專利名稱：生物活性劑的囊封方法
生物活性劑的囊封方法
背景技術：
很多藥物在大腦或眼中的靶標處具有活性，為了使這些藥物到達它們的靶標，它 們必須穿過生物屏障，如血腦屏障。雖然一些分子能夠通過生物屏障，但是還有一些不能有 效或事實上根本不能穿過這些屏障的其它分子。許多藥物也僅僅當直接進入靶標組織時才 有效，且如果不能到達這個靶標組織，藥物實際上也不能起作用。因此，由于不能穿過這樣 的生物屏障，很多可能有效的藥物不能在臨床上使用。現(xiàn)有技術中已記述了很多方法以增強藥物穿透這些生物屏障的能力。一種方法是改變屏障本身的功能。例如，滲透劑或擬膽堿藥物檳榔堿類 (cholinomimetic arecolines)，其能打開血腦屏障或者改變血腦屏障的穿透性(Saija A 等人，J Pharm. Pha. 42 135-138 (1990))。其它的方法是修飾藥物分子本身。例如，修飾蛋白以試圖穿過血腦屏障，包括使這 些蛋白糖基化或者形成前藥(W0/2006/029845)。還有另一方法是植入可控制釋放的聚合物，其從基質(zhì)系統(tǒng)直接將活性成分釋放進 入神經(jīng)組織。然而，如果直接植入大腦或骨髓，這種方法是浸入性的且需要外科手術介入 (sable等人，美國專利4，833，666)，這存在的問題是需要病人的同意，且通常僅僅是在大 腦內(nèi)隨給予的藥物一起進行定位輸送，通常很快被排出(W0/2006/(^9845)。為了克服這些局限，人們使用了藥物載體系統(tǒng)，然而，靶標的藥物傳輸?shù)闹饕獑?題是通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(REQ尤其是通過肝和脾的巨噬細胞的注射的載體的快速調(diào)理 (opsonisation)禾口攝取。因此，仍然需要一種有效的方法，以將大分子(如蛋白質(zhì))輸送到大腦和眼中。具 體而言，需要找到一種將大分子穿過血腦屏障的方法，所述大分子在進入大腦時仍能保留 活性，以及還能提供所需要的釋放動力學，保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定和活性，且能夠回避清除機 制。


圖1所示為通過動態(tài)光散射(DLS)從納米粒子制劑中獲得的粒度數(shù)據(jù)，表明在懸 液中有通過空心法制備的納米粒子存在。圖1 (a)所示為通過動態(tài)光散射對納米粒子懸液分析之后獲得的相關圖。圖1(b)所示為納米粒子的多模態(tài)粒度分布(導出數(shù)據(jù))，繪圖以說明相對于粒度 范圍的粒子群(數(shù)量)的分布。圖1(c)所示為所示為納米粒子的多模態(tài)粒度分布(導出數(shù)據(jù))，繪圖以說明相對 于粒度范圍的粒子群(數(shù)量)的分布。圖1(d)所示為所示為納米粒子的多模態(tài)粒度分布(導出數(shù)據(jù))，繪圖以說明相對 于粒度范圍的粒子群(數(shù)量)的分布。圖2所示為經(jīng)SEM分析的納米粒子。圖3所示為經(jīng)TEM的空心納米粒子的圖像，以及用于比較的固態(tài)PBCA納米粒子的疊加圖像。圖4所示為單克隆IgGl (抗-⑶23)的囊封效果的測量結果。圖5所示為粒子的酶降解和通過ELISA的釋放的酶的分析之后得到的釋放曲線。圖6所示為通過二喹啉甲酸測定(BCA測定)在空心PBCA納米粒子中測得的域抗 體(雞蛋溶菌酶dAb)的囊封效果曲線。圖7所示為為單克隆IgGl (抗-⑶23)的囊封效果的測量結果。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明的一個方面中，提供一種在微粒載體中囊封生物活性劑的方法，如在納 米粒子中，或納米粒子中和上，或用納米粒子囊封蛋白和/或肽的方法，和通過在納米粒子 中，或納米粒子中和上，或用納米粒子囊封以輸送蛋白和/或肽穿過血腦屏障的方法，以及 通過在微粒載體中，或微粒載體中和上，或用微粒載體囊封以將蛋白和/或肽輸送到眼中 的方法。在本發(fā)明的另一實施方式中，提供一種微粒載體，其包括粒子形成物質(zhì)和生物活 性劑如蛋白和/或肽，以將蛋白和/或肽從血液穿過血腦屏障輸送到腦或輸送到眼中。在 本發(fā)明的再一實施方式中，提供納米粒子的組合物以及它們在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)和/或眼 的疾病或病癥中的用途。發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種包括粒子形成物質(zhì)和生物活性劑的微粒載體，以及所述微粒載體 的制備方法。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種包括在空腔的水相中的生物活性劑的聚合物 微粒載體。在本發(fā)明的另一實施方式中，其提供在微粒載體中囊封生物活性劑以用于眼輸送 的方法，該方法包括以下步驟a)在有機溶劑中溶解聚合物以形成聚合物溶液；b)將含有生物活性劑的水溶液加入到聚合物溶液中以形成在連續(xù)有機相中的水 相液滴的初級乳液；c)使初級乳液與水介質(zhì)混合形成W/0/W乳液；以及d)使有機相蒸發(fā)，并藉此得到包含空腔的微粒載體，所述空腔含有在水相中的所 述生物活性劑。在本發(fā)明的另一實施方式中，眼輸送是在眼周進行的，例如經(jīng)鞏膜、結膜下、筋膜 下、眼球周圍、局部的、球后的或輸送到下、上或側直肌中。在一個實施方式中，眼輸送是經(jīng) 鞏膜輸送?？梢灾鲃踊虮粍拥厥褂袡C相蒸發(fā)。例如，主動蒸發(fā)可以通過使用加熱的方式蒸發(fā)。在本發(fā)明的另一實施方式中，其提供一種用于將蛋白輸送到血腦屏障的納米粒子 的制備方法，其包括以下步驟a)在有機溶劑中溶解聚合物以形成聚合物溶液；b)將含有蛋白的水溶液加入到聚合物溶液中以形成在連續(xù)有機相中的水相液滴 的初級乳液；
c)使初級乳液與水介質(zhì)混合形成W/0/W乳液；以及d)使有機相蒸發(fā)，并藉此得到包含空腔的納米粒子，所述空腔含有在水相中的所 述蛋白?？梢灾鲃踊虮粍拥厥褂袡C相蒸發(fā)。例如，主動蒸發(fā)可以通過使用加熱的方式蒸發(fā)。在又一實施方式中，用于上述任一方法中的聚合物選自但不限于以下物質(zhì) 聚-L-交酯(PLA)、聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLG)、聚交酯、聚己酸內(nèi)酯、聚羥基丁 酸酯和/或其共聚物。合適的粒子形成物質(zhì)包括但不限于聚二烯烴如聚丁二烯等；聚烯 烴如聚乙烯、聚丙烯等；聚丙烯酸類如聚丙烯酸等；聚甲基丙烯酸類如聚甲基丙烯酸甲酯、 聚甲基丙烯酸羥乙酯等；聚乙烯醚類、聚乙烯醇類、聚乙烯酮類、聚乙烯基鹵化物如聚氯 乙烯等；聚乙烯腈類；聚乙烯酯類如聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡啶如聚O-乙烯基-吡啶)、 聚(5-甲基-2-乙烯吡啶)等；聚苯乙烯類；聚碳酸酯類；聚酯類；聚原酸酯；聚酯酰胺 (polyesterarnides)；聚酸酐類；聚氨酯類；聚酰胺類；纖維素醚類如甲基纖維素、羥乙基 纖維素、羥丙基甲基纖維素等；纖維素酯類如醋酸纖維素、鄰苯二甲酸醋酸纖維素、醋酸丁 酸纖維素等；多糖、蛋白質(zhì)、凝膠、淀粉、膠、樹脂等等。這些材料可單獨使用，作為物理混合 物(共混物)或作為共聚物。還共混聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丁基氰基丙烯酸酯、 聚烷基氰基丙烯酸酯、聚芳基酰胺、聚酸酐、聚原酸酯、N，N-L-賴氨酸二基對苯二甲酸酯、聚 酸酐、去溶劑化的生物活性劑或碳水化合物、多糖、聚丙烯醛、聚戊二醛及其衍生物、共聚物 和聚合物。在本發(fā)明的另一實施方式中，其提供一種通過制備微粒載體以囊封生物活性劑的 方法，包括以下步驟a)在有機溶劑中溶解聚氰基丙烯酸丁酯(PBCA)以形成聚合物溶液；b)將含有生物活性劑的水溶液加入到聚合物溶液中以形成在連續(xù)有機相中的水 相液滴的初級乳液；c)使初級乳液與水介質(zhì)混合形成W/0/W乳液；以及d)使有機相蒸發(fā)，并藉此得到包含空腔的粒子載體，所述空腔含有在水相中的所 述生物活性劑。可以主動或被動地使有機相蒸發(fā)。例如，主動蒸發(fā)可以通過使用加熱的方式蒸發(fā)。在本文所述的方法的又一實施方式中，步驟(d)還包括加入形成凝膠的聚合物。 在再一實施方式中，形成凝膠的聚合物是瓊脂糖。在一個實施方式中，本發(fā)明的微粒載體包含生物活性劑如蛋白或肽。所述蛋白可 以是抗原結合分子，本文中使用的抗原結合分子是指抗體、抗體片段和能夠結合靶標的其 它蛋白結構。抗原結合分子可包括域(domain)。“域”是折疊的蛋白結構，具有獨立于余下的蛋 白的三級結構。一般地，域負責蛋白的離散的功能特性，在很多的情況下可加入、移除或轉移到其 它的蛋白上，而不會損失該蛋白和/或域的余下部分的功能。“單抗體可變域”是折疊的多肽 域，其包括抗體可變域的序列特征。因此，它包括完整的抗體可變域和修飾的可變域，例如， 其中的一個或多個環(huán)已經(jīng)被非特征性的抗體可變域的序列取代，或者被截短或包括N或C 末端延伸部分的抗體可變域取代，以及被可變域的折疊片段取代，所述折疊片段至少保留全長域的結合活性和特異性?？乖Y合分子可包括至少一個免疫球蛋白可變域，例如，這些分子可包括抗體、域 抗體、Fab、Fab'、F(ab' ) 2、Fv、kFv、雙特異抗體、異源結合抗體。這些抗原結合分子能 結合單個的靶標，或可以是多特異性的，即結合多個靶標，如它們可以是雙特異性的或三特 異性的。在一個實施方式中，所述抗原結合分子是抗體。在另一實施方式中，所述抗原結合 分子是域抗體(dAb)。在又一實施方式中，所述抗原結合分子可以是抗體和抗原結合片段 的組合物，例如連接到單克隆抗體的一個或多個dAb和/或一個或多個kFv。在又一實施 方式中，所述抗原結合分子可以是抗體和肽的組合物。抗原結合分子可包括至少一個非Ig 結合域，例如特異性地結合獨立于不同V區(qū)或域的抗原或表位的域，這可以是dAb，例如人、 駱駝或鯊魚的免疫球蛋白單可變域，或者它可以是這樣的域，其選自以下的支架的衍生物 CTLA-4(Evibody)、脂籠蛋白(Lipocalin)、蛋白A衍生的分子如蛋白A的Z-域(親和蛋白 體，SpA)、A-域(Avimer/Maxibody)、熱休克蛋白如GeoEI和GroES、轉鐵蛋白(穿膜抗體)、 錨蛋白重復蛋白(DARPin)、肽適體、C型凝集素域(四連接素)、人晶體蛋白和人泛素(親 和物)、PDZ域、人蛋白酶抑制劑的的蝎毒kimitz型域、以及纖連蛋白(adnectin)；其已經(jīng) 用于蛋白工程，以便使其與配體而非與天然的配體結合。CTLA_4(細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4)是主要在⑶4+T細胞上表達的⑶觀家族 受體。它的胞外域是可變域狀的Ig折疊。對應于抗體的CDR的環(huán)可用異源序列取代，以賦 予不同的結合特性。業(yè)已知道，經(jīng)工程改造成具有不同結合特性的CTLA-4分子是Evibody。 進一步詳細的內(nèi)容請參見免疫學方法雜志248 (1-2)，31-45 (2001)。脂籠蛋白是轉運小疏水分子如類固醇、后膽色素、類視黃醇和脂質(zhì)的胞外蛋白家 族。它們具有剛性折疊的二極結構，其在圓錐形結構的開始端具有很多的環(huán)，可以經(jīng)工程 改造以結合不同的靶標抗原。Anticalin的大小在160-180個氨基酸之間，并源自脂籠蛋 白。進一步詳細的內(nèi)容參見 Biochim Biophys Actal482 :337-350 (2000)，US7250297B1 和 US20070224633。親和體是源自能經(jīng)工程改造以結合抗原的金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)的蛋白A的支架。該域由三螺旋束的約58個氨基酸組成。通過表面殘基的隨機化產(chǎn) 生庫。進一步詳細的內(nèi)容參見 Protein Eng. Des. Sel. 17，455-462 (2004)和 EP1641818A1。Avimer是源自A-域支架家族的多域蛋白。約35個氨基酸的天然域采用限定的 二硫化物鍵合結構。通過慢慢移動由A域家族展現(xiàn)的天然變異可產(chǎn)生多種變化。進一步 詳細的內(nèi)容參見 Nature Biotechnology 23 (12)，1556-1561 (2005)和 Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6)，909—917U007 年 6 月)。轉鐵蛋白是單體血清轉運糖蛋白。通過在允許的表面環(huán)中插入肽序列，轉鐵蛋白 可以經(jīng)工程改造以結合不同的靶標抗原。工程改造的轉鐵蛋白支架的例子包括穿膜抗體 (trans-body)。進一步詳細的內(nèi)容參見 J. Biol. Chem 274，24066-24073 (1999)。設計的錨蛋白重復蛋白(DARPin)源自錨蛋白，其為一種蛋白家族，用于將整合膜 蛋白的附屬部分介導至細胞骨架上。單個的錨蛋白重復是由雙螺旋和a轉角組成的33個 殘基基序。通過隨機化每個重復的第一螺旋和轉角中的殘基，它們可經(jīng)改造以結合不 同的靶標蛋白。通過增加單元的數(shù)量(親和力成熟的方法)，可增加結合界面。進一步詳 細的內(nèi)容參見 J. Mol. Biol. 332，489-503 (2003)，PNAS 100 (4)，1700—1705 (2003)和 J. Mol.Biol. 369，1015-1028(2007)以及 US20040132028A1。纖連蛋白是一種能改造以結合抗原的支架。Adnectin由人的III型纖連蛋白 (FN3)的15個重復單元的第十域的天然氨基酸序列的主鏈組成。夾心結構的一端的三個環(huán) 可改造成使Adnectin特異性地識別感興趣的治療靶標。進一步詳細的內(nèi)容參見ftOtein Eng. Des. Sel. 18，435-444 (2005)、US20080139791、W02005056764 和 US6818418B1。肽適體是由連續(xù)的支架蛋白組成的組合識別分子，一般是含有在活性位點插入 的限制性的可變肽環(huán)的硫氧還蛋白(TrxA)。進一步詳細的內(nèi)容參見Expert Opin. Biol. Ther. 5,783-797(2005)。微體源自天然生成的長度為25-50個氨基酸的微蛋白，包含3-4個半胱氨酸橋，微 蛋白的例子包括KalataBl和芋螺毒素(conotoxin)和結蛋白(knottins)。微蛋白具有能 夠改造成包括多達25個氨基酸的環(huán)，且不影響微蛋白的整體折疊。改造的結蛋白域的進一 步詳細內(nèi)容，參見W02008098796。其它的非Ig結合域包括已用作支架以改造不同靶標抗原結合特性的蛋白，包括 人晶體蛋白和人泛素(親和結合體)，人蛋白酶抑制劑的kimitz型域、Ras-結合蛋白AF-6 的PDZ域、蝎毒素(北非蝎毒素)，C型凝集素域(四連蛋白)，其在Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007，Stefan Dubel 編輯)的第 7 章禾口 Protein Science 15 =14-27(2006)中有綜述。本發(fā)明的非Ig結合域可源自任意的這些可 替代的蛋白域。在本發(fā)明的進一步的實施方式中，抗原結合分子結合到在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的 靶標中，例如腦或脊髓中或者例如神經(jīng)組織中。在本文描述的本發(fā)明的再一實施方式中，抗原結合分子特異性地結合到已知與神 經(jīng)疾病或病癥相關的靶標中，例如MAG (髓鞘相關糖蛋白)、N0G0 (神經(jīng)突起生長抑制蛋白) 或淀粉樣蛋白。這些抗原結合分子包括能夠結合N0G0 (如抗-N0G0抗體)的抗原結合分子。用于 本發(fā)明的的抗-N0G0抗體的一個例子是由SEQ ID NO 1的重鏈和SEQ ID NO 2的輕鏈限定 的抗體，或包含SEQ ID NO 1和2所示的抗體的⑶R的抗-N0G0抗體或其抗原結合片段。該 抗體0E8L16)的進一步詳細的內(nèi)容可在PCT申請W02007068750中找到，其內(nèi)容納入本文 中作為參考。這種抗原結合分子包括能夠結合MGA (如抗-MGA抗體)的抗原結合分子。用于本 發(fā)明的抗-MGA抗體的一個例子是由SEQ ID NO 11的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 12的輕鏈 可變區(qū)限定的抗體，或包含SEQ ID NO 1和2所示的抗體的⑶R的抗-MGA抗體或其抗原結 合片段。該抗體(BvHICvLl)的進一步詳細的內(nèi)容可在PCT申請W02004014953中找到，其 內(nèi)容納入本文中作為參考。這種抗原結合分子包括能夠結合β -淀粉樣蛋白(如抗β -淀粉樣蛋白抗體)的 抗原結合分子。用于本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白抗體的一個例子是由SEQ ID NO 5的重 鏈和/或SEQ ID NO 6的輕鏈限定的抗體，或包含SEQ ID NO 5和7所示的抗體的⑶R的 抗-β-淀粉樣蛋白抗體或其抗原結合片段。該抗體(H2L1)的進一步詳細的內(nèi)容可在PCT 申請W02007113172中找到，其內(nèi)容納入本文中作為參考。用于本發(fā)明的可替代的抗β -淀 粉樣蛋白抗體是由SEQ ID NO 7的重鏈和/或SEQ ID NO 8的輕鏈限定的抗體，或包含SEQID NO 7和8所示的抗體的⑶R的抗-淀粉樣蛋白抗體或其抗原結合片段。這種抗體的CDR序列可由以下方法確定Kabat編號系統(tǒng)(Kabat等人Jequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987)、Chothia 編號系統(tǒng)(Al-Lazikani 等人，(1997) JMB 273,927-948)、接觸定義方法(MacCallum R. Μ.，和 Martin Α. C. R.和 Thornton J. Μ, (1996)，Journal of Molecular Biology, 262 (5), 732-745)或本領域的技 術人員已知的對抗體的殘基編號并確定CDR的任何其它確定的方法。在本發(fā)明的一個實施方式中，該抗原結合蛋白結合到眼中的靶標中，例如TNF、 TNFr-l、TNFr-2、TGF3 受體-2、VEGF、N0G0、MAG、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL_17、CD20、β -淀 粉樣蛋白、FGF-2、IGF-I、PEDF、PDGF 或補體因子，如 C3、C5、C5aR、CFD、CFH、CFB、CFI、sCRl 或C3。在本發(fā)明的一個實施方式中，該抗原結合蛋白結合VEGF。在本發(fā)明的另一個可替 代的實施方式中，該抗原結合蛋白結合淀粉樣蛋白。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述微粒載體可以是微球體或納米粒子。在一個這 樣的實施方式中，所述微粒載體是納米粒子，且生物活性劑是蛋白。在另一實施方式中，所 述微粒載體是納米粒子，且生物活性劑是肽。在又一實施方式中，所述微粒載體是納米粒 子，且生物活性劑包括抗原結合分子，如域抗體或抗體。在又一實施方式中，所述微粒載體 是納米粒子，且生物活性劑包含域。在另一實施方式中，所述微粒載體是微球體，且生物活 性劑是蛋白。在又一實施方式中，所述微粒載體是微球體，且生物活性劑是肽。在又一實施 方式中，所述微粒載體是微球體，且生物活性劑包含抗原結合分子，如域抗體或抗體。在再 一實施方式中，所述微粒載體是微球體，且生物活性劑包含域。在本發(fā)明的一個實施方式中，其提供包括本發(fā)明所述的任一種方法制備的納米粒 子的組合物。在另一實施方式中，當用動態(tài)光散射技術測量時，數(shù)量上至少約90%的納米粒 子在約Inm-約IOOOnm之間的范圍內(nèi)。在又一實施方式中，當用動態(tài)光散射技術測量時，數(shù) 量上至少約90%的納米粒子在約Inm-約400nm之間，或約Inm-約250nm之間，或約Inm-約 150nm之間，或約40nm_約250nm之間，或約40nm_約150nm之間，或約40nm_約IOOnm之間 的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的又一實施方式中，當用動態(tài)光散射技術測量時，數(shù)量上至少約90%的 納米粒子在約40nm-約250nm之間的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的又一實施方式中，當用動態(tài)光散射技術測量時，數(shù)量上至少約90%的 納米粒子在約40nm-約150nm之間的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的又一實施方式中，其提供一種包括本發(fā)明的納米粒子的組合物，其中 當用動態(tài)光散射技術測量時，組合物中的納米粒子的粒徑中間值小于約lOOOnm，例如粒徑 小于約400nm，例如粒徑小于約250nm，例如粒徑小于約150nm。在另一實施方式中，組合物中的納米粒子的粒度中間值為約40nm-約250nm。在另一實施方式中，組合物中的納米粒子的粒度中間值為約40nm-約150nm。在本發(fā)明的一個實施方式中，其提供包括本發(fā)明所述的任一種方法制備的微球體 的組合物。在另一實施方式中，當用小角激光光散射技術測量時，數(shù)量上至少約90%的微球 體的直徑在約1 μ m-約100 μ m之間的范圍內(nèi)。在又一實施方式中，當用小角激光光散射技 術測量時，數(shù)量上至少約90%的粒子在約1 μ m-約80 μ m之間，或在約1 μ m_約60 μ m之間，或在約1 μ m-約40 μ m之間，或在約1 μ m_約30 μ m之間，或在約1 μ m_約10 μ m之間 的范圍內(nèi)。在另一實施方式中，當用小角激光光散射技術測量時，數(shù)量上至少約90%的微球 體在約1 μ m-約60 μ m之間的范圍內(nèi)。在另一實施方式中，當用小角激光光散射技術測量時，數(shù)量上至少約90%的微球 體在約1 μ m-約30 μ m的范圍之間。在本發(fā)明的又一實施方式中，其提供一種包括本發(fā)明的微球體的組合物，其中當 用小角激光光散射技術測量時，組合物中的微球體的直徑的粒度中間值小于約100 μ m，例 如直徑小于約80 μ m,例如直徑小于約60 μ m,例如直徑小于約40 μ m。在另一實施方式中，組合物中微球體的粒度中間值為約1 μ m-約6 μ m或1 μ m-約 30 μ m0在本發(fā)明的又一實施方式中，所述微粒載體在超過至少3個月或更長的時間內(nèi)， 或長達6個月內(nèi)或更長的時間或者長達12個月內(nèi)或更長的時間內(nèi)持續(xù)釋放治療量的活性 生物分子。在一個實施方式中，蛋白與聚合物的重量比可以是0.5% -50%，例如是至少約 0. 5%，或至少約1%，或至少約2%，或至少約5%，或至少約7%，或至少約10%，或至少約 11%,或至少約14%，或至少約20%，或至少約40%，或至少約50%。例如，當?shù)鞍资请臅r， 該肽與聚合物的比率可以是至少約11，當?shù)鞍资强贵w時，該抗體與聚合物的比率可以至少 是約14%，或當?shù)鞍资怯蚩贵w時，該域抗體與聚合物的比率可以至少是約11%。在本發(fā)明的一個實施方式中，粒子的囊封效率是至少約1%，或至少約2%，或至 少約10%，或至少約20%，或至少約40%，或至少約50%，或至少約60%，或至少約70%， 或至少約80 %，或至少約90 %，或至少約95 %，或至少約97 %，或至少約99 %。例如，當?shù)?白是肽時，囊封效率可以是至少約60%，當?shù)鞍资强贵w時，囊封效率可以是至少約90%，當 蛋白是域抗體時，囊封效率可以是至少約60 %。適合用于本發(fā)明的方法的有機溶劑的例子包括但不限于不溶于水的酯如乙酸乙 酯、乙酸異丙酯、乙酸正丙酯、乙酸異丁酯、乙酸正丁酯、異丁酸異丁酯、2-乙基乙酸己酯、乙 二醇二乙酸酯；不溶于水的酮如甲基乙基酮、甲基異丁基酮、甲基異戊基酮、甲基正戊基酮、 二異丁基酮；不溶于水的醛如乙醛、正丁醛、巴豆醛、二乙基己醛、異丁醛和丙醛；不溶于水 的醚酯如3-乙氧基丙酸乙酯；不溶于水的芳香烴如甲苯二甲苯和苯；不溶于水的鹵代烴如 1，1，1-三氯乙烷；不溶于水的乙醇醚酯如丙二醇單甲醚醋酸酯、乙二醇單乙醚醋酸酯、乙 二醇單丁醚醋酸酯、二乙二醇單丁醚醋酸酯；不溶于水的鄰苯二甲酸增塑劑如鄰苯二甲酸 二丁酯、鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二辛酯、對苯二甲酸二辛酯、辛 基鄰苯二甲酸丁酯、鄰苯二甲酸芐丁酯、鄰苯二甲酸烷基芐酯；不溶于水的增塑劑如己二酸 二辛酯、乙二醇二 -2-乙基己酸三乙烯酯、偏苯三酸三辛酯、三醋酸甘油酯、甘油基/三丙 酸菌素&1706巧1八1^ 1~叩101^11)、2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇二異丁酯、二氯甲烷、乙酸 乙酯或二甲基亞砜、四氯化碳、氯仿、環(huán)己烷、1，2-二氯乙烷、二氯甲烷、二乙醚、二甲基甲酰 胺、庚烷、己烷或其它的烴；甲基叔丁基醚、戊烷、甲苯、2，2，4_三甲基戊烷、1-辛醇及其異 構體或苯甲醇。在本發(fā)明的一個實施方式中，用于本發(fā)明的方法的溶劑選自二氯甲烷、乙酸乙酯或二甲基亞砜、四氯化碳、氯仿、環(huán)己烷、1，2-二氯乙烷、二氯甲烷、二乙醚、二甲基甲酰胺、 庚烷、己烷或其它的烴；甲基叔丁基醚、戊烷、甲苯、2，2，4-三甲基戊烷、1-辛醇及其異構體 或苯甲醇。本文所述的本發(fā)明的所有方面的微粒載體、包含它們的組合物或它們的制備方 法可進一步包括加入表面活性劑，其例如但不限于膽酸鈉、泊洛沙姆188(p0l0Xamer) (pluronic F68 ，或F127)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚山梨醇酯80、葡聚糖、泊洛沙姆、 poloxamines、多功能醇的羧酸酯類、烷氧基化醚類、烷氧基酯類、烷氧基化甘油單、二、三酯 類、烷氧基酚類以及聯(lián)苯酚類、乙氧基醚類、乙氧基酯類、乙氧基甘油三酸酯類、GenapolR 和BaukiR 系列的物質(zhì)、脂肪酸的金屬鹽、羧酸的金屬鹽、醇硫酸金屬鹽以及脂肪醇硫酸金 屬鹽和磺基琥珀酸金屬鹽以及兩種或更多種上述物質(zhì)的混合物。在又一實施方式中，表面活性劑選自膽酸鈉、泊洛沙姆188(plur0niCF68TM)、聚 乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚山梨醇酯80和葡聚糖。在本發(fā)明的一個實施方式中，其提供包含生物活性劑的微粒載體，其可由本發(fā)明 的任意方法制備。囊封在本發(fā)明的微粒載體和/或組合物內(nèi)的生物活性劑在它從微粒載體釋放時 保留至少一些生物活性，例如，當藥劑是結合的藥劑并對生物活性劑從粒子中釋放產(chǎn)生生 物應答時，該組合物中的一定比例的分子可保留至少一些結合它們的靶標的能力。可用合 適的生物結合測定測量這樣的結合，合適的測定的例子包括但不限于ELISA或Biacore 。 在另一實施方式中，當通過生物活性測定對粒子的釋放進行測量時，例如在一個實施方式 中通過ELISA或Biacore測量時，組合物保留至少50%它對靶標的親和力，或對靶標保留至 少70%或至少90%的親和力(Kd)。在一個實施方式中，組合物能夠在給藥的對象中引出治 療效果。本發(fā)明的組合物的生物活性可通過任意合適的測定進行測量，其測量的是囊封的 生物活性分子的活性。在本發(fā)明的一個實施方式中，其提供一種通過在納米粒子中囊封蛋白，以輸送蛋 白穿過患者的生物屏障如血腦屏障的方法。在另一實施方式中，所述患者是人。在本發(fā)明的一個實施方式中，其提供一種將在微粒載體(如微球體)中囊封的蛋 白輸送到哺乳動物(如人)的眼中的方法。在另一個實施方式中，其提供一種包含囊封在本文所述的本發(fā)明的微粒載體中的 生物活性劑的藥物組合物。在另一個實施方式中，其提供一種包含囊封在本文所述的本發(fā)明的微納米粒子中 的蛋白的藥物組合物。在另一個實施方式中，其提供一種藥物組合物，其包含囊封在本文所 述的微球體中的用于眼睛輸送的蛋白，以治療或預防眼疾。在另一個實施方式中，本發(fā)明的組合物可用來治療和/或預防涉及微粒載體穿過 血腦屏障的疾病或病癥。在另一個實施方式中，本文所述的本發(fā)明的組合物可用來治療和/或預防中樞神 經(jīng)系統(tǒng)的疾病或病癥，例如可用來治療和/或預防阿爾茨海默病、亨廷頓舞蹈癥、牛海綿狀 腦病、西尼羅河病毒性腦炎、神經(jīng)艾滋病、腦損傷、脊髓損傷、轉移性腦癌、多發(fā)性硬化、中 風。在另一個實施方式中，所述組合物可包含抗MAG-抗體，以治療和/或預防中風或神經(jīng)損傷。在另一個實施方式中，所述組合物可包含抗-NOGO-抗體，以治療和/或預防中風 或神經(jīng)損傷，或者例如治療或預防神經(jīng)退化性疾病如阿爾茨海默病。在另一個實施方式中，所述組合物可包含抗-淀粉樣蛋白抗體，以治療和/或 預防中風或神經(jīng)損傷，或者例如治療或預防神經(jīng)退化性疾病如阿爾茨海默病。在本文所述的本發(fā)明的一個實施方式中，所述微粒載體可通過腸胃外注射或輸 注、靜脈或動脈給藥的方式給予患者。在另一個實施方式中，本文所述的本發(fā)明的組合物可用來治療和/或預防眼睛疾 病或病癥。在另一個實施方式中，本文所述的本發(fā)明的組合物可用來治療和/或預防疾病， 其例如但不限于年齡相關的黃斑變性(新生血管/濕的)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜 脈閉塞癥、葡萄膜炎、角膜新生血管形成或青光眼。在另一個實施方式中，所述組合物可用來治療和/或預防AMD (年齡相關的黃斑變 性)，例如濕性AMD或干性AMD。在本發(fā)明的另一個實施方式中，其提供一種囊封在本文所述的納米粒子和/或微 球體中的生物活性劑，用作藥物。在本發(fā)明的一個實施方式中，其提供本文所述的本發(fā)明的組合物在制備治療和/ 或預防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的用途。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供本文所述的 本發(fā)明的組合物在制備治療和/或預防阿爾茨海默病的藥物中的用途。在又一個實施方式 中，本發(fā)明提供本文所述的本發(fā)明的組合物在制備治療和/或預防中風或神經(jīng)損傷的藥物 中的用途。在本發(fā)明另一個實施方式中，提供本文所述的本發(fā)明的組合物在制備治療或預防 眼病的藥物(如在制備治療和/或預防AMD的藥物)中的用途。本發(fā)明提供使用本發(fā)明的組合物治療和/或預防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法。在另 一個實施方式中，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的組合物治療阿爾茨海默病的方法。在另一個實 施方式中，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的組合物治療和/或預防中風或神經(jīng)損傷的方法。本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的組合物治療和/或預防眼病的方法。在另一個實施方 式中，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的組合物治療和/或預防AMD的方法。定義本文使用的術語“粒子形成的物質(zhì)”用來描述任意的能夠聚合的單體和/或寡聚 體，或能形成不溶于水性環(huán)境中的粒子的聚合物，如PBCA、PLGA。在未聚合時，該粒子形成 物質(zhì)可溶于有機溶劑中。本說明書全文使用的術語“微粒載體”包含納米粒子和微球體?！拔⑶蝮w”是由直 徑大于1 μ m的各種天然和合成的材料組成的粒子，而本文使用的“納米粒子”是亞微米級 的粒子，如I-IOOOnm0在一個實施方式中，本文使用的術語微粒載體、納米粒子和微球體具有載體結構， 其具有生物相容性且足以抵抗使用環(huán)境導致的化學和/或物理損壞，以至于在給藥進入人 或動物體之后，足量的粒子基本上保持完整，并能保持足夠的時間，以便能夠到達所需要的 靶器官或組織，如腦或眼睛。本文所使用的術語“生物活性劑”是用于表示當?shù)竭_它們應到的靶標時，該分子必須能夠至少部分具有生物活性的術語。為避免術語“生物活性劑”和“生物活性分子”在本 說明書全文中重復使用表示歧義，兩個術語表示相同的含義，且能夠互換。術語“溶解”定義為形成溶劑中的單獨分子形式的溶液，或形成液體懸液中的固 體，其形式為分子微小固體聚集塊懸浮于液體中。溶解過程也可以得到完全溶解的分子和 懸浮的固體聚集塊的混合物。整份說明書中所使用的用于在微粒載體中囊封的術語“蛋白”包括分子量至少為 llkDa、或至少12kDa、或至少50kDa、或至少lOOkDa、或至少150kDa或至少200kDa的蛋白。 囊封用的蛋白也可以有很長的長度，例如至少為70個氨基酸的長度或至少為100個氨基酸 的長度或至少為150個氨基酸的長度或至少為200個氨基酸的長度。整份說明書中所使用的用于在微粒載體中囊封的術語“肽”包括較短序列的氨基 酸，其分子量不大于約lOkDa、或不大于約8kDa、或不大于約5kDa、或不大于約2kDa或不大 于約IkDa或小于lkDa。囊封用的肽的長度不超過70個氨基酸的長度或不超過50個氨基 酸的長度或不超過40個氨基酸的長度、或不超過20個氨基酸的長度、或小于10個氨基酸 的長度。術語“眼周，，是指局部給藥至眼外周的位置，其包括但不限于“結膜下，，-結膜的 下面-在鞏膜上覆蓋整個眼球的的清澈的黏液膜；“筋膜下”-包裹眼睛的筋膜的下面但在 鞏膜外面；“眼球周圍”-眼球下的空間，其中眼球位于眼框中；“眼球后”-眼球正后方的空 間，鄰近視神經(jīng)；“脈絡膜上層”-鞏膜的下面，但在脈絡膜進入脈絡膜上層空間的外部；“經(jīng) 鞏膜”-該術語也用來指輸送通過，即從鞏膜的外部通過。短語“免疫球蛋白單可變域”是指特異性地結合到獨立于不同V區(qū)或域的抗原或 表位的抗體可變域(VH、VHH、VJ。免疫球蛋白單可變域可以與其它不同的可變區(qū)或可變域的 形式(例如同源或異源多聚體)存在，其中，通過單個免疫球蛋白可變域的抗原結合不需要 所述的其它的區(qū)或域(即免疫球蛋白單可變域獨立于其它的可變域結合抗原)。“域抗體” 或“dAb”與本文所使用的術語能夠結合抗原的“免疫球蛋白單可變域” 一致。免疫球蛋白 單可變域可以是人抗體可變域，但是也包括其它物種的單抗體可變域，如嚙齒目動物(例 如在WO 00/29004中揭示的鉸口鯊和駱駝Vhh dAbs)。駱駝Vra是源自包括駱駝、美洲駝、羊 駝、單峰駱駝和駱馬的物種的免疫球蛋白單可變域多肽，其產(chǎn)生天然地缺少輕鏈的重鏈抗 體。這種Vhh域可根據(jù)本領域中的標準技術進行人源化處理，根據(jù)本發(fā)明，這種域仍然被認 為是“域抗體”。本文使用的“Vh包括駱駝Vhh域”。本文使用的術語“抗原結合分子”是指抗體、抗體片段和能夠結合到靶標的其它蛋 白結構?！坝颉笔钦郫B蛋白結構，具有獨立于余下的蛋白的三級結構。一般地，域負責蛋白的 離散的功能特性，在很多的情況下可加入、移除或轉移到其它的蛋白上，而不損失該蛋白和 /或域的余下部分的功能?！皢慰贵w可變域”是折疊的多肽域，其包括抗體可變域的序列特 征。因此，它包括完整的抗體可變域和修飾的可變域，例如，其中的一個或多個環(huán)已經(jīng)被非 特征性的抗體可變域的序列取代，或者被截短或包括N或C末端延伸部分的抗體可變域，以 及可變域的折疊片段取代，所述折疊片段至少保留結合活性和全長域的特異性。本文使用的術語“光散射技術”是指用來確定溶液中的小粒子的粒度分布特征的 方法-光散射技術的一個例子是可用來測量納米粒子的動態(tài)光散射，光散射的另一例子是可用于測量微球體的靜態(tài)光散射或小角度光散射。本位使用的術語“動態(tài)光散射”(DLQ是使用通過粒子分散利用散射光以得出粒度 的信息的方法。動態(tài)光散射取決于這樣的事實，即當在液體懸液中時，粒子的Browian運動 依賴粒度，且粒子的Browian運動使來自粒子樣品的散射光的強度產(chǎn)生波動。通過相關的 函數(shù)分析這些波動，以得出粒徑。接著利用斯托克斯-愛因斯坦方程算出粒子的平均流體 力學直徑?！岸嘀笖?shù)分析”可得出粒度分布，可確定不同樣品內(nèi)部的不同物種的存在。DLS通 ?？捎糜诩{米粒子的分析。整份說明書中可換用的術語“靜態(tài)光散射”或“小角度激光光散射”有時是指激 光衍射。激光衍射依賴的是衍射角與粒度成反比的事實。該方法使用全米氏理論，其完 全解答了光與物質(zhì)的相互作用的方程。激光衍射可用來分析納米粒子和微粒子(直徑為 0. 02-2000 微米)。本文使用的術語“血腦屏障”(BBB)是指主要保護大腦不受血液中的化學物質(zhì)影 響，但仍允許基礎代謝功能的膜結構。它由腦微血管內(nèi)皮細胞組成，其在腦毛細血管中緊密 聚集。與身體其它任何部位的毛細血管的內(nèi)皮細胞相比，這種較高的密度更能限制物質(zhì)從 血流通過。在整篇說明書中，藥物載入的百分比定義為每份在粒子制劑中使用的物料的重量 (聚合物重量)中含有的藥劑的重量百分比w/V。藥物載入(藥物重量/粒子制劑中使用的物料重量)XlOO %。在整篇說明書中，參考多個實施方式以清楚簡潔的語言描述了本發(fā)明。應該理解 的是，在不脫離本發(fā)明的范圍內(nèi)實施方式可有多種組合或者分開使用。實施例實施例1 BCA (氰基丙烯酸丁酯)單體的聚合用在有機溶劑中的快速聚合反應形成聚合物將BCA單體ΟΟΟμ l，Vetbond，3M)加入在25ml的燒杯中的Iml無水乙醇中，緩慢 旋轉燒杯。將得到的溶液輕輕混合，直到聚合反應開始。聚合反應完畢后形成白色的固體 分散物。當反應混合物變得很粘而不能攪動時，停止分散物的混合。在通風櫥中使反應混合物中的乙醇蒸發(fā)至少1小時。乙醇蒸發(fā)之后，得到破裂的 白色固體塊。收集該固體，并將其用于納米粒子的制備方法。實施例2通過復乳法制備空心納米粒子將PBCA聚合物以濃度為溶于二氯乙烷中，并通過以下的乳化成復乳液 (水/油/水，w/o/w)的方法將其用來制備空心PBCA納米粒子⑴初級乳化(w/o)內(nèi)相(w)在水或緩沖液中的5%的膽酸鈉(SIGMA)，其通過以下混合過程制備500 μ 1水或緩沖液；以及500 μ 1 膽酸鈉(10% w/v 儲備液)。內(nèi)水相的總體積為1ml。將溶液保存在冰上直到拿出使用之時。使用之前，將每種 溶液吸入至胰島素注射器(Terumo lml, BD microlance needle 19G 1.5〃 )中。外部(有機)相(ο)在二氯甲烷(DCM, Fischer)中的PBCA聚合物(1% w/v)0將有機相(在DCM中的PBCA聚合物，6ml)倒入IOml燒杯(置于冰上冷卻)中，并插入均化器的探針(Ultra-TUrrax，T25，50ml探針)。溶液被石蠟膜(附著于燒杯和探針) 覆蓋，并使用轉子定子均化器(UIltra-Turrax T25 basic)以M，OOOrpm的速度進行均化處理。初級乳液的形成當均化器達到需要的速度，通過將其注射到靠近探針的溶液內(nèi)部加入內(nèi)部水相。 得到的乳液進行均化處理2分鐘(在冰上)，接著轉移到玻璃注射器(SGE，25ml，氣密的，適 合于有機溶劑，P/N 009462 25MDR-LL-GT，批號 #F06-A2190，配有鈍的 5cm 2R2 針頭，0.7mm ID)中。(ii)次級乳液(w/o/w)內(nèi)相(w/o)從上述的均化步驟得到的初級乳液外相(w)水中的膽酸鈉(1.25% w/v)。次級乳液的形成初級單乳液(w/o)通過加入到第二水相(1. 25% w/v膽酸鈉)并均化形成復乳液。 將膽酸鈉溶液(1. 25% w/v 30ml)轉移到高的50ml的燒杯(置于冰上保持乳液冷凍)中， 插入Silverson L4RT均化器的探針(3/4英寸，高乳化劑篩選)。溶液被石蠟膜(附著于燒 杯和探針)覆蓋，并以SOOOrpm的速度進行均化處理。當達到8，OOOrpm的速度時，將初級 乳液注入溶液靠近探針處。將得到的乳液均化處理6分鐘。將形成的復乳液轉移到矮的50ml燒杯中，并在連續(xù)攪拌(IKA磁攪拌器，設置為4 級)下，使有機相在通風櫥中蒸發(fā)3小時。離心法清洗納米粒子除去有機溶劑后，通過16200rCf的離心分離將形成的納米粒子清洗一次，再重新 懸于水(IOml)中。實施例3經(jīng)動態(tài)光散射確認納米粒子形成使用準彈性光散射，也稱動態(tài)光散射(DLS)以確定粒度的方式確定納米粒子的形 成。根據(jù)生產(chǎn)商提供的標準方法，使用Brooldiaven儀器公司的粒度分析儀(BIC 90plus) 來分析粒子。將粒子懸液在水中稀釋200x，使用標準的粒度測定的參數(shù)(溫度25°C，激光 束角度90度，激光波長658nm)進行粒度測量。在每個時間段內(nèi)，1分鐘內(nèi)進行10次粒度 測量，以分析粒子。通過儀器得到的是相關圖的標準形式的原始數(shù)據(jù)。這描述的是粒子在不同時間間 隔的散射光強度的自動相關函數(shù)c( τ )，以及自動相關是如何隨衰減時間τ衰減的。散射 光的自動相關的衰減取決于粒徑，且較小的粒子衰減更快。利用斯托克斯-愛因斯坦方程， 使儀器導出粒子的粒度信息。這得到樣品中的粒子的平均流體力學直徑，并進一步導出粒 子群數(shù)據(jù)。動態(tài)光散射對大粒子的存在非常敏感，即使當它們呈現(xiàn)出小于樣品的時也能 顯著的影響測量結果。因此，在樣品中受大粒子嚴重影響的由儀器導出的平均流體力學直 徑可有實質(zhì)的變化。因此，可以觀察到批次之間的很多納米粒子的粒度差別，且因該原因， 查看儀器提供的全部的數(shù)據(jù)組非常重要，而相關圖是最重要的。通過查看完整的數(shù)據(jù)組，有可能準確地表征樣品，這是因為盡管還存在有極少數(shù) 的大粒子，儀器仍可以輕易地檢測存在于樣品沉積中的大多數(shù)的小粒子。粒子是否是小的，以及樣品是否是多分散的，相關圖本身的形狀提供非常清楚的說明?；€指數(shù)也給出了準 確的數(shù)據(jù)質(zhì)量表示。此文件中所有的數(shù)據(jù)都展現(xiàn)了不低于5的基線指數(shù)，其中讀數(shù)的最高 的可能質(zhì)量的最大值是10。圖Ia所示為在經(jīng)QELS對粒子懸液進行粒度測量之后得到的相關圖(原始數(shù)據(jù))。 該相關圖清楚地表明，納米粒子懸液已經(jīng)通過粒子制備方法得到，因為沒有粒子存在，就不 會產(chǎn)生任何的光散射。該相關圖的形狀表明，該懸液具有很好的制藥質(zhì)量，因為粒子小且 無大的聚集塊存在。通過QELS對粒子懸液進行粒度測量表明形成了平均流體力學直徑為 262. 6nm的納米粒子(圖la)。也發(fā)現(xiàn)粒子群是相對單分散的，而測量樣品中的粒度有多寬 的范圍的多分散指數(shù)為0^62(圖la)。這低于粒子制劑的最大的可接受值0.300。一般而 言，該相關圖確認了復乳化方法已經(jīng)成功地產(chǎn)生了高質(zhì)量的PBCA納米粒子懸液。得到的數(shù)據(jù)(利用斯托克斯-愛因斯坦方程通過儀器產(chǎn)生)表明大多數(shù)的粒子是 小的(圖lb-d)。結果表示，約87. 5%的粒子群的直徑為138. 19nm或更小(圖lb)。還發(fā) 現(xiàn)懸液沒有大的聚集塊，且不含有直徑大于506. Slnm的任何粒子，大多數(shù)的粒子群顯然更 小(圖Ic)。此外，該制劑未含有直徑小于99. 86nm的任何粒子(圖Id)。因此，大多數(shù)粒 子的直徑在99. 86nm-138. 19nm之間，是一種靜脈給藥的理想粒度，但不是非常的小以至于 使得藥物加載受到損害。圖1-經(jīng)QELS得到的粒度數(shù)據(jù)，表明懸液中納米粒子的存在。圖1(a)-通過動態(tài)光散射對納米粒子懸液分析后獲得的相關圖。根據(jù)得到的數(shù) 據(jù)，粒子的平均流體力學直徑為262. 6nm，多分散指數(shù)為0. 2620圖1(b)-納米粒子的多模態(tài)粒度分布(得到的數(shù)據(jù))，繪圖以描述粒子群(數(shù)量) 相對于粒度范圍的分布。大多數(shù)(87. 5% )的粒子群的直徑似乎為138. 19nm或更小。圖1(c)-納米粒子的多模態(tài)粒度分布(得到的數(shù)據(jù))，繪圖以描述粒子群(數(shù)量) 相對于粒度范圍的分布。數(shù)據(jù)表明87. 5%的直徑為138. 19nm或更小，100%的粒子樣品的 直徑為506. Slnm或更小。因此，懸液中沒有大的聚集塊，且因而認為適合于靜脈給藥。圖1(d)-納米粒子的多模態(tài)粒度分布(得到的數(shù)據(jù))，繪圖以描述粒子群(數(shù)量) 相對于粒度范圍的分布。數(shù)據(jù)表明14. 9%的粒子樣品直徑為99. 86nm或更小。當制備不同的納米制劑時，還發(fā)現(xiàn)該方法得到了相似的納米粒子粒度。表1總結 了從一系列4個不同的制劑得到的粒度數(shù)據(jù)
制劑平均流體力學直徑 (nm)多分散指數(shù)1259.60.164 52437.60.2813319.20.3034320.60.248平均值334.250.249 一般而言，業(yè)已發(fā)現(xiàn)空心PBCA納米粒子制備方法產(chǎn)生具有所需要的直徑和多分 散性的納米粒子懸液。
棚列4會謝好白搬斤-會謝好1成,白輸人力·申孑、薩t趣白脾心 形杰為了確認形成了粒子且是空心粒子，使用電子顯微鏡來觀察樣品。使用透射電子 顯微鏡(TEM)來檢測納米粒子懸液。使用掃描電子顯微鏡(SEM)分析凍干的納米粒子。兩 種顯微鏡技術的分析確認了納米粒子的形成。SEM表明形成了穩(wěn)定的納米粒子。TEM核實 了納米粒子是空心的，具有PBCA聚合物壁包圍的水性核。圖2表示經(jīng)SEM分析的納米粒子。圖3表示通過TEM得到的空心納米粒子的圖像，以及用于比較的固體PBCA納米粒 子疊加圖像。^MM 5在苧心PBCA納米粒子中的單克降杭體(人杭-CD23)的囊封通過加入到均化過程的內(nèi)部水相，使單克隆抗體(在W099/58679中揭示的人 抗-CD23mAb)包埋在納米粒子的水性核中。使用抗體溶液制備初級乳液(w/o)，接著與第二 水相均化形成以下的復乳液(w/o/w)(iii)初級乳液(w/o)內(nèi)相(w)在W099/58679中揭示的人抗_CD23mAb (600 μ g，在5 %膽酸鈉中 (SIGMA))，通過混合以下的物質(zhì)制備得到78 μ 1 mAb 溶液(7. 2mg/ml)344 μ 1 7jC500 μ 1膽酸鈉溶液(10% w/v儲備溶液)內(nèi)部水相的總體積為lml。將溶液冷凍直到使用時。使用之前，將每種溶液吸入 Iml 胰島素注射器(Terumo lml, BD microlance needle 19G 1.5〃 )中。外相(ο)在二氯甲烷中的PBCA聚合物(1% w/v) (Fischer)。將有機相(在DCM中的PBCA聚合物，6ml)倒入IOml燒杯(置于冰上冷卻)中，并 插入均化器的探針(Ultra-TUrrax，T25，50ml探針)。溶液用石蠟膜(附著于燒杯和探針) 覆蓋，并以24，OOOrpm的速度進行均化處理。初級乳液的形成當均化器達到最大的速度時，通過將其注射到靠近探針的溶液內(nèi)部加入內(nèi)部水 相。使得到的乳液進行均化處理2分鐘(在冰上)，接著轉移到玻璃注射器(SGE，25ml，氣 密的,適合于有機溶劑，P/N 009462 25MDR-LL-GT，批號#F06-A2190，配有鈍的5cm 2R2針 頭，0. 7mm ID)中。(iv)次級乳液(w/o/w)內(nèi)相(w/o)從上述的均化處理得到的初級乳液外相(w)水中的膽酸鈉(1.25% w/v)。次級乳液的形成用初級單乳液(w/o)通過加入到第二水相(1. 25% w/v膽酸鈉)并均化以形成復 乳液。將膽酸鈉溶液(1.25% w/v 30ml)轉移到高的50ml的燒杯(置于冰上保持乳液冷 凍)中，插入Silverson L4RT均化器的探針(3/4英寸探針，高乳化劑篩選)。溶液用石蠟 膜(附著于燒杯和探針)覆蓋，并以8，OOOrpm的速度進行均化處理。當達到8，OOOrpm的 速度時，將初級乳液注入靠近探針處的溶液。將得到的乳液均化處理6分鐘。
將形成的復乳液轉移到矮的50ml燒杯中，并在連續(xù)攪拌(IKA磁攪拌器，設置為4 級)下，使有機相在通風櫥中蒸發(fā)3小時。通過離心法對納米粒子講行清洗將得到的納米粒子進行經(jīng)離心形成小球，以從囊封的抗體中分離游離抗體。小球 (包埋抗體)和上清液(游離的抗體)都經(jīng)總蛋白測定進行分析，以確定囊封效率。當使用總量600yg抗體時，囊封效率為52%。得到的囊封效率足夠高，足以輸送 潛在治療量的抗體，而不超過PBCA聚合物的最大的耐受劑量(小鼠為50mg/kg)。而且，有 可能接著制備含有不同單克隆抗體人抗-IL13的粒子，這表明該方法適合于任何的水溶性 的生物藥劑。圖4表示囊封效率測量后得到的結果。除了實現(xiàn)生物藥劑的高效囊封，有必要證明給藥之后，材料能從粒子中釋放出來 并能保持活性。活性抗體從粒子中的釋放最初在體外通過降解粒子進行研究，接著通過 ELISA檢測任意釋放的粒子。為了釋放囊封的抗體，用丁基酯酶(源自豬肝，SIGMA)處理粒 子，據(jù)報道，該丁基酯酶可裂解PBCA聚合物的丁酯。在反應過程中(Ringers溶液，pH 7.0， 37°C )，在不同的時間點(0、1、2、3、4和對小時)取樣。并用ELISA分析活性抗體的存在。圖5所示為粒子的酶降解并通過ELISA對釋放的酶進行分析后得到的釋放曲線。實施例7空心PBCA納米粒子中的域抗體(抗雞蛋溶菌酶dAb)的囊封在以下的實施例中，使用從Sigma(QPBCA)得到的BCA試劑盒進行BCA測定，并根 據(jù)說明進行測定。將游離dAb進行2倍和10倍稀釋，以供分析。將囊封的dAb進行100倍 稀釋。通過注入到均化過程的內(nèi)部水相的方法將域抗體(抗雞蛋溶菌酶dAb)包埋在 納米粒子的水性核中。在這種情況下，通過混合0. 5ml 20mg/ml的dAb溶液(IOmg蛋白) 和0.5ml的穩(wěn)定劑溶液(膽酸鈉，10% v/w)，以制備內(nèi)部水相。接著通過實施例4中記 述的復乳法制備納米粒子。將得到的納米粒子經(jīng)離心形成小球，以從囊封的抗體中分離 游離抗體。小球(包埋的抗體)和上清液(游離的抗體)都用總蛋白測定(二喹啉甲酸 (bicinchoninic acid)測定)進行分析，以確定囊封效率。分析結果示于圖6中。囊封 的dAb的量為6. 66mg。游離的dAb的量為4.83mg。因此，囊封效率約為66. 6%，載入率為 11. 1%。因此，使用復乳法有可能在空心PBCA納米粒子中有效地囊封毫克量的蛋白。實施例8單克隆抗體(抗-IL-13-mAb)在空心PBCA納米粒子中的囊封通過注入到均化過程的內(nèi)部水相的方法將單克隆抗體(抗-IL-13-mAb)包埋在納 米粒子的水性核中。通過混合0. 5ml 20mg/ml的mAb(10mg蛋白)溶液和0. 5ml的穩(wěn)定劑 溶液(膽酸鈉，10% v/w)，以制備內(nèi)部水相。接著通過實施例5中記述的復乳法制備納米粒 子。將得到的納米粒子經(jīng)離心形成小球，以從囊封的抗體中分離游離抗體。小球(包埋的 抗體)和上清液(游離的抗體)都用總蛋白測定(二喹啉甲酸測定)進行分析，以確定囊 封效率。分析結果示于圖12中。囊封的mAb的量為8. 62mg。游離的mAb的量為1. 79mg。 因此，囊封效率約為86. 2%，載入率為14. 4% w/w。序列表
權利要求
1.一種制備微粒載體的方法，包括以下步驟a)在有機溶劑中溶解聚氰基丙烯酸丁酯(PBCA)以形成聚合物溶液；b)將含有生物活性劑的水溶液加入到該聚合物溶液中以在連續(xù)有機相中形成水相液 滴的初級乳液；c)使初級乳液與水介質(zhì)混合形成次級乳液；以及d)使有機相蒸發(fā)，并藉此得到包括含有在水相中的生物活性劑的空腔的微粒載體。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)中還包括加入凝膠形成劑。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的凝膠形成劑是瓊脂糖。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，所述的聚合物是聚乙二醇化的。
5.根據(jù)權利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，所述的微粒載體是微球體。
6.根據(jù)權利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，所述的微粒載體是納米粒子。
7.根據(jù)權利要求1-6中任一項所述的方法，其特征在于，所述的生物活性劑是蛋白或肽。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的生物活性劑是抗原結合分子。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的生物活性劑包括域。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于，所述的生物活性劑是抗體。
11.根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于，所述的生物活性劑是域抗體。
12.—種微粒載體，其特征在于，該微粒載體包括前述任意一項權利要求所述的方法得 到的囊封的生物活性劑。
13.根據(jù)權利要求12所述的微粒載體，其特征在于，所述的微粒載體是納米粒子。
14.根據(jù)權利要求13所述的微粒載體，其特征在于，所述的生物活性劑是蛋白。
15.根據(jù)權利要求14所述的微粒載體，其特征在于，納米粒子中所述的蛋白與聚合物 的比例至少是約5% w/w，或至少約10% w/w或者至少是約14% Wi
16.根據(jù)權利要求13所述的微粒載體，其特征在于，所述的生物活性劑是肽。
17.根據(jù)權利要求16所述的微粒載體，其特征在于，納米粒子中所述的肽與聚合物的 比例至少是約5% w/w，或至少約10% w/w。
18.根據(jù)權利要求13所述的微粒載體，其特征在于，所述的生物活性劑是抗體。
19.根據(jù)權利要求18所述的微粒載體，其特征在于，納米粒子中所述的抗體與聚合物 的比例至少是約5% w/w，或至少約10% Wi
20.根據(jù)權利要求13所述的微粒載體，其特征在于，所述的生物活性劑是dAb。
21.根據(jù)權利要求20所述的微粒載體，其特征在于，納米粒子中所述的dAb與聚合物的 比例至少是約5% w/w，或至少約10% w/w或至少是約14% w/w。
22.藥物組合物，其特征在于，所述的組合物包括權利要求12-21中任一項所述的微粒 載體。
23.如權利藥物22所述的組合物在治療或預防疾病中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供將生物活性劑(如蛋白)囊封在微粒載體(如納米粒子)中的多種方法。本發(fā)明還提供包括利用這種方法可得到的微粒載體的組合物以及這些組合物在治療中的用途。
文檔編號A61K9/51GK102083423SQ200980127005
公開日2011年6月1日 申請日期2009年5月5日 優(yōu)先權日2008年5月6日
發(fā)明者I·帕帕尼科勞烏, M·菲丹博伊盧 申請人:葛蘭素集團有限公司