專利名稱：含有來自紫杉形成層或原形成層的細胞系作為活性成分的抗氧化、抗炎或抗衰老組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有任意一種或多種來自紫杉形成層或原形成層的細胞系、其提取 物、其裂解物以及其培養(yǎng)基的抗氧化、抗炎或抗衰老組合物。
背景技術：
衰老是一種功能、結構和生化的過程，其在人類的整個生命中連續(xù)地發(fā)生。衰老在 所有的人體細胞和組織中發(fā)生，表現(xiàn)為代謝率的降低、疾病的增多、適應能力的降低等等， 并最終導致細胞以及整個人體組織的死亡。解釋衰老過程和原因的理論大體上分為遺傳理 論(Chung. H. Y.等，Kor. J. Gerontol.，2 1,1992)和細胞損耗理論(Chung. H. Y.等，Kor. J. Gerontol.，2 :1,1992)。細胞損耗理論認為機體細胞隨著時間的流逝或者由于有害物質 的積累而失去其功能。在這些解釋當中，似乎最為可信的理論是自由基理論，其認為通過人 體代謝過程、暴露于輻射、病毒、重金屬和空氣污染而產生的自由基形成了高毒性的物質， 從而加速了衰老過程并引起與衰老有關的各種疾病。自由基是在最外層軌道上具有一個未成對電子的物質，其結構高度不穩(wěn)定并易反 應，因為其趨向于得到電子從而變得穩(wěn)定。特別地，來自氧氣的自由基被稱為“活性氧簇”， 這些活性氧簇與蛋白質、脂類、碳水化合物等反應而引起脂質過氧化、DNA損傷、蛋白質氧化 等等，從而造成細胞內結構的損傷并最終促使細胞死亡。特別地，由于參與血管老化原因的 炎癥過程，這些活性氧簇增加了動脈硬化、阿爾茨海默病和血液高半胱氨酸水平。人體中與氧有關的毒性物質被稱為活性氧簇(ROS)。ROS的實例包括自由基，如超 氧化基、羥基、過氧化氫基、烷氧基和過氧羥基，以及非游離的放射性自由基，如過氧化氫、 次氯酸、臭氧、單態(tài)氧和過(氧化)亞硝酸鹽。在這些活性氧簇中，超氧化基自由基是最常 被研究的并且扮演著重要的角色(Fridovich L.，Science, 201 175，1978)。在衰老進程中，產生于細胞線粒體的ROS成為表明氧化損傷的靶物質 (Lesnefsky, E. J. & Hoppel，C. L. Arch. Biochem. Biophys. 420，287，2003)。有許多 艮道稱， 有關細胞內氧自由基的自由基理論與衰老相關的氧化應激和由此引起的衰老相關的疾病 密切相關(Finkel，Τ. & Holbrook, N. J.，Science 408 ；239，2000)，并且還有報道稱這種氧 化應激在誘發(fā)衰老中扮演著重要角色(Chen Q. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. May 9 ；92 (10) :4337,1995 ；Packer L. &Fuehr K.，Nature, 267 (5610) :423,1977) 該氧化應激 是用于描述通過升高活性氧簇水平并降低抗氧化劑儲備，通過大分子的氧化引起的細胞損 傷的術語(Thomas C. & Squier, ExperimentalGerontology, 36 ； 1539, 2001)。處于重復性衰老進程中的老化細胞相對于年輕細胞產生高水平的R0S，還能在正 常的代謝過程中產生有毒副產物，如超氧化基、過氧化氫、羥基自由基等等。根據(jù)在老年 個體或老年測試動物上的實驗結果，組織積聚氧化性損傷到其DNA、蛋白質和脂類(Chen， Ann. N. Y. Acad. Sci.，908 111，2000)。R0S，特別是羥基自由基，攻擊DNA使得形成了 8-羥基 脫氧鳥苷(8-OXO-2' -deixyguanosine)以及其它的有效誘變加合物，而在各物種中ROS的比例與壽命相關，也就是說其是限定衰老速度和各種與衰老相關疾病的決定因素(Finkel &Holbrook, Nature,408(6809) :239,2000)。1961年，Hayflick和Moorhead首次報道了年輕培養(yǎng)細胞的復制能力隨著分裂次 數(shù)的增加而降低，最終細胞失去了增殖能力并具有意味著生長條件結束的“有限加倍”。從 那時開始，ROS就被用于定義人類細胞的與衰老相關的分子變化，作為體外衰老試驗和人 成纖維細胞中細胞內衰老的試驗模型(HAYFLICK L. & M00RHEAD P. S.，Exp. Cell Res. ,25 585，1961)。所有好氧生物，包括人類，基本上都具有對活性氧簇引起的損傷的自我防御機制， 所述損傷總是發(fā)生在利用氧氣的能量代謝過程中，產生的活性氧簇超出組織的防御能力則 會引起各種成年疾病，包括關節(jié)炎、心血管系統(tǒng)紊亂、以及癡呆(Halliwell et al. ,Drugs, 42 :569,1991 ；Fukuzawa et al. , J. Act. oxyg. Free Rad. , 1 :55,1990)。通常被稱為有害氧的活性氧簇包括超氧陰離子(02_)，它是由最穩(wěn)定的三態(tài)氧 (302)氧化還原生成的單態(tài)氧；過氧化氫(H2O2)，作為未成對自由基的羥基自由基(· 0H)， 這些物質通過免疫系統(tǒng)如蛋白質、DNA、酶和T細胞的損害因子來引發(fā)疾病(Regnstrom et al.，Lancet.，16 :1183,1992 ；Gey et al. , Am. Ac. J. Cin. Nutr. ,53 :326，1991)。為此，關于抗氧化劑開發(fā)的研究正積極地進行，并因而已知了許多抗氧化劑，包括 預防性抗氧化酶如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶，天然抗氧化劑如 維生素E、維生素C、類胡羅卜素和谷胱甘肽，以及合成抗氧化劑如叔丁基-4-羥基苯甲醚 (BHA)和3，5-(叔丁基)-4-甲基苯酚(BHT)。然而，隨著人們漸漸變老，所述抗氧化酶類表 現(xiàn)出對活性氧簇的防御能力降低，并且已知合成抗氧化劑具有誘變性和毒性。因此，迫切需 要開發(fā)出更加穩(wěn)定而有效的天然抗氧化劑(Hatano et al.，Natural Medicines,49 :359, 1995 ；Masaki et al.，Biol. Pharm. Bull, 18 :162,1995)。與此同時，炎癥是出現(xiàn)在損傷部位處以啟動去除病原體入侵和損壞組織的局部反 應。盡管其具有積極的作用，但對人類疾病而言炎癥卻成為其中最為普遍的致病機制之一。 活化的單核細胞和巨噬細胞中產生的一氧化氮(NO)啟動了有效的炎癥反應，并且是對細 菌性病原體最重要的初始免疫應答(Bogdan C.，Nat. Immunol.，2 =907,2001)。當發(fā)生組織(細胞)損傷或者被外源物質(例如細菌、真菌、病毒、各種引發(fā)過敏 反應的物質)感染時，通常伴隨有炎癥反應，其表現(xiàn)為一系列復雜的生理反應，諸如激活 酶、分泌炎癥介導物、體液滲透、細胞移動、以及造成與各種炎癥介導因子和局部血管和體 液中的免疫細胞有關的損害，并且表現(xiàn)為外部癥狀，如紅斑、水腫、發(fā)熱和疼痛。對正常人來 說，炎癥反應去除了外部的感染源、使損壞組織再生、并恢復了機體功能，但當抗原并未去 除或者由于內源性物質炎癥反應過度地或連續(xù)地發(fā)生時，免疫反應刺激損傷粘膜，并且結 果是在一些情況下會引起疾病，如癌癥。因此，需要開發(fā)天然的抗炎劑，其能夠防止過度和 連續(xù)的炎癥反應而不引起副作用。因而，本發(fā)明的發(fā)明者們做了許多努力以開發(fā)出自天然物質的組合物，其與現(xiàn)有 的抗氧化劑和抗炎劑相比具有最低的副作用并且具有極好的抗氧化活性和抗炎活性。作為 結果，本發(fā)明的發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，來自紫杉形成層或原形成層的細胞系以及其提取物具有極 好的對抗衰老和炎癥的抑制效果，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種來自天然物質的組合物，其與現(xiàn)有的抗氧化劑和 抗炎劑相比具有最小的副作用并且表現(xiàn)出預防和延緩衰老的抗氧化活性和抗炎活性。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種抗氧化、抗炎或抗衰老的組合物，其含有來 自紫杉形成層或原形成層的任意一種或多種細胞系、其提取物、其裂解物以及其培養(yǎng)基，并 且具有以下特征(a)其處于天生的未分化狀態(tài)；(b)其生長速度快于除來自紫杉形成層或 原形成層之外的組織的細胞系并被穩(wěn)定培養(yǎng)；以及(c)其形態(tài)學特征在于有許多液泡。本發(fā)明還提供了一種抗衰老的化妝品組合物，其含有任意一種或多種所述細胞 系、其提取物、其裂解物以及其培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供了一種美白化妝品組合物，其含有任意一種或多種所述細胞系、其 提取物、其裂解物以及其培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供了一種抗氧化功能性食品，其含有任意一種或多種所述細胞系、其 提取物、其裂解物以及其培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供了一種抗衰老功能性食品，其含有任意一種或多種所述細胞系、其 提取物、其裂解物以及其培養(yǎng)基。通過以下詳細說明和所附加的權利要求書，本發(fā)明的其它特征和具體實施方式
將
更加全面清楚。附圖簡述

圖1是一組照片，示出了獲取根據(jù)本發(fā)明的細胞系的過程，所述形成層 或原形成層在分離后的外觀，以及去分化細胞與來自紫杉形成層和原形成層的細胞的比較。圖2示出了從根據(jù)本發(fā)明的細胞系逐步提取有效物質的過程的流程圖。圖3描繪了 ROS量和DCFH熒光圖像的比較圖，其示出了當用H2A處理人二倍體成 纖維細胞(HDFs)以誘發(fā)老化時，根據(jù)本發(fā)明的細胞系提取物的抗氧化活性(p-WE:原形成 層的蒸餾水提取物；C-WE 形成層的蒸餾水提取物)。圖4是一組照片，其示出了當用H2A處理人二倍體成纖維細胞(HDFs)以誘發(fā)老 化時，根據(jù)本發(fā)明的細胞系提取物的ERK表達抑制能力(p-WE 原形成層的蒸餾水提取物； C-WE 形成層的蒸餾水提取物)。圖5是一組照片，其示出了當用H2A處理人二倍體成纖維細胞(HDFs)以誘發(fā)老 化之時，根據(jù)本發(fā)明的細胞系提取物的MnSOD表達誘導能力(p-WE 原形成層的蒸餾水提取 物)。圖6是一組照片，其示出了當用LPS處理人二倍體成纖維細胞(HDFs)以誘發(fā)炎 癥時，根據(jù)本發(fā)明的細胞系提取物的IL-I β表達抑制能力(P-WE:原形成層的甲醇提取物； C-WE 形成層的甲醇提取物)。圖7是一組照片，其示出了當用LPS處理人二倍體成纖維細胞(HDFs)以誘發(fā)炎癥 時，根據(jù)本發(fā)明的細胞系提取物的MMP-9表達抑制能力(P-WE 原形成層的甲醇提取物)。圖8是一組照片，其示出了當用LPS處理人二倍體成纖維細胞(HDFs)以誘發(fā)炎癥 時，根據(jù)本發(fā)明的細胞系提取物的MMP-2表達抑制能力(P-WE 原形成層的甲醇提取物)。圖9是一組照片，其示出了當用LPS處理人二倍體成纖維細胞(HDFs)以誘發(fā)炎癥 時，根據(jù)本發(fā)明的細胞系提取物的ICAM-I表達抑制能力(P-WE 原形成層的甲醇提取物)。
圖10示出了用根據(jù)本發(fā)明的細胞系提取物(來自紫杉形成層的細胞系的DMSO提 取物)處理后的成纖維細胞存活率測量結果圖表。圖11示出了在本發(fā)明的細胞系提取物和培養(yǎng)基中用UV光照射而產生的活性氧簇 去除效果圖表。圖12示出了當用UV光照射誘發(fā)MMP-I時本發(fā)明的細胞系提取物和培養(yǎng)基中 MMP-I生成的抑制效果圖表。圖13示出了在本發(fā)明細胞系提取物和培養(yǎng)基的B-16黑色素瘤細胞系中黑素生成 的抑制效果圖表。
具體實施例方式除非另有說明，本文所使用的所有技術和科學術語都具有如本領域普通技術人員 所通常理解的那樣的相同含義。一般來說，本文所使用的術語是公知的并且常規(guī)使用于本 領域。本發(fā)明的詳細說明中使用的主要術語定義如下維管束形成層是一種位于植物側 面的側生分生組織。通過形成層的活動植物發(fā)生變厚的生長，結果，可存在具有11，000年 以上生長輪的巨型植物。從胚胎學來講，維管束形成層起源于原形成層，因而是具分生連續(xù) 性的已逐漸分化的相同分生組織。這種形成層和原形成層為1期分生組織，因而在本發(fā)明 中，預期使用這種形成層和原形成層將具有相同的效果。如本文所使用的術語“裂解物”是指通過化學方法例如用去垢劑或者物理方法破 壞細胞所獲得的細胞裂解物。術語細胞系的“提取物”是指通過將細胞溶解在溶劑中并分 離所述細胞而獲得的物質，所述提取物可以通過蒸餾或蒸發(fā)進行濃縮。同樣，術語細胞系的 “培養(yǎng)基”是指在培養(yǎng)細胞之后去除了所述細胞的細胞培養(yǎng)基溶液。如本文所使用的術語“天生地未分化的”是指細胞不是通過去分化過程以未分化 的狀態(tài)存在，而是原始地保持在分化前的狀態(tài)。一方面，本發(fā)明涉及一種抗氧化、抗炎或抗衰老組合物，其含有任意一種或多種來 自紫杉形成層或原形成層的細胞系、其提取物、其裂解物以及其培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的來自紫杉形成層或原形成層的細胞系具有如下特征(a)其處于天 生地未分化狀態(tài)；(b)其生長速度快于除來自紫杉形成層或原形成層之外的組織的細胞系 并被穩(wěn)定培養(yǎng)；以及(c)其形態(tài)學特征在于有許多液泡。根據(jù)本發(fā)明的來自紫杉形成層或 原形成層的細胞系進一步具有以下特征(a)其在懸浮培養(yǎng)過程中以單個細胞存在；以及 (b)相比較來自紫杉形成層或原形成層之外組織的細胞系，其在生物反應器中對剪切應力 具有低靈敏度。根據(jù)本發(fā)明的細胞系可以使用包括以下步驟的分離方法獲得(a)獲得含有紫杉 形成層或原形成層的組織；(b)培養(yǎng)所獲得的含有紫杉形成層或原形成層的組織，以誘導 由所述形成層或原形成層增殖而成的形成層或原形成層，以及由除所述形成層或原形成層 之外的組織增殖而成的無定型愈傷組織；以及(c)從所述愈傷組織中分離所述形成層或原 形成層，并從所述形成層或原形成層中收集來自紫杉形成層或原形成層的細胞系。在本發(fā)明中，所述細胞系優(yōu)選在如下培養(yǎng)基中進一步培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基包含 3-5wt%的粗糖或糖以及至少一種選自下組中的物質茉莉酮酸甲酯、真菌提取物、細菌提取物、酵母提取物、殼聚糖、葡甘露聚糖、葡聚糖、苯丙氨酸、苯甲酸、水楊酸、花生四稀酸、 STS、mevalonalonate N-benzolyglycine、ABA、SNP、IPP、BHT、CCC、乙烯禾U、馬尿酸、硝酸鈰 銨、AgN03、硫酸氧釩、對氨基苯酸、油菜素留醇、海藻酸鈉和醋酸鈉。這里，所述茉莉酮酸甲 酯優(yōu)選含量為10 100 μ Μ。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用選自下組中的溶劑來獲得所述提取物該組由蒸餾水、乙 醇、丙酮、DMSO(二甲基亞砜)以及其混合溶劑所組成。在本發(fā)明中，二倍體成纖維蛋白用所述細胞系提取物和H2O2—起處理，結果發(fā)現(xiàn) 所述細胞系提取物抑制了活性氧簇的產生和p-ERKl/2的表達，并且誘導MnSOD的表達，這 表明根據(jù)本發(fā)明的細胞系提取物具有抗氧化活性。同樣，在本發(fā)明中，二倍體成纖維蛋白用 所述細胞系提取物和LPS —起處理，結果發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的細胞系提取物抑制了 ICAM-1、 MMP9、MMP2和IL-I β，這表明所述細胞系提取物具有抗炎活性。也就是說，發(fā)現(xiàn)當細胞在衰 老和炎癥被誘發(fā)之前用所述細胞系提取物處理時，所述細胞系提取物阻斷了所述細胞中的 這些信號。同樣，在本發(fā)明的另一實施例中，發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的細胞系提取物和細胞系培養(yǎng) 基具有去除由UV照射產生的活性氧簇的作用。因此，如上所述，發(fā)現(xiàn)所述細胞系提取物具有抗氧化活性、抗炎活性和抗衰老活 性。因而，即使在本發(fā)明中，沒有具體的實施例來表現(xiàn)含有所述細胞系的組合物表現(xiàn)出抗氧 化活性、抗炎活性和抗衰老活性，但對于本領域技術人員來說顯而易見的是含有根據(jù)本發(fā) 明細胞系的組合物或其裂解物同樣會表現(xiàn)出抗氧化活性和抗炎活性，這表明所述組合物可 以預防衰老并預防和緩解皮膚炎癥。含有任意一種或多種根據(jù)本發(fā)明的細胞系、其提取物、其裂解物和其培養(yǎng)基作為 活性成分的抗氧化、抗炎或抗衰老組合物可以被提供作為藥物組合物，其單獨含有它們中 的任意一種或多種或者與至少一種藥物學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑相結合。所述 細胞系或細胞提取物可以以藥物學上有效的量包含在藥物組合物中，所述量取決于疾病及 其嚴重程度、患者年齡、體重、健康狀況和性別、給藥途徑和治療周期。本文所使用的術語“藥物學上可接受的”是指生理學上可接受的并且當對人給藥 時不會造成胃功能紊亂、過敏性反應如腸胃紊亂或眩暈，或類似反應的組合物。所述載體、 賦形劑或稀釋劑的例子可包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥 芽糖醇、淀粉、阿拉伯樹膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯 烷酮、水、甲基羥苯酸酯、丙基羥苯酸酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。所述藥物組合物可進一步包含填充劑、抗凝劑、潤滑劑、潤濕劑、香料、乳化劑和防 腐劑。同樣，本發(fā)明的藥物組合物可以利用本領域公知的方法來配制，使得其在給藥到哺乳 動物后能夠提供活性成分的快速、持久或延遲的釋放。所述配方可以以粉末、顆粒、片劑、乳 液、糖漿、氣霧劑、軟或硬膠囊、無菌注射液、無菌粉末等等的形式。同時，在本發(fā)明的另一個實施例中，發(fā)現(xiàn)與已知具有出色抗衰老效果的紫杉提取 物和RA(維甲酸)相比，根據(jù)本發(fā)明細胞系的提取物和培養(yǎng)基表現(xiàn)出出色的抑制基質金屬 蛋白酶I(MMP-I)產生的效果，這表明含有根據(jù)本發(fā)明的細胞系、其提取物、其裂解物或其 培養(yǎng)基的組合物具有抑制膠原降解，從而具有預防皮膚衰老和減少皺紋的效果。因而，所述 組合物作為抗衰老化妝品組合物非常有用。因此，另一方面，本發(fā)明涉及一種含有任意一種或多種來自紫杉形成層或原形成層細胞系、其提取物、其裂解物及其培養(yǎng)基作為活性成分 的抗衰老化妝品組合物。在本發(fā)明的另一個實施例中，發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的細胞系提取物和細胞系培養(yǎng)基在 鼠黑色素瘤細胞系中具有抑制黑素生成的效果，其表明含有所述細胞系提取物或細胞系培 養(yǎng)基的組合物作為美白化妝品組合物非常有用。因此，另一方面，本發(fā)明涉及一種美白化妝 品組合物，其含有任意一種或多種來自紫杉形成層或原形成層的細胞系、其提取物、其裂解 物以及其培養(yǎng)基。本文所使用的術語“功能性化妝品”是指一種化妝品，通過另外添加一種或多種根 據(jù)本發(fā)明的來自紫杉形成層或原形成層的細胞系、其提取物、其裂解物以及其培養(yǎng)基而改 進了其功能性。例如，含有本發(fā)明細胞系或其提取物的抗衰老化妝品組合物可用于制備功 能性化妝品。除了所述細胞系提取物作為活性成分之外，本發(fā)明的化妝品組合物可以含有常規(guī) 的用于化妝品的成分。例如，所述化妝品組合物可含有常規(guī)的輔料，如溶劑、穩(wěn)定劑、增溶 劑、乳化劑、維生素、色素和香料以及載體。本發(fā)明的化妝品組合物可以制備成本領域常規(guī)的任何制劑。優(yōu)選地，所述化妝品 組合物可以制備成選自下組中的制劑潤膚乳、滋潤乳、滋潤霜、按摩霜、滋潤精華、面膜、修 容底霜、粉底霜、身體油、發(fā)油、香波和染發(fā)劑。不考慮化妝品制劑實施例的情況下，含有任意一種或多種本發(fā)明的細胞系、其提 取物、其裂解物以及其培養(yǎng)基的本發(fā)明化妝品組合物具有抗氧化效果，并因而具有去除皮 膚中生成的自由基并保護細胞內抗氧化系統(tǒng)的效果。因此，本發(fā)明的化妝品組合物顯示出 能預防和延緩由于自由基作用引起的氧化反應所導致的皮膚衰老的效果，并能抑制MMP-I 的生成，從而預防皮膚衰老和減少皺紋。在另一方面，本發(fā)明涉及一種抗氧化功能性食品，其含有任意一種或多種來自紫 杉形成層或原形成層的細胞系、其提取物、其裂解物以及其培養(yǎng)基作為活性成分。在還一方面，本發(fā)明涉及一種抗衰老功能性食品，其含有任意一種或多種來自紫 杉形成層或原形成層的細胞系、其提取物、其裂解物以及其培養(yǎng)基作為活性成分。這里所使用的術語“功能性食品”是指一種食品，通過另外添加一種或多種根據(jù)本 發(fā)明的細胞系或所述細胞系的提取物而改善了其功能性。
實施例在下文中，將參照實施例進一步詳細地描述本發(fā)明。然而，應當明白的是，這些實 施例僅用于說明目的，而并不解釋為限制本發(fā)明的范圍。特別地，盡管在以下實施例中證實了來自紫杉形成層或原形成層的細胞系的抗氧 化、抗炎和抗衰老效果和美白效果，但對于本領域技術人員來說顯而易見的是使用所述細 胞系本身可以提供與使用其提取物或培養(yǎng)基獲得相同的結果。實施例1 來自紫杉形成層或原形成層的細胞系的制備。(1)植物材料的制備分別收集紫杉的嫩枝和莖，然后立即浸入100mg/L的抗氧化 劑L-抗壞血酸(DUCHEFA，TheNetherlands)。接著將其轉移并存放起來。然后，用1 % 的苯菌靈(Dongbu Hannong Chemical, Korea)、1 % 的百菌清(DongbuHannong Chemical, Korea)、1 % 的硫酸鏈霉素(DUCHEFA，The Netherlands)和 0. 的頭孢噻肟鈉(DUCHEFA，The Netherlands)的混合溶液預處理所述植株M小時，接 著用自來水沖洗30分鐘以去除酚類化合物和殘余的化學藥品。接下來，將所述植株在70% 的乙醇(DCChemical，Korea) 1 分鐘，在 30%的過氧化氫(LG Chemical,Korea)中 15 分鐘， 在1 %的CLOROX溶液中滅菌15分鐘，以及在3%的CLOROX溶液中5分鐘以進行表面消毒， 然后用水洗滌3-4遍。(2)從嫩枝和莖中分離原形成層和形成層組織經(jīng)過上述滅菌過程的所述嫩枝和莖 的外部組織很容易通過縱向拉扯而剝離。所述剝離的組織由木質部、原形成層或形成層、韌 皮部、皮層和表皮層組成，將其以這種方式培養(yǎng)，使所述剝離的組織的最內層組織即木質部 與培養(yǎng)基接觸。(3)獲得來自紫杉原形成層和形成層的細胞系在最初培養(yǎng)的4-7天，可以目測觀 察原形成層和形成層上的細胞的分裂，在培養(yǎng)15天之后，由去分化作用形成的無定型愈傷 組織開始從韌皮部、皮層和表皮層組成的層中引入。然而，在整個培養(yǎng)期間木質部中并不發(fā) 生細胞分裂，因而所述形成層從所述木質部上自然分離。在培養(yǎng)30天后，所述組織開始分 離成形成層和含韌皮部的上層，即無定型的愈傷組織層(圖1中的(a)A和(b)A)，而在所 述組織自然完全地分離成兩層之后，分別在不同的陪替氏培養(yǎng)皿中培養(yǎng)所述層(圖1中的 (a)B C和(b)B D)。在圖l(a)A中，示出了原形成層的分離，上部表示的是含韌皮部/ 皮層/表皮層的組織，下部表示的是原形成層。在圖1(b)中，“A”表示的是形成層的分離， 上部表示的是含韌皮部/皮層/表皮層的組織，中部表示的是形成層，下部表示的是原形成 層，因為所述培養(yǎng)是在去除木質部之后進行的。此外，箭頭指示了原形成層/形成層與含韌 皮部/皮層/表皮層的組織之間的分離。在圖1(a)和1(b)中，“B”表示的是來自含韌皮 部/皮層/表皮層的組織的細胞系，由于上述細胞之間分裂的差異，所述細胞系的增殖是不 規(guī)則的，“C”表示的是來自原形成層/形成層的細胞系，其通過規(guī)律的細胞分裂增殖形成了 均勻的細胞層；1(b)中的“D”表示木質部，其中沒有發(fā)生細胞分裂。在如上所述那樣分離 了所述組織之后，在與誘導培養(yǎng)基相同的新鮮培養(yǎng)基中以21天為間隔繼代培養(yǎng)其白色和 易碎部分，該白色和易碎部分具有良好生長速度。同時，下表1示出了用于誘導僅來自原形成層和形成層的細胞系的培養(yǎng)基〈表1> 用于誘導來自紫杉屬的細胞系的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基1)
權利要求
1.一種抗氧化、抗炎或抗衰老的組合物，其含有來自紫杉形成層或原形成層的任意一 種或多種細胞系、其提取物、其裂解物以及其培養(yǎng)基，并且其具有以下特征(a)其處于天生的未分化狀態(tài)；(b)其生長速度快于來自紫杉形成層或原形成層之外的組織的細胞系并被穩(wěn)定培 養(yǎng)；以及(c)其形態(tài)學特征在于具有許多液泡。
2.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述細胞系進一步具有以下特征 (a)其在懸浮培養(yǎng)過程中以單個細胞存在；以及(b)相比較來自紫杉形成層或原形成層之 外組織的細胞系，其在生物反應器中對剪切應力具有低靈敏度。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的組合物，其特征在于，使用包括以下步驟的分離方法獲 得所述細胞系(a)獲得含有紫杉形成層或原形成層的組織；(b)培養(yǎng)所獲得的含有紫杉形成層或原形成層的組織，以誘發(fā)由所述形成層或原形成 層增殖而成的形成層或原形成層，以及由所述形成層或原形成層之外的組織增殖而成的無 定型愈傷組織；以及(c)分離所述形成層或原形成層與所述愈傷組織，并從所述形成層或原形成層中收集 來自紫杉形成層或原形成層的細胞系。
4.根據(jù)權利要求3所述的組合物，其特征在于，所述細胞系在培養(yǎng)基中進一步培養(yǎng)， 所述培養(yǎng)基包含3-5wt%的粗糖或糖以及至少一種選自下組中的物質茉莉酮酸甲酯、真菌 提取物、細菌提取物、酵母提取物、殼聚糖、葡甘露聚糖、葡聚糖、苯丙氨酸、苯甲酸、水楊酸、 花生四稀酸、STS、mevalonalonate N-benzolyglycine、ABA、SNP, IPP, BHT, CCC,乙烯利、馬 尿酸、硝酸鈰銨、AgN03、硫酸氧釩、對氨基苯酸、油菜素留醇、海藻酸鈉和醋酸鈉。
5.根據(jù)權利要求1或2所述的組合物，其特征在于，使用選自下組中的溶劑來獲得所 述提取物蒸餾水、乙醇、丙酮、DMSO (二甲基亞砜)、以及其混合溶劑。
6.一種抗衰老化妝品組合物，其含有任意一種或多種來自紫杉形成層或原形成層且 具有以下特征的細胞系、其提取物、其裂解物和其培養(yǎng)基(a)其處于天生的未分化狀態(tài)；(b)其生長速度快于來自紫杉形成層或原形成層之外的組織的細胞系并被穩(wěn)定培 養(yǎng)；以及(c)其形態(tài)學特征在于具有許多液泡。
7.根據(jù)權利要求6所述的化妝品組合物，其特征在于，所述細胞系進一步具有以下特 征(a)其在懸浮培養(yǎng)過程中以單個細胞存在；以及(b)相比較來自紫杉形成層或原形成層 之外組織的細胞系，其在生物反應器中對剪切應力具有低靈敏度。
8.根據(jù)權利要求6或7所述的化妝品組合物，其特征在于，所述組合物抑制MMP-I的 生成。
9.根據(jù)權利要求6或7所述的化妝品組合物，其特征在于，使用包括以下步驟的分離 方法獲得所述細胞系(a)獲得含有紫杉形成層或原形成層的組織；(b)培養(yǎng)所獲得的含有紫杉形成層或原形成層的組織，以誘發(fā)由所述形成層或原形成層增殖而成的形成層或原形成層，以及由所述形成層或原形成層之外的組織增殖而成的無 定型愈傷組織；以及(c)分離所述形成層或原形成層與所述愈傷組織，并從所述形成層或原形成層中收集 來自紫杉形成層或原形成層的細胞系。
10.根據(jù)權利要求9所述的化妝品組合物，其特征在于，所述細胞系在培養(yǎng)基中進一 步培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基包含3-5wt%的粗糖或糖以及至少一種選自以下組的物質茉莉酮酸甲 酯、真菌提取物、細菌提取物、酵母提取物、殼聚糖、葡甘露聚糖、葡聚糖、苯丙氨酸、苯甲酸、 水楊酸、花生四稀酸、STS、mevalonalonate N-benzolyglycine、ABA、SNP、IPP、BHT、CCC、乙 烯利、馬尿酸、硝酸鈰銨、AgN03、硫酸氧釩、對氨基苯酸、油菜素留醇、海藻酸鈉和醋酸鈉。
11.根據(jù)權利要求6或7所述的化妝品組合物，其特征在于，使用選自下組中的溶劑 來獲得所述提取物蒸餾水、乙醇、丙酮、DMSO (二甲基亞砜)、以及其混合溶劑。
12.—種美白化妝品組合物，其含有任意一種或多種來自紫杉形成層或原形成層且 具有以下特征的細胞系、其提取物、其裂解物和其培養(yǎng)基(a)其處于天生的未分化狀態(tài)；(b)其生長速度快于來自紫杉形成層或原形成層之外的組織的細胞系并被穩(wěn)定培 養(yǎng)；以及(c)其形態(tài)學特征在于具有許多液泡。
13.根據(jù)權利要求12所述的化妝品組合物，其特征在于，使用選自下組中的溶劑來獲 得所述提取物蒸餾水、乙醇、丙酮、DMSO (二甲基亞砜)、以及其混合溶劑。
14.一種抗氧化功能性食品，其含有任意一種或多種來自紫杉形成層或原形成層且 具有以下特征的細胞系、其提取物、其裂解物和其培養(yǎng)基(a)其處于天生的未分化狀態(tài)；(b)其生長速度快于來自紫杉形成層或原形成層之外的組織的細胞系并被穩(wěn)定培 養(yǎng)；以及(c)其形態(tài)學特征在于具有許多液泡。
15.根據(jù)權利要求14所述的功能性食品，其特征在于，使用選自下組中的溶劑來獲得 所述提取物蒸餾水、乙醇、丙酮、DMSO (二甲基亞砜)、以及其混合容劑。
16.一種抗衰老功能性食品，其含有任意一種或多種來自紫杉形成層或原形成層且 具有以下特征的細胞系、其提取物、其裂解物和其培養(yǎng)基(a)其處于天生地未分化狀態(tài)；(b)其生長速度快于來自紫杉形成層或原形成層之外的組織的細胞系并被穩(wěn)定培 養(yǎng)；以及(c)其形態(tài)學特征在于具有許多液泡。
17.根據(jù)權利要求16所述的功能性食品，其特征在于，使用選自下組中的溶劑來獲得 所述提取物蒸餾水、乙醇、丙酮、DMSO (二甲基亞砜)、以及其混合溶劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有任意一種或多種紫杉形成層或原形成層的細胞系、其提取物、其裂解物以及其培養(yǎng)基的抗氧化劑、消炎劑或抗衰老組合物。根據(jù)本發(fā)明的組合物與現(xiàn)有抗氧化劑和抗炎劑相比具有最小的副作用，其涉及到細胞內新陳代謝從而減少細胞內活性氧簇，以及降低和誘發(fā)與衰老相關的信號。因此，本發(fā)明的組合物適用于預防和延緩衰老。此外，本發(fā)明的組合物還具有抑制黑素生成的效果，從而適于用作美白化妝品組合物。
文檔編號A61K36/13GK102099046SQ200980127544
公開日2011年6月15日 申請日期2009年5月14日 優(yōu)先權日2008年5月14日
發(fā)明者李大熙, 李恩景, 蘇恩美, 陳榮雨 申請人:云火公司