專(zhuān)利名稱(chēng)：抑制靶基因表達(dá)的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于抑制靶基因表達(dá)的組合物等。
背景技術(shù)：
作為抑制靶基因表達(dá)的方法，已知例如利用RNA干涉(RNAinterference，以下稱(chēng) 為RNAi)的方法等，具體而言，有報(bào)道指出通過(guò)在線蟲(chóng)中導(dǎo)入具有與靶基因相同的序列的 雙鏈RNA，可特異性地抑制該靶基因表達(dá)的現(xiàn)象[參見(jiàn)“自然(Nature)，，，1998年，第391 卷、第6669號(hào)，p. 806-811]。另外，發(fā)現(xiàn)通過(guò)在果蠅中導(dǎo)入21 23堿基長(zhǎng)度的雙鏈RNA代 替長(zhǎng)雙鏈RNA，可以抑制靶基因的表達(dá)，將其命名為短干擾RNA (short interfering RNA) (siRNA)(參見(jiàn)國(guó)際公開(kāi)第01/75164號(hào)說(shuō)明書(shū))。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中導(dǎo)入長(zhǎng)雙鏈RNA時(shí)，由于病毒防御機(jī)制引起細(xì)胞程序死亡，不能 抑制特定的基因表達(dá)，但發(fā)現(xiàn)只要為20 29堿基的siRNA，則不會(huì)引起上述反應(yīng)，可以抑 制特定基因的表達(dá)。其中21 25個(gè)堿基的siRNA的表達(dá)抑制效果高[“自然(Nature) ”，
2001年，第411 卷，第6836 號(hào)，p. 494-498，“遺傳學(xué)自然評(píng)論(Nature Reviews Genetics) ”，
2002年，第 3 卷，第 10 號(hào)，p. 737-747，“分子細(xì)胞(Molecular Cell) ”，(美國(guó))，2002 年，第 10 卷，第 3 號(hào)，p. 549-561，“ 自然生物技術(shù)(NatureBiotechnology) ”，(美國(guó))，2002 年，第 20卷，第5號(hào)，p. 497-500]。另外，已有報(bào)道指出，不僅是雙鏈RNA，具有通過(guò)分子內(nèi)雜交形 成的發(fā)夾(hairpin)結(jié)構(gòu)的單鏈RNA也與siRNA相同地顯示為RNAi [參見(jiàn)“美國(guó)國(guó)家科學(xué) 院院刊(Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America) ”，2002 年，第 99 卷，第 9 號(hào)，p. 6047-6052]。關(guān)于RNAi，在體內(nèi)試驗(yàn)中也經(jīng)常得到驗(yàn)證，已經(jīng)報(bào)道了對(duì)胎兒動(dòng)物使用50個(gè)堿基 對(duì)以下的siRNA的效果(參見(jiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)1)及對(duì)成體小鼠的效果(參見(jiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。另外， 靜脈內(nèi)給與小鼠胎鼠siRNA時(shí)，可確認(rèn)在腎臟、脾臟、肺、胰臟及肝臟各臟器內(nèi)具有抑制特 定基因表達(dá)的效果(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。并且，還報(bào)道了在腦細(xì)胞中直接給與siRNA，也能 抑制特定基因的表達(dá)(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。另一方面，作為向細(xì)胞內(nèi)輸送核酸的方法，已知有使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體或陽(yáng)離子聚 合物的方法。但是，該方法中，靜脈內(nèi)給與含有核酸的陽(yáng)離子脂質(zhì)體或陽(yáng)離子聚合物后，核 酸被迅速地從血中除去，靶組織為肝臟或肺以外的組織時(shí)，例如為腫瘤部位等時(shí)，不能將核 酸輸送到靶組織，不能夠充分地發(fā)揮作用。因此，已有報(bào)道指出一種包封核酸的脂質(zhì)體(在 脂質(zhì)體內(nèi)包封了核酸的脂質(zhì)體)可以解決核酸在血中被迅速地除去的問(wèn)題(參見(jiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn) 3 6及非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。作為包封核酸等的脂質(zhì)體的制備方法，專(zhuān)利文獻(xiàn)3中報(bào)道了如下方 法，即，例如將陽(yáng)離子性脂質(zhì)預(yù)先溶解在氯仿中，然后加入寡脫氧核苷酸(ODN)的水溶液和 甲醇，混合后，通過(guò)離心分離使陽(yáng)離子性脂質(zhì)/ODN的復(fù)合體移至氯仿層中，再取出氯仿層， 向其中加入聚乙二醇化磷脂、中性的脂質(zhì)和水，形成油包水型(W/0)乳劑，采用逆相蒸發(fā)法 處理，制備ODN內(nèi)包脂質(zhì)體，專(zhuān)利文獻(xiàn)4及非專(zhuān)利文獻(xiàn)3中報(bào)道了如下方法，即，將ODN溶解 于PH3. 8的檸檬酸水溶液中，加入脂質(zhì)(乙醇中)，使乙醇濃度降低至20v/v%，制備ODN內(nèi)包脂質(zhì)體，進(jìn)行定型過(guò)濾，通過(guò)透析除去過(guò)量的乙醇后，再在PH7. 5下透析試樣，除去附著 在脂質(zhì)體表面的ODN，制備ODN內(nèi)包脂質(zhì)體。上述方法均可制備包封核酸等有效成分的脂質(zhì) 體。 相對(duì)于此，在專(zhuān)利文獻(xiàn)5及6中報(bào)道了通過(guò)在液體中用脂雙層膜(lipid bilayer membrane)被覆微粒的方法，制備包封了核酸等有效成分的脂質(zhì)體。在該方法中，通過(guò)減少 含有分散有微粒且溶解了脂質(zhì)的極性有機(jī)溶劑的水溶液中的極性有機(jī)溶劑的濃度，可以在 液體中用脂雙層膜被覆微粒。該方法中，能夠以?xún)?yōu)異的效率制備例如適于靜脈注射用微粒 等的大小的用脂雙層膜被覆的微粒(被覆微粒)。另外，專(zhuān)利文獻(xiàn)5及6中，作為被覆微粒 的例子，例如舉出了由ODN或siRNA與陽(yáng)離子性脂質(zhì)構(gòu)成的通過(guò)靜電相互作用形成的復(fù)合 體。有報(bào)道指出被覆該粒子得到的被覆微粒的粒徑較小，可以用作注射劑，靜脈內(nèi)給與該被 覆微粒時(shí)，顯示較高的血中滯留性，較多地集聚在腫瘤組織。專(zhuān)利文獻(xiàn)1 美國(guó)公開(kāi)第2002-132788號(hào)專(zhuān)利文獻(xiàn)2 國(guó)際公開(kāi)第03/10180號(hào)說(shuō)明書(shū)專(zhuān)利文獻(xiàn)3 日本特表2002-508765號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)4 日本特表2002-501511號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)5 國(guó)際公開(kāi)第02/28367號(hào)說(shuō)明書(shū)專(zhuān)利文獻(xiàn)6 國(guó)際公開(kāi)第2006/080118號(hào)說(shuō)明書(shū)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1 “自然 遺傳學(xué)(Nature Genetics) ”，2002年，第32卷，第1號(hào)， P.107-108非專(zhuān)利文獻(xiàn)2 “自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology) ”，2002年，第20卷，第10 號(hào)，p. 1006-1010非專(zhuān)利文獻(xiàn)3 “生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)(Biochimica etBiophysica Acta)”， 2001 年，第 1510 卷，p. 152-16
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供用于抑制靶基因表達(dá)的組合物等。本發(fā)明涉及以下(1) (54)項(xiàng)發(fā)明。(1) 一種組合物，含有包封了 RNA的脂質(zhì)體，所述RNA含有靶基因mRNA的連續(xù)15 30個(gè)堿基的序列(以下記為序列X)及與該序列X互補(bǔ)的堿基的序列(以下記為互補(bǔ)序列 X’ )，與序列X及互補(bǔ)序列X’的堿基鍵合的糖的總計(jì)1 90%為在2’位上被修飾基團(tuán)取 代的核糖，所述脂質(zhì)體是可到達(dá)包含靶基因表達(dá)部位的組織或臟器的脂質(zhì)體。(2)如上述(1)所述的組合物，其中，所述脂質(zhì)體是具有可靜脈內(nèi)給藥的大小的脂 質(zhì)體。(3)如上述(1)或⑵所述的組合物，其中，所述RNA是具有利用RNA干涉(RNAi) 抑制該靶基因表達(dá)的作用的RNA。(4)如上述⑴ ⑶中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述靶基因是與腫瘤或炎癥 相關(guān)的基因。(5)如上述(1) (4)中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述靶基因是與血管新生 (angiogenesis)相關(guān)的基因。
(6)如上述⑴ (4)中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述靶基因是血管內(nèi)皮生長(zhǎng) 因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體、纖維芽細(xì)胞生長(zhǎng)因子、纖維芽細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、血小板衍 生生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、Kruppel樣 因子、Ets轉(zhuǎn)錄因子、核因子及低氧誘導(dǎo)因子中的任一種的基因。(7)如上述(1) (6)中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述mRNA為人或小鼠的 mRNA。 (8)如(1) (7)中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述包封了 RNA的脂質(zhì)體含 有復(fù)合粒子及被覆該復(fù)合粒子的脂雙層膜，所述復(fù)合粒子的構(gòu)成成分為前導(dǎo)粒子(lead particle)和該 RNA，該脂雙層膜的構(gòu)成成分可溶于極性有機(jī)溶劑，該脂雙層膜的構(gòu)成成分及該復(fù)合粒 子可以分散在以特定濃度含有該極性有機(jī)溶劑的液體中。(9)如⑶所述的組合物，其中，所述極性有機(jī)溶劑為醇。(10)如⑶所述的組合物，其中，所述極性有機(jī)溶劑為乙醇。(11)如(8) (10)中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述前導(dǎo)粒子是含有陽(yáng)離子性 物質(zhì)的前導(dǎo)粒子，所述脂雙層膜是以中性脂質(zhì)及水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物 或脂肪烴衍生物為構(gòu)成成分的脂雙層膜。(12)如⑴ (7)中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述包封了 RNA的脂質(zhì)體是含有 復(fù)合粒子及被覆該復(fù)合粒子的脂雙層膜的脂質(zhì)體，所述復(fù)合粒子以含有陽(yáng)離子性物質(zhì)的前 導(dǎo)粒子和該RNA為構(gòu)成成分，其中，該脂雙層膜是以中性脂質(zhì)及水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或脂 肪烴衍生物為構(gòu)成成分的脂雙層膜。(13)如(11)或(12)所述的組合物，其中，所述陽(yáng)離子性物質(zhì)為選自N_[l_(2， 3_ 二油酰丙基)]_N，N，N-三甲基氯化銨、N-[l-(2，3-二油酰丙基)]-N，N-二甲基胺、 N-[l-(2，3-二油基氧基丙基)]-N，N, N-三甲基氯化銨、N-[l-(2，3-雙十四烷氧基丙 基)]-N，N- 二甲基-N-羥乙基溴化銨及3 β - [N-(N’，N’ -二甲基氨基乙基)氨基甲酰基] 膽固醇中的一種以上。(14)如(11) (13)中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生 物、脂肪酸衍生物或脂肪烴衍生物為聚乙二醇_磷脂酰乙醇胺。(15)如(11) (14)中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述中性脂質(zhì)為卵黃卵磷脂。(16) 一種癌癥或炎癥疾病的治療劑，所述治療劑含有脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體含有復(fù) 合粒子及被覆該復(fù)合粒子的脂雙層膜，所述復(fù)合粒子以前導(dǎo)粒子和RNA為構(gòu)成成分，所述RNA含有與腫瘤或炎癥相關(guān)的 靶基因mRNA的連續(xù)15 30個(gè)堿基的序列(以下記為序列X1)及與該序列互補(bǔ)的堿基的 序列(以下記為互補(bǔ)序列X1')，與序列X1及互補(bǔ)序列X1'的堿基鍵合的糖的總計(jì)1 90% 為在2’位上被修飾基團(tuán)取代的核糖，其中，該脂雙層膜的構(gòu)成成分可溶于極性有機(jī)溶劑，該脂雙層膜的構(gòu)成成分及該 復(fù)合粒子能夠分散在以特定濃度含有該極性有機(jī)溶劑的液體中。(17)如(16)所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述極性有機(jī)溶劑為醇。(18)如(16)所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述極性有機(jī)溶劑為乙醇。
(19)如(16) (18)中任一項(xiàng)所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述前導(dǎo)粒 子為含有陽(yáng)離子性物質(zhì)的前導(dǎo)粒子，所述脂雙層膜是以中性脂質(zhì)及水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生 物、脂肪酸衍生物或脂肪烴衍生物為構(gòu)成成分的脂雙層膜。 (20) 一種癌癥或炎癥疾病的治療劑，所述治療劑含有復(fù)合粒子及被覆該復(fù)合粒子 的脂雙層膜，所述復(fù)合粒子以含有陽(yáng)離子性物質(zhì)的前導(dǎo)粒子和RNA為構(gòu)成成分，所述RNA含 有與腫瘤或炎癥相關(guān)的靶基因mRNA的連續(xù)15 30個(gè)堿基的序列(序列X1)及與該序列 互補(bǔ)的堿基的序列(互補(bǔ)序列X1')，與序列X1及互補(bǔ)序列X1'的堿基鍵合的糖的總計(jì)1 90%為在2’位上被修飾基團(tuán)取代的核糖，其中，該脂雙層膜是以中性脂質(zhì)及水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或脂 肪烴衍生物為構(gòu)成成分的脂雙層膜。(21)如(19)或(20)所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述陽(yáng)離子性物質(zhì) 為選自N-[1-(2，3-二油酰丙基)]-N，N，N-三甲基氯化銨、N-[1-(2，3-二油酰丙基)]-N， N-二甲基胺、N-[l-(2，3-二油基氧基丙基)]-N，N，N-三甲基氯化銨、N-[l-(2，3-雙十四烷 氧基丙基)]-N，N- 二甲基-N-羥乙基溴化銨及3 β - [N- (N’，N’ - 二甲基氨基乙基)氨基甲 酰基]膽固醇中的一種以上。(22)如(19) (21)中任一項(xiàng)所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述水溶性 物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烴衍生物為聚乙二醇_磷脂酰乙醇胺。(23)如(19) (22)中任一項(xiàng)所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述中性脂 質(zhì)為卵黃卵磷脂。(24)如(16) (23)中任一項(xiàng)所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述RNA是 具有利用RNA干涉(RNAi)抑制該靶基因表達(dá)的作用的RNA。(25)如(16) (23)中任一項(xiàng)所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，與腫瘤或炎 癥相關(guān)的靶基因是與血管新生相關(guān)的基因。(26)如(16) (23)中任一項(xiàng)所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述與腫瘤 或炎癥相關(guān)的靶基因是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體、纖維芽細(xì)胞生長(zhǎng)因子、 纖維芽細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、血小板衍生生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因 子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、Kruppel樣因子、Ets轉(zhuǎn)錄因子、核因子及低氧誘導(dǎo)因子中的任一 種的基因。(27)如(16) (26)中任一項(xiàng)所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述mRNA 是人或小鼠的mRNA。(28) 一種癌癥或炎癥疾病的治療方法，所述治療方法將含有脂質(zhì)體的組合物給與 哺乳動(dòng)物，所述脂質(zhì)體含有復(fù)合粒子及被覆該復(fù)合粒子的脂雙層膜所述復(fù)合粒子以前導(dǎo)粒子和RNA為構(gòu)成成分，所述RNA含有與腫瘤或炎癥相關(guān)的 靶基因mRNA的連續(xù)15 30個(gè)堿基的序列(序列X1)及與該序列互補(bǔ)的堿基的序列(互 補(bǔ)序列X1')，與序列X1及互補(bǔ)序列X1'的堿基鍵合的糖的總計(jì)1 90%為在2’位上被修 飾基團(tuán)取代的核糖，其中，該脂雙層膜的構(gòu)成成分可溶于極性有機(jī)溶劑，該脂雙層膜的構(gòu)成成分及該 復(fù)合粒子能夠分散在以特定濃度含有該極性有機(jī)溶劑的液體中。(29)如(28)所述的癌癥或炎癥疾病的治療方法，其中，所述極性有機(jī)溶劑為醇。
(30)如(28)所述的癌癥或炎癥疾病的治療方法，其中，所述極性有機(jī)溶劑為乙醇。 (31)如(28) (30)中任一項(xiàng)所述的癌癥或炎癥疾病的治療方法，其中，所述前導(dǎo) 粒子是含有陽(yáng)離子性物質(zhì)的前導(dǎo)粒子，所述脂雙層膜是以中性脂質(zhì)及水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍 生物、脂肪酸衍生物或脂肪烴衍生物為構(gòu)成成分的脂雙層膜。(32) 一種癌癥或炎癥疾病的治療方法，所述治療方法將組合物給與哺乳動(dòng)物，所 述組合物含有復(fù)合粒子及被覆該復(fù)合粒子的脂雙層膜，所述復(fù)合粒子以含有陽(yáng)離子性物質(zhì)的前導(dǎo)粒子和RNA為構(gòu)成成分，所述RNA含有 與腫瘤或炎癥相關(guān)的靶基因mRNA的連續(xù)15 30個(gè)堿基的序列(序列X1)及與該序列互補(bǔ) 的堿基的序列(互補(bǔ)序列X1')，與序列X1及互補(bǔ)序列X1'的堿基鍵合的糖的總計(jì)1 90% 為在2’位上被修飾基團(tuán)取代的核糖，其中，該脂雙層膜是以中性脂質(zhì)及水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或脂 肪烴衍生物為構(gòu)成成分的脂雙層膜。(33)如(31)或(32)所述的癌癥或炎癥疾病的治療方法，其中，所述陽(yáng)離子性物質(zhì) 為選自N-[1-(2，3-二油酰丙基)]-N，N，N-三甲基氯化銨、N-[1-(2，3-二油酰丙基)]-N， N-二甲基胺、N-[l-(2，3-二油基氧基丙基)]-N，N，N-三甲基氯化銨、N-[l-(2，3-雙十四烷 氧基丙基)]-N，N- 二甲基-N-羥乙基溴化銨及3 β - [N- (N’，N’ - 二甲基氨基乙基)氨基甲 ?；鵠膽固醇中的一種以上。(34)如(31) (33)中任一項(xiàng)所述的癌癥或炎癥疾病的治療方法，其中所述水溶 性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烴衍生物為聚乙二醇_磷脂酰乙醇胺。(35)如(31) (34)中任一項(xiàng)所述的癌癥或炎癥疾病的治療方法，其中，所述中性 脂質(zhì)為卵黃卵磷脂。(36)如(28) (35)中任一項(xiàng)所述的癌癥或炎癥疾病的治療方法，其中，所述RNA 是具有利用RNA干涉(RNAi)抑制該靶基因表達(dá)的作用的RNA。(37)如(28) (35)中任一項(xiàng)所述的癌癥或炎癥疾病的治療方法，其中，與腫瘤或 炎癥相關(guān)的靶基因是與血管新生相關(guān)的基因。(38)如(28) (35)中任一項(xiàng)所述的癌癥或炎癥疾病的治療方法，其中，所述與腫 瘤或炎癥相關(guān)的靶基因是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體、纖維芽細(xì)胞生長(zhǎng)因 子、纖維芽細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、血小板衍生生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體、肝細(xì)胞生 長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、Kruppel樣因子、Ets轉(zhuǎn)錄因子、核因子及低氧誘導(dǎo)因子中的 任一種的基因。(39)如(28) (38)中任一項(xiàng)所述的癌癥或炎癥疾病的治療方法，其中，mRNA是 人或小鼠的mRNA。(40) 一種組合物在制備癌癥或炎癥疾病的治療劑中的應(yīng)用，所述組合物含有脂質(zhì) 體，所述脂質(zhì)體含有復(fù)合粒子及被覆該復(fù)合粒子的脂雙層膜，所述復(fù)合粒子以前導(dǎo)粒子和RNA為構(gòu)成成分，所述RNA含有與腫瘤或炎癥相關(guān)的 靶基因mRNA的連續(xù)15 30個(gè)堿基的序列(序列X1)及與該序列互補(bǔ)的堿基的序列(互 補(bǔ)序列X1')，與序列X1及互補(bǔ)序列X1'的堿基鍵合的糖的總計(jì)1 90%為在2’位上被修 飾基團(tuán)取代的核糖，
其中，該脂雙層膜的構(gòu)成成分可溶于極性有機(jī)溶劑，該脂雙層膜的構(gòu)成成分及該 復(fù)合粒子能夠分散在以特定濃度含有該極性有機(jī)溶劑的液體中。(41)如(40)所述的應(yīng)用，其中，所述極性有機(jī)溶劑為醇。(42)如(40)所述的應(yīng)用，其中，所述極性有機(jī)溶劑為乙醇。 (43)如(40) (42)中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述前導(dǎo)粒子是含有陽(yáng)離子性物 質(zhì)的前導(dǎo)粒子，所述脂雙層膜是以中性脂質(zhì)及水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或 脂肪烴衍生物為構(gòu)成成分的脂雙層膜。(44) 一種組合物在制備癌癥或炎癥疾病的治療劑中的應(yīng)用，所述組合物含有復(fù)合 粒子及被覆該復(fù)合粒子的脂雙層膜，所述復(fù)合粒子以含有陽(yáng)離子性物質(zhì)的前導(dǎo)粒子和RNA為構(gòu)成成分，所述RNA含有 與腫瘤或炎癥相關(guān)的靶基因mRNA的連續(xù)15 30個(gè)堿基的序列(序列X1)及與該序列互補(bǔ) 的堿基的序列(互補(bǔ)序列X1')，與序列X1及互補(bǔ)序列X1'的堿基鍵合的糖的總計(jì)1 90% 為在2’位上被修飾基團(tuán)取代的核糖，其中，該脂雙層膜為以中性脂質(zhì)及水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或脂 肪烴衍生物為構(gòu)成成分的脂雙層膜。(45)如(43)或(44)所述的應(yīng)用，其中，所述陽(yáng)離子性物質(zhì)為選自N_[l_(2，3_ 二 油酰丙基)]-N，N，N-三甲基氯化銨、N-[1-(2，3-二油酰丙基)]-N，N-二甲基胺、N-[1-(2， 3-二油基氧基丙基)]-N，N, N-三甲基氯化銨、N-[l-(2，3-雙十四烷氧基丙基)]_N，N-二 甲基-N-羥乙基溴化銨及3 β-[N-(N’，N’ - 二甲基氨基乙基)氨基甲?；鵠膽固醇中的一 種以上。(46)如(43) (45)中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、 脂肪酸衍生物或脂肪烴衍生物為聚乙二醇_磷脂酰乙醇胺。(47)如(43) (46)中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述中性脂質(zhì)為卵黃卵磷脂。(48)如(40) (47)中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述RNA是具有利用RNA干涉 (RNAi)抑制該靶基因表達(dá)的作用的RNA。(49)如(40) (47)中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述與腫瘤或炎癥相關(guān)的靶基因 是與血管新生相關(guān)的基因。(50)如(40) (47)中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述與腫瘤或炎癥相關(guān)的靶基因 是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體、纖維芽細(xì)胞生長(zhǎng)因子、纖維芽細(xì)胞生長(zhǎng)因子 受體、血小板衍生生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 受體、Kruppel樣因子、Ets轉(zhuǎn)錄因子、核因子及低氧誘導(dǎo)因子中任一種的基因。(51)如(40) (50)中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述mRNA為人或小鼠的mRNA。(52) 一種測(cè)定血液中SiRNA濃度的方法，其特征在于，在含有SiRNA的試液中加入 與核酸形成復(fù)合體的試劑，使其與該siRNA形成電中性的復(fù)合體，分離該復(fù)合體并在再溶 解液中溶解，利用高效液相色譜法分析所得的溶液，由此測(cè)定該siRNA的濃度。(53)如(52)所述的血液中siRNA濃度的測(cè)定方法，其特征在于，使與被測(cè)定的 siRNA具有不同的堿基數(shù)的核酸作為IS共存在試液中。(54)如(52)或(53)所述的血液中siRNA濃度的測(cè)定方法，其特征在于，利用高效 液相色譜法進(jìn)行分析時(shí)使用的檢測(cè)裝置為質(zhì)譜儀。
通過(guò)將本發(fā)明的含有脂質(zhì)體的組合物給與哺乳動(dòng)物等，能夠抑制該靶基因的表 達(dá)，所述脂質(zhì)體包封有RNA，所述RNA含有靶基因RNA的連續(xù)15 30個(gè)堿基的序列及與該 序列互補(bǔ)的堿基序列。


[圖1]表示給與實(shí)施例1中所得的制劑時(shí)血液中的RNA濃度。橫軸表示給與制劑 后的時(shí)間(小時(shí))，縱軸表示血液中的RNA濃度(μ mol/L)。[圖2]表示給與比較例1中所得的制劑時(shí)血液中的RNA濃度。橫軸表示給與制劑 后的時(shí)間(小時(shí))，縱軸表示血液中的RNA濃度(μ mol/L)。[圖3]表示給與實(shí)施例2中所得的制劑時(shí)血液中的RNA濃度。橫軸表示給與制劑 后的時(shí)間(小時(shí))，縱軸表示血液中的RNA濃度(μ mol/L)。[圖4]表示給與實(shí)施例3中所得的制劑時(shí)血液中的RNA濃度。橫軸表示給與制劑 后的時(shí)間(小時(shí))，縱軸表示血液中的RNA濃度(μ mol/L)。[圖5]表示給與比較例2中所得的制劑時(shí)血液中的RNA濃度。橫軸表示給與制劑 后的時(shí)間(小時(shí))，縱軸表示血液中的RNA濃度(μ mol/L)。[圖6]表示給與實(shí)施例4中所得的制劑時(shí)血液中的RNA濃度。縱軸表示血液中的 RNA 濃度(μ mol/L)。[圖7]表示給與比較例3中所得的制劑時(shí)血液中的RNA濃度。縱軸表示血液中的 RNA 濃度(μ mol/L)。
具體實(shí)施例方式作為本發(fā)明中的靶基因，只要為在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生mRNA并進(jìn)行表達(dá)的基因即可， 沒(méi)有特殊的限制。例如，優(yōu)選與腫瘤或炎癥相關(guān)的基因，較優(yōu)選與血管新生相關(guān)的基因等， 例如可以舉出編碼血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，以下簡(jiǎn)稱(chēng) VEGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor rec印tor,以下簡(jiǎn) 稱(chēng)VEGFR)、纖維芽細(xì)胞生長(zhǎng)因子、纖維芽細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、血小板衍生生長(zhǎng)因子、血小板 衍生生長(zhǎng)因子受體、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、Kruppel樣因子(Kruppel-like factor，以下簡(jiǎn)稱(chēng)KLF)、Ets轉(zhuǎn)錄因子、核因子、低氧誘導(dǎo)因子等蛋白質(zhì)的基因等，具體而 言，可以舉出VEGF基因、VEGFR基因、纖維芽細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因、纖維芽細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體 基因、血小板衍生生長(zhǎng)因子基因、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體基因、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因、肝 細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體基因、KLF基因、Ets轉(zhuǎn)錄因子基因、核因子基因、低氧誘導(dǎo)因子基因等， 優(yōu)選舉出VEGF基因、VEGFR基因、KLF基因等，較優(yōu)選舉出KLF基因，更優(yōu)選舉出KLF5基因。KLF家族是以C末端的鋅指(zinc finger)基序?yàn)樘卣鞯霓D(zhuǎn)錄因子家族，已知 KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、 KLF15、KLF16等。有報(bào)道指出，在哺乳動(dòng)物中，KLF家族對(duì)各種組織或細(xì)胞例如紅細(xì)胞、血 管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌、皮膚、淋巴細(xì)胞等的分化十分重要，另外在癌癥、心血管疾病、肝硬化、 腎疾病、免疫疾病等各種疾病的病理?xiàng)l件的形成中也發(fā)揮重要的作用[生物化學(xué)雜志(The Journal of Biological Chemistry)，2001 年，第 276 卷，第 37 號(hào)，p. 34355-34358，基因組 生物學(xué)(Genome Biology)，2003 年，第 4 卷，第 2 號(hào)，p. 206]。
KLF家族中的KLF5也稱(chēng)為BTEB2 (基本轉(zhuǎn)錄元件結(jié)合蛋白(basic transcriptional element binding protein 2))或 IKLF (腸富集 Kruppel 樣因子 (intestinal-enriched Kruppel-Iike factor))。血管平滑肌中KLF5的表達(dá)在發(fā)生階段受 到抑制，在胎兒的血管平滑肌中高度表達(dá)，而在正常成人的血管平滑肌中未見(jiàn)表達(dá)。另外， 在用氣囊導(dǎo)管削剝后新生的血管內(nèi)膜的平滑肌中，可見(jiàn)KLF5高度表達(dá)，在動(dòng)脈硬化或再狹 窄的病變部的平滑肌中也可見(jiàn)KLF5表達(dá)[循環(huán)(Circulation)，2000年，第102卷，第20 號(hào)，p. 2528-2534]。VEGF是Ferrara等于1983年發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的增殖因子。同 年，Senger、Dvorak等發(fā)現(xiàn)了具有血管透過(guò)性作用的因子，并將其命名為VPF(vascular permeability factor)。從蛋白質(zhì)的氨基酸序列解析的結(jié)果可知，兩者是同一物質(zhì)。VEGF 與位于血管內(nèi)側(cè)的內(nèi)皮細(xì)胞的受體結(jié)合促進(jìn)增殖。VEGF不僅在胎兒期形成血管時(shí)發(fā)揮作 用，而且在病理血管的形成時(shí)也發(fā)揮作用。例如癌癥發(fā)展到某種程度并且變得氧不足時(shí)， VEGF和其受體增加，引起血管新生。另外血管透過(guò)性亢進(jìn)作用也被認(rèn)為是癌癥性腹水的原 因。VEGF在糖尿病發(fā)展時(shí)視網(wǎng)膜上的新生血管的形成上也發(fā)揮作用。即，VEGF是形成新血 管的蛋白質(zhì)?？梢哉f(shuō)VEGF的表達(dá)被低氧狀態(tài)所誘導(dǎo)，由此在血管新生中發(fā)揮重要作用。另 外，不僅是血管新生，通過(guò)對(duì)腫瘤或炎癥性病變等中出現(xiàn)的浮腫的機(jī)制進(jìn)行的說(shuō)明，也明顯 暗示出與該因子有關(guān)。另一方面，VEGFR存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞或癌癥細(xì)胞自身，通過(guò)VEGFR與受體結(jié)合， 受體自身被磷酸化(活化)，結(jié)果向細(xì)胞內(nèi)傳達(dá)增殖或移動(dòng)等各種命令。已知通過(guò)抑制該受 體的磷酸化可以抑制向細(xì)胞內(nèi)的傳達(dá)、從而抑制血管新生。另外，作為靶基因，例如可以舉出B-CELL CLL/LYMPH0MA(以下簡(jiǎn)稱(chēng)bcl)基因，優(yōu) 選舉出bcl2基因。Bcl-2是抑制在幾種細(xì)胞中由凋亡引起的細(xì)胞死亡的線粒體內(nèi)膜蛋白質(zhì)。Bcl-2 蛋白質(zhì)的大量表達(dá)引起的對(duì)凋亡的抑制被認(rèn)為是癌癥和血液學(xué)的惡性疾病等的原因。實(shí) 際上，Bcl-2蛋白質(zhì)在淋巴肉瘤、前列腺癌癥、乳癌癥、肺癌癥、結(jié)腸癌癥及直腸癌癥等多種 實(shí)體癌中大量產(chǎn)生(T. J. McDonnell 等、“Cancer Research”、1992 年 12 月 15 日，52 卷，24 號(hào)，p. 6940-6944)。另外，有報(bào)道指出胸腺的凋亡與Bcl_2的表達(dá)有關(guān)(Kanavaros et al.， Histol. Histopathol.16(4) 1005-12 (Oct.2001))。在大量產(chǎn)生Bcl-2蛋白質(zhì)的細(xì)胞中，由于其凋亡抑制作用使得無(wú)法誘導(dǎo)細(xì)胞死 亡，結(jié)果產(chǎn)生了對(duì)各種抗癌癥劑的抗藥性。另一方面，已知如果在前列腺癌癥細(xì)胞中抑 制Bcl-2的產(chǎn)生，則可以抑制細(xì)胞增殖，容易誘導(dǎo)凋亡(Shi et al. , Cancer Biother. Radiopharm. , 16 (5) :421_9 (Oct. 2001))。因此，在實(shí)體癌及血液學(xué)的惡性疾病等其治愈中 需要促進(jìn)凋亡的疾病中，抑制Bcl-2蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法可以作為有效的治療方法或預(yù)防 方法。作為本發(fā)明中使用的RNA，可以舉出含有上述靶基因mRNA的連續(xù)15 30個(gè)堿基、 優(yōu)選17 25個(gè)堿基、較優(yōu)選19 23個(gè)堿基的序列(以下記為序列X)及與該序列互補(bǔ) 的堿基的序列(以下記為互補(bǔ)序列X’)的RNA，例如，本發(fā)明中使用的RNA中，可以舉出由 含有序列X的有義鏈及含有互補(bǔ)序列X’的反義鏈組成的雙鏈RNA、或具有由間隔寡核苷酸 (spacer oligonucleotide)連接該有義鏈和該反義鏈形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA。
作為含有序列X的有義鏈，可以舉出只含有序列X作為堿基的RNA(以下記為序列 X鏈)、或者是在序列X鏈的3’端、5’端或兩端添加相同或不同的1 6個(gè)、優(yōu)選2 4個(gè) 核苷酸的RNA。作為含有互補(bǔ)序列V的反義鏈，可以舉出只含有互補(bǔ)序列V作為堿基的RNA(以 下記為互補(bǔ)序列X’鏈)、或者是在互補(bǔ)序列X’鏈的3’端、5’端或兩端添加相同或不同的 1 6個(gè)、優(yōu)選2 4個(gè)核苷酸的雙鏈RNA等。作為具有由間隔寡核苷酸連接含有序列X的有義鏈和含有互補(bǔ)序列X’的反義鏈 形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA的間隔寡核苷酸，優(yōu)選6 12個(gè)堿基的核苷酸，其5’端的序列優(yōu)選 為2個(gè)U。作為間隔寡核苷酸的例子，可以舉出由UUCAAGAGA的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸。 可以將通過(guò)間隔寡核苷酸連接的2個(gè)RNA中的任一個(gè)作為5’端，優(yōu)選含有序列X的有義鏈 作為5’端。序列X鏈及互補(bǔ)序列X’鏈中添加的核苷酸及間隔寡核苷酸的堿基可以為鳥(niǎo)嘌呤、 腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶中的任一種或多種，另外，與各個(gè)堿基鍵合的糖可以為 核糖、脫氧核糖或2’位的羥基被修飾基團(tuán)取代的核糖中的任一種，作為添加的核苷酸，較優(yōu) 選為尿苷酸(U)及脫氧胸苷酸(dT)中的任1種或2種。另外，添加到序列X鏈的3’端的 核苷酸的堿基序列可以為與在靶基因的mRNA內(nèi)與序列X相鄰的核苷酸的堿基序列相同的 堿基序列，較優(yōu)選該結(jié)構(gòu)。另外，添加到互補(bǔ)序列X’鏈的3’端的核苷酸的堿基序列可以為 與在靶基因的mRNA內(nèi)與序列X相鄰的核苷酸的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列，較優(yōu)選該結(jié)構(gòu)。作為本發(fā)明中使用的RNA的較優(yōu)選例，例如可以舉出下述雙鏈RNA等(a)由含有 序列X的有義鏈及含有互補(bǔ)序列X’的反義鏈構(gòu)成的雙鏈RNA，所述序列X是靶基因mRNA的 連續(xù)19 21個(gè)堿基的序列，所述有義鏈由序列X鏈及在該序列X鏈的3’端添加的相同或 不同的2 4個(gè)的核苷酸構(gòu)成，所述反義鏈由互補(bǔ)序列V鏈及在該互補(bǔ)序列V鏈的3’端 添加的相同或不同的2 4個(gè)的核苷酸構(gòu)成；(b)由含有序列X的有義鏈及含有互補(bǔ)序列 X’的反義鏈構(gòu)成的雙鏈RNA，所述序列X為靶基因mRNA的連續(xù)23 25個(gè)堿基的序列，所 述有義鏈為序列X鏈，所述反義鏈為互補(bǔ)序列X’鏈；(c)由含有序列X的有義鏈及含有互 補(bǔ)序列X’的反義鏈構(gòu)成的雙鏈RNA，所述序列X為靶基因mRNA的連續(xù)23 27個(gè)堿基的序 列，所述有義鏈由序列X鏈及在該序列X鏈的3’端添加的相同或不同的2 4個(gè)的核苷酸 構(gòu)成，所述反義鏈由互補(bǔ)序列X’鏈及在該互補(bǔ)序列X’鏈的3’端添加的相同或不同的2 4個(gè)的核苷酸構(gòu)成，互補(bǔ)序列V鏈的3’端添加的核苷酸的堿基序列是與在靶基因的mRNA 內(nèi)與序列X相鄰的核苷酸的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。另外，作為本發(fā)明中使用的RNA，優(yōu)選舉出具有利用RNA干涉(RNAi)抑制該靶基因 表達(dá)的作用的RNA。此處，以抑制Bcl2基因表達(dá)的RNA為例，對(duì)利用RNA干涉(RNAi)抑制靶基因表達(dá) 的RNA進(jìn)行說(shuō)明。抑制其他基因表達(dá)的RNA也可以通過(guò)相同的步驟獲得。抑制Bcl-2基因表達(dá)的RNA可以基于與作為GenbankAccessionNo. NM_000633被 登記的bcl-2的全長(zhǎng)mRNA相對(duì)應(yīng)的DNA堿基序列(序列號(hào)29)進(jìn)行設(shè)計(jì)。取出該DNA堿 基序列的連續(xù)15 30個(gè)堿基、優(yōu)選17 27個(gè)堿基、較優(yōu)選19 25個(gè)堿基的部分序列。 計(jì)算取出的序列的GC含量，選擇GC含量為20 80%、優(yōu)選為30% 70%、較優(yōu)選為40 60%的序列，將序列中的T被U取代的堿基序列作為序列X。由含有所選擇的序列X的有義鏈及含有與序列X為互補(bǔ)序列的互補(bǔ)序列X’的反義鏈構(gòu)成的雙鏈RNA、或具有由間隔寡核 苷酸連接該有義鏈和該反義鏈形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA為抑制bcl-2基因表達(dá)的RNA。進(jìn)而，本發(fā)明中使用的RNA中，與序列X及互補(bǔ)序列V的堿基鍵合的糖的總計(jì)1 90%、優(yōu)選10 75%、較優(yōu)選20 65%、最優(yōu)選30 55%為2，位上被修飾基團(tuán)取代的核糖。本發(fā)明中所謂的核糖的2’位被修飾基團(tuán)取代是指2’位的羥基被修飾基團(tuán)取代， 修飾基團(tuán)可以與核糖2’位的羥基的立體構(gòu)型相同或不同，優(yōu)選與核糖2’位的羥基的立體 構(gòu)型相同。與序列X及互補(bǔ)序列V的堿基鍵合的糖除2’位上被修飾基團(tuán)取代的核糖之外為 核糖或脫氧核糖，優(yōu)選除2’位上被修飾基團(tuán)取代的核糖之外的糖全部為核糖。本發(fā)明中使用的RNA，包括核糖核酸結(jié)構(gòu)中的磷酸部、酯部等中含有的氧原子等被 例如硫原子等其他原子取代得到的衍生物。另外，本發(fā)明中使用的與RNA的5’末端的堿基鍵合的糖的各自5’位的羥基可以 被磷酸基、修飾基團(tuán)、或通過(guò)生物體內(nèi)的核酸分解酶等變?yōu)榱姿峄蛐揎椈鶊F(tuán)的基團(tuán)修飾。 優(yōu)選與有義鏈的5’末端的堿基鍵合的糖的5’位羥基被磷酸化。另外，本發(fā)明中使用的與RNA的3’末端的堿基鍵合的糖的各自3’位的羥基可以 被磷酸基、修飾基團(tuán)、或通過(guò)生體內(nèi)的核酸分解酶等變?yōu)榱姿峄蛐揎椈鶊F(tuán)的基團(tuán)修飾。作為本發(fā)明中的修飾基團(tuán)，例如可以舉出2’-氰基、2’-烷基、2’-取代烷基、2’-鏈 烯基、2’ -取代鏈烯基、2’ -鹵素、2’ -0-氰基、2’ -0-烷基、2’ -0-取代烷基、2’ -0-鏈烯 基、2’ -0-取代鏈烯基、2’ -S-烷基、2’ -S-取代烷基、2’ -S-鏈烯基、2’ -S-取代鏈烯基、 2’ -氰基、2’ -NH-烷基、2’ -NH-取代烷基、2’ -NH-鏈烯基、2’ -NH-取代鏈烯基、2’ -SO-烷 基、2’ -SO-取代烷基、2’ -羧基、2’ -CO-烷基、-CO-取代烷基、-Se-烷基、-Se-取代烷 基、-SiH2-烷基、-SiH2-取代烷基、2，-ONO2,2' -NO2,2' _N3、2，-NH-烷基、2，-NH-取代烷基、 2’_氨基酸殘基(從氨基酸的羧酸中除去羥基得到的基團(tuán))、2’-0_氨基酸殘基(與上述氨 基酸殘基含義相同)，另外，本發(fā)明中2’位被修飾基團(tuán)取代的核糖也包括具有2’位的修飾 基團(tuán)與4’位的碳原子交聯(lián)的結(jié)構(gòu)的交聯(lián)結(jié)構(gòu)型人工核酸(Bridged Nucleic Acid) (BNA)， 更具體而言，也包括2’位的氧原子和4’位的碳原子通過(guò)亞甲基交聯(lián)得到的鎖定人工核酸 (Locked Nucleic Acid) (LNA)、及亞乙基交聯(lián)結(jié)構(gòu)型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid) (ΕΝΑ) [Nucleic Acid Research, 32, el75(2004)]等。作為本發(fā)明中的修飾基團(tuán)，優(yōu)選2’ -氰基、2’ -鹵素、2，-0-氰基、2’ -烷基、 2’ -取代烷基、2’ -0-烷基、2’ -0-取代烷基、2’ -0-鏈烯基、2’ -0-取代鏈烯基、-Se-烷 基、-Se-取代烷基，較優(yōu)選2，-氰基、2，-氟、2，-氯、2，-溴、2，-三氟甲基、2，-0-甲基、 2，-0-乙基、2，-0-異丙基、2，-0-三氟甲基、2，-0-[2-(甲氧基)乙基]、2，_0-(3_氨基 丙基)、2，-0-(2-[N，N-二甲基]氨基氧基)乙基、2，-0-[3-(N，N-二甲基氨基)丙基]、 2，-0-[2-[2-(N，N-二甲基氨基)乙氧基]乙基]及2，-0-[2-(甲基氨基)-2_氧代乙基]、 2，-Se-甲基等，更優(yōu)選2，-0-甲基、2，-0-乙基、2，-氟等，最優(yōu)選2，-0-甲基、2，-0-乙 基。另外，本發(fā)明中的修飾基團(tuán)的優(yōu)選范圍也可以基于其大小進(jìn)行定義，優(yōu)選相當(dāng)于 氟的大小至相當(dāng)于-ο- 丁基大小的修飾基團(tuán)，較優(yōu)選相當(dāng)于-ο-甲基大小至相當(dāng)于-ο-乙基大小的修飾基團(tuán)。作為修飾基團(tuán)中的烷基，例如為直鏈或支鏈狀的碳原子數(shù)1 6的烷基，例如可 以舉出甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、叔戊 基、己基等，優(yōu)選舉出甲基、乙基、丙基、異丙基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、叔戊 基等。作為修飾基團(tuán)中的鏈烯基，例如為直鏈或支鏈狀的碳原子數(shù)1 6的鏈烯基，例如可 以舉出乙烯基、烯丙基、異丙烯基等。作為鹵素，可以舉出氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。作為氨基酸，例如可以舉出脂肪族氨基酸(具體而言為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸等)、羥基氨基酸(具體而言為絲氨酸、蘇氨酸等)、酸性氨基酸(具體而 言為天冬氨酸、谷氨酸等)、酸性氨基酸酰胺(具體而言為天冬酰胺、谷氨酰胺等)、堿性氨 基酸(具體而言為賴(lài)氨酸、羥賴(lài)氨酸、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸等)、含硫氨基酸(具體而言為半胱氨 酸、胱氨酸、蛋氨酸等)、亞氨基酸(具體而言為脯氨酸、4-羥脯氨酸等)等。作為取代烷基及取代鏈烯基的取代基，例如可以舉出鹵素(與上述鹵素含義相 同)、羥基、硫基(sulfanyl)、氨基、氧代、-0-烷基(與上述烷基含義相同)、-S-烷基(與 上述烷基含義相同)、-NH-烷基(與上述烷基含義相同)、二烷基氨基氧基(所述2個(gè)烷基 相同或不同，與上述烷基含義相同)、二烷基氨基(所述2個(gè)烷基相同或不同，與上述烷基含 義相同)、二烷基氨基亞烷基氧基(所述2個(gè)烷基相同或不同，與上述烷基含義相同，該亞烷 基是指從上述烷基中除去氫所得的基團(tuán))等，取代數(shù)優(yōu)選為1 3。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中使用的RNA不依賴(lài)于制備方法、原料及中間體，例如即使 原料或中間體為DNA或脫氧核糖，但只要最終的結(jié)構(gòu)式相同，則也包括在本發(fā)明使用的RNA 中。即，本發(fā)明中核糖的2’位被脫氧的核糖包括脫氧核糖，2’位被修飾基團(tuán)取代的核糖包 括2’位的氫被修飾基團(tuán)取代的脫氧核糖。本發(fā)明中使用的RNA中，2’位被修飾基團(tuán)取代的核糖優(yōu)選以使相鄰的、2’位被修 飾基團(tuán)取代的核糖的數(shù)目最少的方式進(jìn)行分布，較優(yōu)選使2’位被修飾基團(tuán)取代的核糖間隔 1個(gè)、2個(gè)及3個(gè)位置進(jìn)行組合且所述核糖全部不相鄰地進(jìn)行分布。另外，特別是與序列X 的堿基鍵合的核糖中，較優(yōu)選30 55%的所述核糖為2’位被修飾基團(tuán)取代的核糖，且間隔 1個(gè)位置，全部不相鄰。另外，序列X及互補(bǔ)序列V中互補(bǔ)的堿基對(duì)中，相對(duì)于兩方均為2’位被修飾基團(tuán) 取代的核糖，優(yōu)選只在單側(cè)為2’位被修飾基團(tuán)取代的核糖，在上述的優(yōu)選方式中，最優(yōu)選間 隔1個(gè)、2個(gè)及3個(gè)位置組合上述2’位被修飾基團(tuán)取代的核糖，使上述2’位被修飾基團(tuán)取 代的核糖全部不相鄰地進(jìn)行分布。本發(fā)明中使用的RNA可以使用已知的RNA或DNA合成法及RNA或DNA修飾法進(jìn)行 制備。例如可以委托北海道System Science株式會(huì)社等進(jìn)行化學(xué)合成而得到。作為本發(fā)明的組合物中的脂質(zhì)體(以下稱(chēng)為脂質(zhì)體A)，優(yōu)選包封了 RNA的脂質(zhì)體， 所述RNA含有靶基因mRNA的連續(xù)15 30個(gè)堿基的序列及與該序列互補(bǔ)的堿基的序列。 該脂質(zhì)體A只要是能夠到達(dá)含有靶基因表達(dá)部位的組織或臟器的脂質(zhì)體即可，沒(méi)有特殊限 定，但由于已知一些脂質(zhì)體比其他脂質(zhì)體更容易到達(dá)組織或臟器，所以應(yīng)該適當(dāng)選擇脂質(zhì) 體A。作為本發(fā)明中使用的脂質(zhì)體A，例如可以舉出下述脂質(zhì)體，S卩，將陽(yáng)離子性脂質(zhì)/RNA的復(fù)合體分散在疏水性的有機(jī)溶劑層中，加入聚乙二醇化脂質(zhì)、中性脂質(zhì)和水，形成油 包水型(W/0)乳劑，利用逆相蒸發(fā)法處理而制備得到的脂質(zhì)體(參見(jiàn)日本特表2002-501511 號(hào)公報(bào))；將RNA溶解在酸性的電解質(zhì)水溶液中，加入脂質(zhì)(乙醇中)，降低乙醇濃度配制 內(nèi)含RNA的脂質(zhì)體，之后，提高樣品的pH并進(jìn)行透析，除去附著在脂質(zhì)體表面的上述RNA 而制備得到的脂質(zhì)體(參見(jiàn)日本特表2002-501511號(hào)公報(bào)及生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào) (Biochimica et Biophysica Acta)，2001 年，第 1510卷，p. 152-166)；由含有前導(dǎo)粒子和上 述RNA的復(fù)合粒子及包封該復(fù)合粒子的脂雙層膜構(gòu)成的脂質(zhì)體(參見(jiàn)國(guó)際公開(kāi)第02/28367 號(hào)說(shuō)明書(shū)及國(guó)際公開(kāi)第2006/080118號(hào)說(shuō)明書(shū))等，優(yōu)選由含有前導(dǎo)粒子和上述RNA的復(fù) 合粒子及包封該復(fù)合粒子的脂雙層膜構(gòu)成的脂質(zhì)體，較優(yōu)選該脂雙層膜的構(gòu)成成分可溶解 于極性有機(jī)溶劑中，并且該脂雙層膜的構(gòu)成成分及該復(fù)合粒子能夠分散在以特定濃度含有 該極性有機(jī)溶劑的液體中。另外，作為脂質(zhì)體A，優(yōu)選舉出由以含有陽(yáng)離子性物質(zhì)的前導(dǎo)粒 子和上述RNA為構(gòu)成成分的復(fù)合粒子、及被覆該復(fù)合粒子的脂雙層膜構(gòu)成，并且該脂雙層 膜以中性脂質(zhì)及水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烴衍生物為構(gòu)成成分的脂 質(zhì)體，較優(yōu)選該脂雙層膜的構(gòu)成成分可溶解于極性有機(jī)溶劑中，并且該脂雙層膜的構(gòu)成成 分及該復(fù)合粒子能夠分散在以特定濃度含有該極性有機(jī)溶劑的液體中。需要說(shuō)明的是，本 發(fā)明中所謂的分散是指不溶解而進(jìn)行分散。已有報(bào)道指出上述示例的脂質(zhì)體已被送達(dá)到腫瘤或產(chǎn)生炎癥的組織或臟器，具體 而言被送達(dá)到實(shí)體腫瘤及實(shí)體癌、血管或血管附近的炎癥部位等，以與腫瘤或炎癥相關(guān)的 基因?yàn)榘谢驎r(shí)，可以?xún)?yōu)選使用上述脂質(zhì)體。另外，已有報(bào)道指出上述示例的脂質(zhì)體在血液中的滯留性高，所以上述脂質(zhì)體通 過(guò)體循環(huán)送達(dá)到任意組織或臟器的可能性高，因此能作為靶基因的基因而不受限制。作為本發(fā)明中的前導(dǎo)粒子，例如可以舉出作為脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、高分子膠束等 的微粒，優(yōu)選舉出作為脂質(zhì)體的微粒。本發(fā)明中的前導(dǎo)粒子可以為組合脂質(zhì)集合體、脂質(zhì) 體、高分子膠束等中的2種以上得到的復(fù)合體，例如，可以為作為復(fù)合體的高分子膠束，所 述復(fù)合體含有為脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體等的構(gòu)成成分的脂質(zhì)；或者可以為作為復(fù)合體的脂質(zhì) 集合體、脂質(zhì)體等，所述復(fù)合體含有為高分子膠束的構(gòu)成成分的高分子。作為前導(dǎo)粒子的脂質(zhì)集合體或脂質(zhì)體(以下稱(chēng)為脂質(zhì)體B)，例如可以由脂質(zhì)及 /或表面活性劑等構(gòu)成，優(yōu)選由脂質(zhì)或脂質(zhì)及表面活性劑構(gòu)成。作為該脂質(zhì)，可以為單純 脂質(zhì)、復(fù)合脂質(zhì)或衍生脂質(zhì)中的任一種，例如可以舉出磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂、鞘氨醇?jí)A (sphingoid)、固醇或陽(yáng)離子性脂質(zhì)等，但不限定于此。優(yōu)選舉出磷脂或陽(yáng)離子性脂質(zhì)。另 外，作為脂質(zhì)，例如也可以含有表面活性劑(與下述的表面活性劑含義相同)、高分子(與 下述的高分子含義相同，具體而言為葡聚糖等)或聚氧乙烯衍生物(具體而言為聚乙二醇 等)等脂質(zhì)衍生物。作為表面活性劑，例如可以舉出非離子性表面活性劑、陰離子性表面活 性劑、陽(yáng)離子性表面活性劑或兩性表面活性劑等。作為上述構(gòu)成前導(dǎo)粒子的脂質(zhì)中的磷脂，例如可以舉出卵磷脂(具體而言為大 豆卵磷脂、卵黃卵磷脂(EPC)、二硬脂酰卵磷脂、二棕櫚酰卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二油 酰卵磷脂等)、磷脂酰乙醇胺(具體而言為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕櫚酰磷脂 酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺等)、甘油磷脂(具體而言為磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、磷脂 酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血卵磷脂等)、鞘磷脂(sphingophospholipid)(具體而言為鞘磷脂(sphingomyelin)、磷酸乙醇胺神經(jīng)酰胺、磷酸甘油神經(jīng)酰胺、神經(jīng)酰胺磷酸甘油磷酸酯 (ceramide phosphoglycerophosphate)等)、甘油月粦月旨(glycerophosphono lipid)、銷(xiāo)月粦月旨 (sphingophosphonolipid)、天然卵磷脂(具體而言為卵黃卵磷脂、大豆卵磷脂等)或氫化 磷脂(具體而言為氫化大豆卵磷脂等)等天然或合成的磷脂。作為上述構(gòu)成前導(dǎo)粒子的脂質(zhì)中的甘油糖脂，例如可以舉出磺氧基核糖基甘油酯 (sulfoxyribosyl glyceride)、二糖基二甘油酯、二半乳糖基二甘油酯、半乳糖基二甘油酯 或糖基二甘油酯等。作為上述構(gòu)成前導(dǎo)粒子的脂質(zhì)中的鞘糖脂，例如可以舉出半乳糖基腦苷脂、乳糖 基腦苷脂或神經(jīng)節(jié)苷脂等。作為上述構(gòu)成前導(dǎo)粒子的脂質(zhì)中的鞘氨醇?jí)A，例如可以舉出sphingan、 icosasphingan,鞘氨醇或它們的衍生物等。作為衍生物，例如可以舉出sphingan、 icosasphingan或鞘氨醇等中的-NH2變?yōu)?NHCO (CH2) xCH3 (式中，χ表示0 18的整數(shù)，其 中優(yōu)選6、12或18)的衍生物等。作為上述構(gòu)成前導(dǎo)粒子的脂質(zhì)中的固醇，例如可以舉出膽固醇、二氫膽固醇、羊毛 固醇、β-谷固醇、菜油留醇、豆留醇、菜籽留醇、麥角鈣化留醇(ergocasterol)、巖藻甾醇 或3β-[Ν-(Ν，，Ν，- 二甲基氨基乙基)氨基甲?；鵠膽固醇(DC-Chol)等。作為上述構(gòu)成前導(dǎo)粒子的脂質(zhì)中的陽(yáng)離子性脂質(zhì)，例如可以舉出Ν-[1_(2，3-二 油酰丙基)]_Ν，N，N-三甲基氯化銨(D0TAP)、^[1-(2，3-二油酰丙基)]-隊(duì)N-二甲基胺 (D0DAP)、N-[l-(2，3-二油基氧基丙基)]-Ν，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)、2，3-二油酰氧 基-N-[2-(精胺羧基酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙基三氟乙酸銨(DOSPA)、Ν-[1-(2， 3-雙十四烷氧基丙基)]-N，N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(DMRIE)或N_[l_(2，3-二油基氧 基丙基)]-N，N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(DORIE)等。作為上述構(gòu)成前導(dǎo)粒子的非離子性表面活性劑，例如可以舉出聚氧乙烯脫水山梨 糖醇單油酸酯(具體而言為聚山梨酸酯80等)、聚氧乙烯聚氧化丙烯二醇(具體而言為普 魯洛尼克(Pluronic)F68等)、脫水山梨糖醇脂肪酸酯(具體而言為脫水山梨糖醇單月桂酸 酯、脫水山梨糖醇單油酸酯等)、聚氧乙烯衍生物(具體而言為聚氧乙烯氫化蓖麻油60、聚 氧乙烯月桂醇等)或甘油脂肪酸酯等。作為上述構(gòu)成前導(dǎo)粒子的陰離子性表面活性劑，例如可以舉出酰肌氨酸、烷基硫 酸鈉、烷基苯磺酸鹽、碳原子數(shù)7 22的脂肪酸鈉等。具體而言可以舉出十二烷基硫酸鈉、 月桂基硫酸鈉、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉或?；敲撗跄懰徕c等。作為上述構(gòu)成前導(dǎo)粒子的陽(yáng)離子性表面活性劑，例如可以舉出烷基胺鹽、酰基胺 鹽、季銨鹽、胺衍生物等。具體而言可以舉出苯扎氯銨、?；被一一符}、N-烷基 聚烷基聚胺鹽、脂肪酸聚乙烯聚酰胺、十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基三甲基溴化銨、烷 基聚氧乙烯胺、N-烷基氨基丙基胺或脂肪酸三乙醇胺脂肪酸酯等。作為上述構(gòu)成前導(dǎo)粒子的兩性表面活性劑，例如可以舉出3-[(3_膽酰胺丙基)二 甲基銨基]-1-丙磺酸或N-十四烷基-N，N- 二甲基-3-銨基-1-丙磺酸等。脂質(zhì)體B中，上述脂質(zhì)及表面活性劑可以單獨(dú)使用或組合2種以上進(jìn)行使用，優(yōu)選 組合2種以上進(jìn)行使用。作為組合2種以上進(jìn)行使用時(shí)的組合，例如可以舉出選自氫化大 豆卵磷脂、聚乙二醇化磷脂及膽固醇中的2種成分以上的組合。選自二硬脂酰卵磷脂、聚乙二醇化磷脂及膽固醇中的2種成分以上的組合，EPC和DOTAP的組合，EPC, DOTAP及聚乙二 醇化磷脂的組合，EPC、D0TAP、膽固醇及聚乙二醇化磷脂的組合等。另外，脂質(zhì)體B可以根據(jù)需要含有例如膽固醇等固醇等膜穩(wěn)定化劑，例如生育酚 等抗氧化劑等。上述穩(wěn)定化劑可以單獨(dú)使用或者組合2種以上進(jìn)行使用。作為脂質(zhì)集合體，例如可以舉出球狀膠束、球狀逆膠束、臘腸狀膠束、臘腸狀逆 膠束、板狀膠束、板狀逆膠束、六角相I、六角相II及由2分子以上的脂質(zhì)構(gòu)成的締合 體、乳液微粒(例如脂肪乳劑、由非離子性表面活性劑和大豆油構(gòu)成的乳劑、脂質(zhì)乳劑 (Iipidemulsion)、脂質(zhì)納米球(lipid nanosphere)等水包油型(0/W)乳劑或水包油包水 型(W/0/W)乳液微粒等)。作為高分子膠束，例如可以舉出由蛋白質(zhì)、白蛋白、葡聚糖、polyfect、脫乙酰殼多 糖、硫酸葡聚糖和例如聚-L-賴(lài)氨酸、聚乙烯亞胺、聚天冬氨酸、苯乙烯馬來(lái)酸共聚物、異丙 基丙烯酰胺-丙烯?；量┩橥簿畚?、聚乙二醇修飾的樹(shù)枝狀高分子(dendrimer)、聚 乳酸、聚乳酸聚乙二醇酸或聚乙二醇化聚乳酸等高分子或它們的鹽中的一種以上形成的膠
束ο此處，高分子的鹽，包括例如金屬鹽、銨鹽、酸加成鹽、有機(jī)胺加成鹽、氨基酸加成 鹽等。作為金屬鹽，例如可以舉出鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽，鎂鹽、鈣鹽等堿土金屬鹽，鋁 鹽或鋅鹽等。作為銨鹽，例如可以舉出銨或四甲基銨等的鹽。作為酸加成鹽，例如可以舉出 鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽或磷酸鹽等無(wú)機(jī)酸鹽，及乙酸鹽、馬來(lái)酸鹽、富馬酸鹽或檸檬酸鹽等 有機(jī)酸鹽。作為有機(jī)胺加成鹽，例如可以舉出嗎啉或哌啶等的加成鹽。作為氨基酸加成鹽， 例如可以舉出甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或賴(lài)氨酸等的加成鹽。另外，本發(fā)明中的前導(dǎo)粒子可以含有選自例如糖、肽、核酸及水溶性高分子中的1 種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性劑等。選自糖、肽、核酸及水溶性高 分子中的1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性劑可以作為前導(dǎo)粒子的 構(gòu)成成分使用，也可以添加到前導(dǎo)粒子中使用。作為選自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸 衍生物、或表面活性劑，優(yōu)選舉出糖脂質(zhì)、或水溶性高分子的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物， 較優(yōu)選舉出水溶性高分子的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物。選自糖、肽、核酸及水溶性高分子 中的1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性劑優(yōu)選為具有兩性的物質(zhì)， 即分子的一部分具有通過(guò)例如疏水性親和力、靜電相互作用等與前導(dǎo)粒子的其他構(gòu)成成分 鍵合的性質(zhì)，另一部分具有通過(guò)例如親水性親和力、靜電相互作用等與制備前導(dǎo)粒子時(shí)的 溶劑鍵合的性質(zhì)。作為糖、肽或核酸的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物，可以舉出例如蔗糖、山梨糖醇、 乳糖等糖，例如來(lái)自酪蛋白的肽、來(lái)自蛋白的肽、來(lái)自大豆的肽、谷胱甘肽等肽，或者例如 DNA、RNA、質(zhì)粒、siRNA, ODN等核酸，與上述前導(dǎo)粒子定義中舉出的脂質(zhì)或例如硬脂酸、棕櫚 酸、肉豆蔻酸、月桂酸等脂肪酸鍵合得到的物質(zhì)等。另外，作為糖的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物，也包括例如上述前導(dǎo)粒子的定義中 舉出的甘油糖脂或鞘糖脂等。作為水溶性高分子的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物，例如可以舉出聚乙二醇、聚甘 油、聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、寡糖、糊精、水溶性纖維素、葡聚糖、硫酸軟骨素、聚甘油、脫乙酰殼多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚天冬酰胺(polyaspartate amide)、 聚-L-賴(lài)氨酸、甘露聚糖、茁霉多糖、甘油低聚物(oligoglycerol)等或它們的衍生物，與上 述前導(dǎo)粒子的定義中舉出的脂質(zhì)、或例如硬脂酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、或月桂酸等脂肪酸鍵 合得到的衍生物等，較優(yōu)選舉出聚乙二醇衍生物、聚甘油衍生物等的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸 衍生物，更優(yōu)選舉出聚乙二醇衍生物的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物。作為聚乙二醇衍生物的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物，例如可以舉出聚乙二醇化脂 質(zhì)(具體而言有聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(更具體而言有1，2_二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷 酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000] (PEG-DSPE)等)、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、聚氧 乙烯蓖麻油(CREM0PH0REL)等)、聚乙二醇脫水山梨糖醇脂肪酸酯類(lèi)(具體而言為聚氧乙烯 脫水山梨糖醇單油酸酯等)或聚乙二醇脂肪酸酯類(lèi)等，較優(yōu)選舉出聚乙二醇化脂質(zhì)。作為聚甘油衍生物的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物，例如可以舉出聚甘油化脂質(zhì) (具體而言為聚甘油-磷脂酰乙醇胺等)或聚甘油脂肪酸酯類(lèi)等，較優(yōu)選舉出聚甘油化脂 質(zhì)。作為表面活性劑，例如可以舉出上述前導(dǎo)粒子的定義中舉出的表面活性劑、聚乙 二醇烷基醚等，優(yōu)選舉出聚氧乙烯聚氧化丙烯二醇、甘油脂肪酸酯或聚乙二醇烷基醚等。優(yōu)選上述前導(dǎo)粒子帶有正電荷。此處所謂的正電荷包括對(duì)上述RNA內(nèi)的電荷、分 子內(nèi)極化等產(chǎn)生靜電引力的電荷、表面極化等。為了使前導(dǎo)粒子帶有正電荷，優(yōu)選前導(dǎo)粒子 含有陽(yáng)離子性物質(zhì)，較優(yōu)選前導(dǎo)粒子含有陽(yáng)離子性脂質(zhì)。前導(dǎo)粒子中含有的陽(yáng)離子性物質(zhì)為呈現(xiàn)陽(yáng)離子性的物質(zhì)，但即使是具有陽(yáng)離子性 基團(tuán)和陰離子性基團(tuán)的兩性物質(zhì)，由于相對(duì)電負(fù)性根據(jù)PH或與其他物質(zhì)鍵合等而變化，所 以根據(jù)不同情況，可分類(lèi)為陽(yáng)離子性物質(zhì)。上述陽(yáng)離子性物質(zhì)可以作為前導(dǎo)粒子的構(gòu)成成 分使用，也可以添加到前導(dǎo)粒子中加以使用。作為陽(yáng)離子性物質(zhì)，例如可以舉出上述前導(dǎo)粒子的定義中舉出的物質(zhì)中的陽(yáng)離子 性物質(zhì)[具體而言，有陽(yáng)離子性脂質(zhì)、陽(yáng)離子性表面活性劑(與上述含義相同)、陽(yáng)離子性 高分子等]、能夠在等電點(diǎn)以下的PH值下呈現(xiàn)陽(yáng)離子性的蛋白質(zhì)或肽等。優(yōu)選舉出選自 N-[1-(2，3-二油酰丙基)]-N，N，N-三甲基氯化銨、N-[1-(2，3-二油酰丙基)]-N，N-二甲 基胺、N-[l-(2，3-二油基氧基丙基)]-N，N，N-三甲基氯化銨、N-[l-(2，3-雙十四烷氧基丙 基)]-N，N- 二甲基-N-羥乙基溴化銨及3 β - [N-(N’，N’ -二甲基氨基乙基)氨基甲?；鵠 膽固醇中的一種以上。作為脂質(zhì)中的陽(yáng)離子性物質(zhì)，例如可以舉出DOTAP、DODAP, DOTMA, DOSPA, DMRIE, DORIE 或 DC-Chol 等。作為陽(yáng)離子性高分子，例如可以舉出聚-L-賴(lài)氨酸、聚乙烯亞胺、polyfect或脫乙 酰殼多糖等。作為能夠在等電點(diǎn)以下的ρΗ值下呈現(xiàn)陽(yáng)離子性的蛋白質(zhì)或肽，只要為能夠在該 物質(zhì)的等電點(diǎn)以下的PH值下呈現(xiàn)陽(yáng)離子性的蛋白質(zhì)或肽即可，沒(méi)有特殊限定。作為該蛋白 質(zhì)或肽，例如可以舉出白蛋白、血清類(lèi)粘蛋白、球蛋白、血纖維蛋白原、胃蛋白酶或核糖核酸 酶Tl等。本發(fā)明中的前導(dǎo)粒子可以采用公知的制備方法或以其為基準(zhǔn)進(jìn)行制備，可以是使 用任意制備方法制備得到的前導(dǎo)粒子。例如，作為前導(dǎo)粒子之一的脂質(zhì)體B的制備可以適用公知的脂質(zhì)體的制備方法。作為公知的脂質(zhì)體的制備方法，例如可以舉出Bangham等的 脂質(zhì)體制備方法[參見(jiàn)“分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.) ”，1965年，第13卷，p. 238-252]、 乙醇注入法[參見(jiàn)“細(xì)胞生物學(xué)雜志(J. CellBiol.) ”，1975年，第66卷，p. 621-634]、法式 壓濾法(French pressmethod)[參見(jiàn) “FEBS Lett. ”，1979 年，第 99 卷，p. 210-214]、冷凍 融解法[參見(jiàn)“生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)(Arch. Biochem. Biophys.) ”，1981年，第212卷， p. 186-194]、逆相蒸發(fā)法[參見(jiàn)“美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 1978 年，第75卷，p. 4194-4198]或pH梯度法(參見(jiàn)例如日本專(zhuān)利第2572554號(hào)公報(bào)，日本專(zhuān)利 第沈59136號(hào)公報(bào)等)等。制備脂質(zhì)體B時(shí)，作為使脂質(zhì)體B分散的溶液，例如可以使用水、 酸、堿、各種緩沖液、生理鹽水、氨基酸輸液等。另外，制備脂質(zhì)體B時(shí)，也可以添加例如檸檬 酸、抗壞血酸、半胱氨酸或乙二胺四乙酸(EDTA)等抗氧化劑，例如甘油、葡萄糖、氯化鈉等 等滲劑等。另外，可以如下制備脂質(zhì)體，將脂質(zhì)等溶解于例如乙醇等有機(jī)溶劑中，蒸餾除去 溶劑后，添加生理鹽水等，振動(dòng)攪拌，形成脂質(zhì)體B。另外，也可以任意地通過(guò)例如非離子性表面活性劑(與上述含義相同)、陽(yáng)離子性 表面活性劑(與上述含義相同)、陰離子性表面活性劑(與上述含義相同)、高分子、聚氧 乙烯衍生物等進(jìn)行脂質(zhì)體B等的前導(dǎo)粒子的表面改質(zhì)[參見(jiàn)D. D. Lasic, F. Martin編寫(xiě)的 "Stealth Liposomes”(美國(guó))，CRC Press Inc，1995 年，p. 93-102]。作為可在表面改質(zhì)中 使用的高分子，例如可以舉出葡聚糖、茁霉多糖、甘露聚糖、支鏈淀粉(amylopectin)或羥 乙基淀粉等。作為聚氧乙烯衍生物，例如可以舉出聚山梨酸酯80、普魯洛尼克F68、聚氧乙 烯氫化蓖麻油60、聚氧乙烯月桂醇或PEG-DSPE等。脂質(zhì)體B等的前導(dǎo)粒子的表面改質(zhì)也可 以通過(guò)使前導(dǎo)粒子含有選自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物 或脂肪酸衍生物、或表面活性劑的方法中的一種進(jìn)行。脂質(zhì)體B的平均粒徑可以根據(jù)需要自由地選擇。優(yōu)選調(diào)節(jié)為下述前導(dǎo)粒徑。作 為調(diào)節(jié)脂質(zhì)體B的平均粒徑的方法，例如可以舉出擠壓延伸(extrusion)法、機(jī)械式粉 碎(具體而言，使用蒙頓膠體磨、超微粒分散乳化機(jī)等)較大的多層脂質(zhì)體(MLV)的方法 [參見(jiàn) R. H. Muller、S. Benita、B. Bohm 編著的"Emulsion andNanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs”，德國(guó)斯圖力口特，Scientific Publishers, 1998 年，p. 267-294]等。另外，將選自作為前導(dǎo)粒子的例如脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體B、高分子膠束等中的2種 以上物質(zhì)組合得到的復(fù)合體的制備方法，例如可以為只在水中混合脂質(zhì)、高分子等的制備 方法，根據(jù)需要也可以進(jìn)一步加入整粒工序或無(wú)菌化工序等。另外，也可以在例如丙酮或乙 醚等各種溶劑中進(jìn)行復(fù)合體的制備。本發(fā)明中的前導(dǎo)粒子的大小，優(yōu)選平均粒徑為數(shù)nm 數(shù)十ym，較優(yōu)選約為 IOnm lOOOnm，更優(yōu)選約為50nm 300nm。作為本發(fā)明中被覆含有前導(dǎo)粒子和RNA的復(fù)合粒子的脂雙層膜的構(gòu)成成分，例如 可以舉出上述前導(dǎo)粒子的定義中舉出的脂質(zhì)或表面活性劑等，優(yōu)選舉出脂質(zhì)或表面活性劑 中的中性脂質(zhì)，此處，上述所謂中性脂質(zhì)，是指下述物質(zhì)之外的脂質(zhì)，即脂質(zhì)、表面活性劑 中，上述前導(dǎo)粒子帶有正電荷時(shí)陽(yáng)離子性物質(zhì)中列舉的脂質(zhì)中的陽(yáng)離子性物質(zhì)和陽(yáng)離子性 表面活性劑及下述的附著競(jìng)爭(zhēng)劑中列舉的陰離子性脂質(zhì)和陰離子性表面活性劑之外的脂 質(zhì)，作為中性脂質(zhì)，優(yōu)選舉出磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂等。較優(yōu)選舉出磷脂，更優(yōu)選舉出EPC。上述脂質(zhì)或表面活性劑可以單獨(dú)使用或者組合2種以上進(jìn)行使用。另外，被覆復(fù)合粒子的脂雙層膜的構(gòu)成成分優(yōu)選可溶于極性有機(jī)溶劑，并且優(yōu)選 能夠分散在以特定濃度含有該極性有機(jī)溶劑的液體中。以特定濃度含有該極性溶劑的液體 中的該極性溶劑的濃度優(yōu)選該脂雙層膜的構(gòu)成成分能夠分散、該復(fù)合粒子也能夠分散的濃 度。作為該極性有機(jī)溶劑，例如可以舉出甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、正丁醇、2-丁醇、叔丁 醇等醇，甘油、乙二醇、丙二醇等二醇，或聚乙二醇等聚亞烷基二醇等，其中，優(yōu)選醇，較優(yōu)選 乙醇。作為本發(fā)明中的含有極性有機(jī)溶劑的液體中的、極性有機(jī)溶劑之外的溶劑，例如 可以舉出水、液體二氧化碳、液烴、鹵化碳或鹵化烴等，優(yōu)選舉出水。另外，也可以含有離子 或緩沖成分等?？梢允褂?種或2種以上的溶劑，但使用2種以上時(shí)，優(yōu)選相容的組合。另外，作為被覆復(fù)合粒子的脂雙層膜中使用的脂質(zhì)，例如也可以?xún)?yōu)選舉出合成脂 質(zhì)等。作為合成脂質(zhì)，例如可以舉出氟化卵磷脂、氟化表面活性劑或溴化二烷基銨等，上述 物質(zhì)可以單獨(dú)使用也可以與其他脂質(zhì)等組合使用。另外，被覆復(fù)合粒子的脂雙層膜優(yōu)選含有水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生 物或脂肪烴衍生物、或上述表面活性劑。作為水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或 脂肪烴衍生物，例如可以舉出選自上述的糖、肽、核酸及水溶性高分子中的1種以上物質(zhì)的 脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者選自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的1種以上物質(zhì)的脂 肪烴衍生物。作為水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烴衍生物，較優(yōu)選上述 水溶性高分子的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物，更優(yōu)選上述聚乙二醇化磷脂，最優(yōu)選聚乙二 醇-磷脂酰乙醇胺。需要說(shuō)明的是，作為本發(fā)明中的水溶性物質(zhì)的脂肪烴衍生物，可以舉出 水溶性物質(zhì)與例如長(zhǎng)鏈脂肪醇、聚氧丙烯烷烴或甘油脂肪酸酯的醇性殘基等鍵合形成的衍 生物。作為糖、肽或核酸的脂肪烴衍生物，可以舉出下述物質(zhì)的脂肪烴衍生物，例如蔗 糖、山梨糖醇或乳糖等糖、例如來(lái)自酪蛋白的肽、來(lái)自蛋白的肽、來(lái)自大豆的肽或谷胱甘肽 等肽、或者例如DNA、RNA、質(zhì)粒、siRNA或ODN等核酸。作為水溶性高分子的脂肪烴衍生物，可以舉出例如聚乙二醇、聚甘油、聚乙烯亞 胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、寡糖、糊精、水溶性纖維素、葡聚糖、硫酸軟骨素、聚甘 油、脫乙酰殼多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚天冬酰胺、聚-L-賴(lài)氨酸、甘露聚糖、茁霉多糖、甘油 低聚物等或它們的衍生物的脂肪烴衍生物，較優(yōu)選舉出聚乙二醇衍生物或聚甘油衍生物等 的脂肪烴衍生物，更優(yōu)選舉出聚乙二醇衍生物的脂肪烴衍生物。前導(dǎo)粒子是作為脂質(zhì)體B的微粒時(shí)，含有以脂質(zhì)體B和上述RNA為構(gòu)成成分的復(fù) 合粒子及被覆該復(fù)合粒子的脂雙層膜的脂質(zhì)體成為脂質(zhì)體A，根據(jù)其構(gòu)成，分類(lèi)為狹義的脂 質(zhì)體，即使前導(dǎo)粒子是除作為脂質(zhì)體B的微粒之外的微粒時(shí)，也由于被覆脂雙層膜，所以被 分類(lèi)為廣義的脂質(zhì)體。在本發(fā)明中，較優(yōu)選前導(dǎo)粒子是作為脂質(zhì)體B的微粒。本發(fā)明中以前導(dǎo)粒子和上述RNA為構(gòu)成成分的復(fù)合粒子，可以在制備該前導(dǎo)粒 子后或在制備該前導(dǎo)粒子的同時(shí)，將該RNA附著在前導(dǎo)粒子上或包封在前導(dǎo)粒子中，制備 復(fù)合粒子，然后在制備該復(fù)合粒子后或制備該復(fù)合粒子的同時(shí)，用脂雙層膜被覆該復(fù)合粒 子，由此制備脂質(zhì)體A。脂質(zhì)體A例如可以根據(jù)日本特表2002-508765號(hào)公報(bào)、日本特表 2002-501511 號(hào)公報(bào)、“Biochimica et BiophysicaActa", 2001 年，第 1510 卷，p. 152-166、國(guó)際公開(kāi)第02/28367號(hào)說(shuō)明書(shū)等中記載的公知制備方法或以其為基準(zhǔn)進(jìn)行制備，或者例 如采用包括下述工序的制備方法進(jìn)行制備，所述工序?yàn)閷⑸鲜鯮NA附著在前導(dǎo)粒子上或 包封在前導(dǎo)粒子中制備復(fù)合粒子后，使該復(fù)合粒子及被覆層成分分散于液體中的工序，所 述液體含有可溶解該被覆層成分的極性有機(jī)溶劑，其濃度為該復(fù)合粒子不溶解、該被覆層 成分以分散狀態(tài)存在的濃度；及用該被覆層成分被覆該復(fù)合粒子的工序。本發(fā)明中以前導(dǎo) 粒子和上述RNA為構(gòu)成成分的復(fù)合粒子優(yōu)選如下制備在水中制備前導(dǎo)粒子，在制備該前 導(dǎo)粒子后或制備該前導(dǎo)粒子的同時(shí)，將上述RNA分散或者溶解在水中并與前導(dǎo)粒子混合， 使該RNA附著在前導(dǎo)粒子上或包封在前導(dǎo)粒子中制備復(fù)合粒子，或者在任意的溶劑中制備 前導(dǎo)粒子后，將該前導(dǎo)粒子分散在水中，將上述RNA分散或溶解于水中并與前導(dǎo)粒子混合， 使該RNA附著在前導(dǎo)粒子上進(jìn)行制備，較優(yōu)選在水中制備前導(dǎo)粒子，制備該前導(dǎo)粒子后，將 上述RNA分散或溶解于水中并與上述前導(dǎo)粒子混合，使該RNA附著在前導(dǎo)粒子上進(jìn)行制備。作為本發(fā)明的組合物中的脂質(zhì)體A的優(yōu)選制備方法，可以舉出包括下述工序的制 備方法，所述工序?yàn)橄率龅闹苽湟郧皩?dǎo)粒子和上述RNA為構(gòu)成成分的復(fù)合粒子的工序(工 序1)及用脂雙層膜被覆該復(fù)合粒子的工序(工序2或工序3)。工序1)制備以前導(dǎo)粒子和上述RNA為構(gòu)成成分的復(fù)合粒子的工序優(yōu)選將前導(dǎo)粒子分散在例如水等溶劑中，通過(guò)混合將上述RNA分散或溶解而使其 包含在分散有前導(dǎo)粒子的液體中，由此使該RNA附著在前導(dǎo)粒子上。在工序1中，為了抑制 前導(dǎo)粒子的凝集，優(yōu)選前導(dǎo)粒子為含有凝集抑制物質(zhì)的前導(dǎo)粒子，作為凝集抑制物質(zhì)，優(yōu)選 舉出選自上述糖、肽、核酸及水溶性高分子中的1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生 物、或表面活性劑。另外，前導(dǎo)粒子為帶有正電荷的粒子時(shí)，在分散有前導(dǎo)粒子的溶液中，可 以使該RNA和附著競(jìng)爭(zhēng)劑共存，使附著競(jìng)爭(zhēng)劑與該RNA —同附著在前導(dǎo)粒子上，進(jìn)而前導(dǎo)粒 子為含有凝集抑制物質(zhì)的前導(dǎo)粒子時(shí)，為了進(jìn)一步抑制前導(dǎo)粒子的凝集，也可以使用附著 競(jìng)爭(zhēng)劑。作為前導(dǎo)粒子和上述RNA的組合，優(yōu)選復(fù)合粒子能夠分散在含有極性有機(jī)溶劑的 液體中的組合，較優(yōu)選復(fù)合粒子在極性有機(jī)溶劑中的溶解度低于工序2或3中使用的脂雙 層膜的構(gòu)成成分的組合。另外，較優(yōu)選在含有該極性有機(jī)溶劑的液體中存在以下述濃度含 有該極性有機(jī)溶劑的液體的組合，以所述濃度含有該極性有機(jī)溶劑時(shí)該脂雙層膜構(gòu)成成分 能夠分散、該復(fù)合粒子也能分散。作為附著競(jìng)爭(zhēng)劑，例如可以舉出陰離子性物質(zhì)等，該陰離子性物質(zhì)包括通過(guò)分子 內(nèi)電荷、分子內(nèi)極化等產(chǎn)生的靜電引力而靜電地附著在前導(dǎo)粒子上的物質(zhì)。用作附著競(jìng)爭(zhēng) 劑的陰離子性物質(zhì)為呈陰離子性的物質(zhì)，但即使是含有陰離子性基團(tuán)和陽(yáng)離子性基團(tuán)二者 的兩性物質(zhì)，由于通過(guò)PH或與其他物質(zhì)結(jié)合等使相對(duì)電負(fù)性發(fā)生變化，所以根據(jù)情況可被 分類(lèi)為陰離子性物質(zhì)。作為陰離子性物質(zhì)，可以舉出陰離子性脂質(zhì)、陰離子性表面活性劑(與上述含義 相同)、陰離子性高分子等或在等電點(diǎn)以上的PH值下呈陰離子性的蛋白質(zhì)、肽或核酸等，優(yōu) 選舉出硫酸葡聚糖、葡聚糖硫酸鈉、硫酸軟骨素、軟骨素硫酸鈉、透明質(zhì)酸、軟骨素、硫酸皮 膚素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角質(zhì)素或葡聚糖葡聚糖熒光素陰離子等。上述陰離子性物 質(zhì)可以單獨(dú)使用或者組合2種以上進(jìn)行使用。作為陰離子性脂質(zhì)，例如可以舉出磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或磷脂酸等。
作為陰離子性高分子，例如可以舉出聚天冬氨酸、苯乙烯馬來(lái)酸共聚物、異丙基丙 烯酰胺-丙烯?；量┩橥簿畚?、聚乙二醇修飾的樹(shù)枝狀高分子、聚乳酸、聚乳酸聚乙二 醇酸、聚乙二醇化聚乳酸、硫酸葡聚糖、葡聚糖硫酸鈉、硫酸軟骨素、軟骨素硫酸鈉、透明質(zhì) 酸、軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角質(zhì)素或葡聚糖葡聚糖熒光素陰離子寸。作為在等電點(diǎn)以上的pH值下呈陰離子性的蛋白質(zhì)或肽，只要是在該物質(zhì)的等電 點(diǎn)以上的PH值下呈陰離子性的蛋白質(zhì)或肽即可，沒(méi)有特殊限定。例如可以舉出白蛋白、血 清類(lèi)粘蛋白、球蛋白、血纖維蛋白原、組蛋白、精蛋白、核糖核酸酶或溶菌酶等。作為為陰離子性物質(zhì)的核酸，例如可以舉出DNA、RNA、質(zhì)粒、siRNA或ODN等，只要 為不顯示生理活性的物質(zhì)即可，可以為任意長(zhǎng)度、任意序列。優(yōu)選附著競(jìng)爭(zhēng)劑靜電地附著在前導(dǎo)粒子上，優(yōu)選大小為即使附著在前導(dǎo)粒子上也 不形成使前導(dǎo)粒子凝集之類(lèi)的交聯(lián)的物質(zhì)，或者在分子內(nèi)具有附著部分、和排斥附著、抑制 前導(dǎo)粒子凝集的部分的物質(zhì)。工序1，更具體而言可以采用例如下述的制備方法實(shí)施，所述制備方法包括如下 步驟，即制備分散有含有凝集抑制物質(zhì)的前導(dǎo)粒子的液體的步驟、及在分散有該前導(dǎo)粒子 的液體中使上述RNA分散或溶解而包含在液體中的步驟(例如，在分散有該前導(dǎo)粒子的液 體中，加入該RNA使其分散或溶解的步驟，在分散有該前導(dǎo)粒子的溶液中，加入分散或溶解 有該RNA的液體的步驟等)。此處，作為通過(guò)在分散有前導(dǎo)粒子的液體中使上述RNA分散 或溶解而包含在液體中的工序所獲得的復(fù)合粒子，具體而言可以舉出下述復(fù)合離子，即，該 RNA附著在作為含有該陽(yáng)離子性物質(zhì)的脂質(zhì)體B的微粒上而形成的復(fù)合粒子，上述RNA附著 在作為含有陽(yáng)離子性物質(zhì)的脂質(zhì)集合體的微粒上而形成的復(fù)合粒子，上述RNA附著在作為 含有聚-L-賴(lài)氨酸等陽(yáng)離子性高分子的高分子的微粒上而形成的復(fù)合粒子。另外，在分散 有前導(dǎo)粒子的液體中使上述RNA分散或溶解而包含在液體中的步驟，優(yōu)選為使在分散或溶 解有該RNA的液體中進(jìn)一步含有附著競(jìng)爭(zhēng)劑并將其加入到分散有該前導(dǎo)粒子的液體中的 步驟。此時(shí)，該RNA和該附著競(jìng)爭(zhēng)劑一同附著在該前導(dǎo)粒子上，制備復(fù)合粒子，由此能夠在 進(jìn)一步抑制該復(fù)合粒子制備中前導(dǎo)粒子的凝集、及制備后復(fù)合粒子的凝集的前提下進(jìn)行制 備。前導(dǎo)粒子在分散有前導(dǎo)粒子的液體中所占的比例，只要上述RNA能夠附著在前導(dǎo) 粒子上即可，沒(méi)有特殊的限制，優(yōu)選約為1 μ g/mL lg/mL，較優(yōu)選約為0. 1 500mg/mL。工序2、用脂雙層膜被覆復(fù)合粒子的工序(1)可以通過(guò)包含以下步驟的制備方法制備脂質(zhì)體A，所述步驟包括制備含有極性有 機(jī)溶劑的液體(液體A)的步驟，所述極性有機(jī)溶劑中分散有工序1所得的復(fù)合粒子且溶解 了脂雙層膜的構(gòu)成成分，以及通過(guò)減小液體A中極性有機(jī)溶劑的濃度，用脂雙層膜被覆復(fù) 合粒子的步驟。此時(shí)，以分散液(液體B)的形態(tài)獲得脂質(zhì)體A。優(yōu)選液體A中的溶劑是含有 極性有機(jī)溶劑的溶劑，極性有機(jī)溶劑的濃度為該脂雙層膜構(gòu)成成分可以溶解、該復(fù)合粒子 可以分散的濃度，在減小液體A中極性有機(jī)溶劑的濃度而得到的液體B中，該脂雙層膜的構(gòu) 成成分可以分散，該復(fù)合粒子也可以分散。液體A中的溶劑為極性有機(jī)溶劑與除極性有機(jī) 溶劑之外的溶劑的混合液時(shí)，通過(guò)加入例如含有能夠與極性有機(jī)溶劑混合的除極性有機(jī)溶 劑之外的溶劑(液體C)，及/或通過(guò)蒸餾除去、半透膜分離、分餾等選擇性地除去極性有機(jī)溶劑，能夠減小極性有機(jī)溶劑的濃度。此處，優(yōu)選液體C含有除極性有機(jī)溶劑之外的溶劑， 也可以含有極性有機(jī)溶劑，只要該極性有機(jī)溶劑的濃度低于液體A中極性有機(jī)溶劑的濃度 即可。作為工序2中的除極性有機(jī)溶劑之外的溶劑，例如可以舉出水、液體二氧化碳、液 烴、鹵化碳或鹵化烴等，優(yōu)選舉出水。另外，液體A及液體C可以含有離子或緩沖成分等。上 述溶劑可以單獨(dú)使用或者組合2種以上進(jìn)行使用。極性有機(jī)溶劑和除極性有機(jī)溶劑之外的溶劑的組合，優(yōu)選為可以相互混合的溶劑 的組合，并可以根據(jù)在液體A及液體B中的溶劑及液體C中復(fù)合粒子和脂雙層膜的構(gòu)成成 分的溶解度等進(jìn)行選擇。優(yōu)選復(fù)合粒子在液體A及液體B中的溶劑及液體C中的溶解度 均低，還優(yōu)選在極性有機(jī)溶劑及除極性有機(jī)溶劑之外的溶劑中的溶解度也低。脂雙層膜的 構(gòu)成成分優(yōu)選在液體B中的溶劑及液體C中的溶解度低，優(yōu)選在液體A的溶劑中的溶解度 高，并且優(yōu)選在極性有機(jī)溶劑中的溶解度高，優(yōu)選在除極性有機(jī)溶劑之外的溶劑中的溶解 度低。此處，所謂“復(fù)合粒子的溶解度低”是指復(fù)合粒子中含有的前導(dǎo)粒子、RNA及附著競(jìng)爭(zhēng) 劑等各成分在溶劑中的溶出性小，即使各成分各自的溶解度高，只要通過(guò)各成分間的鍵合 等使得各成分的溶出性變小也可以。例如，即使為前導(dǎo)粒子中含有的任意成分在液體A的 溶劑中的溶解度高的情況，在前導(dǎo)粒子帶有正電荷時(shí)，通過(guò)RNA內(nèi)的電荷、分子內(nèi)極化等靜 電鍵合能夠抑制復(fù)合粒子中的成分溶出，由此可以降低復(fù)合粒子在液體A的溶劑中的溶解 度。即，在脂質(zhì)體A的制備中，前導(dǎo)粒子帶正電荷能夠抑制復(fù)合粒子的成分溶出，具有提高 制備性和成品性的效果。液體A中極性有機(jī)溶劑的濃度，只要脂雙層膜的構(gòu)成成分可溶且復(fù)合粒子可以分 散即可，沒(méi)有特殊的限制，根據(jù)所用的溶劑或復(fù)合粒子、脂雙層膜的構(gòu)成成分的種類(lèi)等的不 同而不同，優(yōu)選約為30V/V%以上，較優(yōu)選約為60 90V/V%。另外，液體B中的極性有機(jī) 溶劑的濃度，只要以比液體A低的濃度含有該極性有機(jī)溶劑，且脂雙層膜的構(gòu)成成分及復(fù) 合粒子都可分散即可，沒(méi)有特殊的限制，優(yōu)選約為50v/v%以下。作為制備液體A的工序，可以舉出下述工序，S卩，混合極性有機(jī)溶劑、復(fù)合粒子及 脂雙層膜的構(gòu)成成分、并根據(jù)需要混合除極性有機(jī)溶劑之外的溶劑來(lái)制備液體A。只要復(fù)合 粒子不溶解，則加入極性有機(jī)溶劑、復(fù)合粒子及脂雙層膜的構(gòu)成成分、及根據(jù)需要加入的除 極性有機(jī)溶劑之外的溶劑的順序沒(méi)有特殊限制，但優(yōu)選舉出下述工序，即，例如制備含有分 散有該復(fù)合粒子的極性有機(jī)溶劑的液體(液體D)，制備使該脂雙層膜的構(gòu)成成分溶解于含 有與液體D中的極性有機(jī)溶劑相同或不同的極性有機(jī)溶劑的溶劑中的液體(液體E)，再混 合液體D和液體E進(jìn)行制備。混合液體D和液體E制備液體A時(shí)，優(yōu)選緩緩地混合。工序幻用脂雙層膜被覆復(fù)合粒子的工序O)通過(guò)含有如下步驟的制備方法，可以制備脂質(zhì)體A，此時(shí)，脂質(zhì)體A以分散液的狀 態(tài)獲得，所述步驟為使工序1所得的復(fù)合粒子及脂雙層膜的構(gòu)成成分分散于液體(液體F) 中，所述液體F含有可以溶解該脂雙層膜的構(gòu)成成分的極性有機(jī)溶劑，其濃度為該脂雙層 膜的構(gòu)成成分可以以分散狀態(tài)存在的濃度。需要說(shuō)明的是，液體F中含有可以溶解該脂雙 層膜的構(gòu)成成分的極性有機(jī)溶劑，是以該脂雙層膜的構(gòu)成成分及復(fù)合粒子均可以分散的特 定濃度含有該極性有機(jī)溶劑的液體。液體F的制備方法可以采取任意方案。例如可以在制備復(fù)合粒子的分散液、和脂雙層膜的構(gòu)成成分的溶解液或分散液之后，將兩種液體混合，制備液體F;也可以制備復(fù)合 粒子或脂雙層膜的構(gòu)成成分中任一方的分散液，在此分散液中加入固態(tài)的復(fù)合粒子或脂雙 層膜的構(gòu)成成分的另一方，使其分散，制備液體F。在將復(fù)合粒子的分散液和脂雙層膜構(gòu)成 成分的溶解液或分散液混合時(shí)，復(fù)合粒子的分散介質(zhì)可以預(yù)先含有極性有機(jī)溶劑，脂雙層 膜的構(gòu)成成分的溶劑或分散介質(zhì)可以為含有極性有機(jī)溶劑的液體或只由極性有機(jī)溶劑構(gòu) 成的液體。另一方面，制備復(fù)合粒子或脂雙層膜的構(gòu)成成分中任一方的分散液，在該分散液 中加入固態(tài)的復(fù)合粒子或脂雙層膜的構(gòu)成成分的另一方的情況下，該分散液優(yōu)選為含有極 性有機(jī)溶劑的液體。需要說(shuō)明的是，制備液體F后復(fù)合粒子不溶解、脂雙層膜的構(gòu)成成分分 散時(shí)，可以在復(fù)合粒子不溶解、脂雙層膜的構(gòu)成成分分散的極性有機(jī)溶劑濃度的范圍內(nèi)，加 入極性有機(jī)溶劑，也可以除去極性有機(jī)溶劑或減小濃度。另一方面，制備液體F后復(fù)合粒子 不溶解，但脂雙層膜的構(gòu)成成分溶解的情況下，可以在復(fù)合粒子不溶解、脂雙層膜的構(gòu)成成 分分散的極性有機(jī)溶劑濃度的范圍內(nèi)，除去極性有機(jī)溶劑或減小濃度。另外，可以預(yù)先在 除極性有機(jī)溶劑之外的溶劑中混合復(fù)合粒子和脂雙層膜的構(gòu)成成分，可以在復(fù)合粒子不溶 解、脂雙層膜的構(gòu)成成分分散的極性有機(jī)溶劑濃度的范圍內(nèi)向其中加入極性有機(jī)溶劑，此 時(shí)，可以使復(fù)合粒子和脂雙層膜的構(gòu)成成分分別分散于除極性有機(jī)溶劑之外的溶劑中，混 合兩分散液后，加入極性有機(jī)溶劑，也可以使復(fù)合粒子或脂雙層膜的構(gòu)成成分的任一方分 散在除極性有機(jī)溶劑之外的溶劑中，在此分散液中加入固態(tài)的復(fù)合粒子或脂雙層膜的構(gòu)成 成分的另一方，使其分散后，加入極性有機(jī)溶劑。另外，優(yōu)選包括如下步驟，即，使復(fù)合粒子 和脂雙層膜的構(gòu)成成分分散的含有極性有機(jī)溶劑的液體靜置或混合充分時(shí)間使脂雙層膜 被覆復(fù)合粒子的步驟。使復(fù)合粒子和脂雙層膜的構(gòu)成成分分散在含有極性有機(jī)溶劑的液 體中后，靜置或混合的時(shí)間，只要不在使復(fù)合粒子和脂雙層膜的構(gòu)成成分分散在含有極性 有機(jī)溶劑的液體中后立刻結(jié)束即可，沒(méi)有限定，可以根據(jù)脂雙層膜的構(gòu)成成分、或含有極性 有機(jī)溶劑的液體的種類(lèi)任意地設(shè)定，優(yōu)選設(shè)定所得脂質(zhì)體A的收率為定值的時(shí)間，例如約3 秒 30分鐘。作為液體F中除極性有機(jī)溶劑之外的溶劑，例如可以舉出工序2中的除極性有機(jī) 溶劑之外的溶劑中列舉的例子，優(yōu)選舉出水。液體F中極性有機(jī)溶劑的濃度，只要滿足復(fù)合粒子和脂雙層膜的構(gòu)成成分均分散 的條件即可，沒(méi)有特殊的限制，根據(jù)所用溶劑或復(fù)合粒子、脂雙層膜的構(gòu)成成分的種類(lèi)等的 不同而不同，優(yōu)選約為1 80ν/ν %，較優(yōu)選約為10 60ν/ν %，更優(yōu)選約為20 50ν/ν %， 最優(yōu)選約為30 40ν/ν %。本發(fā)明中，所謂“脂雙層膜的構(gòu)成成分可溶解在極性有機(jī)溶劑中”，包括下述幾種 情況，即，脂雙層膜的構(gòu)成成分具有溶解于極性有機(jī)溶劑中的性質(zhì)的情況，脂雙層膜的構(gòu)成 成分具有通過(guò)使用增溶劑溶解于極性有機(jī)溶劑中的性質(zhì)的情況，脂雙層膜的構(gòu)成成分具有 能夠在極性有機(jī)溶劑中形成凝集體或膠束等，發(fā)生乳濁或乳劑化的性質(zhì)的情況等。另外，所 謂“脂雙層膜的構(gòu)成成分分散”，包括下述幾種狀態(tài)，即，脂雙層膜的構(gòu)成成分全部形成凝集 體或膠束等，發(fā)生乳濁或乳劑化的狀態(tài)；脂雙層膜的構(gòu)成成分的一部分形成凝集體或膠束 等，發(fā)生乳濁或乳劑化，剩余部分溶解的狀態(tài)；脂雙層膜的構(gòu)成成分的一部分形成凝集體或 膠束等，發(fā)生乳濁或乳劑化，剩余部分沉淀的狀態(tài)等。需要說(shuō)明的是，所謂“脂雙層膜的構(gòu)成 成分溶解”，不包括脂雙層膜的構(gòu)成成分全部形成凝集體或膠束等，發(fā)生乳濁或乳劑化的狀態(tài)。本發(fā)明中，所謂“復(fù)合粒子分散”，是指復(fù)合粒子懸濁或乳濁或者乳劑化的狀態(tài)，包 括如下幾種狀態(tài)，即，復(fù)合粒子的一部分懸濁或乳濁或者乳劑化，剩余部分溶解的狀態(tài)；復(fù) 合粒子的一部分乳濁或者乳劑化，剩余部分沉淀的狀態(tài)等。所謂“復(fù)合粒子不溶解”，與上述 “復(fù)合粒子分散”的含義相同。在本發(fā)明的脂質(zhì)體A的制備方法中使用的、含有極性有機(jī)溶劑的水溶液中的復(fù) 合粒子的濃度，只要能夠用脂雙層膜被覆復(fù)合粒子即可，沒(méi)有特殊的限制，優(yōu)選約為ι μ g/ mL lg/mL，較優(yōu)選約為0. 1 500mg/mL。另外，所用的脂雙層膜的構(gòu)成成分的濃度，只要 能夠被覆復(fù)合粒子即可，沒(méi)有特殊的限制，優(yōu)選約為1 μ g/mL lg/mL，較優(yōu)選約為0. 1 400mg/mLo脂雙層膜相對(duì)于本發(fā)明的脂質(zhì)體A的比例，以重量比計(jì)優(yōu)選約為1 0. 1 1 1000，較優(yōu)選約為1 1 1 10。另外，本發(fā)明中的脂質(zhì)體A的大小，優(yōu)選平均粒徑約為300nm以下，較優(yōu)選約為 200nm以下，具體而言，優(yōu)選例如可以注射的大小。并且，可以通過(guò)抗體等蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、糖脂質(zhì)、氨基酸、核酸、各種低分子化合物或 高分子化合物等物質(zhì)對(duì)上述得到的脂質(zhì)體A進(jìn)行修飾，通過(guò)上述修飾得到的被覆復(fù)合粒子 也包括在脂質(zhì)體A中。例如，為了用于靶向，也可以進(jìn)一步用抗體等蛋白質(zhì)、肽或脂肪酸類(lèi) 等對(duì)上述所得的脂質(zhì)體A進(jìn)行脂雙層膜的表面修飾[參見(jiàn)D. D. Lasic, F. Martin編寫(xiě)的 "Stealth Liposomes”(美國(guó))，CRCPress Inc，1995 年，p. 93-102]。另外，也可以用例如水 溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烴衍生物對(duì)脂質(zhì)體A任意地進(jìn)行表面改質(zhì)。 用于上述表面改質(zhì)的水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烴衍生物，與上述作 為脂雙層膜構(gòu)成成分的水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烴衍生物的含義相 同。通過(guò)將本發(fā)明的組合物給與包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物，能夠?qū)⑸鲜鯮NA送達(dá)到靶基 因的表達(dá)部位，例如，能夠在體內(nèi)向哺乳動(dòng)物細(xì)胞中導(dǎo)入可抑制基因表達(dá)的RNA等，抑制基 因等的表達(dá)。本發(fā)明的組合物中的靶基因例如如果為與腫瘤或炎癥相關(guān)的基因，則可以將 本發(fā)明的組合物用作癌癥或炎癥疾病的治療劑或預(yù)防劑，優(yōu)選用作實(shí)體癌或者血管或血管 附近炎癥的治療劑或預(yù)防劑。具體而言，本發(fā)明的組合物中的靶基因如果為與血管新生相 關(guān)的基因等，由于能夠抑制血管平滑肌的增殖或血管新生等，則本發(fā)明的組合物例如可以 用作伴隨著血管平滑肌的增殖或血管新生的癌癥或炎癥疾病的治療劑或預(yù)防劑。S卩，本發(fā)明還提供一種將上述說(shuō)明的本發(fā)明的組合物投與哺乳動(dòng)物的癌癥或炎癥 疾病的治療方法。投與對(duì)象優(yōu)選人，較優(yōu)選患有癌癥或炎癥疾病的人。另外，本發(fā)明的組合物也可以在與癌癥或炎癥疾病的治療劑或預(yù)防劑相關(guān)的體內(nèi) 篩選體系中用作獲取POCO^roof of concept)]的工具。本發(fā)明的組合物也可以用作達(dá)到下述目的的制劑，例如血液成分等生物體成分 (例如血液、消化管等)中的上述RNA的穩(wěn)定化、副作用的降低或增加在含有靶基因的表達(dá) 部位的組織或臟器中的藥物的蓄積等。將本發(fā)明的組合物用作癌癥或炎癥疾病等的治療劑或預(yù)防劑時(shí)，作為給藥途徑， 優(yōu)選使用治療時(shí)最有效果的給藥途徑，可以舉出口腔內(nèi)、氣管內(nèi)、直腸內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)等非口服給藥或口服給藥，優(yōu)選舉出靜脈內(nèi)給藥或肌肉內(nèi)給藥，較優(yōu)選舉出靜脈內(nèi)給藥。給藥量根據(jù)給藥對(duì)象的病情、年齡、給藥途徑等的不同而不同，例如換算為RNA的 1天給藥量約為0. 1 μ g lOOOmg。作為適于靜脈內(nèi)給藥或肌肉內(nèi)給藥的制劑，例如可以舉出注射劑，通過(guò)上述方法 制備的脂質(zhì)體A的分散液也可以直接作為例如注射劑等形態(tài)使用，也可以通過(guò)例如過(guò)濾、 離心等從該分散液中除去溶劑后進(jìn)行使用，也可以冷凍干燥該分散液或冷凍干燥加入了例 如甘露糖醇、乳糖、海藻糖、麥芽糖或甘氨酸等賦形劑的分散劑，進(jìn)行使用。為注射劑時(shí)，優(yōu)選在上述的脂質(zhì)體A的分散液或上述除去了溶劑或冷凍干燥后的 脂質(zhì)體A中，混合例如水、酸、堿、各種緩沖液、生理鹽水、氨基酸輸液等，制備注射劑。另外， 也可以添加例如檸檬酸、抗壞血酸、半胱氨酸或EDTA等抗氧化劑，或甘油、葡萄糖或氯化鈉 等等滲劑等，制備注射劑。另外，也可以加入例如甘油等冷凍保存劑進(jìn)行冷凍保存。在上述說(shuō)明的本發(fā)明的組合物中，作為本發(fā)明的癌癥或炎癥疾病的治療劑，可以 舉出含有脂質(zhì)體A的組合物，所述脂質(zhì)體A為下述脂質(zhì)體含有以前導(dǎo)粒子和下述RNA為構(gòu) 成成分的復(fù)合粒子及被覆該復(fù)合粒子的脂雙層膜的脂質(zhì)體，該脂雙層膜的構(gòu)成成分可溶解 于極性有機(jī)溶劑，并且該脂雙層膜的構(gòu)成成分及該復(fù)合粒子能夠分散在以特定濃度含有該 極性有機(jī)溶劑的液體中；或者是含有以含有陽(yáng)離子性物質(zhì)的前導(dǎo)粒子和下述RNA為構(gòu)成成 分的復(fù)合粒子及被覆該復(fù)合粒子的脂雙層膜的脂質(zhì)體，該脂雙層膜以中性脂質(zhì)及水溶性物 質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烴衍生物為構(gòu)成成分。其中，上述RNA含有與腫瘤或 炎癥相關(guān)的靶基因mRNA的連續(xù)15 30個(gè)堿基的序列(以下記為序列X1)及與該序列互 補(bǔ)的堿基的序列(以下記為互補(bǔ)序列X1')，并且與序列&及互補(bǔ)序列X1'的堿基鍵合的糖 的總計(jì)1 90%為2’位上被修飾基團(tuán)取代的核糖。本發(fā)明的癌癥或炎癥疾病的治療劑中， 作為癌癥，優(yōu)選舉出實(shí)體癌，作為炎癥疾病，優(yōu)選舉出血管或血管附近的炎癥。另外，本發(fā)明還提供了上述說(shuō)明的本發(fā)明的組合物在制備癌癥或炎癥疾病的治療 劑優(yōu)選實(shí)體癌或者血管或血管附近炎癥的治療劑中的應(yīng)用，所述組合物含有包封有RNA的 脂質(zhì)體A，所述脂質(zhì)體A為下述脂質(zhì)體含有以前導(dǎo)粒子和下述RNA為構(gòu)成成分的復(fù)合粒子 及被覆該復(fù)合粒子的脂雙層膜的脂質(zhì)體，該脂雙層膜的構(gòu)成成分可溶于極性有機(jī)溶劑，該 脂雙層膜的構(gòu)成成分及該復(fù)合粒子能夠分散在以特定濃度含有該極性有機(jī)溶劑的液體中； 或者含有以含有陽(yáng)離子性物質(zhì)的前導(dǎo)粒子和下述RNA為構(gòu)成成分的復(fù)合粒子及被覆該復(fù) 合粒子的脂雙層膜，該脂雙層膜以中性脂質(zhì)及水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或 脂肪烴衍生物為構(gòu)成成分。其中，上述RNA含有與腫瘤或炎癥相關(guān)的靶基因mRNA的連續(xù) 15 30個(gè)堿基的序列(記為序列X1)及與該序列互補(bǔ)的堿基的序列(記為互補(bǔ)序列)(/)， 并且與序列&及互補(bǔ)序列X1'的堿基鍵合的糖的總計(jì)1 90%為2’位上被修飾基團(tuán)取代 的核糖，。接下來(lái)，根據(jù)實(shí)施例及試驗(yàn)例，更具體地說(shuō)明本發(fā)明。但是，本發(fā)明不限于這些實(shí) 施例及試驗(yàn)例。[實(shí)施例1]實(shí)施例1中使用的RNA是含有BCL2基因的mRNA的連續(xù)19個(gè)堿基的序列(以 下記為序列X2)及與該序列互補(bǔ)的堿基的序列(以下記為序列V )的雙鏈RNA[有義鏈5'-GmUG mAAmG UmCAmACmA UmGC mCUmG CdTdT-3，(與帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖， 與從5’-端開(kāi)始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18個(gè)的前綴為m的堿基鍵合的糖為2’-0_甲基 取代核糖)(序列號(hào) 1)、反義鏈；5，-mGCmA GmGC mAUmG UmUG mACmU UmCA mCdTdT-3，(與前 綴為d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖，與從5’-端開(kāi)始的第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19個(gè)的 帶有m的堿基鍵合的糖為2’-0_甲基取代核糖)(序列號(hào)2)](以下稱(chēng)作2’-0MeBCLkiRNA Exp. 1)，與序列\(zhòng)及互補(bǔ)序列V的堿基鍵合的核糖的總計(jì)50%為2’ -0-甲基取代核糖。 有義鏈及反義鏈均從Eurogentec公司(Belgium)獲得，通過(guò)退火制備雙鏈RNA。^ DOTAP (Avanti Polar Lipids 公司制)/PEG-DSPE (日本油脂公司制)/ 蒸餾 水(大塚制藥公司制)按40mg/16mg/lmL混合，用渦流混合器振動(dòng)攪拌。將該懸濁液于 70°C下通過(guò)0. 4 μ m的聚碳酸酯微孔濾膜(Costar公司制)10次、0. 2 μ m的聚碳酸酯微孔 濾膜(Whatman公司制)3次、0. 1 μ m的聚碳酸酯微孔濾膜(Corning公司制)10次、再通過(guò) 0. 05 μ m的聚碳酸酯微孔濾膜(Whatman公司制)20次。采用動(dòng)態(tài)光散射法(DLQ測(cè)定所得 的前導(dǎo)粒子的平均粒徑，結(jié)果為73. Olnm。另一方面，將EPC(日本油脂公司制)/PEG_DSPE(日本油脂公司制)/乙醇(和光 純藥公司制)/水按15mg/3. 125mg/0. 625mL/0. 375mL混合，制備脂雙層膜的構(gòu)成成分的溶液。將0. 2917mL 以 24mg/lmL 混合 2’ -OMe BCL2siRNA Exp. 1/ 水所得的水溶液混合 在0. 875mL所得的前導(dǎo)粒子的分散液中，制備復(fù)合粒子。將所得的復(fù)合粒子的分散液添加 到4. 667mL脂雙層膜的構(gòu)成成分的溶液中，接著添加1. 459mL蒸餾水，添加0. 4667mL脂雙 層膜的構(gòu)成成分的溶液后，緩緩加入54. 3ImL蒸餾水，將乙醇的濃度調(diào)節(jié)至5%以下。對(duì)所 得的脂質(zhì)體懸濁液進(jìn)行超離心(80分鐘，110，000Xg，25°C)，除去上清液。用約5mL的生理 鹽水(大塚制藥公司制)使生成的沉淀再次懸濁。采用DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，結(jié)果為92. 89nm。另外，進(jìn)行脂質(zhì)體內(nèi)2’ -OMe BCL2siRNA Exp. 1的定量，結(jié)果濃度為1. 2460mg/mL,相對(duì)于加入的2，-OMe BCL2siRNA Exp. 1的量，回收率為88. 02%。最后添加3. 270mL生理鹽水將2，-OMe BCL2siRNA Exp. 1 濃度調(diào)節(jié)至0. 75mg/mL，得到制劑。比較例1比較例1中使用的RNA是含有序列\(zhòng)及互補(bǔ)序列\(zhòng) ’的雙鏈RNA [有義鏈5 ’ -GUG AAG UCA ACA UGC CUG CdTdT_3’ (與帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖)(序列號(hào)3)、反義 鏈5’ -GCAGGC AUG UUG A⑶UCA CdTdT_3，(與帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖)(序 列號(hào)4)](以下稱(chēng)為BCL2siRNA Com. 1)。有義鏈及反義鏈均從Eurogentec公司(Belgium) 獲得，通過(guò)退火制備雙鏈RNA。與實(shí)施例1同樣地在0. 5mL所得的前導(dǎo)粒子的分散液中混合2%ig/mL的 BCL2siRNA Com. 1水溶液0. 1667mL，制備復(fù)合粒子。將所得的復(fù)合粒子的分散液添加到 2. 667mL脂雙層膜的構(gòu)成成分的溶液中，接著添加0. 8334mL蒸餾水，添加0. 2667mL脂雙層 膜的構(gòu)成成分的溶液后，緩緩加入31. 03mL蒸餾水將乙醇的濃度調(diào)節(jié)至5%以下。對(duì)所得的 脂質(zhì)體懸濁液進(jìn)行超離心(80分鐘，110，000Xg，25°C)，除去上清液。用約2mL的生理鹽水 (大塚制藥公司制)使生成的沉淀再次懸濁。采用DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，結(jié)果為88. 31nm。另外，對(duì)脂質(zhì)體內(nèi)的BCL2siRNACom. 1進(jìn)行定量，結(jié)果濃度為1. 7332mg/mL,相對(duì)于加入的BCL2siRNA Com. 1的量，回收率為 90. 09%。最后添加0. 3232mL生理鹽水將BCL2siRNA Com. 1濃度調(diào)節(jié)至1. 5mg/mL，得到制 劑。試驗(yàn)例1將200 μ L含有實(shí)施例1及比較例1中得到的制劑的藥液(siRNA濃度750 μ g/mL) 以7天的間隔通過(guò)尾靜脈給與雄性Balb/c小鼠(6周齡、日本CLEA)2次(給藥量為150μ g/ mouse)。第2次給藥后，通過(guò)尾動(dòng)脈在給藥0. 5、3、7及M小時(shí)后的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取血10 μ L， 添加90 μ L變性溶液(4mol/L硫氰酸胍、25mmol/L檸檬酸鈉、0. lv/v% 2-巰基乙醇、0. 5w/ v% N-月桂酰肌氨酸鈉；以下稱(chēng)為D溶液)進(jìn)行混合，得到10v/v%血液。在實(shí)施例1中所得的制劑的給藥組的10V/V%血液的10 μ L中添加焦碳酸二乙酯 水溶液(以相對(duì)于超純水為0. 1 ν/ν%的容量添加焦碳酸二乙酯并進(jìn)行混合)10 μ L、I. S.溶 液(將濃度為0. 3 μ mol/L的上述焦碳酸二乙酯水溶液作為I. S.) 10 μ L、D溶液100 μ L、 2mmol/L 乙酸鈉(pH 4. 0) 10 μ L 及 TE (IOmM Tris-HCl pH8. 0, ImM EDTA)飽和苯酚 / 氯仿溶 液(使用以1/1的容量比混合TE飽和苯酚和氯仿后的下層)150 μ L進(jìn)行混合，于4°C下、 以132000Xg離心10分鐘。在65 μ L上清液中添加15 μ L GenTLE溶液(被上述焦碳酸二 乙酯水溶液稀釋15倍的GenTLE precipitation carrier (Takara Bio))進(jìn)行混合后，添加 200 μ L乙醇進(jìn)行混合，于室溫下靜置10分鐘以上。于4°C下、132000Xg離心10分鐘后， 丟棄上清液，在沉淀中添加75V/V%乙醇200yL。于4°C下、以132000 Xg離心15分鐘，丟 棄上清液，風(fēng)干沉淀后，溶解在100 μ L再溶解液(將焦碳酸二乙酯/三乙胺/六氟異丙醇 /水以0. 1/0. 4/30/1000的容量比混合得到)中。于4°C下、以132000Xg離心10分鐘，將 上清液作為分析樣品，用HPLC法定量。結(jié)果示于圖1。< 裝置 >HPLC 裝置ACQUITY UPLC 系統(tǒng)(Waters)質(zhì)譜儀API4000QTRAP (Applied Biosystems/MDS Sciex)分析軟件Analyst 1. 4. 2 (Applied Biosystems/MDS Sciex)<HPLC 條件 >內(nèi)標(biāo)物質(zhì)(Ι· S.)5， -GmUG mAAmG UmCA mACmA UmGC mCUmG CdT_3，(與帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖，與從5’-端開(kāi)始的第2、4、6、8、10、12、14、 16、18個(gè)的帶有m的堿基鍵合的糖為2’ -0-甲基取代核糖)(序列號(hào)5)5， -mGCmA GmGC mAUmG UmUG mACmU UmCA mCdT-3，(與帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖，與從5’-端開(kāi)始的第1、3、5、7、9、11、13、 15、17、19個(gè)的帶有m的堿基鍵合的糖為2’ -0-甲基取代的核糖)(序列號(hào)6)柱Xbridge C18 (3. 5 μ m、2. Imm I. D. X 50mm、Waters)預(yù)濾器Xbridge guard cartridge (3. 5 μ m、2. Imm I. D. X 10mm、Waters)柱溫65°C流動(dòng)相三乙胺/六氟異丙醇/水(0. 4/30/1000)甲醇=93 7 75 25注入量25μ L檢測(cè)質(zhì)譜儀(離子化法電噴霧離子，負(fù)離子，離子源溫度500°C )
在比較例1中得到的制劑給藥組的10V/V%血液的10 μ L中添加焦碳酸二乙酯水 溶液(以相對(duì)于超純水為0. 1V/V%的容量添加焦碳酸二乙酯并進(jìn)行混合)10yL、I. S.溶 液(將濃度為0. 3 μ mol/L的上述焦碳酸二乙酯水溶液作為I. S.) 10 μ L、D溶液100 μ L、 2mmol/L乙酸鈉(pH 4. 0) 10 μ L及酸性飽和苯酚/氯仿溶液(使用以1/1的容量比混合酸 性飽和苯酚和氯仿后的下層)15(^1^進(jìn)行混合，于41下、以132000\8離心10分鐘。在 65 μ L上清液中添加GenTLE溶液(用上述焦碳酸二乙酯水溶液將GenTLE precipitation carrier (Takara Bio)稀釋15倍)15 μ L進(jìn)行混合，之后添加200 μ L乙醇混合，于室溫下靜 置10分鐘以上。于4°C下、以132000Xg離心10分鐘后，丟棄上清液，在沉淀中添加75v/
乙醇200yL。于4°C下、以132000Xg離心15分鐘，丟棄上清液，風(fēng)干沉淀后，溶解在 100 μ L再溶解液(將焦碳酸二乙酯/三乙胺/六氟異丙醇/水以0. 1/0. 4/30/1000的容 量比混合得到)中。于4°C下、以132000Xg離心10分鐘，以上清液作為分析樣品，用HPLC 法定量。結(jié)果示于圖2。< 裝置 >HPLC 裝置ACQUITY UPLC system (Waters)質(zhì)譜儀API4000QTRAP (Applied Biosystems/MDS Sciex)分析軟件Analyst 1. 4. 2 (Applied Biosystems/MDS Sciex)<HPLC 條件 >內(nèi)標(biāo)物質(zhì)(I. S.)5’ -GUG AAG UCA ACA UGC CUG dTdT_3’ (與帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖) (序列號(hào)7)5’ -CAG GCA UGU UGA CUU CAC dTdT_3’ (與帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖) (序列號(hào)8)柱Xbridge C18 (3. 5 μ m、2. Imm I. D. X 50mm、Waters)予頁(yè)濾器Xbridge guard cartridge (3. 5 μ m、2. Imm I. D. X 10mm、Waters)柱溫65°C流動(dòng)相三乙胺/六氟異丙醇/水(0. 4/30/1000)甲醇=93 7 75 25注入量25yL檢測(cè)質(zhì)譜儀(離子化法電噴霧離子，負(fù)離子，離子源溫度500°C )本發(fā)明還提供一種簡(jiǎn)便且精度良好的血液中的SiRNA濃度的測(cè)定方法。作為本發(fā) 明的血液中siRNA濃度的測(cè)定方法，可以舉出以通過(guò)下述方法測(cè)定siRNA濃度為特征的血 液中siRNA濃度的測(cè)定方法，所述方法正如上述的試驗(yàn)例1具體說(shuō)明的那樣，優(yōu)選在共存有 與被測(cè)定的siRNA具有不同堿基數(shù)的核酸作為IS的條件下，加入與核酸形成復(fù)合體的試 劑，例如加入GenTLE溶液使試液中的siRNA形成電中性的復(fù)合體，分離該復(fù)合體后，用再溶 解液溶解，采用高效液相色譜法分析所得的溶液。需要說(shuō)明的是，血液中的siRNA濃度的測(cè)定不限于本發(fā)明的血液中的siRNA濃度 的測(cè)定方法，也可以按照常規(guī)方法測(cè)定血液中的siRNA濃度。圖1及圖2顯示，給與了實(shí)施例1中所得制劑的小鼠與給與了比較例1中所得制 劑的小鼠相比，RNA的血液中濃度推移較高。即，表明了與序列X及互補(bǔ)序列X’的堿基鍵 合的糖的總計(jì)1 90%為2’位上被修飾基團(tuán)取代的核糖的本發(fā)明的組合物的血中滯留性被進(jìn)一步改善，能夠降低副作用或者增大藥物在含有靶基因表達(dá)部位的組織或臟器中的蓄 積。[實(shí)施例2]實(shí)施例2中使用的RNA是含有BCL2基因mRNA的連續(xù)19個(gè)堿基的序列(以下記 為序列X3)及與該序列互補(bǔ)的堿基的序列(以下記為互補(bǔ)序列V )的雙鏈RNA[有義鏈 5'-GmAA mGUmG AmCAmUCmU UmCA mGCmA AdTdT_3，(與帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖， 與從5’-端開(kāi)始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18個(gè)的帶有m的堿基鍵合的糖為2’_0_甲基 取代核糖)(序列號(hào) 9)、反義鏈5，-mUUmG CmUG mAAmG AmUG mUCmA CmUU mCdTdT-3，(與 帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖，與從5’ -端開(kāi)始的第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19 個(gè)的帶有m的堿基鍵合的糖為2’ -0-甲基取代核糖)(序列號(hào)10)](以下稱(chēng)為2’ -OMe BCL2siRNAExp. 2)，與序列\(zhòng)及互補(bǔ)序列的堿基鍵合的核糖的總計(jì)50%為2’ -0-甲基 取代核糖。有義鏈及反義鏈均從北海道System Science獲得，通過(guò)退火制備雙鏈RNA。^ DOTAP (Avanti Polar Lipids 公司制)/PEG-DSPE (日本油脂公司制)/ 蒸餾 水(大塚制藥公司制)按40mg/16mg/lmL混合，用渦流混合器振動(dòng)攪拌。將該懸濁液于 70°C下通過(guò)0. 4 μ m的聚碳酸酯微孔濾膜(Costar公司制)10次、0. 2 μ m的聚碳酸酯微孔 濾膜(Whatman公司制)3次、0. 1 μ m的聚碳酸酯微孔濾膜(Corning公司制)10次、再通過(guò) 0. 05 μ m的聚碳酸酯微孔濾膜(Whatman公司制)20次。采用動(dòng)態(tài)光散射法(DLQ測(cè)定所得 的前導(dǎo)粒子的平均粒徑，結(jié)果為70. 71nm。另一方面，將EPC(日本油脂公司制)/PEG_DSPE(日本油脂公司制)/乙醇(和光 純藥公司制)/水按15mg/3. 125mg/0. 625mL/0. 375mL混合，制備脂雙層膜的構(gòu)成成分的溶液。在0. 225mL所得的前導(dǎo)粒子的分散液中混合0. 075mL以Mmg/lmL混合2’ -OMe BCL2siRNA Exp. 2/水所得的水溶液，制備復(fù)合粒子。將所得的復(fù)合粒子的分散液添加 到1. 2mL脂雙層膜的構(gòu)成成分的溶液中，接著添加0. 375mL蒸餾水，然后添加在40Vol% 乙醇中按62. 5mg/62. 5mg/mL溶解有EPC/PEG-DSPE所得的溶液0. 12mL,之后，緩緩加入 13. 965mL蒸餾水，將乙醇的濃度調(diào)節(jié)至5Vol%以下。對(duì)所得的脂質(zhì)體懸濁液進(jìn)行超離心 (80分鐘，110，000Xg，25°C)，除去上清液。用生理鹽水(大塚制藥公司制)使生成的沉淀 再次懸濁。采用DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，結(jié)果為88. 52nm。另外，對(duì)脂質(zhì)體內(nèi)的2’ -OMe BCL2siRNA Exp. 2進(jìn)行定量，結(jié)果濃度為2. 307mg/mL,相對(duì)于加入的2，-OMe BCL2siRNA Exp. 2量，回收率為87. 2%o最后添加0. 366mL生理鹽水，將2，-OMe BCL2siRNA Exp. 2濃 度調(diào)至1.5mg/mL，得到制劑。[實(shí)施例3]實(shí)施例3中使用的RNA，為含有序列1、及互補(bǔ)序列1、’的雙鏈RNA [有義鏈5’ -GmAA mGUmG AmCA mUCmU UmCA mGCmMdTdT-3’(與帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖，與從5’-端 開(kāi)始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18個(gè)的帶有m的堿基鍵合的糖為2’ -0-甲基取代核糖) (序列號(hào)11)、反義鏈5’ -UUG CUG AAGAUG UCA CUU CdTdT_3’ (與帶有d的堿基鍵合的糖 為脫氧核糖)(序列號(hào)12)](以下稱(chēng)作2’-0Me BCLhiRNA Exp. 3)，與序列&及互補(bǔ)序列)(3’ 的堿基鍵合的核糖的為2’ -0-甲基取代核糖。有義鏈及反義鏈分別從北海道SystemScience獲得，通過(guò)退火制備雙鏈RNA。除了用 2，-OMe BCL2siRNA Exp. 3 代替 2，-OMe BCL2siRNAExp. 2 之外，與實(shí)施例 2同樣地得到制劑。采用DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，結(jié)果為91. 42nm。比較例2比較例2中使用的RNA為含有序列1、及互補(bǔ)序列X3’的雙鏈RNA[有義鏈5’_GAA GUG ACA UCU UCA GCA AdTdT_3，(與帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖)(序列號(hào)13)、反 義鏈5’-UUGCUG AAG AUG UCA CUU CdTdT_3’ (與帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖)(序 列號(hào)14)](以下稱(chēng)為BCLhiRNA Com. 2)。有義鏈及反義鏈均從北海道System Science獲 得，通過(guò)退火制備雙鏈RNA。除了用 BCL2siRNA Com. 2 代替 2’_0Me BCL2siRNA Exp. 2 之外，與實(shí)施例 2 同樣地 得到制劑。采用DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，結(jié)果為96. 52nm。試驗(yàn)例2將200 μ L含有實(shí)施例2、3及比較例2中所得制劑的藥液(siRNA濃度750 μ g/mL) 通過(guò)尾靜脈以7天的間隔給與雄性Balb/c小鼠(6周齡、日本CLEA)2次(給藥量為150 μ g/ mouse)。給與2次后，通過(guò)尾動(dòng)脈在給藥0. 5、3、7及M小時(shí)后的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取血10 μ L，添 力口 90 μ L變性溶液(4mol/L硫氰酸胍、25mmol/L檸檬酸鈉、lmmol/L 二硫蘇糖醇、0. 5w/v% N-月桂酰肌氨酸鈉；以下稱(chēng)為D溶液)進(jìn)行混合，得到10v/v%血液。在各給藥組的10V/V%血液的50yL中添加焦碳酸二乙酯水溶液(以相對(duì)于 超純水為0. 1V/V%的容量添加焦碳酸二乙酯并進(jìn)行混合)5yL、I. S.溶液(將濃度為 0. 3 μ mol/L的上述焦碳酸二乙酯水溶液作為I. S.) IOyL, D溶液50 μ L、2mmol/L乙酸鈉 (pH 4. 0)10 μ L及酸性飽和苯酚/氯仿溶液(使用以1/1的容量比混合酸性飽和苯酚和氯 仿后的下層)150 μ L進(jìn)行混合，于4°C下、以132000 Xg離心10分鐘。在65 μ L上清液中添 加15 μ L GenTLE溶液(被上述焦碳酸二乙酯水溶液稀釋15倍的GenTLE precipitation carrier (Takara Bio))并進(jìn)行混合后，添加200 μ L乙醇進(jìn)行混合，在室溫下靜置10分鐘 以上。于4°C下、以132000Xg離心10分鐘后，丟棄上清液，在沉淀中添加75V/V%乙醇 200 μ L0于4°C下、以132000 Xg離心15分鐘，丟棄上清液，風(fēng)干沉淀后，溶解在100 μ L再 溶解液(以0. 1/0. 4/30/1000的容量比混合焦碳酸二乙酯/三乙胺/六氟異丙醇/水)中。 于4°C下、以132000Xg離心10分鐘，將上清液作為分析樣品，用HPLC法定量。結(jié)果分別示 于圖3 5。< 裝置 >HPLC 裝置ACQUITY UPLC system (Waters)質(zhì)譜儀API4000QTRAP (Applied Biosystems/MDS Sciex)分析軟件Analyst 1. 4. 2 (Applied Biosystems/MDS Sciex)<HPLC 條件 >實(shí)施例2 :5，-GmUG mAAmG UmCA mACmA UmGC mCUmGCdT-3，(與帶有 d 的堿基鍵合 的糖為脫氧核糖，與從5’-端開(kāi)始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18個(gè)的帶有m的堿基鍵合的 糖為2’ -0-甲基取代核糖)(序列號(hào)15)
5，-mGCmA GmGC mAUmG UmUG mACmU UmCAmCdT-3，(與帶有 d 的堿基鍵合的糖為 脫氧核糖，從5’ -端開(kāi)始的第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19的帶有m的堿基鍵合的糖為 2’ -0-甲基取代核糖)(序列號(hào)16)實(shí)施例3 5'-GmUG mAAmG UmCA mACmA UmGC mCUmGCdT-3，(與帶有 d 的堿基鍵合 的糖為脫氧核糖，與從5’-端開(kāi)始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18個(gè)的帶有m的堿基鍵合的 糖為2’ -0-甲基取代的核糖)(序列號(hào)17)5’ -GCA GGC AUG UUG ACU UCA CdT_3，(與帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖) (序列號(hào)18)比較例2 5'-GUG AAG UCA ACA UGC CUG CdT_3，(與帶有d的堿基鍵合的糖為脫 氧核糖)(序列號(hào)19)5’ -GCA GGC AUG UUG ACU UCA CdT_3，(與帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖) (序列號(hào)20)柱Xbridge C18 (3. 5 μ m、2. Imm I. D. X 50mm、Waters)5 ! ! Xbridge guard cartridge (3. 5 μ m、2. Imm I. D. X 10mm、Waters)柱溫65°C流動(dòng)相三乙胺/六氟異丙醇/水(0. 4/30/1000)甲醇=93 7 75 25注入量25yL檢測(cè)質(zhì)譜儀(離子化法電噴霧離子，負(fù)離子，離子源溫度500°C )圖3 5顯示，給與了實(shí)施例2及3中所得制劑的小鼠與給與了比較例2中所得 制劑的小鼠相比，RNA的血液中濃度推移較高。即，表明與序列X及互補(bǔ)序列X’的堿基鍵 合的糖的總計(jì)1 90%為2’位上被修飾基團(tuán)取代的核糖的本發(fā)明的組合物的血中滯留性 被進(jìn)一步改善，能夠降低副作用或者增大藥物在含有靶基因表達(dá)部位的組織或臟器中的蓄 積。[實(shí)施例4]實(shí)施例4中使用的RNA是含有BCL2基因的mRNA的連續(xù)23個(gè)堿基的序列(以下 記為序列)(4)及與該序列互補(bǔ)的堿基的序列(以下記為互補(bǔ)序列A’ )的雙鏈RNA[有義 鏈5，-GmAA mGUmG AmCAmUCmU UmCA mGCmA AmAU mAAdA dC_3，(與帶有 d 的堿基鍵合的 糖為脫氧核糖，與從5’-端開(kāi)始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22個(gè)的帶有!11的堿基鍵 合的糖為2’ -0-甲基取代的核糖)(序列號(hào)21)、反義鏈5’ -GUmU UmAU mUUmG CmUGmAAmG AmUG mUCmA CmUU mCmUmU-3，(與從 5，-端開(kāi)始的第 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25 27個(gè)的帶有m的堿基鍵合的糖為2’ -0-甲基取代核糖)(序列號(hào)22)](以下稱(chēng)為2’ -OMe BCL2siRNA Exp. 4)，與序列&及互補(bǔ)序列X/的堿基鍵合的核糖的總計(jì)50%為2’ -0-甲基 取代核糖。有義鏈及反義鏈均從北海道System Science獲得，通過(guò)退火制備雙鏈RNA。^ DOTAP (Avanti Polar Lipids 公司制)/PEG-DSPE (日本油脂公司制)/ 蒸餾 水(大塚制藥公司制)按40mg/16mg/lmL混合，用渦流混合器振動(dòng)攪拌。將該懸濁液于 70°C下通過(guò)0. 4 μ m的聚碳酸酯微孔濾膜(Costar公司制)10次、0. 2 μ m的聚碳酸酯微孔 濾膜(Whatman公司制)5次、0. 1 μ m的聚碳酸酯微孔濾膜(Corning公司制)10次、再通過(guò) 0. 05 μ m的聚碳酸酯微孔濾膜(Whatman公司制)20次。采用動(dòng)態(tài)光散射法(DLQ測(cè)定所得 的前導(dǎo)粒子的平均粒徑，結(jié)果為72. 93nm。
另一方面，將EPC(日本油脂公司制)/PEG_DSPE(日本油脂公司制)/乙醇(和光 純藥公司制)/水按15mg/3. 125mg/0. 625mL/0. 375mL混合，制備脂雙層膜的構(gòu)成成分的溶液。在所得的前導(dǎo)粒子的分散液0. 0125mL中混合0. 00417mL以2%ig/lmL混合 2' -OMe BCL2siRNA Exp. 4/水所得的水溶液，制備復(fù)合粒子。將所得的復(fù)合粒子的分散液 添加到0. 06667mL脂雙層膜的構(gòu)成成分的溶液中，接著添加0. 02083mL蒸餾水。然后添加 在 40vol % 乙醇中按 62. 5mg/62. 5mg/mL 溶解有 EPC/PEG-DSPE 所得的溶液 0. 00667mL,然 后緩緩加入0. 7758mL蒸餾水，將乙醇的濃度調(diào)節(jié)至5Vol%以下。用食鹽水使所得的脂質(zhì) 體懸濁液等滲。然后用生理鹽水(大塚制藥公司制)使最終液體容量為lmL，將2’ -OMe BCL2siRNAExp. 4濃度調(diào)節(jié)為0. lmg/mL，得到制劑。采用DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，結(jié)果為87. 50nm。比較例3比較例3中使用的RNA為含有序列&及互補(bǔ)序列X/的雙鏈RNA[有義鏈5’_GAA GUG ACA UCU UCA GCA AAU AAdA dC_3’(與帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖)(序列 號(hào) 23)、反義鏈5，-⑶U UAU UUG CUG AAG AUG UCA CUU CUU-3，(序列號(hào) 24)](以下稱(chēng)為 BCL2siRNA Com. ；3)。有義鏈及反義鏈均從北海道Systen^cience獲得，通過(guò)退火制備雙鏈 RNA。除了用 BCL2siRNA Com. 3 代替 2，_0Me BCL2siRNA Exp. 4 之外，與實(shí)施例 4 同樣地 得到制劑。采用DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，結(jié)果為94. 32nm。試驗(yàn)例3將100 μ L含有實(shí)施例4及比較例3中所得制劑的藥液(siRNA濃度50 μ g/mL) 通過(guò)尾靜脈以7天間隔給與雄性Balb/c小鼠(6周齡、日本CLEA)2次(給藥量為5yg/ mouse)。給與第2次后，通過(guò)尾動(dòng)脈在投與3小時(shí)后的時(shí)間點(diǎn)取血10 μ L，添加90 μ L變性 溶液(4mol/L硫氰酸胍、25mmol/L檸檬酸鈉、lmmol/L 二硫蘇糖醇、0. 5w/v% N-月桂酰肌氨 酸鈉；以下稱(chēng)為D溶液)進(jìn)行混合，得到10v/v%血液。在各給藥組的10v/v%血液的IOOyL中添加焦碳酸二乙酯水溶液(以相對(duì)于 超純水為0. 1V/V%的容量添加焦碳酸二乙酯并進(jìn)行混合)10 μ L、I. S.溶液(將濃度為 0. 3 μ mol/L的上述焦碳酸二乙酯水溶液作為I. S.) 10 μ L、2mmol/L乙酸鈉(pH 4. 0) 10 μ L 及酸性飽和苯酚/氯仿溶液(使用將酸性飽和苯酚和氯仿以1/1的容量比混合后的下 層)150 μ L進(jìn)行混合，于4 °C下、以132000 X g離心10分鐘。在30 μ L上清液中添加 IOyL GenTLE溶液(被上述焦碳酸二乙酯水溶液稀釋15倍的GenTLE precipitation carrier (Takara Bio))并進(jìn)行混合，之后，添加100 μ L乙醇進(jìn)行混合，于室溫下靜置10分 鐘以上。于4°C下、以132000Xg離心10分鐘后，丟棄上清液，在沉淀中添加75V/V%乙醇 IOOyL0于4°C下、以132000Xg離心15分鐘后，丟棄上清液，風(fēng)干沉淀后，溶解于50 μ L 再溶解液(以0. 1/0. 4/30/1000的容量比混合焦碳酸二乙酯/三乙胺/六氟異丙醇/水) 中。于4°C下、以132000Xg離心10分鐘，以上清液作為分析樣品，采用HPLC法定量。結(jié)果 分別示于圖6及圖7?！囱b置〉
HPLC 裝置ACQUITY UPLC system (Waters)質(zhì)譜儀API4000QTRAP (Applied Biosystems/MDS Sciex)分析軟件Analyst 1. 4. 2 (Applied Biosystems/MDS Sciex)<HPLC 條件〉內(nèi)標(biāo)物質(zhì)(I. S.)實(shí)施例4 :5，-GmUG mAAmG UmCA mACmA UmGC mCUmGCdT-3，(與帶有 d 的堿基鍵合 的糖為脫氧核糖，與從5’-端開(kāi)始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18個(gè)的帶有m的堿基鍵合的 糖為2’ -0-甲基取代核糖)(序列號(hào)25)5’-mGCmA GmGC mAUmG UmUG mACmU UmCAmCdT-3’ (與帶有 d 的堿基鍵合的糖為脫 氧核糖，與從5’ -端開(kāi)始的第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19個(gè)的帶有m的堿基鍵合的糖為 2’ -0-甲基取代核糖)(序列號(hào)沈)比較例3 5'-GUG AAG UCA ACA UGC CUG CdT_3，(與帶有d的堿基鍵合的糖為脫 氧核糖(序列號(hào)27)5’ -GCA GGC AUG UUG ACU UCA CdT_3，(與帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖) (序列號(hào)觀)柱Xbridge C18 (3. 5 μ m、2. Imm I. D. X 50mm、Waters)5 ! ! Xbridge guard cartridge (3. 5 μ m、2. Imm I. D. X 10mm、Waters)柱溫65°C流動(dòng)相三乙胺/六氟異丙醇/水(0. 4/30/1000)甲醇=93 7 75 25注入量25yL檢測(cè)質(zhì)譜儀(離子化法電噴霧離子，負(fù)離子，離子源溫度500°C )圖6及圖7顯示，給與了實(shí)施例4中所得制劑的小鼠與給與了比較例3中所得制 劑的小鼠相比，RNA的血液中濃度推移較高。即，表明了與序列X及互補(bǔ)序列X’的堿基鍵 合的糖的總計(jì)1 90%為2’位上被修飾基團(tuán)取代的核糖的本發(fā)明的組合物的血中滯留性 被進(jìn)一步改善，能夠降低副作用或者增大藥物在含有靶基因表達(dá)部位的組織或臟器中的蓄 積。產(chǎn)業(yè)上的可利用性通過(guò)將本發(fā)明的含有脂質(zhì)體的組合物給與哺乳動(dòng)物等，所述脂質(zhì)體包封有RNA，所 述RNA含有靶基因mRNA的連續(xù)15 30個(gè)堿基的序列及與該序列互補(bǔ)的堿基的序列，能夠 抑制該靶基因的表達(dá)。序列表自由文本
序列號(hào)1-實(shí)施例1的siRNA有義鏈
序列號(hào)2-實(shí)施例1的siRNA反義鏈
序列號(hào)3-比較例1的siRNA有義鏈
序列號(hào)4-比較例1的siRNA反義鏈
序列號(hào)5-實(shí)施例1的siRNA有義鏈用IS
序列號(hào)6-實(shí)施例1的siRNA反義鏈用IS
序列號(hào)7-比較例1的siRNA有義鏈的IS
序列號(hào)8-比較例1的siRNA反義鏈的IS
序列號(hào)9-實(shí)施例2的s；iRNA有義鏈
序列號(hào)10--實(shí)施例2的siRNA反義鏈
序列號(hào)11--實(shí)施例3的siRNA有義鏈
序列號(hào)12--實(shí)施例3的siRNA反義鏈
序列號(hào)13--比較例2的siRNA有義鏈
序列號(hào)14--比較例2的siRNA反義鏈
序列號(hào)15--實(shí)施例2的siRNA有義鏈用IS
序列號(hào)16--實(shí)施例2的siRNA反義鏈用IS
序列號(hào)17--實(shí)施例3的siRNA有義鏈用IS
序列號(hào)18--實(shí)施例3的siRNA反義鏈用IS
序列號(hào)19--比較例2的siRNA有義鏈的IS
序列號(hào)20--比較例2的siRNA反義鏈的IS
序列號(hào)21--實(shí)施例4的siRNA有義鏈
序列號(hào)22--實(shí)施例4的siRNA反義鏈
序列號(hào)23--比較例3的siRNA有義鏈
序列號(hào)24--比較例3的siRNA反義鏈
序列號(hào)25--實(shí)施例4的siRNA有義鏈用IS
序列號(hào)26--實(shí)施例4的siRNA反義鏈用IS
序列號(hào)27--比較例3的siRNA有義鏈的IS
序列號(hào)28--比較例3的siRNA反義鏈的IS
序列號(hào)29--be 12 mRNA
權(quán)利要求
1.一種組合物，含有包封了 RNA的脂質(zhì)體，所述RNA含有靶基因mRNA的連續(xù)15 30 個(gè)堿基的序列(以下記為序列X)及與所述序列X互補(bǔ)的堿基的序列(以下記為互補(bǔ)序列 X’ )，與序列X及互補(bǔ)序列X’的堿基鍵合的糖的總計(jì)1 90%為在2’位上被修飾基團(tuán)取 代的核糖，所述脂質(zhì)體是可到達(dá)包含靶基因表達(dá)部位的組織或臟器的脂質(zhì)體。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述脂質(zhì)體是具有可靜脈內(nèi)給藥的大小的脂質(zhì)體。
3.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中，所述RNA是具有利用RNA干涉(RNAi)抑制 所述靶基因表達(dá)的作用的RNA。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述靶基因是與腫瘤或炎癥相關(guān)的基因。
5.如權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述靶基因是與血管新生相關(guān)的基因。
6.如權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述靶基因是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體、纖維芽細(xì)胞生長(zhǎng)因子、纖維芽細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、血小板衍生生長(zhǎng) 因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、Kruppel樣因子、 Ets轉(zhuǎn)錄因子、核因子及低氧誘導(dǎo)因子中的任一種的基因。
7.如權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述mRNA是人或小鼠的mRNA。
8.如權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述包封了RNA的脂質(zhì)體含有復(fù)合 粒子及被覆所述復(fù)合粒子的脂雙層膜，所述復(fù)合粒子的構(gòu)成成分為前導(dǎo)粒子和所述RNA，其中，所述脂雙層膜的構(gòu)成成分可溶于極性有機(jī)溶劑，所述脂雙層膜的構(gòu)成成分及所 述復(fù)合粒子可以分散在以特定濃度含有所述極性有機(jī)溶劑的液體中。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中，所述極性有機(jī)溶劑為醇。
10.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中，所述極性有機(jī)溶劑為乙醇。
11.如權(quán)利要求8 10中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述前導(dǎo)粒子是含有陽(yáng)離子性物 質(zhì)的前導(dǎo)粒子，所述脂雙層膜是以中性脂質(zhì)及水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或 脂肪烴衍生物為構(gòu)成成分的脂雙層膜。
12.如權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述包封了RNA的脂質(zhì)體是含有 復(fù)合粒子及被覆所述復(fù)合粒子的脂雙層膜的脂質(zhì)體，所述復(fù)合粒子以含有陽(yáng)離子性物質(zhì)的 前導(dǎo)粒子和所述RNA為構(gòu)成成分，其中，所述脂雙層膜是以中性脂質(zhì)及水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪 烴衍生物為構(gòu)成成分的脂雙層膜。
13.如權(quán)利要求11或12所述的組合物，其中，所述陽(yáng)離子性物質(zhì)為選自N-[l-(2，3-二 油酰丙基)]_N，N，N-三甲基氯化銨、N-[1-(2，3- 二油酰丙基)]-N，N- 二甲基胺、N-[1-(2， 3-二油基氧基丙基)]-N，N, N-三甲基氯化銨、N-[l-(2，3-雙十四烷氧基丙基)]_N，N-二 甲基-N-羥乙基溴化銨及3β-[Ν-(Ν’，Ν’ - 二甲基氨基乙基)氨基甲?；鵠膽固醇中的一 種以上。
14.如權(quán)利要求11 13中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、 脂肪酸衍生物或脂肪烴衍生物為聚乙二醇_磷脂酰乙醇胺。
15.如權(quán)利要求11 14中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述中性脂質(zhì)為卵黃卵磷脂。
16.一種癌癥或炎癥疾病的治療劑，所述治療劑含有脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體含有復(fù)合粒子 及被覆所述復(fù)合粒子的脂雙層膜，所述復(fù)合粒子以前導(dǎo)粒子和RNA為構(gòu)成成分，所述RNA含有與腫瘤或炎癥相關(guān)的靶基 因mRNA的連續(xù)15 30個(gè)堿基的序列(以下記為序列X1)及與所述序列互補(bǔ)的堿基的序列 (以下記為互補(bǔ)序列X1')，與序列X1及互補(bǔ)序列X1'的堿基鍵合的糖的總計(jì)1 90%為在 2’位上被修飾基團(tuán)取代的核糖，其中，所述脂雙層膜的構(gòu)成成分可溶于極性有機(jī)溶劑，所述脂雙層膜的構(gòu)成成分及所 述復(fù)合粒子能夠分散在以特定濃度含有所述極性有機(jī)溶劑的液體中。
17.如權(quán)利要求16所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述極性有機(jī)溶劑為醇。
18.如權(quán)利要求16所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述極性有機(jī)溶劑為乙醇。
19.如權(quán)利要求16 18中任一項(xiàng)所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述前導(dǎo)粒 子為含有陽(yáng)離子性物質(zhì)的前導(dǎo)粒子，所述脂雙層膜是以中性脂質(zhì)及水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生 物、脂肪酸衍生物或脂肪烴衍生物為構(gòu)成成分的脂雙層膜。
20.一種癌癥或炎癥疾病的治療劑，所述治療劑含有復(fù)合粒子及被覆所述復(fù)合粒子的 脂雙層膜，所述復(fù)合粒子以含有陽(yáng)離子性物質(zhì)的前導(dǎo)粒子和RNA為構(gòu)成成分，所述RNA含有與腫 瘤或炎癥相關(guān)的靶基因mRNA的連續(xù)15 30個(gè)堿基的序列(序列X1)及與所述序列互補(bǔ) 的堿基的序列(互補(bǔ)序列X1')，與序列X1及互補(bǔ)序列X1'的堿基鍵合的糖的總計(jì)1 90% 為在2’位上被修飾基團(tuán)取代的核糖其中，所述脂雙層膜是以中性脂質(zhì)及水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪 烴衍生物為構(gòu)成成分的脂雙層膜。
21.如權(quán)利要求19或20所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述陽(yáng)離子性物質(zhì)為 選自N-[1-(2，3-二油酰丙基)]-N，N，N-三甲基氯化銨、N-[1-(2，3-二油酰丙基)]-N，N-二 甲基胺、N-[l-(2，3-二油基氧基丙基)]-N，N，N-三甲基氯化銨、N-[l-(2，3-雙十四烷氧基 丙基)]-N，N-二甲基-N-羥乙基溴化銨及3 β-[N-(N’，N’ - 二甲基氨基乙基)氨基甲酰 基]膽固醇中的一種以上。
22.如權(quán)利要求19 21中任一項(xiàng)所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述水溶性 物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烴衍生物為聚乙二醇_磷脂酰乙醇胺。
23.如權(quán)利要求19 22中任一項(xiàng)所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述中性脂 質(zhì)為卵黃卵磷脂。
24.如權(quán)利要求16 23中任一項(xiàng)所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述RNA是 具有利用RNA干涉(RNAi)抑制所述靶基因表達(dá)的作用的RNA。
25.如權(quán)利要求16 23中任一項(xiàng)所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，與腫瘤或炎 癥相關(guān)的靶基因是與血管新生相關(guān)的基因。
26.如權(quán)利要求16 23中任一項(xiàng)所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述與腫瘤 或炎癥相關(guān)的靶基因是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體、纖維芽細(xì)胞生長(zhǎng)因子、 纖維芽細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、血小板衍生生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因 子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、Kruppel樣因子、Ets轉(zhuǎn)錄因子、核因子及低氧誘導(dǎo)因子中的任一 種的基因。
27.如權(quán)利要求16 26中任一項(xiàng)所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述mRNA是 人或小鼠的mRNA。
28.—種癌癥或炎癥疾病的治療方法，所述治療方法將含有脂質(zhì)體的組合物給與哺乳 動(dòng)物，所述脂質(zhì)體含有復(fù)合粒子及被覆所述復(fù)合粒子的脂雙層膜，所述復(fù)合粒子以前導(dǎo)粒子和RNA為構(gòu)成成分，所述RNA含有與腫瘤或炎癥相關(guān)的靶基 因mRNA的連續(xù)15 30個(gè)堿基的序列(序列X1)及與所述序列互補(bǔ)的堿基的序列(互補(bǔ) 序列X1')，與序列X1及互補(bǔ)序列X1'的堿基鍵合的糖的總計(jì)1 90%為在2’位上被修飾 基團(tuán)取代的核糖，其中，所述脂雙層膜的構(gòu)成成分可溶于極性有機(jī)溶劑，所述脂雙層膜的構(gòu)成成分及所 述復(fù)合粒子能夠分散在以特定濃度含有所述極性有機(jī)溶劑的液體中。
29.—種癌癥或炎癥疾病的治療方法，所述治療方法將組合物給與哺乳動(dòng)物，所述組合 物含有復(fù)合粒子及被覆所述復(fù)合粒子的脂雙層膜，所述復(fù)合粒子以含有陽(yáng)離子性物質(zhì)的前導(dǎo)粒子和RNA為構(gòu)成成分，所述RNA含有與腫 瘤或炎癥相關(guān)的靶基因mRNA的連續(xù)15 30個(gè)堿基的序列(序列X1)及與所述序列互補(bǔ) 的堿基的序列(互補(bǔ)序列X1')，與序列X1及互補(bǔ)序列X1'的堿基鍵合的糖的總計(jì)1 90% 為在2’位上被修飾基團(tuán)取代的核糖，其中，所述脂雙層膜是以中性脂質(zhì)及水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪 烴衍生物為構(gòu)成成分的脂雙層膜。
30.一種組合物在制備癌癥或炎癥疾病的治療劑中的應(yīng)用，所述組合物含有脂質(zhì)體，所 述脂質(zhì)體含有復(fù)合粒子及被覆所述復(fù)合粒子的脂雙層膜，所述復(fù)合粒子以前導(dǎo)粒子和RNA為構(gòu)成成分，所述RNA含有與腫瘤或炎癥相關(guān)的靶基 因mRNA的連續(xù)15 30個(gè)堿基的序列(以下記為序列X1)及與所述序列互補(bǔ)的堿基的序列 (以下記為互補(bǔ)序列X1')，與序列X1及互補(bǔ)序列X1'的堿基鍵合的糖的總計(jì)1 90%為在 2’位上被修飾基團(tuán)取代的核糖，其中，所述脂雙層膜的構(gòu)成成分可溶于極性有機(jī)溶劑，所述脂雙層膜的構(gòu)成成分及所 述復(fù)合粒子能夠分散在以特定濃度含有所述極性有機(jī)溶劑的液體中。
31.一種組合物在制備癌癥或炎癥疾病的治療劑中的應(yīng)用，所述組合物含有復(fù)合粒子 及被覆所述復(fù)合粒子的脂雙層膜，所述復(fù)合粒子以含有陽(yáng)離子性物質(zhì)的前導(dǎo)粒子和RNA為構(gòu)成成分，所述RNA含有與腫 瘤或炎癥相關(guān)的靶基因mRNA的連續(xù)15 30個(gè)堿基的序列(序列X1)及與所述序列互補(bǔ) 的堿基的序列(互補(bǔ)序列X1')，與序列X1及互補(bǔ)序列X1'的堿基鍵合的糖的總計(jì)1 90% 為在2’位上被修飾基團(tuán)取代的核糖，其中，所述脂雙層膜為以中性脂質(zhì)及水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪 烴衍生物為構(gòu)成成分的脂雙層膜。
32.一種測(cè)定血液中siRNA濃度的方法，其特征在于，在含有siRNA的試液中加入與核 酸形成復(fù)合體的試劑，使其與所述siRNA形成電中性的復(fù)合體，分離所述復(fù)合體后在再溶 解液中溶解，利用高效液相色譜法分析所得的溶液，由此測(cè)定所述siRNA的濃度。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種用于抑制靶基因表達(dá)的組合物等。本發(fā)明提供下述組合物等，所述組合物含有包封了RNA的脂質(zhì)體，所述RNA含有靶基因mRNA的連續(xù)15～30個(gè)堿基的序列(以下記為序列X)及與該序列X互補(bǔ)的堿基的序列(以下記為互補(bǔ)序列X’)，與序列X及互補(bǔ)序列X’的堿基鍵合的糖的總計(jì)1～90％為在2’位上被修飾基團(tuán)取代的核糖，所述脂質(zhì)體是可到達(dá)包含靶基因表達(dá)部位的組織或臟器的脂質(zhì)體。
文檔編號(hào)A61K31/713GK102112136SQ20098013077
公開(kāi)日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2009年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月1日
發(fā)明者八木信宏, 榎園淳一 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會(huì)社