專利名稱：反義制劑的制作方法
反義制劑
背景技術：
1.發(fā)明領域本發(fā)明涉及一種室溫儲存穩(wěn)定的寡核苷酸液體制劑。更具體地，本發(fā)明涉及硫代 磷酸寡核苷酸的穩(wěn)定制劑，其設計結合Hsp27 mRNA，而Hsp27 mRNA也將聚集體形成減至最 少。2.相關領域說明Hsp-27反義寡核苷酸(ASO)設計結合Hsp27 mRNA以抑制人Hsp27蛋白產(chǎn)生。美 國專利7, 101，991描述了多種Hsp27 AS0。在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、目標pH 7. 4的等滲溶液中配制的0GX-427或Hsp27 ASO Seq. Id. No. 1劑量的早期動物研究顯示良好的生物效應。但是，在更高濃度的所述ASO下， 所述0GX-427制劑在室溫和冷凍條件下數(shù)天之后都形成非共價聚集，因此不適合臨床使 用。PBS配制溶液曾經(jīng)令人滿意地用于類似的反義產(chǎn)品(參見涉及凝聚素ASO的美國專利 6，900，187)，也曾經(jīng)期待相似的配制溶液可用于HSP27 AS0。但是如上面解釋以及下面顯 示，HSP27 ASO的PBS溶液不能實際用作臨床制劑。用于注射給藥ASO藥物產(chǎn)品的液體制劑習慣上冷凍以確保足夠的長期穩(wěn)定性。將 寡核苷酸制劑凍干成粉末(冷凍干燥)并在使用之前復原可用于提供具有足夠穩(wěn)定特性的 藥物產(chǎn)品輸送系統(tǒng)。但是，寡核苷酸的液體制劑具有顯著的商業(yè)利益，尤其是在環(huán)境(室 溫)條件下保持穩(wěn)定的制劑。美國專利出版物2003/0119768公開了關于靶向c_myc mRNA的15聚體反義序列， 即AACGTTGAGG GGCAT (Seq. ID No. 2)的發(fā)現(xiàn)。觀察到該序列包括4個連續(xù)的G殘基，進行 聚集以形成毒性增大的多聚體。因此所述出版物公開了在使用之前裂解所述多聚體。公開 的一種方法為凍干之前加入糖類冷凍保護劑例如甘露醇、蔗糖、葡萄糖、trialose或乳糖。 已發(fā)現(xiàn)這樣在用水復原時減少多聚體形成。但是沒有提供關于長期溶液穩(wěn)定性和避免聚集 的信息。不管其生物學效能如何，經(jīng)受聚集的ASO可能是公司藥物計劃的不適宜臨床候選 物，且不會進一步開發(fā)。但是，Hsp27 ASO的體內生物學特性非常適宜，因此做出努力以克 服在液體制劑中長時間儲存的聚集和穩(wěn)定性問題。另外，還應注意ASO藥物生產(chǎn)仍然昂貴，其儲存的浪費或成本的任何降低可能是 另外的利益，并可能使可商業(yè)化和不可商業(yè)化藥物產(chǎn)生差異。

發(fā)明內容
在試驗發(fā)現(xiàn)提供可接受的溶液穩(wěn)定性并減少具有Seq. ID No. 1的ASO非共價聚集 的制劑時，發(fā)現(xiàn)甘露醇(5%)能夠在溫度攝氏-20度到攝氏60度范圍內保持極低聚集水平 24周時間。當使用葡萄糖代替甘露醇時觀察到相似的結果。在此時間內總體穩(wěn)定性良好直 至攝氏40度。因此，本發(fā)明提供了一種室溫穩(wěn)定并極少聚集的藥物產(chǎn)品液體制劑，其包含 一種ASO和一種水相載體；其中所述ASO包含Seq ID No. 1或者包含一種變體寡核苷酸，所述變體寡核苷酸中不超過3個非序列堿基與Seq ID No. 1不同；所述水相載體包含一種防 止聚集的化合物，其選自單糖和二糖(例如葡萄糖和乳糖)，以及糖醇(例如甘露醇和山梨 糖醇)。在特定的實施方案中，所述ASO由Seq ID No. 1或者一種變體組成，所述變體中不 超過3個非序列堿基與Seq ID No. 1不同。所述載體也可包含磷酸鹽緩沖液或Tris緩沖 液。通過閱讀下面本發(fā)明特定實施方案的說明并結合附圖，本發(fā)明的其它方面和特征 對本領域技術人員是顯而易見的。


在說明本發(fā)明實施方案的附圖中，圖1為擴展HPLC色譜圖，其顯示磷酸鹽緩沖鹽水( 70-75mg/mL)中的0GX-427 在40°C儲存在第0、3、5天的兩個峰(左峰為0GX-427寡核苷酸單體，右峰為聚集)，表明聚 集隨時間增加。圖2為HPLC色譜圖，其顯示0GX-427寡核苷酸及其聚集(右峰)。從制備的溶液 中產(chǎn)生高度聚集的樣品(>50%)，其包含？85中的20011^/1^ 0GX-427，并在分析之前在環(huán) 境條件下老化4天。圖3為無緩沖5%葡萄糖水相制劑中25mg/mL的0GX-427在40°C在第0、3、5天的 擴展HPLC色譜圖(無緩沖5%甘露醇制劑產(chǎn)生實質相同的結果，參見表1)；圖4 為 Captisol 制劑中 25mg/mL 的 0GX-427 在 40°C在第 0、3、5 天的擴展 HPLC 色譜圖；顯示聚集形成增加。圖5為5種制劑在儲存溫度60°C的4周中的0GX-427主峰面積百分比純度( 25mg/mL)的繪圖表示，5種制劑即5%甘露醇(Vl)、5%甘露醇在IOmM Tris緩沖液pH 7.4 中(V2)、5%甘露醇在IOmM磷酸鈉緩沖液pH 7. 4中(V3)、5%葡萄糖(V4)、5%葡萄糖在 IOmM Tris 緩沖液 pH 7. 4 中(V5)；圖6為5%甘露醇和IOmM磷酸鈉緩沖液pH 7. 4制劑(V3)在溫度-20、2-8、25、40 和60°C在24周中穩(wěn)定性(以0GX-427濃度顯示)的繪圖表示；圖7為5%甘露醇和IOmM Tris緩沖液pH 7. 4制劑(V2)在溫度_20、2_8、25、40 和60°C在24周中穩(wěn)定性的繪圖表示；以及圖8為玻璃瓶中的對應穩(wěn)定性樣品(V1-V5)在12周時間點的照片。0GX-427在濃 度 25mg/mL的整體降解效果可簡單看作溶液的暗化。瓶19 = 5%甘露醇在IOmM磷酸鹽 緩沖液中或V3 ；瓶18 = 5%甘露醇在IOmM Tris緩沖液中或V2 ；瓶17 = 5%甘露醇或Vl ； 瓶16 = 5%葡萄糖在IOmM Tris緩沖液中或V5 ；以及瓶15 = 5%葡萄糖或V4。詳細說明在典型的寡核苷酸化合物中，磷酸鹽基團共價連接相互鄰近的核苷以形成線性 聚合化合物。在寡核苷酸結構中，磷酸鹽基團涉及形成寡核苷酸的核苷間主鏈。RNA和 DNA的正常鍵或主鏈為3’到5’磷酸二酯鍵。0GX-427為抑制熱休克蛋白27 (Hsp27)表達 的靶向ASO治療劑。0GX-427藥物物質或活性藥物成分(API)為具有硫代磷酸核苷酸間 鍵的合成寡核苷酸，其通常分類為4-12-4 MOE gapmer寡核苷酸(gapmer討論參見Isis Pharmaceuticals專利EP 0618925，通過引用結合到本文中，0GX-427詳細信息參見美國專利 7，101，991)。0GX-427 (Hsp27 ASO Seq. Id. No. 1)可表示為5，-GGGAMeCGMeCGGMeCGMeCTMeCGG-U-CA-U-3'其中下劃線標記的核苷迨、Δ、、和mW表示核糖核苷鳥苷、腺苷、5_甲基胞苷 和5-甲基尿苷的2’ -0-甲氧基乙基(2’ -Μ0Ε)修飾；其中G、feC、和T代表脫氧核糖核苷 2’ -脫氧鳥苷、2’ -脫氧-5-甲基胞苷、和2’ -脫氧胸苷；并且其中核苷酸間鍵為硫代磷酸 二酯(鈉鹽)。0GX-427 的 CAS 登記號(CAS#)為 915443-09-3，CAS 索弓丨名為"DNA, d(P-硫 代)([2，-0-(2-甲氧基乙基)]rG-[2，_0-(2_甲氧基乙基)]rG(-{2，_0-(2_甲氧基乙 基)]rG-[2，-0-(2-甲氧基乙基)]rA-m5rC-G-m5rC-G-G-m5rC-G-m5rC-T-m5rC-G-G-2‘ -0-(2-甲氧基乙基)]m5rU-{2，_0-(2_甲氧基乙基)]m5rC_[2，_0-(2_甲氧基乙基)] rA-[2' -0-(2-甲氧基乙基)]m5rU)，十九鈉鹽”。本發(fā)明致力于0GX-427制劑以及與0GX-427實質相同的反義治療劑制劑。因此， 所述制劑由Seq. ID No. 1組成，或者本發(fā)明制劑中的ASO由該序列的寡核苷酸變體組成，所 述變體中不超過3個非序列堿基相對于Seq. ID No. 1變化，其保留抑制Hsp27表達的能力。 所述ASO也可通過加入末端堿基而比Seq. ID No. 1或上述變體長，而仍然是寡核苷酸(長 度小于100堿基)并保留抑制Hsp27表達的能力。這種較長的寡核苷酸據(jù)說包含Seq. ID No. 1或該序列的寡核苷酸變體，其中不超過3個非序列堿基相對于Seq. ID No. 1變化。0GX-427的具體序列提示聚集受長度僅20的寡核苷酸序列中鳥苷核糖核苷(G)數(shù) 量影響的可能性。在0GX-427中有9個鳥苷殘基；其數(shù)量幾乎占該序列的50%。雖然申請 人無意受限于任何具體的聚集機制，聚集可能是由于強Watson-Crick互補堿基作用或者 由于高級結構形成。如上所述，配制0GX-427的初選為pH 7. 4的PBS溶液。在更高濃度下，溶液中觀 察到HPLC色譜中的附加峰；該峰后來確定為非共價聚集。傳聞歷史信息提示，具有潛在聚集問題的反義化合物基本還未開發(fā)，從而本領域 未留下如何解決聚集和低穩(wěn)定性問題的教導。因此申請人選擇可能的賦形劑以達到多種實驗要求必需的0GX-427可溶性和穩(wěn) 定性，以及0GX-427產(chǎn)品與靜脈(IV)給藥的相容性。0GX-427在PBS中在監(jiān)測條件和多種賦形劑類型中作為對照，假定賦形劑可能影 響0GX-427聚集。在氯化鈉或其它鹽存在下破壞形成的非共價聚集可幫助制劑設計。類似 地，環(huán)式糊精可封裝藥物，可能防止0GX-427聚集體形成。引入有機共溶劑可能破壞氫鍵結 合現(xiàn)象，否則聚集形成。在此類別中，通過OncoGenex明確知道DMSO幫助逆轉聚集形成。包 含單糖的制劑也可改變氫鍵結合作用以抑制聚集。篩選不同類型的賦形劑時已發(fā)現(xiàn)這些制 劑之間在防止Hsp27 ASO Seq. Id. No. 1聚集的能力方面差異顯著，如表1所示。雖然通常糖/糖醇在有限選擇中看起來是有希望的實驗成果，可能作為此類賦形 劑的代表。進一步的開發(fā)產(chǎn)生了多種原始制劑，包括包含甘露醇和葡萄糖的制劑，其經(jīng)定期 制備并研究聚集形成與總體穩(wěn)定性長達24周。所述研究的結果獲得了選擇的制劑甚至在 高達40°C儲存數(shù)周的情況下的穩(wěn)定性的顯著證據(jù)。該結果顯示一種可能的長期室溫儲存的 0GX-427液體制劑。
基于推斷一般反義寡核苷酸觀察的結果，相關化合物(“硫代磷酸寡核苷酸”)，尤 其是GC含量高的化合物，例如超過50 %，更具體地超過65 %，通過使用甘露醇、葡萄糖或者 其它糖或糖醇，以及可選的合適的緩沖液，例如本發(fā)明中的磷酸鹽緩沖液，可在液體制劑中 在室溫下穩(wěn)定。所述組合物優(yōu)選地用于一種方法，其中反義物在液體制劑中與糖或糖醇配制，并 保持在液體狀態(tài)超過6小時的時間，可選地超過12小時或18小時，在所述時間之后所述液 體制劑用作治療組合物。材料與方法設備HPLC系統(tǒng)為Shimadzu LC-10，帶有UV檢測和自動取樣器；以及Delta Pak HPLC 柱(C18 5μπι 300Α 2.1 X 150mm)?；瘜W藥品標準緩沖液、糖和溶劑例如D-甘露醇、葡萄糖、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸、 磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、四丁基硫酸氫銨、乙腈、山梨糖醇、乳糖、蔗糖、酒石酸、聚山梨醇 酯80、聚氧乙烯(20)、去水山梨糖醇單油酸酯、磷酸鹽緩沖液、PEG-300、PEG-400以及二 甲基乙酰胺，購自 Sigma (St. Louis，MO)，Aldrich (St. Louis, MO)，Spectrum Chemicals (Gardena, California)，VffR(West Chester, PA, JT Baker (Phillipsburg, NJ)。0GX-427由合同生產(chǎn)商為申請人生產(chǎn)。聚合物例如Cremphor EL聚乙氧基化蓖麻油、Poloxamer 407 α -氧-ω -羥基 聚(氧乙烯)、聚(氧丙烯)b聚(氧乙烯)a嵌段共聚物、聚乙二醇-聚丙二醇、以及丙二 醇，購自 BASF (Florsham Park, NJ)。Captisol ，一種環(huán)式糊精，為 CyDex(Lenexa，KS)的產(chǎn)品。方法Hsp27 ASO Seq. Id. No. 1為每次分析制備為標準物，其在無菌水中的濃度 為Hsp27 ASO Seq. Id. No. 1，置于25mL容量瓶。該溶液作為起始溶液用于 25-250 μ g/mL的稀釋物以建立5點線性曲線。每個校準點注入HPLC —次。RP-HPLC 方法研究中產(chǎn)生的樣品在柱溫度50°C通過反相(RP)-HPLC方法分析，使用流動相 “A”20mM四丁基硫酸氫銨和20mM Tris堿pH 7. 8 ；流動相“B”乙腈；以及流動相“C”水。流 速為0. 35mL/min。用水稀釋樣品至合適的濃度，轉移至HPLC瓶，在注入之前保持在冷卻的 自動取樣器中。注入量為101^，在26011111通過而吸收檢測。使用如上所述的HPLC方法評估Hsp27 ASO的穩(wěn)定性和聚集形成，并計算該化合物 在正常和聚集峰的百分比，或者記錄為濃度mg/mL。實施例1賦形劑篩選研究選擇支持的賦形劑以提供靜脈(IV)給藥液體和/或凍干制劑的可能性。0GX-427 的初始PBS制劑作為對照( 75mg/mL)。制劑在40°C和濃度75mg/mL下老化以模擬“加速條件”，依據(jù)是早前觀察在40°C比 在室溫和更高濃度下聚集更快。制備150mg/mL儲存溶液之后，使用制備的載體1 1稀釋等分樣品至研究目標濃度的2倍。最終溶液包含目標濃度 75mg/mL的0GX-427和賦形劑。每份樣品在1.5mL管 中制備，然后蓋上管并短暫渦旋以混合樣品。制備之后，樣品移至用于研究的40°C房間。所 有賦形劑(除了基于共溶劑的賦形劑)在用于0GX-427溶液制備之前過濾。所有研究樣品 在儲存溶液完成約60分鐘之內制備。HPLC樣品制備0GX-427溶液在水中稀釋1000倍以獲得750 μ g/mL樣品用于注入HPLC。樣品在制備(T = 0)和在40°C儲存5 (T = 5)天時記錄的信息如表1所示。第3 天或T = 3的結果未顯示但與T = 5的數(shù)據(jù)趨勢相同。圖3、4a和4b反映了葡萄糖、PBS、 和10% Captisol 制劑的結果。表1 在 40°C和濃度 75mg/mL 下儲存，Hsp27 ASO Seq. Id. No. 1 (0GX-427)在多種
賦形劑中在時間⑴=0和5天的聚集
權利要求
1.一種室溫穩(wěn)定并極少聚集的液體制劑，其包含(a)寡核苷酸，其包含^^ID No. 1或者包含變體寡核苷酸，所述變體寡核苷酸中不超 過3個非序列堿基與kq ID No. 1不同，以及(b)水相載體，其包含防止聚集的化合物，所述化合物選自單糖和二糖和/或糖醇。
2.根據(jù)權利要求1所述的制劑，其中所述載體進一步包含磷酸鹽緩沖液。
3.根據(jù)權利要求1所述的制劑，其中所述載體進一步包含Tris緩沖液。
4.根據(jù)權利要求1、2或3中任一權利要求所述的制劑，其中所述反義寡核苷酸由Seq ID No. 1或變體寡核苷酸組成，所述變體寡核苷酸中不超過3個非序列堿基與％(1 ID No. 1 不同。
5.根據(jù)權利要求4所述的制劑，其中所述寡核苷酸由具有如下修飾的ASeqID No. 1組成5，-GGGAMeCGMeCGGMeCGMeCTMeCGG-U-CA-U~3，其中下劃線標記的核苷迨、4、％、和aeH)表示核糖核苷鳥苷、腺苷、5-甲基胞苷和5-甲 基尿苷的2’ -0-甲氧基乙基(2’ -Μ0Ε)修飾；其中G、MeC和T代表脫氧核糖核苷2’ -脫氧 鳥苷、2’ -脫氧-5-甲基胞苷和2’ -脫氧胸苷；并且其中核苷酸間鍵為硫代磷酸二酯(鈉^Tt. ) ο
6.根據(jù)權利要求1到5中任一權利要求所述的制劑，其中所述防止聚集的化合物為甘露醇。
7.根據(jù)權利要求6所述的制劑，其中所述甘露醇在所述水相載體中的含量以重量計為5%。
8.根據(jù)權利要求1到5中任一權利要求所述的制劑，其中所述防止聚集的化合物為葡萄糖。
9.根據(jù)權利要求6所述的制劑，其中所述葡萄糖在所述水相載體中的含量以重量計為5%。
10.一種配制用于體內注射的反義寡核苷酸的方法，其包含將所述反義物在液體制劑 中與糖或糖醇混合，并將所述制劑保持在液體狀態(tài)超過6小時的時間，可選地超過12小時 或18小時，在所述時間之后所述液體制劑用作體內注射的治療組合物。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中所述反義物根據(jù)權利要求1到9中任一權利要 求配制。
12.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中所述反義物具有65%或更高的GC含量，例如 75%或更高。
全文摘要
一種室溫穩(wěn)定并極少聚集的液體制劑，其包含一種寡核苷酸和一種水相載體；其中所述寡核苷酸包含Seq ID No.1或者包含一種變體寡核苷酸，所述變體寡核苷酸中不超過3個非序列堿基與Seq ID No.1不同；所述水相載體包含一種防止聚集的化合物，其選自單糖和二糖和/或糖醇。
文檔編號A61K31/713GK102099041SQ200980128901
公開日2011年6月15日 申請日期2009年7月13日 優(yōu)先權日2008年7月18日
發(fā)明者L·尼克松, N·D·克里拉, T·K·海斯 申請人:Ogx科技公司