專利名稱：用于生物活性化合物施用的軛合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療所需的化合物以特定方式穩(wěn)定并靶向靶組織的方法領(lǐng)域。特別 地，本發(fā)明基于載脂蛋白A能夠靶向治療所需化合物至所有那些表面結(jié)合位點(diǎn)對(duì)所述蛋白 具有高親和力的組織。
背景技術(shù)：
應(yīng)用大分子作為活性組分的新治療形式的發(fā)展，催生了開(kāi)發(fā)穩(wěn)定并靶向所述分子 至其合適細(xì)胞靶標(biāo)的有效形式的需求。要求特異性靶向靶組織的治療實(shí)例包括，基于特異 性生長(zhǎng)因子的使用或基于在靶組織中取代缺失或缺陷基因的基因的使用的療法。那些不基 于病毒載體的組織特異性系統(tǒng)常常為其低或無(wú)的細(xì)胞特異性的問(wèn)題所困擾。已經(jīng)描述了基于內(nèi)含治療性化合物的脂質(zhì)囊泡靶向治療性化合物至肝細(xì)胞的不 同系統(tǒng)，并且其通過(guò)存在對(duì)肝細(xì)胞膜具有親和性的囊泡表面分子而具有靶向作用。例如，W007130873公開(kāi)了通過(guò)在所述膠囊表面整合被肝細(xì)胞內(nèi)的脫唾液酸糖蛋 白、透明質(zhì)酸、N-乙?；肴樘前坊蚋事短鞘荏w所識(shí)別的化合物的方式，靶向微囊泡至肝細(xì) 胞的方法。W002086091描述了通過(guò)在所述納米囊泡中整合乙型肝炎病毒外殼蛋白的方式 靶向納米囊泡至肝細(xì)胞的方法。W0200473684描述了基于表面含有ApoA-I的磷脂盤(pán)狀囊 泡靶向部分疏水性化合物至肝細(xì)胞的方法。Lou等(World J. Gastroenterol. ,2005,11 954-959)描述了基于HDL容納疏水性化合物如膽固醇的能力，應(yīng)用高密度脂蛋白(HDL)作 為載體，靶向親脂性抗癌化合物至肝細(xì)胞性肝癌細(xì)胞的方法。最后，Kim等(MolecularTherapy, 2007,15 :1145-1152)描述了基于包含干擾RNA 且表面具有ApaA-I的脂質(zhì)體的靶向干擾RNA至肝細(xì)胞的方法。然而，這些方法具有以下缺 點(diǎn)由于所述化合物存在于囊泡或人工膜內(nèi)部與磷脂的疏水部分相接觸，它們僅能允許運(yùn) 載疏水性化合物?？蛇x地，可通過(guò)使用所述化合物與那些可為肝臟特異性捕獲的試劑軛合的方式運(yùn) 載親水性化合物。例如，Kramer 等(J. Biol. Chem. ,1992,267 =18598-18604)描述了通過(guò) 所述化合物與膽汁酸軛合的方式靶向治療性化合物(細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑苯丁酸氮芥以及脯 氨酰-4羥化酶I-硝基苯-2-氧雜-1，3-疊氮-β - α -丙氨酸-苯丙氨酸-5-羥脯氨酸 (oxaproline)-甘氨酸抑制劑)至肝細(xì)胞的方法。然而，這種軛合方式僅允許運(yùn)載至肝臟， 其阻止了施用治療所需化合物至其它組織的應(yīng)用。W004082720描述了通過(guò)在由乙型肝炎病毒外殼蛋白形成的偽病毒顆粒中整合所 述化合物的方式靶向治療活性化合物至肝細(xì)胞的方法。然而，這些載體存在的問(wèn)題在于具 有縮短的血漿半衰期，其要求持續(xù)不斷地給藥或高劑量給藥以達(dá)到持續(xù)不變的治療性血漿 水平。此外，形成偽病毒顆粒的病毒蛋白產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答。W08702061A描述了通過(guò)使用由載脂蛋白B或E受體結(jié)合區(qū)與活性組分形成的融合 蛋白，靶向化合物至表達(dá)LDL受體的組織的方法。干擾素的短半衰期的問(wèn)題已經(jīng)被W007021494解決，其描述了由白蛋白和干擾素形成的融合蛋白。這些融合蛋白的血漿半衰期約為14天。因此，需要用于特異性靶向治療性化合物至肝細(xì)胞的合適載體，并且使軛合物達(dá) 到長(zhǎng)的血漿半衰期。發(fā)明概述在第一方面，本發(fā)明涉及一種軛合物，其包括(i)Apo A分子或其功能等價(jià)變體，以及(ii)治療所需的化合物其中組分⑴和(ii)共價(jià)結(jié)合。在第二方面，本發(fā)明涉及一種多核苷酸或基因構(gòu)建體，其包括編碼根據(jù)本發(fā)明的 軛合物的多核苷酸，其中治療所需的化合物(ii)是與組分(i)形成單鏈的多肽。在接下來(lái)的方面，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸或基因構(gòu)建體的載體， 并涉及包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸、基因構(gòu)建體或載體的宿主細(xì)胞，或包含根據(jù)本發(fā)明軛 合物的納米脂質(zhì)體顆粒。在另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的軛合物、多核苷酸、基因構(gòu)建體、載體、宿主 細(xì)胞或納米脂質(zhì)體顆粒在藥物中的應(yīng)用。在另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的軛合物、多核苷酸、基因構(gòu)建體、載體、宿主 細(xì)胞或納米脂質(zhì)體顆粒在治療肝臟疾病或與免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病中的應(yīng)用。在另一方面，本發(fā)明涉及一種組合物，其包括(a)第一組分，選自由以下物質(zhì)構(gòu)成的組中根據(jù)本發(fā)明的軛合物、多核苷酸、基 因構(gòu)建體、載體、宿主細(xì)胞、納米脂質(zhì)體顆粒或藥物制劑，其中組分(ii)是一種TGF-βΙ抑 制肽，以及(b)第二組分，選自由以下物質(zhì)構(gòu)成的組中免疫刺激性細(xì)胞因子、編碼所述細(xì)胞 因子的多核苷酸、包含所述多核苷酸的載體、TGF-β 1抑制肽、細(xì)胞毒素劑或其組合。在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的組合物在藥物以及特別是癌癥治療中的應(yīng)用。


圖 LIFNa 表達(dá)的動(dòng)力學(xué)。用表達(dá) ApoAI (Apo)、IFNa (IFN)、Apo-IFN(AF)或 IFN-Apo (IA)的質(zhì)粒高壓注射(hydrodynamic injection)BALB/c 鼠。在 6 小時(shí)后、第 1 天、 第3天、第6天以及第9天，采血并通過(guò)ELISA分析血清中的IFNa水平。典型實(shí)驗(yàn)每組 4只動(dòng)物，平均值以及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差如圖所示。通過(guò)重復(fù)測(cè)量方差分析和Bonferroni 檢驗(yàn)分析結(jié)果。質(zhì)粒AF和IA誘導(dǎo)的IFN α在第1天和第3天的水平，與質(zhì)粒IFN誘導(dǎo)的 IFNa水平存在顯著性差異(ρ < 0. 001)。圖2. IFN a 1的肝臟mRNA的定量RT-PCR。每天向三只BALB/c鼠高壓注射每種質(zhì) 粒。在第1天、第3天和第6天，處死動(dòng)物并提取肝臟。純化肝臟mRNA，用定量RT-PCR檢 測(cè)IFNal基因。典型實(shí)驗(yàn)的平均值以及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差如圖所示。通過(guò)重復(fù)測(cè)量方差 分析和Bonferroni檢驗(yàn)分析結(jié)果。質(zhì)粒IFN a 1、AF和IA誘導(dǎo)的mRNA水平之間沒(méi)有顯著
性差異。圖3.體溫和血清新蝶呤水平。對(duì)BALB/c鼠施用編碼具有IFNa的構(gòu)建體的質(zhì) 粒。在第3天采血，通過(guò)ELISA測(cè)量血清新蝶呤(A)水平。同時(shí)分析體溫(B)。兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(N = 6只小鼠)的平均值以及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差如圖所示。通過(guò)重復(fù)測(cè)量方差分析和 Dunnett，s檢驗(yàn)分析結(jié)果，將IFNa組和ApoAI對(duì)照組相比較。_p < 0. 0001。圖4. IFNa 1誘導(dǎo)基因的肝臟mRNA的定量RT-PCR。用表達(dá)IFNa 1的構(gòu)建體的質(zhì)粒 高壓注射BALB/c鼠。在第3天，處死動(dòng)物并提取肝臟。純化肝臟mRNA，并對(duì)2’-5’0AS(A)， USP18 (B)，ISG15(C)和IRFl (D)基因進(jìn)行定量RT-PCR0兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(N = 6只小鼠)的 平均值以及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差如圖所示。以重復(fù)測(cè)量方差分析和Durmett’ s檢驗(yàn)分析結(jié) 果，將IFNa組和ApoAI對(duì)照組相比較。*p < 0. 05 ;_p < 0. 0001。圖5.脾細(xì)胞數(shù)量及活化的增加。BALB/c鼠通過(guò)高壓注射接受具有IFNa的不同 構(gòu)建體，6天后處死小鼠并分離脾臟。分析脾細(xì)胞的數(shù)目㈧以及CD4+T細(xì)胞(B)、CD8+T 細(xì)胞(C)、B細(xì)胞(D)和NK細(xì)胞(E)上的早期活化標(biāo)記CD69的表達(dá)。典型實(shí)驗(yàn)每組7只動(dòng) 物，平均值以及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差如圖所示。以重復(fù)測(cè)量方差分析和Durmett’ s檢驗(yàn)分析 結(jié)果，將 IFNa 組和 ApoAI 對(duì)照組相比較。*p < 0. 05 ；**p < 0. 001 ；< 0. 0001。圖6.在表達(dá)IFNa的構(gòu)建體存在下由基因疫苗接種誘導(dǎo)的特異性裂解的上升。 通過(guò)高壓注射表達(dá)β-半乳糖苷酶的質(zhì)粒和共施用表達(dá)具有IFN α的不同構(gòu)建體的質(zhì)粒作 為佐劑來(lái)免疫BALB/c鼠。7天后，靜脈內(nèi)注射加載細(xì)胞毒素肽以及高濃度CFSE的靶細(xì)胞 和具有低濃度CFSE的對(duì)照細(xì)胞。M小時(shí)后，處死動(dòng)物，分析靶細(xì)胞以及對(duì)照細(xì)胞的比例以 計(jì)算特異性裂解的百分?jǐn)?shù)。每組的柱狀圖代表(A)以及每組3個(gè)動(dòng)物的典型實(shí)驗(yàn)的平均值 和平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(B)如圖所示。以重復(fù)測(cè)量方差分析和Durmett’ s檢驗(yàn)分析結(jié)果，將 Apo-IFN 禾口 IFN-Apo 組與 IFNa 相比較。**p < 0. 001。圖7.不同免疫系統(tǒng)細(xì)胞群中SR-BI的表達(dá)。分離BALB/c鼠脾臟中的脾細(xì)胞以抗 SR-BI抗體標(biāo)記，并以抗體標(biāo)記來(lái)區(qū)分CD4+T細(xì)胞(抗CD4) (A)、CD8+淋巴細(xì)胞(抗CD8)
(B)、NK細(xì)胞(抗CD49b) (C)、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(抗CDllb) (D)或樹(shù)突細(xì)胞(抗CDllc)㈤。圖8.抗腫瘤接種疫苗模型中的佐劑效果。每個(gè)處理組11-17只BALB/c鼠，用表 達(dá)ApoAI (Apo)、IFNa (IFN)、或IFN-Apo (IA)的質(zhì)粒進(jìn)行高壓注射。M小時(shí)后，用在不完全 弗氏佐劑中的細(xì)胞毒素肽接種。9天后，皮下接種5X IO6的CD6細(xì)胞并隨時(shí)間觀察腫瘤的 發(fā)病。隨時(shí)間推移的無(wú)瘤小鼠百分比如圖所示。通過(guò)Log-rank檢驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。 **p < 0. 01。圖9.循環(huán)的白細(xì)胞和血小板的動(dòng)力學(xué)。對(duì)BALB/c鼠施用編碼具有IFNa的構(gòu)建 體的質(zhì)粒。在高壓注射后的第1天從一個(gè)組抽血，在第3天從另一個(gè)組抽血，在第6天從最 后一組抽血。應(yīng)用Zl Coulter粒子計(jì)數(shù)器，依據(jù)操作說(shuō)明書(shū)量化白細(xì)胞(A)和血小板(B) 數(shù)目。兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(N = 4小鼠/每天以及每組)的平均值以及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差如圖 所示。以重復(fù)測(cè)量方差分析和Durmett’ s檢驗(yàn)分析結(jié)果，將IFN-Apo組與IFN相比較。**p < 0. 01。圖10. IFNa可誘導(dǎo)的基因的腦mRNA的定量RT-PCR。給BALB/c小鼠高壓注射具有 表達(dá)IFN α的構(gòu)建體的質(zhì)粒。在第1天，處死動(dòng)物并提取大腦。純化腦mRNA并對(duì)USP18 (A)、 ISG15(B)、2，-5，0AS(C)、Mxl(D)以及 IRFl (D)基因進(jìn)行定量 RT-PCR。兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(N = 5 小鼠/每組)的平均值以及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差如圖所示。以重復(fù)測(cè)量方差分析和Durmett's 檢驗(yàn)分析結(jié)果，將IFN-Apo組與IFN相比較。*p < 0. 05 ；**p < 0. 01 ；***p < 0. 001。這是一個(gè)代表兩個(gè)的實(shí)驗(yàn)。圖11.循環(huán)高密度脂蛋白(HDLs)中融合蛋白的整合。施用編碼具有IFNa的構(gòu) 建體的質(zhì)粒給BALB/c小鼠。M小時(shí)后，采血并從獲得的血清中通過(guò)NaBr梯度差速離心提 取HDLs。通過(guò)干擾素生物測(cè)定，細(xì)胞病變效應(yīng)保護(hù)測(cè)定來(lái)分析不同組的HDLs中IFN α的存 在(A)。在無(wú)HDLs (HDLs-)血清樣品中以及含有HDLs (HDLs+)的部分，用免疫印跡確定載脂 蛋白AI的存在(B)0圖12.施用含有IFN-Apo的HDLs的血液學(xué)效應(yīng)。相當(dāng)于10000IU IFN的含有 IFN-Apo 的 HDLs、10000IU 重組 IFN 或 PBS 被施用給 BALB/c 小鼠。3 天后，應(yīng)用 Zl Coulter 粒子計(jì)數(shù)器，依據(jù)操作說(shuō)明書(shū)量化白細(xì)胞(A)和血小板(B)數(shù)目。兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(N = 4-6 小鼠/每組)的平均值以及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差如圖所示。以重復(fù)測(cè)量方差分析和Durmett's 檢驗(yàn)分析結(jié)果，將IFN-Apo組與IFN相比較。< 0. 01 ;_p < 0· 001。圖13. IL12誘導(dǎo)的IFNy誘導(dǎo)的上升。高壓注射一個(gè)表達(dá)IL12的可被強(qiáng)力霉素誘 導(dǎo)的增強(qiáng)子調(diào)控的質(zhì)粒，以及另一個(gè)表達(dá)對(duì)照構(gòu)建體或具有TGF β抑制子ρ17(Α)或TGF β 抑制子ρ144(Β)之一的構(gòu)建體的質(zhì)粒。4天后，通過(guò)ELISA分析血清中IFNy的濃度。每 組3個(gè)動(dòng)物的典型實(shí)驗(yàn)的平均值以及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差如圖所示。以重復(fù)測(cè)量方差分析和 Dunnett' s檢驗(yàn)分析結(jié)果，將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比較。**p < 0. 001。圖14.對(duì)抗CD6腫瘤發(fā)展的保護(hù)。以不完全弗氏佐劑中的細(xì)胞毒素肽AHl接種 BALB/c小鼠。7天后，高壓注射表達(dá)TGFβ抑制子或以ApoA-I作為對(duì)照的構(gòu)建體。再過(guò)7 天，皮下接種5Χ IO5的CD6細(xì)胞并隨時(shí)間推移觀察腫瘤的發(fā)病。隨時(shí)間推移的無(wú)瘤小鼠 百分比如圖所示。通過(guò)Log-rank檢驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。*p < 0. 05 ；**p < 0. 001。圖15.循環(huán)高密度脂蛋白(HDLs)中Ap0-連接子-P144融合蛋白的整合。對(duì)BALB/ c小鼠施用編碼具有Apo或Apo-連接子-P144的構(gòu)建體的質(zhì)粒。M小時(shí)后，采血并從所獲 得的血清中通過(guò)NaBr梯度差速離心提取HDLs。在含有HDLs的部分，以免疫印跡確定載脂 蛋白AI的存在。圖16.在施用含有Apo-連接子-P144的HDLs后由IL12誘導(dǎo)的FNy誘導(dǎo)的上 升。高壓注射一個(gè)表達(dá)IL12的可被強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的增強(qiáng)子調(diào)控的質(zhì)粒，以及一個(gè)表達(dá)對(duì)照 構(gòu)建體(Apo)或Apo-連接子-P144的質(zhì)粒。最后一組施用IL12質(zhì)粒并腹腔注射14yg/每 只小鼠的含有Apo-連接子-P144的HDLs。4天后，通過(guò)ELISA檢測(cè)血清中IFN γ的濃度。 每組3個(gè)動(dòng)物的典型實(shí)驗(yàn)的平均值以及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差如圖所示。以重復(fù)測(cè)量方差分析 和Durmett ’ s檢驗(yàn)分析結(jié)果，將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比較。**p < 0. 01。發(fā)明詳述1.本發(fā)明的軛合物本發(fā)明的作者觀察到，由Apo A蛋白或其功能等價(jià)變體與治療所需分子的軛合物 在施用給患者后，顯示出比給患者施用未軛合的治療所需分子更大的血清半衰期。此外， Apo A與治療所需分子的軛合物被特異性運(yùn)載至患者肝臟，其極大地促進(jìn)了肝臟疾病治療 并減少了治療性分子在其它組織中產(chǎn)生的副作用。因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種軛合物，其包括(i)Apo A分子或其功能等價(jià)變體，以及(ii)治療所需的化合物
其中組分(i)和(ii)共價(jià)軛合。不受任何理論限制，據(jù)認(rèn)為，用于肝臟組織的軛合物的親和力，是基于該事實(shí)即所 述組織具有Apo A蛋白的特異性受體，其擁有捕獲表面具有ApoA-I的HDLs的天然功能。另 外，軛合物半衰期的延長(zhǎng)看起來(lái)與Apo A分子在有機(jī)體中所顯示的長(zhǎng)半衰期相關(guān)(在Apo A-I的情況下，在人體大約為35小時(shí)或在小鼠體內(nèi)為10小時(shí))。此外，還存在表面表達(dá)Apo A-I特異性受體的其它細(xì)胞，以運(yùn)載到其它組織。1. IApo A 分子在本發(fā)明的上下文中，“Apo A蛋白”應(yīng)理解為形成高密度脂蛋白(HDLs)部分的 Apo A家族中的任何成員，其能夠與肝細(xì)胞表面受體特異性相互作用，從而確保其運(yùn)載偶 聯(lián)至所述Apo A蛋白的所需分子到該器官的能力。可用于本發(fā)明的Apo A分子優(yōu)選自由 ApoA-I、ApoA-II、ApoA-III、ApoA-IV以及ApoA-V或其功能等價(jià)變體所組成的組中。在一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明所使用的Apo A蛋白是ApoA-I蛋白。在本發(fā) 明的上下文中，ApoA-I應(yīng)理解為形成高密度脂蛋白(HDLs)組分的前-proApoA-I蛋白的成 熟形式。ApoA-I作為含有分泌信號(hào)序列的前體(前-proApoA-I)被合成，其中所述分泌信 號(hào)序列被切除以產(chǎn)生前體。該信號(hào)序列由18個(gè)氨基酸組成，前導(dǎo)肽由6個(gè)氨基酸組成而蛋 白的成熟形式由243個(gè)氨基酸組成。優(yōu)選缺乏信號(hào)肽的并被加工過(guò)的成熟形式蛋白。在一 優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，ApoA-I蛋白是人源的并且其氨基酸序列如SEQ ID NO :1 (UniPort 中的登錄號(hào)為P02647)所示。在另一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，ApoA-I是鼠源的特別是來(lái)自 于小鼠，并且其氨基酸序列如SEQ ID NO :2 (UniPort中的登錄號(hào)為Q00623)所示。在另一 優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，ApoA-I是鼠源的特別是來(lái)自于大鼠，并且其氨基酸序列如SEQ ID NO 3 (UniPort中的登錄號(hào)為P04639)所示。ApoA-I的功能等價(jià)變體應(yīng)理解為所有由前述人或鼠ApoA-I序列通過(guò)插入、替換 或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸所產(chǎn)生的，并實(shí)質(zhì)上完整保持了與在肝細(xì)胞中形成HDL受體的 所謂的“B類(lèi)I型清道夫受體”(SR-BI)相互作用能力的那些多肽。基本上如Monaco等 (EMBO J. ,1987,6 =3253-3260)所描述的，通過(guò)ApoA-I結(jié)合肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞膜的研究或通過(guò)檢 測(cè)ApoA-I或其變體抑制HDL結(jié)合肝細(xì)胞膜受體的能力，來(lái)檢測(cè)其與HDL受體相互作用的能 力。ApoA-I變體結(jié)合肝細(xì)胞膜的離解常數(shù)優(yōu)選至少是10_8M、ΙΟΙ、10_6M、10_5M或10_%。本發(fā)明預(yù)期的ApoA-I變體包括與ApoA-I多肽具有至少60 %、65 %、70 %、72 %、 74 %、76 %、78 %、80 %、90 %或95 %相似性或同一性的多肽。兩種肽之間的同一性程度通 過(guò)計(jì)算機(jī)算法以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法來(lái)確定。兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性優(yōu) 選通過(guò) BLASTP 算法(BLASTManual, Altschul, S.等，NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894， Altschul, S.，等，J.，1990，Mol. Biol. 215 :403-410)來(lái)確定。本發(fā)明使用的ApoA-I變體優(yōu)選具有比天然ApoA-I更長(zhǎng)的血清半衰期，使得 ApoA-I血清水平達(dá)到比用ApoA-I所觀察到的更高的水平。確定蛋白質(zhì)以及特別是ApoA-I 的血清半衰期的方法是本領(lǐng)域公知的，其中包括，Eisenberg，S等(J. Lipid Res.，1973，14 446_458)、Blum 等(J.Clin· Invest. , 1977,60 :795-807)以及 Graversen 等(J Cardiovasc Pharmacol.，2008，51 :170-177)所描述的基于以標(biāo)記蛋白標(biāo)記代謝的方法。具有更長(zhǎng)半衰 期的所述變體的例子有，例如，被稱為Milano的變體(其含有R173C突變)。1. 2治療所需的化合物
在本發(fā)明中，“治療所需的化合物”應(yīng)理解為任何能夠預(yù)防或消除疾病癥狀的化合 物。本發(fā)明首先考慮了易受共價(jià)修飾而基本上不喪失其生物活性的任意治療性化合物的應(yīng) 用，諸如其可被軛合至ApoA-I或其功能等價(jià)變體。因此，本發(fā)明考慮了小有機(jī)分子、肽、擬 肽物、類(lèi)肽、蛋白質(zhì)、多肽、糖蛋白、低聚糖、核酸等作為治療有效成分的應(yīng)用。舉例來(lái)說(shuō)，可軛合至ApoA-I或其功能等價(jià)變體的化合物包括抗生素、膽堿酯酶 劑、阿托品、東莨菪堿、擬交感神經(jīng)藥、催眠藥、鎮(zhèn)靜劑、抗癲癇藥、類(lèi)鴉片、鎮(zhèn)痛劑、抗炎藥、 組胺、脂質(zhì)衍生物、平喘藥、解熱鎮(zhèn)痛藥、黃嘌呤、滲透性利尿劑、水銀化合物、噻嗪化物以及 磺胺劑、碳酸酐酶抑制劑、有機(jī)硝酸鹽、抗高血壓藥、強(qiáng)心甙、抗心律失常藥物、催產(chǎn)素、前列 腺素、生物堿、抑制分娩藥、驅(qū)蟲(chóng)劑、抗原蟲(chóng)藥物、抗瘧疾藥物、殺阿米巴藥、磺胺類(lèi)藥、青霉 素類(lèi)、trimetropin、頭孢菌素類(lèi)、磺胺甲惡唑、抗真菌藥、喹諾酮、抗病毒藥、抗生素、氨基 糖苷類(lèi)、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、烷基化劑、激素、抗代謝物、抗生素、放射性同位素、硫唑嘌 呤、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、抗凝劑、溶栓藥物、抗血小板藥物、腺垂體激素、甲狀 腺和抗甲狀腺激素、雌激素和黃體酮、雄激素、促腎上腺皮質(zhì)激素、胰島素、甲狀旁腺激素、 維生素D的類(lèi)固醇衍生物、維生素、(水溶性維生素諸如維生素B復(fù)合物以及抗壞血酸或脂 溶性維生素諸如維生素A、D、K或E)、抗組胺藥、抗癌抗菌素、抗病毒藥物、抗真菌化合物。優(yōu) 選使用可有效治療疾病感染或在肝臟中有其來(lái)源的化合物。在一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明軛合物的組分(ii)包含多肽鏈。在一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，ApoA-I多肽與形成組分(ii)的多肽形成單鏈多肽。本發(fā)明涵蓋了兩個(gè)多 肽的兩個(gè)相對(duì)方位。因此，在一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，組分(i)的C末端結(jié)合到組分(ii) 的N末端。在另一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，組分(i)的N末端結(jié)合到組分(ii)的C末端。 優(yōu)選地，當(dāng)ApoA-I軛合物由單鏈多肽形成時(shí)，它們不通過(guò)下列方式形成(i)金黃色葡萄球菌A蛋白經(jīng)C末端連接ApoA-I蛋白N末端(ii) ApoA-I蛋白經(jīng)C末端連接血管腸肽(VIP-I)N末端(iii)組分(ii)是免疫球蛋白重鏈或纖維蛋白溶酶原片段(iv)四連接素三聚結(jié)構(gòu)域(TTSE)經(jīng)C末端連接ApoA-I蛋白N末端?？墒褂帽景l(fā)明的軛合物運(yùn)載至肝臟的多肽包括促紅細(xì)胞生成素(EPO)、瘦素、促腎 上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、生長(zhǎng)激素釋放激素(GHRH)、促性腺激素釋放激素(&iRH)、促 甲狀腺激素釋放激素(TRH)、催乳素釋放激素(PRH)、褪黑激素釋放激素(MRH)、催乳素抑制 激素(PIH)、抑生長(zhǎng)素、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、促生長(zhǎng)激素或生長(zhǎng)激素(GH)、促黃體激 素(LH)、促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH或甲狀腺刺激激素)、催乳素、催產(chǎn)素、抗利 尿激素(ADH或后葉加壓素)、褪黑激素、苗勒管抑制因子、降血鈣素、甲狀旁腺激素、胃泌激 素、縮膽囊素(CCK)、精氨酸加壓素、甲狀腺激素、氧化偶氮甲烷、三碘甲狀腺氨酸、白細(xì)胞抑 制因子、雙調(diào)蛋白、可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白、干細(xì)胞因子、成骨蛋白1、骨形成蛋白、巨噬細(xì)胞生 長(zhǎng)因子(MGF)、黑瘤生長(zhǎng)刺激因子、調(diào)蛋白(heregulins)、促黑細(xì)胞激素、胰泌素、胰島素樣 生長(zhǎng)因子I (IGF-I)、胰島素樣生長(zhǎng)因子II (IGF-II)、心房利鈉肽(ANP)、人絨毛膜促性腺激 素(hCG)、胰島素、胰高血糖素、抑生長(zhǎng)素、胰多肽(PP)、瘦素、神經(jīng)肽Y、腎素、血管緊張素I、 血管緊張素II、VIII因子、IX因子、組織因子、因子VII、X因子、凝血酶、凝血因子V、因子 XI、因子X(jué)III、白細(xì)胞介素-1 (IL-I)、白細(xì)胞介素2 (IL-2)、白細(xì)胞介素3 (IL-3)、白細(xì)胞介 素4 (IL-4)、白細(xì)胞介素5 (IL-5)、白細(xì)胞介素_6 (IL-6)、白細(xì)胞介素7 (IL-7)、白細(xì)胞介素8 (IL-8)、白細(xì)胞介素9 (IL-9)、白細(xì)胞介素10 (IL-10)、白細(xì)胞介素11 (IL-Il)、白細(xì)胞介素 12(IL-12)、白細(xì)胞介素13(IL-13)、白細(xì)胞介素14(IL-14)、白細(xì)胞介素15(IL_15)、白細(xì)胞 介素16 (IL-16)、白細(xì)胞介素M (IL-M)、腫瘤壞死因子α (TNF-α)、干擾素α、干擾素β、 干擾素 Y、CD3、CD134、CD137、ICAM-U LFA-U LFA-3、趨化因子包括 RANTES1 α、MIP-I α、 MIP-I β、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、由Wilms，腫瘤抑制基因編碼的WTl蛋白、血小板衍生的生 長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)、骨形成蛋白(BMPs)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF 和KGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF及相關(guān)因子)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、粒細(xì)胞集落刺激因 子(GM-CSF)、神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源 系、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)、α -抗胰蛋白酶、腫瘤壞死因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF)、心肌營(yíng)養(yǎng)蛋白1 (CT-I)、制瘤素M(OSM)、絲氨酸蛋白酶抑制劑(Α1、Α2、Α3、Α4、Α5、 Α6、Α7、Α8、Α9、Α10、Α11、Α12、Α13、Β1、Β2、Β3、Β4、Β5、Β6、Β7、Β8、Β9、Β10、Β11、Β12、Β13、 C1、D1、E1、E2、F1、F2、G1、H1、I1以及12)、環(huán)孢霉素、纖維蛋白原、纖連蛋白的EDA結(jié)構(gòu)域、 乳鐵蛋白、組織型纖溶酶原激活物(tPA)、糜蛋白酶、免疫球蛋白、水蛭素、超氧化物歧化酶、 伊米苷酶、β -葡糖腦苷脂酶、重組阿葡糖苷酶-α、α -L型艾杜糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫 酸酯酶、加硫酶、人α-半乳糖苷酶Α、α-1蛋白酶抑制劑、乳糖酶、胰酶(脂肪酶，淀粉酶， 蛋白酶)、腺苷脫氨酶、免疫球蛋白、白蛋白、A型和B型肉毒桿菌毒素、膠原酶、人脫氧核糖 核酸酶I、透明質(zhì)酸酶、木瓜酶、左旋天門(mén)冬酰胺酶、重組水蛭素、鏈激酶、膽色素原脫氨酶 (PB⑶)、細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子β (TGF-β)抑制劑肽、ILlO抑制劑、FoxP3抑制劑、TNF α抑制劑、血 管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抑制劑、PD-I抑制劑和⑶152抑制劑。在一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明軛合物的組分(ii)是干擾素(IFN)、干擾素 分為I型、II型和III型。I型干擾素是一種具有細(xì)胞因子活性的多肽家族，最初因其在體 外細(xì)胞系病毒感染中的抑制活性而被發(fā)現(xiàn)(Pestka，S.，Krause，C.D.和Walter，Μ. R. 2004. Immunol Rev. 202 :8-32)，并且其特征在于結(jié)合所謂的IFN α受體(IFNAR)。依據(jù)其序列上 的同源性，I型干擾素分為干擾素α (IFN-α)、干擾素β (IFN-β)和干擾素ω (IFN-ω)。 IFN-α和IFN-β共享表達(dá)在大多數(shù)有核細(xì)胞表面的單二聚體受體。鑒于其啟動(dòng)促進(jìn)感染 細(xì)胞凋亡的死亡以及抑制病毒復(fù)制同時(shí)有利于抗原提呈的機(jī)制，這些細(xì)胞因子在針對(duì)各種 類(lèi)型病毒感染的免疫應(yīng)答中的功能非常重要。最近有實(shí)驗(yàn)記載，其還可以在免疫應(yīng)答中通 過(guò)直接激活T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞以及樹(shù)突細(xì)胞的活性而行使功能(Le Bon Α.等，2003. Nat. Immunol. 4 :1009-1015 ；LeBon Α.等，2006. J. Immunol. 176 :4682-4689 ；Le Bon Α.等， 2006. J Immunol. 176 :2074-8)。II型干擾素的特征在于其結(jié)合干擾素、受體(IFNGR)并僅 包括IFNi 一個(gè)成員。III型干擾素通過(guò)由IL-10受體2(IL10R2)和IFN λ 1受體(IFNLRl) 形成的復(fù)合物轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，并由三種稱為IFNX-1、IFNX-2和IFNX-3的干擾素λ組成。在一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，組分(ii)是I型干擾素如IFN-α、IFN-β ,IFN- δ、 IFN- ε、IFN-κ ,IFN- τ和IFN-ω。在一特別的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明組合物中的至少一 種I型干擾素選自干擾素α (IFN-α)和干擾素β (IFN-β)。當(dāng)所述I型干擾素為IFN-a 時(shí)，后者可對(duì)應(yīng)由人IFN-α基因家族的任一基因成員所編碼的任意干擾素。在一特別的具體實(shí)施方式
中，至少一種I型干擾素是選自IFN-a 2a、IFN-α 2b, IFN-α 4、IFN-α 5、 IFN-α 8和其組合(包括其在藥物制劑中與其它物質(zhì)的組合)的IFN-α。在一更特別的具 體實(shí)施方式中，所述干擾素是IFN- α 1，優(yōu)選是人源干擾素。在一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，所述干擾素是IFN-α 5。I型干擾素的類(lèi)型列表，特別是可用于本發(fā)明的IFN-α和IFN-β，可參見(jiàn)Bekisz 等(Growth Factors, 2004 ；22 :243-251)以及 Petska 等(ImmunologicalReviews, 2004 ； 202:8-32)。此外，本發(fā)明提供了包含一種以上類(lèi)型干擾素的軛合物組合的應(yīng)用，例如 IFN-anK類(lèi)淋巴母細(xì)胞衍生物)或IFN_a3(以仙臺(tái)病毒(或另一種病毒)或病毒顆粒刺 激人白細(xì)胞所產(chǎn)生的干擾素組合)。所使用的I型干擾素的來(lái)源不是本發(fā)明的關(guān)鍵方面。I型干擾素可以是天然的， 從生物液體或組織提取并純化的，或通過(guò)傳統(tǒng)的重組基因工程以及如Sambrook和Russel
ifflW JP Tj ( "Molecular Cloning :to Laboratorymanual" of J. Sambrook, D. W. Russel Eds. 2001，第三版，Cold Spring Harbor, New York)，通過(guò)合成工藝或通過(guò)本領(lǐng) 域所描述的任何其它常規(guī)技術(shù)制備。在本發(fā)明一特別的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明組合物中的至少一種I型干擾 素是聚乙二醇形式的。制備聚乙二醇形式的干擾素的一些例子可參見(jiàn)US576^23和 US5766582。另外，也可以使用一些商用干擾素，聚乙二醇化的或非聚乙二醇化形式。這 包括，不受任何限制的，來(lái)源于Hoffmann LaRoche Inc的R0FER0N-A(人重組IFN- α 2a) 以及PEGASYS (聚乙二醇化IFN-α )，來(lái)源于Schering Corp的INTR0N-A (人重組 IFN- α 2b)以及 PEG-INTR0N (聚乙 二醇化 IFN-α 2b)，來(lái)源于 hterferon Sciences 的 ALFER0N-N(IFN- α 3η,天然干擾素的組合)，或來(lái)源于 hterMunePharmaceuticals Inc 的 IFNERGEN(IFN-α conl)，其序列是不與天然序列完全一致的共有序列。還包括IFN-β制 劑，例如 Biogen Idec 的 AVONEX(IFN-β la)，EMD Serono, Inc 的 REBIF(IFN-β la)，以及 Bayer Health Care 的 BETASERON(IFN_β lb)。在一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的軛合物由ApoA-I經(jīng)其C末端并通過(guò)柔性連 接子與干擾素α 分子N末端融合形成。在另一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的軛合物 由干擾素α 1分子經(jīng)其C末端并通過(guò)柔性連接子與ApoA-I分子N末端融合形成。在另一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，組分(ii)是TGF-β抑制劑。能作為根據(jù)本發(fā)明 軛合物部分的TGF-β抑制劑包括選自TGF-β 1受體序列的肽抑制劑，其結(jié)合TGF-β 1的受 體結(jié)合位點(diǎn)從而阻斷受體結(jié)合。這些類(lèi)型的肽在W0200031135中有描述，其中的全部?jī)?nèi)容 通過(guò)引用納入本文。在一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，TGF-β 1抑制肽來(lái)源于TGF-β IIII型受 體。在一更優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，抑制肽是具有序列為T(mén)SLDASIIWAMMQN(SEQ ID NO 4) 的肽P144。本發(fā)明同樣提供了抑制肽在抑制TGF-β 1與TGF-β 1受體相互作用以及所述相 互作用引發(fā)的信號(hào)中的應(yīng)用，鑒定這樣的肽的噬菌體展示基因文庫(kù)已被W0200519244描 述，其中的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用納入本文。在一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，抑制肽是肽P17，其 特征在于序列為KRIWFIPRSSWYERA(SEQ ID NO :5)及其截短的變體，其基本上保留了抑制 TGF-β 1與TGF-β 1受體相互作用的能力，這些在W02007048857中已有描述，其中的全部?jī)?nèi) 容通過(guò)引用納入本發(fā)明。 1. 3ΑροΑ組分與治療活性化合物之間的連接元件 包含Apo A蛋白和具有天然肽的第二組分的本發(fā)明的軛合物，含有直接連接Apo A蛋白和所述第二組分的鍵，或者，可選擇地，含有在Apo A蛋白和具有天然肽的所述第二組分之間作為連接子的其它氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明，所述非天然中間氨基酸序列在結(jié)構(gòu) 域之間作為鉸鏈區(qū)，使得它們相互之間可獨(dú)立移動(dòng)同時(shí)保持各自結(jié)構(gòu)域的三維構(gòu)型。從這 個(gè)意義上來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的優(yōu)選非天然中間氨基酸序列應(yīng)當(dāng)是以允許這種移動(dòng)的結(jié)構(gòu)延展性 為特征的鉸鏈區(qū)。在一特別的具體實(shí)施方式
中，所述非天然中間氨基酸序列是非天然柔性 連接子。在一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，所述柔性連接子是長(zhǎng)度為20個(gè)氨基酸或更短的柔 性連接肽。在一更優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，連接肽含有2個(gè)或多個(gè)選自甘氨酸、絲氨酸、 丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸。在本發(fā)明的一優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，所述柔性連接子是多聚 甘氨酸連接子?？赡艿倪B接子/間隔區(qū)序列的例子包括SGGTSGSTSGTGST(SEQ ID NO :6)、 AGSSTGSSTGPGSTT (SEQ ID NO 7)或 GGSGGAP(SEQ ID NO :8)。這些序列已用于結(jié)合設(shè)計(jì)的 卷曲螺旋至其它蛋白結(jié)構(gòu)域(Muller，K. Μ.，Arndt, K. Μ.禾Π Alber，Τ.，Meth. Enzymology, 2000,328 :261-281) ο所述連接子優(yōu)選包含氨基酸序列GGGVEGGG(SEQ ID NO 9)或由其組 成。連接區(qū)域的作用是在Apo A蛋白和組分(ii)之間提供空間。從而確保ApoA的二 級(jí)結(jié)構(gòu)不受組分(ii)存在的影響，反之亦然。間隔區(qū)優(yōu)選具有肽性質(zhì)。連接肽優(yōu)選包含至 少2個(gè)氨基酸，至少3個(gè)氨基酸、至少5個(gè)氨基酸、至少10個(gè)氨基酸、至少15個(gè)氨基酸、至 少20個(gè)氨基酸、至少30個(gè)氨基酸、至少40個(gè)氨基酸、至少50個(gè)氨基酸、至少60個(gè)氨基酸、 至少70個(gè)氨基酸、至少80個(gè)氨基酸、至少90個(gè)氨基酸或大約100個(gè)氨基酸。連接子可通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合本發(fā)明軛合物的兩種組分側(cè)翼的組分，并且優(yōu)選間隔區(qū) 基本上是非免疫原性的和/或不包含任何半胱氨酸殘基。以類(lèi)似的方式，間隔區(qū)的三維結(jié) 構(gòu)優(yōu)選是線性的或基本上是線性的。間隔肽或連接肽的優(yōu)選例子包括那些已用于結(jié)合蛋白質(zhì)但基本上不削弱所結(jié)合 蛋白功能的，或至少基本上不削弱其中一個(gè)結(jié)合蛋白質(zhì)的功能的肽。更優(yōu)選的，已用于結(jié)合 蛋白的間隔區(qū)或連接子包含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。連接子可包括在四連接素中形成β片層的四連接素的53-56殘基，以及在四連接 素中形成轉(zhuǎn)角(turn)的 57-59 殘基(Nielsen, B. B.等，F(xiàn)EBS Lett. 412 :388-396,1997) 片段的序列是GTKVHMK(SEQ ID NO :10)。該連接子具有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)其存在于天然四連接素 中時(shí)，其通過(guò)CRD結(jié)構(gòu)域結(jié)合三聚結(jié)構(gòu)域，并因而適于連接三聚結(jié)構(gòu)域至另一普通結(jié)構(gòu)域。 此外，生成的構(gòu)建體預(yù)期不比沒(méi)有連接子的構(gòu)建體具有更強(qiáng)的免疫原性。另外，人纖連蛋白來(lái)源的連接鏈3中的子序列可用作連接子，所述子序列對(duì)應(yīng)于 氨基酸1992-2102 (SffISSPROT編號(hào)，登記號(hào)P02751)。優(yōu)選應(yīng)用對(duì)應(yīng)于氨基酸2037-2049的 子序列PGTSGQQPSVGQQ(SEQ ID NO :11)，其中更優(yōu)選的是對(duì)應(yīng)于氨基酸2038-2042的子序 列片段GTSGQ(SEQ IDNO :52)。該構(gòu)建體具有不易蛋白裂解的優(yōu)點(diǎn)，并且，由于纖連蛋白在 血漿中高濃度存在，其免疫原性不強(qiáng)?？蛇x地，合適的肽連接子可以是基于小鼠IgG3上游鉸鏈區(qū)的10個(gè)氨基酸殘基序 列。該肽(PKPSTPPGSS，SEQ ID NO :12)已被用于生產(chǎn)通過(guò)卷曲螺旋二聚的抗體(Pack P.和 Pluckthun, A.，1992，Biochemistry31 :1579-1584)，并可用作根據(jù)本發(fā)明的間隔肽。更優(yōu) 選的是人IgG3上游鉸鏈區(qū)的相應(yīng)序列。預(yù)期人IgG3序列在人體中不具有免疫原性。在一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，連接肽選自序列APAETKAEPMT(SEQ IDNO :13)的肽 以及具有序列GAP的肽。
可選地，本發(fā)明軛合物的兩種組分可通過(guò)肽連接，所述肽的序列含有蛋白酶切割 靶點(diǎn)，因而能將Apo A-I從組分(ii)分離。適合整合入本發(fā)明多肽的蛋白酶切位點(diǎn)包括 腸激酶(切割位點(diǎn)DDDDK, SEQ ID NO :14)、Xa因子(切割位點(diǎn)IEDGR，SEQ ID NO :15、凝血 酶(切割位點(diǎn) LVPRGS, SEQ IDNO :16)、TEV 蛋白酶(切割位點(diǎn) ENLYFQG，SEQ ID NO 17)、 I^eScission蛋白酶(切割位點(diǎn)LEVLFQGP，SEQ ID NO :18)、內(nèi)含子等等。在一優(yōu)選的具體 實(shí)施方式中，切割位點(diǎn)是表達(dá)在腫瘤組織、發(fā)炎組織、或肝臟中使得軛合物一到達(dá)肝臟就發(fā) 生Apo A與組分(ii)分離的蛋白酶切割位點(diǎn)。在一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，連接子含有基 質(zhì)金屬蛋白酶"9識(shí)別位點(diǎn)(切割位點(diǎn)LFPTS, SEQ ID NO 19)。2.獲得本發(fā)明軛合物的方法本發(fā)明的軛合物可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的任何方法獲得。因此可通過(guò)任何標(biāo) 準(zhǔn)方法獲得Apo A蛋白或所述蛋白質(zhì)的變體。例如，可從個(gè)人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的血清樣品中純 化 Apo A-I 蛋白(W09807751，W09811140, Jackson 等，1976，Biochim Biophys Acta. 420 342-349，Borresen, A. L.禾口 Kindt，Τ. J.，1978，J. Immunogenet. 5 :5-12 以及 Forgez, P, 禾口 Chapman，Μ. J. ，1982，J. Biochem. Biophys. Methods, 6 :283-96)?？蛇x地，Apo A-I 蛋白 可在異種生物例如大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞中應(yīng)用本領(lǐng)域已知的方法表 達(dá) cDNA 獲得，所述方法已描述于 W007023476、W09525786、W08702062、Feng 等，(Protein. Expr. Purif.，2006,46 :337-42)、Pyle 等，1996 Biochemistry. 35 12046-52)、Brissette 等，(Protein Expr. Purif. 1991,2 :296-303)以及 Bonen，D. K. (J. Biol. Chem.，1997，272 5659-67)。一旦有足夠量的純化Apo A蛋白，應(yīng)當(dāng)將其軛合至所需的治療性化合物?？梢酝ㄟ^(guò) 不同方式軛合治療活性組分(ii)至Apo A分子。一種可能性是，官能團(tuán)與治療活性組分在 不干擾所述組分活性的位置直接軛合。如本發(fā)明所理解的，官能團(tuán)涉及分子中的一組特殊 原子，其是所述分子具有特征性化學(xué)反應(yīng)的原因。官能團(tuán)的例子包括但不限于以下物質(zhì)組 成的組羥基、醛、烷基、烯基、炔基、酰胺、氨甲酰、伯胺、仲胺、叔胺以及季胺、氨氧基、疊氮 化物、偶氮基(二酰亞胺)、芐基、碳酸鹽、酯、醚、乙醛酰、鹵烷基、鹵甲?；?、亞胺、酰亞胺、 酮、馬來(lái)酰亞胺、異腈、異氰酸鹽、羰基、硝酸鹽、亞硝酸鹽、硝基、亞硝基、過(guò)氧化物、苯基、磷 化氫、磷酸鹽、膦?；?、吡啶基、硫化物、磺酰基、亞磺酰基、硫酯、硫醇和氧化3，4_ 二羥基苯 丙氨酸(DOPA)基團(tuán)。所述基團(tuán)的例子是特異性地與Apo A分子中的硫醇基反應(yīng)的馬來(lái)酰 亞胺或乙醛?；鶊F(tuán)，以及與Apo A分子中的伯胺反應(yīng)的氧化3，4_ 二羥基苯丙氨酸(DOPA) 基團(tuán)。另一種可能性是，通過(guò)應(yīng)用同源或異源雙官能團(tuán)軛合治療活性組分(ii)至Apo A 分子。雙官能團(tuán)可首先軛合至治療活性化合物，然后軛合至Apo A蛋白，或者，可選地，可軛 合雙官能團(tuán)至Apo A蛋白，然后將其軛合至治療活性化合物。這些類(lèi)型的軛合物的示例包 括被稱為酮肟(US20050255042中有描述)的軛合物，其中軛合物的第一組分包含結(jié)合異源 雙官能團(tuán)中的酮官能團(tuán)的氨氧基，其順序結(jié)合軛合物第二組分中的氨基基團(tuán)。在其它具體實(shí)施方式
中，用于軛合本發(fā)明軛合物組分(i)和(ii)的試劑可以是 光分解的、化學(xué)的、熱處理或酶處理的。特別需要使用能夠在細(xì)胞靶中以酶水解的連接劑， 使得治療活性化合物僅在細(xì)胞內(nèi)部釋放。能夠在細(xì)胞內(nèi)處理的連接劑類(lèi)型的例子已在 W004054622, W006107617, W007046893 和 W007112193 描述。
在一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明軛合物的組分(ii)是具有天然肽的化合物， 包括低聚肽和肽?；瘜W(xué)修飾多肽鏈的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，包括基于半胱氨 酸基中的巰基軛合的方法，基于賴氨酸基中的伯氨基軛合的方法(US6809186)，基于N末端 和C末端部分軛合的方法。用于修飾多肽使得其耦合其它化合物的合適試劑包括戊二醛 (其使得化合物結(jié)合多肽的N末端)、碳化二亞胺(其使得化合物結(jié)合多肽的C末端)、琥珀 酰亞胺酯(例如MBS、SMCC)其激活N末端和半胱氨酸基、對(duì)二氨基聯(lián)苯(BDB)其激活酪氨 酸基、高碘酸鹽，其激活糖基化蛋白中的糖基。在組分Apo A與所需治療性化合物形成單肽鏈的特定情況下，可以使用本發(fā)明的 編碼所述軛合物的基因構(gòu)建體在單獨(dú)步驟中表達(dá)軛合物，因?yàn)樗鰳?gòu)建體與轉(zhuǎn)錄元件以及 可選的翻譯控制元件一同被導(dǎo)入合適在異源有機(jī)體中表達(dá)的載體。本發(fā)明表達(dá)框中的轉(zhuǎn) 錄元件以及可選的翻譯控制元件包括啟動(dòng)子，指導(dǎo)其可操作地連接的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄以 及其它必需或適合轉(zhuǎn)錄的序列及其位置和時(shí)間的適當(dāng)調(diào)控，例如，起始和終止信號(hào)、切割位 點(diǎn)、多聚腺苷酸化信號(hào)、復(fù)制起點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄沉默子等等。用于構(gòu)建本發(fā)明表達(dá)框以 及重組載體的所述元件以及載體通常根據(jù)應(yīng)用的宿主細(xì)胞來(lái)選擇。3.本、11_針_在另一方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解 的是本發(fā)明的多核苷酸僅僅編碼所述軛合物，其中軛合物的組分(ii)具有肽性質(zhì)并且多 肽Apo A形成單個(gè)的肽鏈，而不考慮相對(duì)位置以及不考慮兩個(gè)組分直接連接或由間隔區(qū)隔 開(kāi)的情況。在另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明多核苷酸的基因構(gòu)建體。優(yōu)選的構(gòu)建體包括， 本發(fā)明的多核苷酸受調(diào)節(jié)本發(fā)明多核苷酸表達(dá)序列的可操控調(diào)控。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 理解的是，本發(fā)明的多核苷酸必須接近靶組織的細(xì)胞核，并在那轉(zhuǎn)錄以及翻譯以產(chǎn)生生物 活性融合蛋白。為此，當(dāng)施用的活性組分是多核苷酸時(shí)，后者必須優(yōu)選編碼pre-proApoAl 或ApoAl變體的前體形式，使得在其表達(dá)后由于信號(hào)序列而分泌并被加工以生成成熟的 ApoAl0在Apo A經(jīng)C末端與干擾素分子融合形成軛合物用于表達(dá)的情況下，優(yōu)選編碼軛 合物的多核苷酸位于編碼ApoAl信號(hào)序列的序列之后。在干擾素分子經(jīng)C末端與Apo A分 子N末端融合形成軛合物用于表達(dá)的情況下，優(yōu)選編碼軛合物的多核苷酸位于編碼干擾素 α 信號(hào)序列的序列之后。原則上，任何啟動(dòng)子均可用于本發(fā)明的基因構(gòu)建體，只要所述啟動(dòng)子與待表達(dá)的 多核苷酸的細(xì)胞兼容。因此，適合本發(fā)明具體實(shí)施方式
的啟動(dòng)子包括但不必要限于組成 型啟動(dòng)子，例如真核病毒基因組的衍生物，所述真核病毒如多瘤病毒、腺病毒、SV40、CMV、鳥(niǎo) 類(lèi)肉瘤病毒、乙型肝炎病毒；金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子；單純皰疹病毒胸苷激酶基因啟動(dòng)子； 逆轉(zhuǎn)錄酶病毒LTR區(qū)；免疫球蛋白基因啟動(dòng)子；肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子；EF-I α基因啟動(dòng)子； 以及蛋白質(zhì)表達(dá)依賴于額外的分子或外源信號(hào)的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，如四環(huán)素系統(tǒng)、NF κ B/紫 外光系統(tǒng)、Cre/Lox系統(tǒng)；以及熱休克基因啟動(dòng)子；W02006/135436所述的RNA聚合酶II的 可調(diào)控啟動(dòng)子以及組織特異性啟動(dòng)子。在一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的基因構(gòu)建體 含有位于主要在肝臟表達(dá)基因的啟動(dòng)子區(qū)域的表達(dá)-增強(qiáng)區(qū)，所述基因如人血清白蛋白基 因、凝血酶原基因、α 1微球蛋白基因或醛縮酶基因，或者是幾個(gè)拷貝形式的單拷貝，或者是孤立形式或與其它肝臟特異表達(dá)元件如巨細(xì)胞病毒、α 1抗胰蛋白酶或白蛋白啟動(dòng)子的組
I=I O組織特異啟動(dòng)子的其它例子包括白蛋白基因啟動(dòng)子(Miyatake等，1997， J. Virol, 71 :5124-32)、肝炎病毒的核心啟動(dòng)子(Sandig 等，1996，Gene Ther.，3 :1002-9)、 α -甲胎蛋白(phetoprotein)基因的啟動(dòng)子(Arbuthnot 等，1996，Hum. GeneTher.，7 1503-14)、以及結(jié)合甲狀腺素的球蛋白結(jié)合蛋白的啟動(dòng)子(Wang，L.，等，1997，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :11563-11566)。本發(fā)明的多核苷酸或形成其的基因構(gòu)建體可成為載體的一部分。因此，在另一方 面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明多核苷酸或基因構(gòu)建體的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是 可使用的載體類(lèi)型沒(méi)有限制，因?yàn)樗鲚d體可以是適合增殖以及適合獲得所述多核苷酸的 克隆載體、或合適的基因構(gòu)建體、或合適純化軛合物的不同異源有機(jī)體中的表達(dá)載體。因 此，根據(jù)本發(fā)明的合適載體包括原核生物表達(dá)載體如PUC18、pUC19、Bluescript及其衍生 物、1^18、1^19481 3224]\^9、(0比140 1、1^4、噬菌體和穿梭載體如 pSA3 以及 pAT28，酵母 表達(dá)載體如2微米質(zhì)粒類(lèi)型載體、整合質(zhì)粒、YEP載體、著絲粒質(zhì)粒等等，昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)載體 如pAC系列和pVL系列載體，植物中的植物表達(dá)載體如pIBI、pEarleyGate、pAVA、pCAMBIA，、 pGSA、pGWB、pMDC、pMY、pORE系列載體等等，基于病毒載體(腺病毒、與腺病毒相關(guān)的病 毒以及逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒)的高等真核細(xì)胞表達(dá)載體以及非病毒載體如PSilencer 4. I-CMV(Ambion)、pcDNA3、pcDNA3. 1/hyg pHCMV/Zeo、pCR3. 1、pEFl/His、pIND/GS、pRc/ HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5_His、ρVAXl, pZeoSV2、pCI、pSVL 和 pKSV-10、 pBPV-1、pML2d 以及 pTDTl。本發(fā)明的載體可用于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染那些可被所述載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染的細(xì) 胞。所述細(xì)胞可以是原核的或真核的。例如，其中引入所述DNA序列的載體可以是質(zhì)粒，或 是一種當(dāng)其被引入宿主細(xì)胞時(shí)整合在所述細(xì)胞基因組并與所整合的染色體一同復(fù)制的載 體。所述載體可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法獲得(Sambrok等，2001，如上所述)。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的多核苷酸、基因構(gòu)建體或載體的細(xì) 胞，因?yàn)樗黾?xì)胞已能被本發(fā)明所提供的構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的常規(guī)方法獲得(Sambrok等，2001，如上所述)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞。在一 特別的具體實(shí)施方式
中，所述宿主細(xì)胞是以合適載體轉(zhuǎn)染或感染的動(dòng)物細(xì)胞。適用于表達(dá)本發(fā)明軛合物的宿主細(xì)胞包括但不限于哺乳動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)、真菌 以及細(xì)菌細(xì)胞。細(xì)菌細(xì)胞包括但不限于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞如芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬以 及葡萄球菌種屬，革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞如埃希氏菌屬和假單胞菌屬。優(yōu)選的真核細(xì)胞包 括酵母細(xì)胞如酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母(Pichia pastoris)以及多形漢遜酵母 (Hansenula polymorpha) 0昆蟲(chóng)細(xì)胞包括但不限于果蠅細(xì)胞以及Sf9細(xì)胞。植物細(xì)胞包 括，特別是，農(nóng)作物細(xì)胞如谷類(lèi)植物、藥用植物、觀賞植物或球莖植物。適合本發(fā)明的哺乳動(dòng) 物細(xì)胞包括上皮細(xì)胞系(豬的，等等)、骨肉瘤細(xì)胞系(人的，等等)、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系 (人的，等等)、上皮癌(人的，等等)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(小鼠的，等等)、肝細(xì)胞系(源于猴的， 等等)、CH0(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞、COS細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、911、AT1080、A549、293 或PER. C6、NTERA-2人ECC細(xì)胞、mESC細(xì)胞系的D3細(xì)胞、人胚胎干細(xì)胞如HS293和BGVO1、 SHEFU SHEF2 以及 HS181、NIH3T3 細(xì)胞、293T、REH 和 MCF-7 以及 hMSC 細(xì)胞。
在另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明軛合物的納米脂質(zhì)體顆粒。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“納米脂質(zhì)體顆粒，，等同于術(shù)語(yǔ)“脂蛋白”或“脂蛋白顆粒，， 并可互換使用。所謂“納米脂質(zhì)體顆?！痹诖藨?yīng)理解為任何由非極性脂類(lèi)(如酯化膽固醇 和甘油三酯)核心被載脂蛋白、磷脂和游離膽固醇形成的外部極性包被所形成的水溶性顆 粒。根據(jù)密度將納米脂質(zhì)體顆粒或脂蛋白分為乳糜微粒、極低密度脂蛋白(VLDL)、中 間密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)以及高密度脂蛋白(HDL)。不同脂蛋白的特性如 表1所示。表權(quán)利要求
1.一種軛合物，其包括(OApo A分子或其功能等價(jià)變體，以及 ( )治療所需的化合物 其中組分(i)和(ii)共價(jià)結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的軛合物，其中所述ApoA分子選自以下物質(zhì)組成的組中 ApoA-I、ApoA-II、ApoA-III、ApoA-IV 和 ApoA-V 或其功能等價(jià)變體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的軛合物，其中所述ApoA分子選自人Apo A和鼠Apo A。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的軛合物，其中所述組分U)是多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的軛合物，其中所述組分(i)和(ii)形成單個(gè)多肽鏈。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的軛合物，其中所述組分(i)的C末端結(jié)合至組分( )的N 末端或其中組分(i )的N末端結(jié)合至組分(U )的C末端。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的軛合物，其中所述組分(ii)是干擾素。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的軛合物，其中所述干擾素是人或小鼠干擾素α 或干擾素α 5。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的軛合物，其中所述組分U)是TGF-β抑制劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的軛合物，其中所述TGF-β抑制劑選自SEQID NO=I (Ρ144) 和SEQ ID NO 2 (P 17)或其功能等價(jià)變體。
11.根據(jù)權(quán)利要求4-10中任一項(xiàng)所述的軛合物，其中所述組分(t)和(h )通過(guò)連接肽連接。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的軛合物，其中所述連接肽是柔性肽和/或含有蛋白酶識(shí)別 位點(diǎn)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的軛合物，其中所述連接肽選自SEQID NO 3 (APAETKAEPMT)、SEQ ID NO 4 (GAP)或基質(zhì)金屬蛋白酶_9識(shí)別位點(diǎn)。
14.一種包含編碼權(quán)利要求5-13中任一項(xiàng)所述多肽的多核苷酸的多核苷酸或基因構(gòu) 建體。
15.一種包含權(quán)利要求14所述的多核苷酸或基因構(gòu)建體的載體。
16.一種包含權(quán)利要求14所述的多核苷酸或基因構(gòu)建體或權(quán)利要求15所述的載體的 宿主細(xì)胞。
17.一種包含權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的軛合物的納米脂質(zhì)體顆粒。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的納米脂質(zhì)體顆粒，其中所述納米脂質(zhì)體顆粒是高密度脂 蛋白(HDL)。
19.一種包含治療有效量的權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的軛合物、權(quán)利要求14所述 的多核苷酸或基因構(gòu)建體、權(quán)利要求15所述的載體、權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞或權(quán)利要 求17或18所述的納米脂質(zhì)體顆粒以及藥物學(xué)上可接受載體或賦形劑的藥物制劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的軛合物、權(quán)利要求14所述的多核苷酸或基因 構(gòu)建體、權(quán)利要求15所述的載體、權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求17或18所述的 納米脂質(zhì)體顆粒或權(quán)利要求19所述的藥物制劑在醫(yī)學(xué)中的用途。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的軛合物、權(quán)利要求14所述的多核苷酸或基因 構(gòu)建體、權(quán)利要求15所述的載體、權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求17或18所述的 納米脂質(zhì)體顆?；驒?quán)利要求19所述的藥物制劑用于肝臟疾病或與免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病的治療。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的軛合物、權(quán)利要求14所述的多核苷酸或基因 構(gòu)建體、權(quán)利要求15所述的載體、權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求17或18所述的 納米脂質(zhì)體顆粒或權(quán)利要求19所述的藥物制劑用于以下疾病的治療，所述疾病選自以下 組中慢性丙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝癌、帕金森氏癥、急性間歇性卟啉癥、肺纖維化、骨轉(zhuǎn) 移、系統(tǒng)性硬化、硬斑病、皮膚癌、光化性角化病、瘢痕疙瘩、燒傷、心肌纖維化、腎纖維化、病 毒感染、細(xì)菌感染、寄生蟲(chóng)感染、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和非霍奇金淋巴瘤。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的軛合物、權(quán)利要求14所述的多核苷酸或基因 構(gòu)建體、權(quán)利要求15所述的載體、權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求17或18所述的 納米脂質(zhì)體顆?；驒?quán)利要求19所述的藥物制劑作為疫苗佐劑、免疫治療佐劑、結(jié)腸癌治療 中的佐劑、抗血管生成藥物、肝功能劑或腎功能保護(hù)劑的應(yīng)用。
24.一種組合物，包含(a)第一組分，其選自權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的軛合物、權(quán)利要求14所述的 多核苷酸或基因構(gòu)建體、權(quán)利要求15所述的載體、權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求 17或18所述的納米脂質(zhì)體顆?；驒?quán)利要求17所述的藥物制劑，其中組分U)是TGF-βΙ 抑制肽，以及(b)第二組分，其選自免疫刺激細(xì)胞因子、編碼所述細(xì)胞因子的多核苷酸、包含所 述多核苷酸的載體、TGF-β 1抑制肽、細(xì)胞毒素劑或其組合。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的組合物，其中組分(a)或組分(b)中的所述TGF-β1抑制 肽選自肽Ρ144和肽ρ17。
26.根據(jù)權(quán)利要求M或25所述的組合物，其中組分(b)中的所述免疫刺激細(xì)胞因子 是 IL-12。
27.根據(jù)權(quán)利要求M-26中任一項(xiàng)所述的組合物用于癌癥治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含ApoA分子或其功能等價(jià)變體以及治療所需化合物的軛合物，其中兩種組分共價(jià)連接。本發(fā)明還涉及所述軛合物在特異性靶向所述化合物至顯示ApoA分子特異性結(jié)合位點(diǎn)組織的治療中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K47/48GK102123737SQ200980131382
公開(kāi)日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2009年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月13日
發(fā)明者佩德羅·貝龍多·洛佩斯, 杰西卡·菲奧拉萬(wàn)蒂, 赫蘇斯·瑪麗亞·普列托·巴爾圖埃納 申請(qǐng)人:西馬生物醫(yī)學(xué)計(jì)劃公司