基酸序列、或與所述氨基酸序列有60%以上序列同源 性的氨基酸序列。
10. 一種多肽，含有序列號(hào)105的氨基酸序列。
11. 一種多肽，含有序列號(hào)109的氨基酸序列。
12. —種重鏈⑶R多肽，選自序列號(hào)103、104及102的氨基酸序列。
13. —種輕鏈⑶R多肽，選自序列號(hào)106、107及108的氨基酸序列。
14. 一種DNA，所述DNA編碼權(quán)利要求10 13中任一項(xiàng)所述多肽。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抗體或其片段，該抗體或其片段可以作為用于癌的治療及/或預(yù)防的藥物組合物使用，所述抗體具有與多肽的免疫反應(yīng)性，所述多肽含有CD179b蛋白質(zhì)的7個(gè)以上連續(xù)的氨基酸，所述CD179b蛋白質(zhì)被鑒定為在癌細(xì)胞表面特異性表達(dá)的癌抗原蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102089004SQ200980126629
公開(kāi)日2011年6月8日 申請(qǐng)日期2009年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月10日
發(fā)明者井戶隆喜, 岡野文義, 齋藤孝則, 清水正樹(shù) 申請(qǐng)人:東麗株式會(huì)社