專利名稱：抗氧化LDL/β₂GPI復(fù)合物的抗體及其用途的制作方法
抗氧化LDL/i52GPI復(fù)合物的抗體及其用途技術(shù)分野本發(fā)明涉及抗氧化LDL/β 2GPI復(fù)合物的抗體以及利用該抗體確定粥樣動脈硬化 的存在部位、監(jiān)測治療效果等非介入性的動脈硬化的診斷方法。
背景技術(shù)：
作為觀察動脈硬化的狀態(tài)的目前已得到實用的診斷方法，可例示出以下4種方法?！澳_關(guān)節(jié)手臂血壓比”在躺著的狀態(tài)下測定兩臂、兩腳的血壓，在正常情況下，腳 踝一側(cè)的值稍高。但是，在血管存在狹窄的情況下，狹窄部位下游的血壓降低，腳關(guān)節(jié)的血 壓/手臂的血壓之比(ABI)變小。從ABI降低不僅可以推測下肢動脈存在動脈硬化，而且 可以推測全身都存在動脈硬化?！懊}波速度檢查”:通過研究動脈硬度的方法來推測動脈硬化的進行情況的方法。 健康人由于血管具有彈性，振動被血管壁吸收，脈波的速度慢。當動脈硬化時，脈波變快，因 此能夠以速度為指標來推測動脈硬化的進行情況?！邦i動脈超聲波檢查”利用超聲波能夠容易地觀察到行走于皮膚表面附近的頸動 脈的內(nèi)部狀況，因此通過對該頸動脈進行研究來推測全身的動脈硬化的進行情況?！癕R血管造影(MRA) ”和“CT血管造影(CTA) ”:目前血管造影是主要的血管疾病的 圖像診斷方法，介入性更低且與血管造影基本相當?shù)膱D像信息已得以應(yīng)用。關(guān)于CTA的優(yōu) 點，可列舉出(1)空間分辨力高、(2)檢查簡便、(3)鈣化病變的檢測優(yōu)異。上述“腳關(guān)節(jié)手臂血壓比”、“脈波速度檢查”無法確定粥樣化位置和對每個單個部 位的發(fā)展狀況進行診斷，只能間接地通過數(shù)值進行評價。另外，“頸動脈超聲波檢查”與脈波速度檢查等不同，具有能夠通過圖像實際地直 接對血管內(nèi)部進行診斷的優(yōu)點。但是，由于需要根據(jù)超聲波圖像的深淺和形狀來判斷血管 壁的狀況，因此要求進行檢查的醫(yī)師或檢查技師具有該技能，并且無法確定除頸動脈以外 的部位的粥樣化位置和對每個單個部位的發(fā)展狀況進行診斷。另外，作為監(jiān)測動脈硬化發(fā)展狀況的方法，有通過測定血中的氧化LDL/i32GPI 復(fù)合物的ELISA系統(tǒng)(日本專利3370334號、日本專利3898680號、W02003/022866、 W02004/023141)。但是，目前的氧化LDL/ β 2GPI復(fù)合物測定ELISA雖然能夠推測動脈硬化 灶的大小，但是無法確定動脈硬化灶的存在部位。此外，使用了 MRI和放射性標記的成像由于也需要根據(jù)圖像的深淺和形狀來判斷 血管壁的狀況，因此要求進行檢查醫(yī)師和檢查技師具有該技能(美國專利6716410號、美國 專利6375925號)。另外，以下示出與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)文獻。專利文獻1 日本專利3370334號專利文獻2 日本專利3898680號專利文獻3 :W02003/022866
專利文獻4 :W02004/023141專利文獻5 日本特表2001-506983專利文獻6 日本專利第4044972專利文獻7 美國專利6716410號專利文獻8 美國專利6375925號非專利文獻1 Journal of Biological Chemistry 269，15274-15279，1994

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的課題在于提供抗氧化LDL/β 2GPI復(fù)合物的抗體以及使用該抗體確定粥 樣動脈硬化的存在部位、監(jiān)測治療效果等非介入性的動脈硬化的診斷方法。用于解決課題的手段本發(fā)明人等確定了動脈硬化切片的可免疫染色的抗體中可適用于對體內(nèi)即生物 體內(nèi)的動脈硬化灶、特別是動脈硬化粥樣斑塊的存在位置及其大小進行成像的抗體，并對 其特異性進行了分析。其結(jié)果證明對確定的表位具有特異性的抗氧化LDL/β 2GPI復(fù)合物 抗體的熒光標記物對成像是有效的。即，本發(fā)明提供以下〔1〕 〔12〕。〔1〕一種下述(a) (e)中任一項所述的抗體，其與氧化LDL和β 2_糖蛋白I的 復(fù)合物(氧化LDL/ β 2GPI復(fù)合物)結(jié)合；(a)包含具有序列號2中記載的氨基酸序列作為⑶R1、具有序列號3中記載的 氨基酸序列作為CDR2以及具有序列號4中記載的氨基酸序列作為CDR3的重鏈的抗體；(b)包含具有序列號1中記載的氨基酸序列作為重鏈可變區(qū)的重鏈的抗體；(c)包含具有序列號7中記載的氨基酸序列作為⑶R1、具有序列號8中記載的 氨基酸序列作為CDR2和具有序列號9中記載的氨基酸序列作為CDR3的輕鏈的抗體；(d)包含具有序列號6中記載的氨基酸序列作為輕鏈可變區(qū)的輕鏈的抗體(e)具有由上述(a)或(b)中記載的重鏈和上述(C)或(d)中記載的輕鏈構(gòu)成的 對的抗體?！?〕一種抗體，其與和〔1〕所述的抗體所結(jié)合的表位相同的表位結(jié)合?！?〕根據(jù)〔1〕或〔2〕所述的抗體，其為人源化抗體或嵌合抗體?！?〕一種動脈硬化的存在部位的成像劑，其含有與氧化LDL和β2_糖蛋白I的復(fù) 合物(氧化LDL/ β 2GPI復(fù)合物)結(jié)合的抗體?！?〕一種動脈硬化的存在部位的成像劑，其含有〔1〕 〔3〕中任一項所述的抗體?！?〕根據(jù)〔4〕或〔5〕所述的成像劑，其對動脈硬化的粥樣斑塊的位置和/或大小進 行成像?！?〕一種動脈硬化的存在部位的成像用試劑盒，其包含與氧化LDL和β2_糖蛋白 I的復(fù)合物(氧化LDL/ β 2GPI復(fù)合物)結(jié)合的抗體。〔8〕一種動脈硬化的存在部位的成像用試劑盒，其包含〔1〕 〔3〕中任一項所述的 抗體?！?〕一種動脈硬化治療劑的候補化合物的篩選方法，其包含以下工序
(a)向給予了〔1〕 〔3〕中任一項所述的抗體的動脈硬化患病非人動物模型給予 候補化合物的工序；(b)對給予了所述候補化合物的動脈硬化患病非人動物模型和未給予所述候補化 合物的動脈硬化患病非人動物模型的動脈硬化灶進行成像的工序；(c)對給予了所述候補化合物的動脈硬化患病非人動物模型和未給予所述候補化 合物的動脈硬化患病非人動物模型的動脈硬化灶的大小或存在部位進行比較的工序，和(d)從給予了所述候補化合物的動脈硬化患病非人動物模型中選擇與未給予所述 候補化合物的動脈硬化患病非人動物模型相比動脈硬化灶減少或消失的候補化合物的工 序。〔10〕一種動脈硬化的存在部位的成像方法，其包含〔1〕 〔3〕所述的抗體?！?1〕〔1〕 〔3〕所述的抗體在制造動脈硬化的存在部位的成像劑中的用途?！?2〕〔1〕 〔3〕所述的抗體在動脈硬化的存在部位的成像方法中的用途。


圖1是表示用氧化LDL/i32GPI復(fù)合物作為抗原對BALB/c小鼠進行免疫得到的單 克隆抗體對固定化抗原的反應(yīng)性的圖。橫軸表示抗體濃度、縱軸表示吸光度。圖2是用于分析與液體中的抗原的競爭性(競爭抑制試驗)的示意圖。圖3是表示利用抗原的競爭抑制試驗的曲線圖。橫軸表示液體中的抗原濃度、縱 軸表示當將不存在抑制抗原時的吸光度記為100%時的抑制％。3H3和4C12為識別結(jié)合于 氧化LDL的P2GPI的抗體，其不識別游離β26ΡΙ。另外，2H6、3D4、2A12為與游離的β 2GPI 反應(yīng)的抗體。圖4為動脈硬化多發(fā)小鼠模型(高脂肪飲食喂養(yǎng)的apoE+)的主動脈瓣的免疫熒 光染色照片。A)DAPI 核的染色、B)Mac3 巨噬細胞的特異性抗體、C) 3H3抗體、D)對照。對 用普通飼料喂養(yǎng)的C57BL6系統(tǒng)的小鼠使用3H3抗體、Mac3的免疫熒光染色中，泡沫狀巨噬 細胞聚集而成的粥樣斑塊被染色。使用3H3時，同樣的部位被染色。圖5動脈硬化多發(fā)小鼠模型(高脂肪飲食喂養(yǎng)的apoE+)的主動脈瓣的免疫熒光 染色照片。表示使用了氧化LDL/β 2GPI復(fù)合物抗體的其他抗體的熒光免疫染色的結(jié)果。粥 樣斑塊的染色陽性例子僅為3H3和抗體A。圖6是利用IVIS 200獲得的使用了特異抗體的熒光成像(反射熒光觀察)照片。 體內(nèi)將成像劑從脂肪飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠的尾靜脈給予高脂肪飲食喂養(yǎng)6個月以上 的ApoE-/-小鼠，2 M小時后，用IVIS 200在吸入麻醉下對體內(nèi)熒光進行觀察、攝影。此 時，由于ApoE-/-小鼠的黑色體毛吸收熒光，因此剃掉體毛進行觀察。離體使小鼠安樂死、 開胸使心臟和主動脈露出，在右心耳上開一個小口，然后向左心室插入針并用冷PBS IOml 進行心臟灌流，摘出心臟和主動脈，利用IVIS 200得到反射熒光圖像。圖7是利用IVIS200獲得的成像照片(激發(fā)640nm，發(fā)射720nm.)。實驗1 從 尾靜脈給予高脂肪飲食喂養(yǎng)的apoE+小鼠生理鹽水(PBS、對照)、Cy5. 5標記抗體A、Cy5. 5 標記3H3抗體。M小時后剝掉胸部皮膚，在存活狀態(tài)下進行全身攝影。然后，在與胸部主 動脈連接的狀態(tài)下摘出心臟進行攝影。實驗2 從給予了 PBS、Cy5. 5標記2A12抗體、Cy5. 5 標記3H3抗體的小鼠摘出的心臟和胸部主動脈。3H3給予中，主動脈根部強烈染色?？贵wA中有一定程度染色，但沒有3H3的熒光強度強。2A12中完全不染色。圖8是使用了特異抗體的動脈硬化的三維圖像成像照片。㈧是利用IVIS 200獲 得的使用了特異抗體的熒光成像(反射)、(B)是利用IVIS200獲得的透射光3D圖像(左 圖)與整合前的CT-3D像(中央)的整合后的3D圖像(右圖)、(C)是利用IVIS獲得的熒 光信號與三維CT的整合圖像。圖9是整合前的利用IVIS 200獲得的熒光三維圖像(上圖A)以及利用IVIS 200 獲得的熒光信號與三維CT的整合圖像(下圖B)的照片。圖10是表示用IVIS200測定時的主動脈根部周圍的依存于Cy5. 5的熒光量。測 定主動脈根部的每單位面積的熒光強度。將給予了 PBS的對照小鼠的熒光記為1.0。3H3 給予中，可見為對照的3倍左右的熒光；其他抗體給予中，未見熒光強度有大的變化。圖11是3H3抗體氨基酸序列圖。各⑶R用下劃線表示。
具體實施例方式本發(fā)明提供一種抗體，其與氧化變性LDL(氧化LDL)和β 2_糖蛋白I的復(fù)合物(氧 化LDL/i32GPI復(fù)合物)結(jié)合。動脈硬化灶中形成了氧化LDL與血漿糖蛋白質(zhì)即β 2GPI的 復(fù)合物。本發(fā)明所包含的抗體的特征在于與該復(fù)合物結(jié)合。作為本發(fā)明所包含的抗體，具體地可列舉出以下抗體，但并不限定于這些。(a)包含具有序列號2中記載的氨基酸序列作為⑶R1、具有序列號3中記載的 氨基酸序列作為CDR2以及具有序列號4中記載的氨基酸序列作為CDR3的重鏈的抗體；(b)包含具有序列號1中記載的氨基酸序列作為重鏈可變區(qū)的重鏈的抗體；(c)包含具有序列號7中記載的氨基酸序列作為⑶R1、具有序列號8中記載的 氨基酸序列作為CDR2和具有序列號9中記載的氨基酸序列作為CDR3的輕鏈的抗體；(d)包含具有序列號6中記載的氨基酸序列作為輕鏈可變區(qū)的輕鏈的抗體(e)具有由上述(a)或(b)中記載的重鏈和上述(C)或(d)中記載的輕鏈構(gòu)成的 對的抗體。另外，本發(fā)明還提供一種抗體，其與和氧化LDL和β2_糖蛋白I的復(fù)合物(氧化 LDL/^2GPI復(fù)合物)結(jié)合的本發(fā)明的抗體所結(jié)合的表位相同的表位結(jié)合。該抗體對與氧化 LDL形成了復(fù)合物的氧化LDL/ β 2GPI分子上的特定表位進行識別。并不是進行限制，例如某種抗體是否對與其他抗體相同的表位進行識別，可以通 過二者對表位的競爭來進行確認?？贵w間的競爭可以通過競爭結(jié)合實驗來進行評價，作為 其方法，可列舉出ELISA、熒光能量轉(zhuǎn)移測定法(FRET)和熒光微量測定技術(shù)(FMAT(注冊商 標))等。與抗原結(jié)合的所述抗體的量間接地與對相同表位的結(jié)合進行競爭的候補競爭抗 體(受檢抗體)的結(jié)合能力相關(guān)。即，與相同表位結(jié)合的受檢抗體的量或親和性越大，該抗 體與抗原的結(jié)合量越低，與抗原結(jié)合的受檢抗體的結(jié)合量越增加。具體而言，將進行了適當 標記的所述抗體與要評價的抗體同時添加到抗原中，利用標記檢測結(jié)合的所述抗體。與抗 原結(jié)合的所述抗體的量通過預(yù)先對所述抗體進行標記，能夠容易地進行測定。該標記沒有 特別限制，可選擇與技術(shù)相應(yīng)的標記方法。標記方法具體地可列舉出熒光標記、放射標記、 酶標記等。這里所說的“對相同表位進行識別的抗體”是指下述抗體相對于使與標記的所述抗體的結(jié)合量比與未標記的所述抗體的結(jié)合量低50%的濃度(IC5tl)，受檢抗體以非標記的 所述抗體的IC5tl的通常100倍、優(yōu)選為80倍、進一步優(yōu)選為50倍、進一步優(yōu)選為30倍、更 優(yōu)選為10倍的高濃度將標記的所述抗體的結(jié)合量降低至少50%。本發(fā)明的抗體包括多克隆抗體和單克隆抗體兩者。單克隆抗體和多克隆抗體 的制備禾口純化方法是本領(lǐng)域己知的，例如Harlow and Lane, Antibodies :A Laboratory Manual (New York : Co Id Spring Harbor LaboratoryPress, 1988)中所記載的。本發(fā)明的抗體還包括人源化(humanized)抗體或嵌合(chimeric)抗體等重組抗 體?！叭嗽椿贵w”是指與人的抗體具有類似結(jié)構(gòu)的抗體。這樣的人源化抗體或嵌合抗體 包括人型嵌合抗體(例如抗體的一部分被人源化的抗體、CH2區(qū)被人源化的抗體、Fc區(qū)被 人源化的抗體、恒定區(qū)被人源化的抗體)、和除恒定區(qū)和可變區(qū)存在的CDR(互補決定區(qū)) 以外的部分被人源化的人型CDR移植(CDR-grafted)抗體(P. T. Johons et al.，Nature 321,522(1986))、完全人源化抗體等。為了提高人型CDR移植抗體的抗原結(jié)合活性，已開發(fā) 出選擇與小鼠抗體的同源性高的人抗體FR的方法、制作同源性高的人源化抗體的方法、將 小鼠CDR移植到人抗體后進一步將FR的氨基酸替換的方法的改良技術(shù)(參照美國專利第 5585089號、美國專利第5693761號、美國專利第5693762號、美國專利第6180370號、歐州 專利第451216號、歐州專利第682040號、專利第觀觀340號等)，可用于本發(fā)明的人型⑶R 移植抗體的制作。人型嵌合抗體例如可以通過將具有上述H鏈可變區(qū)的結(jié)構(gòu)和/或L鏈可變區(qū)的結(jié) 構(gòu)的抗體的恒定區(qū)替換為人抗體的恒定區(qū)來制作。作為人抗體的恒定區(qū)，可以采用公知的 恒定區(qū)。以下示出人型嵌合抗體的制作方法的一個例子。首先，從產(chǎn)生抗特定的對象抗原的小鼠抗體的雜交瘤提取mRNA，按照常規(guī)方法合 成cDNA。將合成的cDNA插入到載體中構(gòu)建cDNA庫。通過將H鏈基因片段和L鏈基因片段 用作探針，從上述cDNA庫中選擇含有H鏈基因和L鏈基因的載體。對選擇的載體的插入序 列進行測序，確定H鏈可變區(qū)和L鏈可變區(qū)的基因的序列。以如此得到的序列數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)， 通過化學(xué)合成、生化切斷/再結(jié)合等來制作編碼H鏈可變區(qū)的DNA。將得到的編碼H鏈可變 區(qū)的DNA與編碼人H鏈恒定區(qū)的DNA連接、插入表達用載體，從而制作H鏈表達載體。作為表 達載體，可使用例如基于SV40病毒的載體、基于EB病毒的載體、基于BPV (乳頭狀瘤病毒) 的載體等，但并不限定于這些。另一方面，通過同樣的方法制作L鏈表達載體。利用這些H 鏈表達載體和L鏈表達載體對宿主細胞進行共轉(zhuǎn)化。作為宿主細胞，優(yōu)選使用CHO細胞(中 國倉鼠卵巢)(A.Wright & S. L.Morrison，J. Immunol. 160，3393-3402 (1998))、SP2/0 細胞 (小鼠骨髓瘤)(K. Motmans et al.，Eur. J. Cancer Prev. 5,512-519(1996)，R. P. Junghans et al.，Cancer Res. 50，1495-1502 (1990))等。另外，轉(zhuǎn)化優(yōu)選使用脂質(zhì)體法(R. W. Malone et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86，6077 (1989)，P. L. Feigner et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,7413(1987))、電穿孔法、磷酸鈣法(F. L. Graham& A. J. van der Eb, Virology 52,456-467(1973))、DEAE-Dextran 法等。將轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)后，從轉(zhuǎn)化體的細胞內(nèi)或培養(yǎng)液中分離人型嵌合抗體?？贵w的分離、 純化可以適當組合使用離心分離、硫酸銨分級法、鹽析、超濾、親和層析法、離子交換層析 法、凝膠過濾層析法等方法。另一方面，人型⑶R移植抗體可以通過例如以下的方法制作。首先，通過已在上述嵌合抗體的制造方法中描述的方法來確定抗特定的抗原的抗體的H鏈可變區(qū)和L鏈可變區(qū) 的氨基酸序列和對其進行編碼的堿基序列。各CDR區(qū)的氨基酸序列和堿基序列也一并確定。接著，選擇夾有CDR區(qū)的FR(框架區(qū))。FR的選擇可采用大約三種方法。第1種方 法為使用NEWM、REI等已清楚三維結(jié)構(gòu)的人抗體框架的方法(Riechmann L. et al. ,Nature 332,323-327(1988) ；Tempst, PR.et al. , Protein Engineering 7,1501-1507(1994)； Ellis JH. etal. , J. Immunol 155,925-937 (1995)) 第2種方法為從數(shù)據(jù)庫中選擇與目標 小鼠抗體可變區(qū)具有最高同源性的人抗體可變區(qū)，并使用其FR的方法(Queen C. et al., ProcNatl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989) ；Rozak MJ. et al.，J Biol Chem271, 22611-22618(1996) ；Shearman Cff. et al. , J. Immunol 147,4366-4373 (1991)) 第 3 禾中 方法為在人抗體的FR中選擇最通用的氨基酸的方法(SatoK. et al. , Mol Immunol 31， 371-381 (1994) ；Kobinger F. et al. , ProteinEngineering 6,971-980(1993) ；Kettle borough CA. et al. , Protein Engineering4，773-783 (1991))。本發(fā)明可以使用這些方法 中的任意方法。其中，即使是對選擇的人FR的氨基酸序列進行修飾而得到的氨基酸序列，只要最 終得到的人型CDR移植抗體具有對對象抗原的特異性結(jié)合性，即可以用作FR的氨基酸序 列。特別是，當將選擇的人FR的氨基酸的一部分變更為作為CDR來源的抗體的FR的氨基 酸時，維持抗的特性的可能性高。修飾的氨基酸的數(shù)目優(yōu)選為FR總體的30%以下、更優(yōu)選 為FR總體的20%以下、進一步優(yōu)選為FR總體的10%以下。接著，通過將利用這些任一方法選擇的FR與上述⑶R組合來設(shè)計編碼H鏈可變區(qū) 和L鏈可變區(qū)的DNA。以該設(shè)計為基礎(chǔ)，利用化學(xué)合成、生化切斷/再結(jié)合等來分別制作編 碼H鏈可變區(qū)的DNA和編碼L鏈可變區(qū)的DNA。進而，將編碼H鏈可變區(qū)的DNA與編碼人免 疫球蛋白H鏈恒定區(qū)的DNA—起插入表達載體來構(gòu)建H鏈表達載體。同樣地，將編碼L鏈 可變區(qū)的DNA與編碼人免疫球蛋白L鏈恒定區(qū)的DNA —起插入表達載體來構(gòu)建L鏈表達載 體。作為表達載體，可以使用例如基于SV40病毒的載體、基于EB病毒的載體、基于BPV(乳 頭狀瘤病毒)的載體等，但并不限定于這些。利用通過上述方法制作的H鏈表達載體和L鏈表達載體對宿主細胞進行共 轉(zhuǎn)化。作為宿主細胞，優(yōu)選使用CHO細胞(中國倉鼠卵巢)(AJrigtrt&S. L.Morrison， J. Immunol. 160，3393-3402 (1998))、SP2/0 細胞(小鼠骨髓瘤)(K. Motmans et al.， Eur.J.Cancer Prev.5,512-519(1996), R.P.Junghanset al., Cancer Res.50, 1495-1502(1990))等。另外，轉(zhuǎn)化可優(yōu)選使用脂質(zhì)體法(R. W. Malone et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6077 (1989), P. L. Feigner et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,7413，(1987))、電穿孔法、磷酸鈣法(F.L.Graham & A. J. van der Eb, Virology 52， 456-467(1973))、DEAE-Dextran 法等。將轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)后，從轉(zhuǎn)化體的細胞內(nèi)或培養(yǎng)液中分離人型CDR移植抗體?？贵w的 分離、純化可適當組合離心分離、硫酸銨分級法、鹽析、超濾、親和層析法、離子交換層析法、 凝膠過濾層析法等方法來進行。另外，人抗體的獲得方法也是已知的。例如，將人淋巴細胞在體外用期望的抗原 或表達期望抗原的細胞敏化，將敏化淋巴細胞與人骨髓瘤細胞例如U266融合，也能夠得到具有與抗原結(jié)合的活性的期望的人抗體(參照日本特公平1-59878)。另外，通過用期望的 抗原對具有全部人抗體基因的基因譜的轉(zhuǎn)基因動物進行免疫，能夠獲得期望的人抗體(參 照國際專利申請公開號 W093/12227、W092/03918、W094/02602、W094/25585、W096/34096、 W096/33735)。在其他的實施方式中，抗體或抗體片段可以從利用McCafferty等(Nature，348 552-554(1990))中記載的技術(shù)產(chǎn)生的噬菌體抗體庫中分離。Clackson等(Nature, 352 624-628(1991))和 Marks 等(J. Mol. Biol.，222 :581-597 (1991))記述了 使用了 噬菌體 庫的小鼠和人抗體的分離。后續(xù)的刊物記述了通過鏈改組獲得的高親和性O(shè)iM范圍)的 人抗體的生成(Marks等，Bio/Technology, 10 =779-783[1992])以及作為用于構(gòu)建非常 大的噬菌體庫的策略，記述了組合感染和體內(nèi)重組(Waterhouse等，Nuc. Acids. Res. ,21 2265-2 [1993])。因此，這些技術(shù)是與用于單克隆抗體的分離的傳統(tǒng)的單克隆抗體雜交 瘤法不同的能夠?qū)嵱玫钠渌椒?。在這點上，噬菌體展示是一種檢索大的寡肽庫，并對具有多肽靶性特異性結(jié)合能 力的這些文庫中的成員進行鑒定的熟知的技術(shù)。噬菌體展示是將各種多肽以融合蛋白的形 式呈遞到噬菌體粒子表面上的外殼蛋白的技術(shù)(Scott, J. K.和Smith G.P. (1990) Science 249 :386)。噬菌體展示的有用性在于能夠快速有效地對以選擇性隨機化的蛋白變異體(或 隨機克隆cDNA)的大的文庫為靶分子高親和性地進行結(jié)合的這些序列進行分類。噬菌體 中的多肽(Cwirla, S. Ε.等(1990)Proc. Natl. Acad. ki. USA，87 :6378)或蛋白(Lowman， H. B.等(1991) Biochemistry，30 :10832 ；Clackson, Τ.等(1991) Nature, 352 :624 ；Marks, J. D.等(1991), J. Mol. Biol. , 222 581 ；Kang, A. S.等(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 :8363)庫的展示被用于對具有特異性結(jié)合特性的大量的多肽或寡肽進行篩選(Smith， G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol.，2 :668)。隨機突變體的噬菌體庫的分類需要構(gòu)建 大量的變異體并使之增殖的方法、使用了靶受體的親和性純化的方法和評價結(jié)合增強的結(jié) 果的方法(參照美國專利第5223409號、美國專利第5403484號、美國專利第5571689號和 美國專利第5663143號)。幾乎所有的噬菌體展示法均使用了纖維狀噬菌體，但還已知λ噬菌體展示體 系(W095/34683 ；美國專利第56270 號)、！"4噬菌體展示體系(RenJ.等Gene 215 439(1998) ；Zhu 等 Cancer Researc,58(15) :3209-3214(1998) Jiang 等 Infection & Immunity,65(11) :4770-4777(1997) ；Ren 等，Gene,195(2) :303-311 (1997) ；Ren, Protein Sci. 5 :1833(1996) ；Efimov 等 Virus Genes 10 173 (1995)和 T7 噬菌體展示體系(Smith 和 Scott Methodsin Enzymology, 217, 228-257 (1993)；美國專利第 5766905 號)?，F(xiàn)在，在基礎(chǔ)的噬菌體展示法的基礎(chǔ)上開發(fā)出很多改良和變形。通過這些改良， 改善了以與選擇的靶分子的結(jié)合性等、來自多肽庫或蛋白質(zhì)庫的特性、能力等為基礎(chǔ)進行 篩選的方法。關(guān)于用于噬菌體展示法的重組反應(yīng)方法，在W098/14277中有記載。噬菌 體展示庫被用于對雙分子相互作用(1098/^20169 ；W098/20159)和限制性螺旋肽的特性 (W098/20036)進行分析和控制。W097/35196中記載了使噬菌體展示庫與配體可與靶分子 結(jié)合的第一溶液、和親和性配體不與靶分子結(jié)合的第二溶液接觸從而選擇性地分離結(jié)合配 體的親和性配體的分離方法。W097/46251中記載了利用親和性純化抗體對隨機噬菌體展 示庫進行生物淘篩，然后分離結(jié)合噬菌體，接著在微板的孔中進行微淘篩(microparming)從而分離高親和性結(jié)合噬菌體的方法。另外，還報告了黃色葡萄球菌(Maphlylococcus aureus)蛋白質(zhì)A作為親和性標簽(tag)的用途(Li等，(1998)Mol Biotech.，9 187)。 W097/47314中記載了使用可以是噬菌體展示庫的組合文庫來識別酶特異性的底物消減文 庫的用途。W097/09446中記載了選擇適用做噬菌體展示用的洗滌劑中的酶的方法。選擇 特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)的其他方法記載于美國專利第5498538號、美國專利第M32018號和 W098/15833。多肽庫的制作和這些文庫的篩選的方法記載于美國專利第5723觀6號、美國 專利第5432018號、美國專利第5580717號、美國專利第5427908號、美國專利第5498530 號、美國專利第5770434號、美國專利第5734018號、美國專利第5698426號、美國專利第 5763192號和美國專利第5723323號。此外，還已知利用人抗體庫，通過淘篩來獲得人抗體的技術(shù)。例如，可以利用噬菌 體展示法使人抗體的可變區(qū)以單鏈抗體(scFv)的形式表達在噬菌體的表面，從而選擇與 抗原結(jié)合的噬菌體。對選擇的噬菌體的基因進行分析，從而能夠確定編碼與抗原結(jié)合的人 抗體的可變區(qū)的DNA序列。通過弄清楚與抗原結(jié)合的scFv的DNA序列，能夠制作具有該序 列的適當?shù)谋磉_載體，通過將其導(dǎo)入適當?shù)乃拗鞑⑹怪磉_，從而獲得人抗體。這些方法均 是已公知的，可參照 WO 92/01047,WO 92/2079UW0 93/06213,WO 93/11236,WO 93/19172、 WO 95/01438、WO 95/15388 來實施。作為其他方法，可以使用噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，Nature 348 552-553[1990])，從非免疫化供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因譜在體外生產(chǎn)人抗體和抗 體片段。根據(jù)該技術(shù)，能夠?qū)⒖贵wV區(qū)基因在框架單元中用纖維狀噬菌體例如M13或fd 的外殼蛋白基因中的任一種克隆，并使之以功能性抗體片段的形式呈遞在噬菌體粒子的表 面。由于纖維狀粒子包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，因此即使基于以抗體的功能特性 為基礎(chǔ)的選擇，其結(jié)果也完成了編碼顯示這些特性的抗體的基因的選擇。因此，該噬菌體模 仿B細胞的幾個特性。噬菌體展示可以以多種形式進行，例如參照Johnson，Kevin S.和 Chiswell, David J. , Current Opinion in Structural Biology3 :564_571 (1993)?？梢?將V-基因片段的幾個供給源用于噬菌體展示。Clackson等，Nature, 352 =624-628(1991) 從經(jīng)免疫化的小鼠脾臟來源的V基因的小的隨機組合文庫中分離出了多種大量的抗噁唑 酮抗體。能夠構(gòu)成非免疫化人供體的V基因的基因譜，且抗多種大量的抗原(包括自身抗 原)的抗體可以直接按照 Marks 等，J. Mol. Biol. 222 :581-597 (1991)、或 Griff ith 等，EMBO J. 12 :725-734(1993)中記載的技術(shù)分離。另外，請參照美國專利第5565332號和美國專利 5573905 號。本發(fā)明的抗體中也包括Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv、scFv、dsFv、Diabody 和 sc (Fv)2 等抗體的功能性片段。另外，這些功能性片段的多倍體(例如、二聚體、三聚體、四聚體、聚 合物)也包括在本發(fā)明的抗體中。Fab是通過將IgG在半胱氨酸存在下用木瓜蛋白酶消化而得到的，是由L鏈和H鏈 可變區(qū)、以及包含ChI區(qū)和鉸鏈區(qū)的一部分的H鏈片段構(gòu)成的分子量約5萬的片段。本發(fā)明 中，可以通過將上述抗體用木瓜蛋白酶消化來得到。另外，也可以通過將編碼上述抗體的H 鏈的一部分和L鏈的DNA導(dǎo)入適當?shù)妮d體，利用使用該載體進行轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化體來制備 Fab0Fab'是通過將后述的F(ab' )2的H鏈間的二硫鍵切斷而得到的分子量約5萬的片段。本發(fā)明中，可以通過將上述抗體用胃蛋白酶消化，并使用還原劑將二硫鍵切斷來得 到。另外，與Fab同樣地，可以使用編碼Fab'的DNA通過基因工程來制備。F(ab' )2是通過將IgG用胃蛋白酶消化而得到的，是由片段(Fab')通過二硫鍵 結(jié)合而得到的分子量約10萬的片段，所述片段(Fab')是由L鏈和H鏈可變區(qū)、以及包含 ChI區(qū)和鉸鏈區(qū)的一部分的H鏈片段構(gòu)成的。本發(fā)明中，可以通過將上述抗體用胃蛋白酶消 化來得到。另外，與Fab同樣地，可以使用編碼F(ab' ) 2的DNA通過基因工程來制備。Fv可以通過將抗體用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶處理生成抗體片段來制 備，或者通過構(gòu)建編碼這些抗體片段的基因并將該基因?qū)氡磉_載體，然后在適當?shù)乃?主細胞中表達來制備(例如參照 Co，M. S. et al.，J. Immunol. (1994) 152,2968-2976, Better, Μ· &￡imp ；Horwitz, Α. H. Methods inEnzymology (1989) 178,476-496> Plueckthun, A. ；Skerra, A. Methods inEnzymology (1989) 178, 476-496> Lamoyi, Ε. , Methods in Enzymology(1989) 121,652-663,Rousseaux,J. et al. ,Methods in Enzymology(1989) 121, 663-669，Bird, R. E. et al.，TIBTECH(1991)9，132-137)。scFv是將包含H鏈可變區(qū)和L鏈可變區(qū)的Fv的一條鏈的C末端用適當?shù)亩嚯慕?頭連接到另一條鏈的N末端并進行單鏈化而得到的抗體片段。作為多肽接頭，可以使用例 如柔軟性高的(GGGGS)3等。例如可以使用編碼上述抗體的H鏈可變區(qū)和L鏈可變區(qū)的DNA 與編碼多肽接頭的DNA來構(gòu)建編碼scFv抗體的DNA，將其導(dǎo)入適當?shù)妮d體，利用使用該載體 進行轉(zhuǎn)化而得到的轉(zhuǎn)化體來制備scFv。dsFv是通過將Cys殘基導(dǎo)入H鏈可變區(qū)和L鏈可變區(qū)的適當位置，并通過二硫鍵 使H鏈可變區(qū)和L鏈可變區(qū)穩(wěn)定而得到的Fv片段。各鏈中的Cys殘基的導(dǎo)入位置可以基 于利用分子模擬預(yù)測的立體結(jié)構(gòu)來確定。本發(fā)明中，例如可以根據(jù)上述抗體的H鏈可變區(qū) 和L鏈可變區(qū)的氨基酸序列來預(yù)測立體結(jié)構(gòu)，基于上述預(yù)測構(gòu)建分別編碼導(dǎo)入了變異的H 鏈可變區(qū)和L鏈可變區(qū)的DNA，將其導(dǎo)入適當?shù)妮d體，然后利用使用該載體進行轉(zhuǎn)化而得到 的轉(zhuǎn)化體來制備dsFv。另外，還可以通過使用適當?shù)慕宇^將scFv抗體、dsFv抗體等連接，或使鏈霉親和 素融合等來使抗體片段多倍體化。本發(fā)明的抗體(包括抗體片段)可以通過使低分子化合 物、蛋白質(zhì)、標記物等融合或結(jié)合來構(gòu)成融合抗體或標記化抗體。作為標記物，可以使用125I 等放射性物質(zhì)等。Diabody是指通過基因融合構(gòu)建的二價(bivalent)的抗體片段(HolligerP et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444-6448(1993)、EP404097 號、W093/11161 號等)。 Diabody是由2條多肽鏈構(gòu)成的二聚體，通常多肽鏈的各相同鏈中的VL和VH通過VL和VH 不會相互結(jié)合的短的例如5個殘基左右的接頭結(jié)合。同一多肽鏈上編碼的VL和VH由于 它們之間的接頭短、無法形成單鏈可變區(qū)片段而形成二聚體，因此Diabody具有2個抗原 結(jié)合部位。Diabody可以通過將抗體用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等處理生成抗體片段 來制備，或者通過構(gòu)建編碼這些抗體片段的DNA，將該DNA導(dǎo)入表達載體，然后在適當?shù)乃?主細胞中進行表達來制備(例如參照Co，M. S. et al.，J. Immunol. (1994) 152,2968-2976 ； Better, Μ. and Horwitz, Α. H. , Methods Enzymo 1. (1989) 178,476-496 ；Pluckthun, A. and Skerra, Α. , Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ；Lamoyi, Ε. , Methods Enzymol. (1986) 121,652-663 ；Rousseaux, J. et al.，Methods Enzymol. (1986) 121,663-669 ；Bird,R.E. and Walker, B. W.，Trends Biotechnol. (1991)9,132—137)。sc (Fv)2是將2個VH和2個VL用接頭等結(jié)合制成單鏈而得到的低分子化抗體 (Hudson et al、J Immunol. Methods 1999;231:177-189)。sc (Fv)2 可以通過例如將 scFv 用接頭連接來制作。本發(fā)明的抗體中還包括本發(fā)明的抗體與其他的多肽或蛋白融合而得到的融合蛋 白。制作融合蛋白的方法可以使用下述本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法將編碼本發(fā)明抗體 的多核苷酸與其他肽或編碼多肽的多核苷酸按照框架一致的方式連接，然后將其導(dǎo)入表達 載體，使其在宿主中表達。作為用于與本發(fā)明抗體的融合的其他肽或多肽，例如可以使用 FLAG (Hopp, Τ. P. et al.，BioiTechnology (1988) 6，1204-1210)、由 6 個 His (組氨酸)殘基 構(gòu)成的6XHis、10XHis、流感病毒血凝素(HA)、人c-myc的片段、VSV-GP的片段、pl8HIV 的片段、T7_tag、HSV-tag、Ε-tag, SV40T 抗原的片段、lcktag, α -tubulin 的片段、B_tag、 Protein C的片段等公知的肽。另外，作為用于與本發(fā)明的抗體的融合的其他多肽，可列舉 出例如GST (谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)、HA (流感病毒血凝素)、β -半乳糖苷酶、MBP (麥芽糖
纟口口蟲H 乂 寸。本發(fā)明的抗體也包括標記物所結(jié)合的抗體。作為標記物，可列舉出利用酶發(fā)光(熒光素酶)產(chǎn)生的發(fā)光、發(fā)光低分子的標記 物、和使用熒光蛋白或熒光低分子的標記物、放射性核素等，但并不限定于這些。作為放射 性核素，可列舉出 51Cr、59i^、57C0、OTGa、75k、81mKr、99mTC、mIn、125I、131I、mXe、2(llTl 等 γ 射線發(fā) 射核素或"C、13N、150、18F、她ClJ6Br、45Ti、48V、6°CU、61CU、62CU、66(ia、89&、94mTC、124I 等正電子發(fā) 射核素等，但并不限定于這些。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員消楚，“m”表示核同質(zhì)異能素(nuclear isomer)0作為熒光標記或發(fā)光標記，可以使用利用酶發(fā)光(熒光素酶)產(chǎn)生的發(fā)光的標記 和使用熒光(GFP、DsRed、Kusabira Orange 等熒光蛋白質(zhì)、FITC 和 Cy5. 5、Alexa Fluor 750 等熒光性低分子)的標記。在酶發(fā)光(熒光素酶)產(chǎn)生的發(fā)光的情況下，底物給予需要其他途徑。特別是，優(yōu)選減輕動物本來的自身熒光所產(chǎn)生的影響的標記，更優(yōu)選發(fā)出皮膚透 射性高的信號的標記。另外，本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明的抗體的DNA、插入有該DNA的載體和導(dǎo)入有該載 體的轉(zhuǎn)化細胞。作為載體的例子，可列舉出M13系載體、pUC系載體、pBR322、pBlueSCript、 pCR-kript等。另外，當以cDNA的亞克隆、切除為目的時，除了上述載體夕卜，還可列舉出例 如pGEM-T、pDIRECT、pT7等。編碼本發(fā)明抗體的DNA、插入有該DNA的載體和導(dǎo)入有該載體 的轉(zhuǎn)化細胞可以使用公知的技術(shù)來制作。作為編碼與本發(fā)明的氧化LDL/β 2GPI復(fù)合物結(jié)合的抗體的DNA，可列舉出以下的 DNA。(a)具有序列號5中記載的堿基序列的編碼重鏈的DNA(b)具有序列號10中記載的堿基序列的編碼輕鏈的DNA(c)編碼具有序列號2中記載的氨基酸序列作為⑶R1、具有序列號3中記載的 氨基酸序列作為CDR2和具有序列號4中記載的氨基酸序列作為CDR3的重鏈的DNA，(d)編碼具有序列號7中記載的氨基酸序列作為⑶R1、具有序列號8中記載的氨基酸序列作為CDR2和具有序列號9中記載的氨基酸序列作為CDR3的輕鏈的DNA，作為表達載體，例如當為了在大腸桿菌中表達時，載體除了具有能夠在大腸桿 菌中擴增等的上述特征外，當宿主為JM109、DH5 α、HBlOU XLl-Blue等大腸桿菌時，具有 在大腸桿菌中能夠高效地表達的啟動子、例如IacZ啟動子(Ward等，Nature (1989) 341, 544-546 ；FASEB J. (1992)6,2422-2427)、araB 啟動子(Better 等，Science (1988) 240， 1041-1043)、或T7啟動子等也不可缺少的。作為這樣的載體，除了上述載體外還可列舉出 PGEX-5X-1 (Pharmacia 公司制)、“QIAexpress system"(QIAGEN 公司制)、pEGFP 或 pET (此 時，宿主優(yōu)選為表達T7 RNA聚合酶的BL21)等。另外，載體也可以包含用于多肽分泌的信號序列。作為用于蛋白分泌的信號 序列，在產(chǎn)生到大腸桿菌的胞質(zhì)中的情況下，可以使用PelB信號序列(Lei，S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169,4379)。載體向宿主細胞中的導(dǎo)入可以使用例如氯化鈣法、電穿孔 法來進行。除了大腸桿菌以外，還可列舉出例如哺乳動物來源的表達載體(例如 pcDNA3anvitrogen 公司制)、pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res. 1990,18(17), p5322)、pEF、 pCDM8)、或者昆蟲細胞來源的表達載體(例如“Bac-to-BAC baculovairus expression system” (GIBC0-BRL公司制)、pBacPAK8)、植物來源的表達載體(例如pMHl、pMH2)、動 物病毒來源的表達載體(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、逆轉(zhuǎn)錄病毒來源的表達載體(例如 pZIPneo)、酵母來源的表達載體(例如 “Pichia Expression Kit”(Invitrogen 公司制)、 pNVll、SP-QO1)、枯草桿菌來源的表達載體(例如pPL608、pKTH50)。當為了在CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等動物細胞中表達時，載體具有細胞內(nèi) 表達所需的啟動子例如SV40啟動子(Mulligan等，Nature (1979) 277，108)、MMTV_LTR啟動 子、EFl α 啟動子(Mizushima 等，Nucleic Acids Res. (1990) 18，5322)、CMV 啟動子等是不 可缺少的，更優(yōu)選載體具有用于挑選轉(zhuǎn)化到細胞的基因(例如能夠利用藥物(新霉素、G418 等)鑒別的耐藥性基因)。作為具有這樣的特性的載體，可列舉出例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、 pBK-CMV、pOPRSV、p0P13 等。此外，當為了使基因穩(wěn)定表達并且增加細胞內(nèi)的基因的拷貝數(shù)時，可列舉出下述 方法向缺少核酸合成途徑的CHO細胞中導(dǎo)入具有對其進行補償?shù)腄HFR基因的載體(例如 pCHOI等)，并利用氨甲喋呤(MTX)使其擴增；另外，當以基因的瞬時表達為目的時，還可列 舉出下述方法使用在染色體上具有表達SV40 T抗原的基因的COS細胞，并利用具有SV40 的復(fù)制起點的載體(pcD等)進行轉(zhuǎn)化。作為復(fù)制起點，還可以使用多瘤病毒、腺病毒、生乳 頭瘤病毒(BPV)等來源的復(fù)制起點。此外，為了在宿主細胞系中增加基因拷貝數(shù)，表達載體 可以包含氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn) 移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇標記物。作為導(dǎo)入有載體的宿主細胞，沒有特殊限制，例如可使用大腸桿菌或各種動物細 胞等。宿主細胞例如可以用作本發(fā)明抗體的制造或表達用的生產(chǎn)體系。用于多肽制造的生 產(chǎn)體系有體外和體內(nèi)的生產(chǎn)體系。作為體外的生產(chǎn)體系，可列舉出使用真核細胞的生產(chǎn)體 系和使用原核細胞的生產(chǎn)體系。當使用真核細胞時，例如可以將動物細胞、植物細胞、真菌細胞用作宿主。作 為動物細胞，已知哺乳類細胞，例如CHO (J.Exp. Med. (1995) 108，945)、C0S、3T3、骨髓瘤、BHK(幼倉鼠腎)、HeLa、Vero ；兩棲動物類細胞，例如爪蟾卵母細胞(Valle，et al., Nature (1981) 291, 358-340)；或者昆蟲細胞，例如Sf 9, Sf 2 U Tn5。本發(fā)明中，優(yōu)選使用 CH0-DG44、CHO-DXBIU C0S7細胞、BHK細胞。動物細胞中，為了大量表達，特別優(yōu)選CHO細 胞。載體向宿主細胞中的導(dǎo)入可以使用例如磷酸鈣法、DEAE葡聚糖法、使用了陽離子脂質(zhì) 體DOTAP (Boehringer-Mannheim公司制)的方法、電穿孔法、脂轉(zhuǎn)染等方法來進行。作為植物細胞，例如已知菸草(Nicotiana tabacum)來源的細胞作為蛋白生產(chǎn)體 系，可以對其進行callus培養(yǎng)。作為真菌細胞，已知有酵母，例如酵母(Saccharomyces)屬， 例如酸酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)；糸狀 菌，例如曲霉(Aspergillus)屬，例如黑曲霉(Aspergillus niger)。當使用原核細胞時，有使用細菌細胞的生產(chǎn)體系。作為細菌細胞，可列舉出大腸桿 菌(E. coli)，例如JM109、DH5 α、HBlOl等；其他已知枯草桿菌。將利用本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)化 得到的細胞在體外培養(yǎng)，并利用本領(lǐng)域技術(shù)人員通用的方法進行純化，能夠得到本發(fā)明的 抗體。此外，本發(fā)明還提供具有包含編碼本發(fā)明的抗體的核酸的載體的宿主生物。本發(fā) 明的宿主生物對于重組型抗體的生產(chǎn)是有用的。作為本發(fā)明中的宿主生物，可列舉出山羊 等。例如，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因山羊的制作可如下進行。即，通過在編碼本質(zhì)上分泌到乳汁中的 蛋白(山羊β酪蛋白等)的基因的內(nèi)部通過框架插入抗體基因來構(gòu)建融合基因。將包含插 入有抗體基因的融合基因的DNA片段注入到山羊胚中，將該注入胚導(dǎo)入雌山羊。從由接受 胚的山羊生的轉(zhuǎn)基因山羊或其子孫產(chǎn)生的乳汁能夠獲得本發(fā)明的抗體。為了增加從轉(zhuǎn)基因 山羊產(chǎn)生的含有本發(fā)明抗體的乳汁量，也可以給轉(zhuǎn)基因山羊適當使用激素(m^ert，K. Μ. et al.，Bio/Technology(1994) 12，699-702)。本發(fā)明提供一種動脈硬化的存在部位的成像劑，其含有本發(fā)明的與氧化LDL/ ^2GPI復(fù)合物結(jié)合的抗體。另外，本發(fā)明還提供一種動脈硬化的存在部位的成像方法，其包 含將本發(fā)明的與氧化LDL/β 2GPI復(fù)合物結(jié)合的抗體給予哺乳動物的工序。將本發(fā)明的成 像劑給予哺乳動物以對動脈硬化的存在部位進行成像。作為哺乳動物，可列舉出人、非人哺 乳動物(例如小鼠、大鼠、倉鼠、兔、豬、猴等)。本發(fā)明的成像劑在動脈硬化的診斷方面是有 用的。本發(fā)明的成像劑可用于體內(nèi)用、體外用中的任何一種。動脈硬化的癥狀大致分為粥樣斑塊和鈣化病變，利用本發(fā)明的成像劑，特別是動 脈硬化粥樣斑塊部位可被染色。粥樣斑塊是動脈硬化的種病理狀態(tài)，已知巨噬細胞借助于受體特異性地攝入含有 大量膽固醇的氧化LDL并將其泡沫化，然后泡沫化的氧化LDL蓄積在血管內(nèi)膜形成斑塊 (粥樣斑塊)。本發(fā)明的成像劑是通過將能夠直接或間接地進行監(jiān)測的成像用標記、探針結(jié)合于 與氧化LDL/ β 2GPI復(fù)合物結(jié)合的抗體、特別優(yōu)選為3H3抗體而得到的?？梢栽趯⑺鎏结樕矬w內(nèi)給予(例如靜脈內(nèi)給予)生物體后，使用PET或 SPECT、CXD相機等圖像檢測裝置對蓄積量和分布進行測定。另外，近年來，通過利用透射性射線源對物體進行掃描，并利用計算機對其數(shù)據(jù)進 行處理，從而實現(xiàn)了構(gòu)成物體的內(nèi)部圖像的技術(shù)計算機斷層攝影(Computed Tomography 以下“CT”的表述也表示計算機斷層攝影)在病狀診斷、臨床中的應(yīng)用。
這樣的CT技術(shù)是通過得到正電子發(fā)射斷層法(PET)、單光子放射斷層攝影 (SPECT)或核磁共振成像法(MRI)等的截面像來得到物體的(輪廓等的)二維截面圖像的 技術(shù)，這些檢查技術(shù)常常不僅僅用于得到截面圖像，隨著計算機圖像處理技術(shù)的提高，也常 常將該二維圖像整合而顯示為三維圖形，從而成為確定三維的病變的位置、診斷、確定手術(shù) 方案等的有力技術(shù)。例如單純CT是不使用造影劑而進行X射線照射等攝影的技術(shù)，即使不使用造影劑 也能夠充分地觀察組織的浮腫、骨的形態(tài)異常、形態(tài)等，另一方面，造影CT是指將X射線吸 收率高的造影劑等注射到血管內(nèi)，然后進行攝影的方法，通過造影CT能夠觀察血管和血流 豐富的組織的形狀。此外，關(guān)于所謂的新一代CT，例如開發(fā)了射線源螺旋狀運動的螺旋CT、 將檢測器自身沿對軸方向進行分割的多列檢測器CT(MDCT)(也稱為多層螺旋CT(MSCT)) 等，這些均沒有特別限制，可以單獨也可以并用地用于本發(fā)明的成像劑的檢測。當成像用標記探針(本發(fā)明的成像劑)為X射線吸收率高的放射線核素時，也可 以單獨使用CT作為檢測器。作為標記物，可列舉出利用酶發(fā)光(熒光素酶)所產(chǎn)生的發(fā)光、發(fā)光低分子的標記 物和使用熒光蛋白和熒光低分子的標記物、放射性核素等，但并不限定于這些。作為放射性 核素，可列舉出 51Cr、59i^、57C0、OTGa、75k、81mKr、99mTC、mIn、125I、131I、mXe、2(llTl 等 γ 射線發(fā)射 核素和"(:、13Ν、15ο、18ρ、3&1α、76Βι·、45 、48ν、6°αι、61αι、62αι、6^^9ζι·、94ηιΤ(3、124ι 等正電子發(fā)射 核素等，但并不限定于這些。其中，本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚“III”是指核同質(zhì)異能素。銦-111、 锝-99m或碘-131特別優(yōu)選用于平面掃描或單光子發(fā)射斷層攝影(SPECT)。正電子放射標 記的例子如氟-19可特別優(yōu)選用于正電子放射斷層法中。順磁離子的例子如釓(III)或錳 (II)特別優(yōu)選用于核磁共振成像法(MRI)中。還可以使用利用熒光標記或酶(熒光素酶)所產(chǎn)生的發(fā)光系的標記物和使用熒光 (GFP、DsRecU Kusabira Orange 等熒光蛋白質(zhì)、FITC 或 Cy5. 5、Alexa Fluor 750 等熒光性 低分子)的標記物。當為酶發(fā)光(熒光素酶)所產(chǎn)生的發(fā)光的情況下，底物需要另外給予。特別優(yōu)選減輕動物本來的自身熒光所產(chǎn)生的影響的標記物，更優(yōu)選能夠發(fā)出皮膚 透射性高的信號的標記物。作為成像檢測器，可以使用核磁共振成像法(MRI)PET或SPECT，但在熒光標記探 針的觀察中，從低介入性的觀點出發(fā)特別優(yōu)選的測定機器為CCD相機。由此，優(yōu)選發(fā)出可被CXD相機檢測到的波長例如約350 900nm的光的標記。此 外，優(yōu)選能夠根據(jù)CCD相機所測定的測定動物的體表面的測定值測定生物體內(nèi)的光源的強 度的機械。在熒光標記的情況下，可以是反射熒光圖像、透射熒光圖像中的任一個，但優(yōu)選 捕捉兩種圖像。另外，將熒光圖像的多角度的面(不管反射、透射)重疊，然后對射線源信 息進行整合處理，從而獲得立體圖像(三維)，由此能夠正確地構(gòu)成三維的位置、分布，因此 優(yōu)選。如此得到的三維圖像還可以進一步與CT圖像整合。當成像用標記探針為與X射線吸收率高的放射線核素結(jié)合而成時，如上所述，即 使作為成像檢測器的CT單獨也可使用(例如PET、SPECT)，能夠?qū)用}硬化病灶的位置、蓄 積量和分布進行測定。另一方面，在將所述成像用標記探針生物體內(nèi)給予(例如靜脈內(nèi)給予)生物體后，還可進行經(jīng)標記的所述探針的CT觀察、或與CCD并用進行觀察。作為并用觀察的例子，可 以將經(jīng)熒光標記的探針的C⑶像與單純CT(和/或造影CT)的像重疊來使用。即，通過將 利用單純CT對骨、肺等臟器像進行提取(和/或造影CT對血管、組織像的提取)而得到 的CT圖像與心臟等主要的動脈疾病部分的利用CCD相機得到的熒光探針圖像整合，從而能 夠更正確地把握其動脈硬化病灶的位置、蓄積量和分布、三維的組織、血管間的相對位置關(guān) 系、動脈硬化病灶的三維(局部)圖像。本發(fā)明的成像劑在抗體之外還可以導(dǎo)入醫(yī)藥上可容許的載體，并通過公知的方 法制成制劑。例如以與水或除水以外的藥學(xué)上可容許的液體形成的無菌性溶液或者懸浮 液劑的注射劑形式非經(jīng)口地使用。例如可以考慮通過與藥理學(xué)上可容許的載體或介質(zhì)、 具體地、滅菌水或生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、香味劑、賦形劑 (excipients)、賦形劑(vehicle)、防腐劑、粘合劑等適當組合，并以通常認可的制藥實踐所 要求的單位用量形態(tài)混和來制成制劑。這些制劑的有效成分量按照獲得所指示的范圍的適 當?shù)娜萘縼磉M行設(shè)定。用于注射的無菌組合物可以使用注射用蒸餾水等vehicle按照通常的制劑實踐 來配制。作為注射用的水溶液，可列舉出例如含有生理鹽水、葡萄糖或其他的助劑的等滲 液，例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉，適當?shù)娜芙庵鷦?，可以將例如醇具體 地乙醇、多元醇例如丙二醇、聚乙二醇、非離子性表面活性劑例如Polysorbate 80 (TM)、 HC0-50 并用。作為油性液體，可列舉出芝麻油、大豆油，作為溶解助劑，可以將苯甲酸芐酯、芐醇 并用。另外，還可以與緩沖劑、例如磷酸鹽緩沖液、醋酸鈉緩沖液，鎮(zhèn)痛劑、例如鹽酸普魯卡 因，穩(wěn)定劑、例如芐醇、苯酚、抗氧化劑配合。所制備的注射液通常填充到適當?shù)陌碴持?。給予方式優(yōu)選為非經(jīng)口給予，具體地可列舉出注射劑型、經(jīng)鼻給予劑型、經(jīng)肺給予 劑型、經(jīng)皮給予劑型等。作為注射劑型的例子，例如可以通過靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、腹腔內(nèi) 注射、皮下注射等全身或局部地給予。另外，可以根據(jù)患者的年齡、癥狀選擇適當?shù)慕o予方法。作為本發(fā)明的成像劑的給 予量，例如可以在每次每Ikg體重0. OOOlmg IOOOmg的范圍內(nèi)選擇?；蛘?，可以在例如每 位對象0. 001 lOOOOOmg/body的范圍內(nèi)選擇給予量，對這些數(shù)值沒有必要進行限制。給予量、給予方法根據(jù)對象的體重和年齡、癥狀、每mg抗體的熒光標記的強度/檢 測機械的檢測靈敏度等的不同而發(fā)生變動，本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當?shù)剡M行選擇。另外，本發(fā)明還提供一種動脈硬化的存在部位的成像用試劑盒，其包含本發(fā)明的 與氧化LDL/i32GPI復(fù)合物結(jié)合的抗體。本發(fā)明的試劑盒的特征在于，通過給予對象來對動 脈硬化的存在部位進行成像。上述試劑盒除了本發(fā)明的抗體外，還包含例如成像劑給予用 的注射(點滴)器具、抑制非特異性吸附的助劑(例如白蛋白等)等，但并不限制于這些。另外，上述試劑盒還可以包含成像中使用的指示書、適當?shù)娜萜?、對照試劑等通?的試劑盒中所包含的物品。本發(fā)明提供一種動脈硬化治療劑的候補化合物的篩選方法，其包含以下所記載的工序。(a)將本發(fā)明的與氧化LDL/i32GPI復(fù)合物結(jié)合的抗體和候補化合物給予動脈硬化患病非人動物模型的工序，例如將候補化合物給予已給予了本發(fā)明的與氧化LDL/i32GPI復(fù) 合物結(jié)合的抗體的動脈硬化患病非人動物模型的工序；(b)對給予了所述抗體和所述候補化合物的動脈硬化患病非人動物模型和給予了 所述抗體而未給予所述候補化合物的動脈硬化患病非人動物模型的動脈硬化灶進行成像 的工序；(c)對給予了所述抗體和所述候補化合物的動脈硬化患病非人動物模型和給予了 所述抗體而未給予所述候補化合物的動脈硬化患病非人動物模型的動脈硬化灶(例如動 脈硬化灶的大小或存在部位)進行比較的工序；和(d)從給予了所述抗體和所述候補化合物的動脈硬化患病非人動物模型中選擇與 給予了所述抗體而未給予所述候補化合物的動脈硬化患病非人動物模型相比動脈硬化灶 減少或消失的候補化合物的工序。各工序使用上述的技術(shù)或公知的技術(shù)來實施。關(guān)于本發(fā)明的篩選方法可利用的候補化合物，可列舉出純化蛋白質(zhì)(包括抗體)、 基因庫的表達產(chǎn)物、合成多肽的文庫、DNA或RNA庫(包括適體、siRNA等功能性核酸)、細 胞提取液、細胞培養(yǎng)上清液和合成低分子化合物的文庫等，但并不限制于這些。作為本發(fā)明的篩選方法可利用的患病非人動物模型，可列舉出小鼠、倉鼠、大鼠、 兔、豬、猴等，但并不限制于這些。例如，作為動脈硬化患病小鼠模型，有過量表達基因的轉(zhuǎn)基因小鼠、和利用導(dǎo)致某 基因缺損的基因打靶獲得的基因敲除小鼠。作為動脈硬化模型，例如有構(gòu)成作為不良膽固 醇已知的LDL的蛋白(載脂蛋白E)的apoE缺失(apoE+)模型、LDL受體缺失(LDLR+)模 型、人型apoB導(dǎo)入模型、顯性突變apoE導(dǎo)入模型。此外，2型糖尿病小鼠模型(KKAy)、或者 小鼠中的更容易患動脈硬化的C57BL6系統(tǒng)，該系統(tǒng)有時僅通過高膽固醇飲食即可觀察到 動脈硬化灶，也可以使用高膽固醇飲食等、其飼料制作的動脈硬化小鼠模型。當給予兔高膽固醇飲食約2個半月時有時即可觀察到動脈硬化灶，此外，作為LDL 受體缺損的動脈硬化患病兔模型，已知有WHHL兔等。豬也可以通過apoB的LDL受體結(jié)合部分的氨基酸序列異常來獲得易患動脈硬化 的模型，本領(lǐng)域技術(shù)人員可參照血栓癥 動脈硬化動物作製法編著t令木宏治(株 式會社金芳堂)等制作動脈硬化模型動物來用于本發(fā)明。通過本發(fā)明的篩選方法選擇的使動脈硬化灶減少或消失的化合物可成為動脈硬 化治療劑的候補化合物。即，本發(fā)明提供一種動脈硬化治療劑，其含有通過本發(fā)明的篩選方 法選擇的物質(zhì)作為有效成分。此外，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明的篩選方法選擇的化合物在制 造動脈硬化治療劑中的用途。當將通過本發(fā)明的篩選方法分離的物質(zhì)用作治療劑時，可以 利用公知的制劑學(xué)制造方法制成制劑后使用。例如，與藥理學(xué)上可容許的載體或介質(zhì)(生 理鹽水、植物油、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑等)一起給予患者。給予方法根據(jù)物質(zhì)的性質(zhì) 可經(jīng)皮、鼻腔內(nèi)、經(jīng)支氣管、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或經(jīng)口地進行。給予量根據(jù)患者的年齡、體重、癥 狀、給予方法等的不同而發(fā)生變動，本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當?shù)剡x擇適當?shù)慕o予量。本說明書中公開的抗體的堿基序列和氨基酸序列按照以下的序列號記載于序列 表中。<3H3 抗體〉
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序列號1 重鏈可變區(qū)的氨基酸序列序列號2 重鏈⑶Rl的氨基酸序列序列號3 重鏈⑶R2的氨基酸序列序列號4 重鏈⑶R3的氨基酸序列序列號5 重鏈可變區(qū)的堿基序列序列號6 輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列序列號7 輕鏈⑶Rl的氨基酸序列序列號8 輕鏈⑶R2的氨基酸序列序列號9 輕鏈⑶R3的氨基酸序列序列號10 輕鏈可變區(qū)的堿基序列另外，本說明書中引用的現(xiàn)有技術(shù)文獻全部引入本說明書中作為參照。實施例以下，通過實施例詳細地對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明的范圍并不限定于這些實 施例中記載的方式。[實施例1]氧化LDL/ β ,GPI復(fù)合物的制備M 600 μ g 的人 LDL (Organon Teknika Corp, Durham, NC)在含有 5 μ MCuSO4 的 PBS (2mL)中在37°C下氧化處理12小時。通過添加ImM的EDTA使氧化停止。將上述氧化LDL 0. 2mg/mL 與人 β 2GPI (從 Affinity Biologicals 購得)一起以 終濃度0. 2mg/mL在37°C條件下孵育16小時，得到氧化LDL/ β 2GPI復(fù)合物。[實施例2]抗原免疫將人氧化LDL/β 2GPI復(fù)合物純化蛋白質(zhì)與同量的完全佐劑(SIGMA ；F5881)混合 制成乳液，向BALB/c小鼠(雌性)的足跖(foot-pad)以5 50 μ g/只每3 7天免疫數(shù)次。 在最終免疫的3 5天后從小鼠摘出腹股溝淋巴結(jié)，與小鼠骨髓瘤細胞P3U1 (P3-X63Ag8Ul) 進行細胞融合。[實施例3]
0180]細胞融合和單克隆抗體產(chǎn)生細胞的選擇和獲得細胞融合以如下所示的常用方法為基礎(chǔ)進行。所有的培養(yǎng)基中的胎牛血清(FBS) 使用通過在56°C下進行30min的保溫處理而滅活的胎牛血清。P3U1通過在RPMI1640_10% FBS (含有青霉素、鏈霉素)中培養(yǎng)來準備。將摘出的小鼠的腹股溝淋巴結(jié)細胞與P3U1以10 1 2 1的比例混合，離心。 一邊將50%聚乙二醇4000 (Merck公司、氣體層析法用PEG4000、Catalog No. 9727)作為融 合促進劑緩緩地加入沉淀的細胞中，一邊溫和地混合，進行細胞融合。進而，一邊緩緩地加 入RPMI1640，一邊溫和地混合，然后進行離心。將沉淀的融合細胞用含有15% FCS的HAT 培養(yǎng)基(RPMI1640,HAT-supp 1 ement (Invitrogen ；11067-030)、青霉素、鏈霉素)適當稀釋， 以200 μ L/孔播種到96孔微板中。將融合細胞在CO2培養(yǎng)箱(5% CO2,370C )中培養(yǎng)，在充分形成集落后，取樣培養(yǎng)上 清液以進行篩選。
篩選為挑選在致敏了免疫中使用的人氧化LDL/ β 2GPI復(fù)合物抗原的96孔平板的 ELISA(實施例4中記載)中為陽性的化合物。用含有15% FCS的HT培養(yǎng)基(RPMI1640、 HT-supplement (Invitrogen ；21060-017)、青霉素、鏈霉素)將它們放大培養(yǎng)后，利用有限 稀釋(limiting dilution)法形成單克隆。由此，以抗人氧化LDL/β 2GPI復(fù)合物抗體為免 疫原，獲得7種包括克隆3H3的雜交瘤克隆。[實施例4]對人氧化LDL/P2GPI復(fù)合物和LaGPI的反應(yīng)件(ELISA)用于檢測抗人氧化LDL/^2GPI復(fù)合物抗體的ELISA按照以下的方法進行。即，將 1 μ g/mL (50 μ L/孔)氧化LDL/ β 2GPI加到微板(Nunc公司Maxisorp)中，在4°C下孵育過 夜，從而使其吸附，將該平板用1%BSA封閉。加入用檢測緩沖液(1%BSA、0. 15M NaCl/20mM HEPES (pH 7.4))稀釋至各橫軸中記載的抗體濃度的樣品50 μ L，在孔中孵育30分鐘。棄掉 液體，用0. Tween20/PBS洗滌后，接著將2000倍稀釋的HRP標記的抗小鼠IgG(MBL code 330)50yL添加到平板中，在孔中孵育30分鐘。棄掉液體，用0. 1% Tween20/PBS洗滌，然 后添加底物TMB (MOSS公司；TMBZ) 50 μ L，在室溫下孵育3分鐘，添加0. 18Μ硫酸50 μ L，使 反應(yīng)停止，然后在吸光度450nm下進行檢測(圖1A)。用于檢測與i32GPI的反應(yīng)性的ELISA按照以下的方法進行。SP，將Iyg/ mL(50yL/孔)i32GPI加入到微板(Nunc公司Maxisorp)中，在4°C下孵育過夜，從而使其 吸附，將該平板用1% BSA封閉。加入用檢測緩沖液(1% BSA、0. 15M NaCl/20mM HEPES(pH 7. 4))稀釋至各橫軸中記載的抗體濃度的樣品50yL，在孔中孵育30分鐘。棄掉液體， 用0. 1 % Tween20/PBS洗滌后，接著將2000倍稀釋的HRP標記的抗小鼠IgG(MBLcode 330) 50 μ L添加到平板中，在孔中孵育30分鐘。棄掉液體，用0. 1% Tween20/PBS洗滌，然 后添加底物TMB (MOSS公司；TMBZ) 50 μ L，在室溫下孵育3分鐘，添加0. 18Μ硫酸50 μ L使反 應(yīng)停止，然后在吸光度450nm下進行檢測(圖1B)。進而，將β 2GPI改變濃度至 50 μ g/mL (50 μ L/孔)力卩入微板(nunc公司 Maxisorp)中，在4°C下孵育過夜，從而使其吸附，同樣地對抗體反應(yīng)性進行試驗(未圖示)。其結(jié)果是對固定化氧化LDL/P2GPI復(fù)合物顯示2H6 > 3H3、2A12、3D4 > 4C12、1H4 的反應(yīng)性。另外，對固定化^2GPI顯示2H6、3D4 > 2A12、4F10的反應(yīng)性，對3H3、4C12不顯 示反應(yīng)性(圖1A、B)。但是，當提高對微量滴定板的致敏濃度時，3H3等也顯示反應(yīng)性(未圖示)。作為確認抗體的反應(yīng)性的方法，用游離的抗原施加抑制來進行試驗，進一步可見 各抗體的特異性。[實施例5]對溶液中的游離β XPI、氧化LDL/P2GPI復(fù)合物的競爭反應(yīng)性(ELISA)在對固定化人氧化LDL/ β 2GPI復(fù)合物和β 2GPI的反應(yīng)性(ELISA)試驗中，與各抗 體反應(yīng)時，通過在氧化LDL/ β 2GPI復(fù)合物或β 2GPI共存下進行反應(yīng)來進行對固定化抗原的 抑制反應(yīng)(圖2顯示測定系統(tǒng)示意圖)。即，將^2GPIl μ g/mL(50 μ L/孔)加入到微板(Nunc 公司；Maxisorp)中，在 4°C 下孵育過夜，從而使其吸附，將該平板用BSA封閉。加入用檢測緩沖液(1% BSA、0. 15M NaCl/20mM HEPES(pH 7.4))稀釋到適當濃度的抗體樣品25 μ L、和將作為競爭性抗原的
19氧化LDL/i32GPI復(fù)合物或i^GPI用檢測緩沖液稀釋到各橫軸中記載的抗原濃度的樣品 25 μ L，在孔中孵育30分鐘。棄掉液體，用0. 1% Tween20/PBS洗滌后，接著將2000倍稀釋 的HRP標記的抗小鼠IgG (MBL ；Code 330) 50 μ L添加到平板中，在孔中孵育30分鐘。棄掉 液體，用0. 1 % Tween20/PBS洗滌，然后添加底物TMB (MOSS公司；TMBZ) 50 μ L，在室溫下孵 育3分鐘，添加0. 18Μ硫酸50 μ L使反應(yīng)停止，然后在吸光度450nm下進行檢測。其結(jié)果，當ELISA中混在的游離抗原為氧化LDL/β 2GPI復(fù)合物的情況下，3H3、 4C12、2A12與固定化的氧化LDL/i32GPI的結(jié)合抑制顯著，β 2GPI沒有抑制結(jié)合。另一方面， 游離抗原為氧化LDL/ β 2GPI復(fù)合物，2H6的結(jié)合也發(fā)生抑制，另外混在有β 2GPI也可見些 許抑制。在3D4中，與游離的抗原為氧化LDL/ β 2GPI復(fù)合物相比，β 2GPI產(chǎn)生的抑制可見 為更高的抑制(圖3)。根據(jù)這些結(jié)果，將各抗體的反應(yīng)性整理于表1中(實施例7所示)。3H3雖顯示與 4C12近似的反應(yīng)性，但不是相同的反應(yīng)性，它們具有不同的特異性。[實施例6]抗體的動脈硬化灶免疫組織染代 用普通飼料喂養(yǎng)(Oriental酵母NMF) apoE+小鼠和LDLR+小鼠(從Jackson Lab 獲得，用R山大學(xué)內(nèi)動物實驗設(shè)施維持系統(tǒng))到8周齡，之后用高脂肪飲食(普通飼料中配 合膽固醇1 %、膽酸1 %、無鹽黃油15% )喂養(yǎng)4 6個月，胸部或腹部主動脈出現(xiàn)動脈硬化 灶(斑塊)，出現(xiàn)肥厚、粥樣斑塊。然后，將8月齡的這些小鼠宰殺，這次特別制作胸部主動 脈、主動脈的根部和主動脈瓣的冷凍切片，制成標本進行觀察。在制備冷凍切片后，用多聚甲醛固定以用于熒光免疫染色抗體法的實驗中。單克隆抗體的Cy5. 5標記將在0. IM碳酸緩沖液(PH9.3)、在4°C下透析過夜的各種單克隆抗體(lmg/ml)加 入到Fluorolink Cy5. 5monofunctional dye(l試管)中，在室溫下使其反應(yīng)30分鐘進行 標記。反應(yīng)后，通過kphadex G-25柱得到Cy5. 5標記抗體。使用了冷凍切片的免疫熒光染代使各種單克隆抗體與用多聚甲醛固定5分鐘得到的切片在4°C下反應(yīng)過夜。洗 滌后，使FITC標記抗小鼠IgG或IgM抗體O次抗體)在室溫下反應(yīng)1小時。在該2次抗 體反應(yīng)時添加DAPl和若丹明鬼筆環(huán)肽(lihodamine Phalloidin)染色。然后用熒光顯微鏡 觀察、攝影。免疫組織染代結(jié)果，在對用普通飼料喂養(yǎng)的C57BL6系統(tǒng)的小鼠使用3H3抗體、Mac3的免疫熒光 染色中，泡沫狀巨噬細胞聚集而成的粥樣斑塊被染色。利用3H3同樣的部位也被染色(圖 4)。將動脈硬化多發(fā)小鼠模型(高脂肪飲食喂養(yǎng)的apoE+)的主動脈瓣的免疫熒光染 色與用識別氧化LDL/i32GPI復(fù)合物的其他抗體獲得的免疫熒光染色進行比較。粥樣斑塊 的染色陽性例子僅為3H3和抗體A(圖5)。用各種特異性的單克隆抗體能夠?qū)用}硬化灶的標記了 Cy5. 5、Alexa等的粥樣 斑塊進行特異性的免疫染色。[實施例7]
碰體內(nèi)成像利用Xenogen公司的IVIS(注冊商標)成像系統(tǒng)、IVIS200進行成像(激發(fā) 640nm，發(fā)射720nm.)。實驗1 對與實施例6同樣地制作的高脂肪飲食喂養(yǎng)apoE-/-小鼠從尾靜脈以 0. 15ml/只給予Cy5. 5標記單克隆抗體(0. 25mg/ml)。給予生理鹽水(PBS、對照)、Cy5. 5標 記抗體A、Cy5. 5標記3H3抗體這3種。給予M小時后將胸部皮膚剝離，在存活狀態(tài)下對全 身進行攝影(圖7)。實驗2 進而在胸部主動脈連接的狀態(tài)下摘出心臟進行攝影(圖7)。在3H3給予 中主動脈根部強烈染色。在抗體A中也有些許染色，但熒光強度沒有3H3強。在2A12中完 全沒有染色。測定主動脈根部單位規(guī)定面積的熒光強度。將給予了 PBS的對照小鼠的熒光記為 1.0。在3H3給予中，可見為對照的3倍左右的熒光。在其他抗體給予中，熒光強度未見大 的變化(圖10)。將這次的抗體組的特異性試驗整理于表1。[表1]抗氧化LDL/ β 2GPI復(fù)合物的特異性抗體
.與固定化抗原的結(jié)合 競爭抑制(固定化氧化LDL/p2GPI) 免疫染色
P2GPI 氧化 LDL/p2GPI P2GPI 氧化LDL/p2GPI
1H4 — -{-NDND—
2A12 +-l· -丨-一+ 十一 2H6+ f+ -+ +-I-++ +—
3D4-τ ■}·■—卜-f-t" +————
3H3 一+-+-—+-+-f- -I- -ι-
4 c 12 — -+- "“-j......j.-—
4F10 + —NDND—在固定化氧化LDL/ β 2GPI復(fù)合物或固定化β 2GPI ELISA液體中可見與競爭抑制 抗原i32GPI的抑制性，結(jié)果是，在固定化氧化LDL/β 2GPI復(fù)合物的情況下3D4 > 2H6 > 4C12 > 3H3，在固定化β 2GPI的情況下2H6 > 3D4(4C12、3H3只對固定化β 2GPI微弱地反 應(yīng))。3H3對液體中的游離氧化LDL/ β 2GPI復(fù)合物(非修飾)的特異性高。[實施例8]識別氧化LDL/ g ,GPI復(fù)合物的小鼠單克隆抗體的可變區(qū)基因的分析分析的單克隆抗體為4種克隆(3H3、4C12、2H6、3D4)。關(guān)于這4種克隆的抗體亞群，3H3和4C12為IgG2b、2H6和3D4為IgGl。(L鏈可變區(qū)基因的分析)將產(chǎn)生4種(3H3、4C12、2H6、3D4)單克隆抗體的雜交瘤細胞分別在RPMI1640+10% FCS 巾J§#。iJM QuickPrep micro mRNA^^i^^O^ (Amersham Biosciences, code 27-9255-01)從該雜交瘤細胞獲得mRNA。使用First-Strand cDNA合成試劑盒(Amersham Biosciences, code27-9261-01)將該 mRNA 制成 cDNA。以該 cDNA 為模板，利用 PCR 法使基 因擴增，利用以下所示的11種模式的引物的組合進行PCR反應(yīng)。這里，MKVl MKVll的引 物序列通過分析大多單克隆抗體的信號序列來設(shè)定，其中，該11種引物序列包括了基本所有的單克隆抗體的L鏈信號的序列。通過該11種MKV引物和與小鼠L鏈恒定區(qū)序列相當?shù)腗KC引物間的11模式的PeR反應(yīng)中的至少1種，擴增目標L鏈可變區(qū)。
PeR反應(yīng)條件如下。
來自小鼠雜交瘤的cDNA4 u L
2．5mIVI dNTPs4 u L
MKVl一MKVl l引物(20 u M)的11種中的一種 2．5 u L
MKC弓!物(20 u M)2．5 u L
DMSO2．5 u L
×10pfu聚合酶緩沖液5 u L
pfu聚合酶l u L
互菌ZK2室巨叢L
總計50 u L
94℃2min
94℃lmin 55℃2min 72℃2min(30個循環(huán))
72℃4min
4℃無限制時間
引物的DNA序列參照以下序列。
MKVl引物A／GAAG／／GCC／G／／AGGC／G／／GG／GC／G(序列號11)
MKV2引物A／GGAGWCAGACACAC／CC／GY／A／GGG／G(序列號l 2)
MKV3引物A／GAG／G／GC／CAC／CAGG／CC／GGSG／／G(序列號l 3)
MKV4弓!彩0ATGAGGRCCCCTGCTCAGwTTYTTGGMwTCTTG(序歹0號14)
MKV5引物A／GGA／／／WCAGG／GCAGA／／W／CAGC／／C(序列號l 5)
MKV6引物A／GAGG／KCYY／GY／SAGY／YC／GRGG(序列號16)
MKV7引物A／GGGCW／CAAGA／GGAG／CACAKWYYCWGG(序列號l 7)
MKV8弓!彩0ATGTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAATTG(序歹0號18)
MKV9引物A／GG／R／CCWCASC／CAG／／CC／／G(序列號19)
MKVl0引物A／G／A／A／A／G／／／G／／G／C／A／／／C／(序列號20)
MKVl l引物A／GGAAGCCCCAGC／CAGC／／C／C／／CC(序列號2 1)
MKC引物AC／GGA／GG／GGGAAGA／GG(序列號22)
(M—A或C、R—A或G、W—A或T、S—C或G、Y—C或T、K—G或T)
通過PeR反應(yīng)L鏈可變區(qū)擴增得到的PeR引物的組合為下述組合。
3H3MKV7一MKC
4C12MKV7一MKC
2H6MKV5一MKC
3D4MKV4一MKC
將PeR擴增得到的L鏈可變區(qū)基因插入peR2．1載體(Invitogen)中。
插入有L鏈可變區(qū)基因的PeR2．1載體的DNA堿基序列用DNA測序儀(Applledgiosystems制3130 Genatic Analyzer)進行測序。
(tt鏈可變區(qū)基因的分析)
將產(chǎn)生4種(3H3、4C12、2H6、3D4)單克隆抗體的雜交瘤細胞在RPMll640+10％FCS培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)。使用QuickPrep micro mRNA純化試劑盒(Amersham Biosciences，code27—9255—01)從該雜交瘤細胞獲得mRNA。使用First—Strand cDNA合成試劑盒(AmershamBiosciences，code27—926卜01)將該mRNA制成cDNA。以該cDNA為模板，利用PCR法使H鏈可變區(qū)基因擴增，利用以下所示的12種模式的引物的組合進行PCR反應(yīng)。這里，MHVl一MHVl2的引物序列通過分析多個單克隆抗體的信號序列來設(shè)定，其中，該12種引物序列包括了基本所有的單克隆抗體的H鏈信號的序列。通過該12種MHV引物和與小鼠H鏈恒定區(qū)序列相當?shù)腗HCG2b或MHCGl引物間的12模式的PCR反應(yīng)中的至少1種，擴增目標H鏈可變區(qū)。這里，MHCG2b引物具有與小鼠Ig02b的H鏈恒定區(qū)相當?shù)男蛄?，MHCGl引物為與小鼠IgGl的H鏈恒定區(qū)相當?shù)男蛄小Ｒ虼?，作為IgG2b亞群的3H3克隆和4C12克隆的PCR擴增使用MHCG2b引物、作為IgGl亞群的2H6克隆和3D4克隆的PCR擴增使用MHCGl引物。
PCR反應(yīng)條件如下。
來自小鼠雜交瘤的cDNA4 u L
2．5mM dNTPs4 u L
MHVl一MHVl2引物(20 u M)的12種中的一種2．5 u L
MHCG2b或MHCGl弓!物(20 u M)2．5 u L
DMSO2．5 lX L
×10pfu聚合酶緩沖液5 u L
pfu聚合酶l u L
滅菌丞285 u L
總計50 u L
94℃2min
94℃lmin 55℃2min 72℃2min(30個循環(huán))
72℃4min
4℃無限制時間
引物的DNA序列參照以下序列。
MHVl引物ATGAAATGCAGCTGGGGCATSTTCTTC(序列號23)
MHV2引物ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT(序列號24)
MHV3引物ATGAAGWTGTGGTTAAACTGGGTTTTT(序列號25)
MHV4弓!彩0ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRTTT(序歹0號26)
MHV5引物ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTT(序列號27)
MHV6引物ATGGCTGTCYTRGSGCTRCTCTTCTGC(序列號28)
MHV7弓!彩0ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT(序歹0號29)
MHV8引物ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG(序列號30)
MHV9引物ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGCTATTCCTG(序列號3 1)
MHVl0引物ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCTG(序列號32)
MHVl l引物ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG(序列號33)
MHVl2引物ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTG(序列號34)
MHCG2b引物CAGTGGATAGACTGATGGGGG(序列號35)
MHCGl 引物CAGTGGATAGACAGATGGGGG (序列號36)(M = A 或 C，R = A 或 G，W = A 或 T，S = C 或 G，Y = C 或 T，K = G 或 T)通過PCR反應(yīng)H鏈可變區(qū)擴增得到的PCR引物的組合為以下的組合。3H3 :MHV4-MHCG2b4C12 :MKV4-MHCG2b2H6 :MHV4-MHCG13D4 :MHV1-MHCG1將PCR擴增得到的H鏈可變區(qū)基因插入pCR2. 1載體Gnvitogen)中。插入有H鏈可變區(qū)基因的PCR2. 1載體的DNA堿基序列用DNA測序儀(Applied Biosystems 制3130 Genatic Analyzer)進行測序。其結(jié)果清楚了可用于本發(fā)明的3H3的氨基酸序列、⑶R(圖11)。本說明書中公開的抗體的堿基序列和氨基酸序列按照下述序列號記載于序列表 中。<3H3 抗體 >序列號1 重鏈可變區(qū)的氨基酸序列序列號2 重鏈⑶Rl的氨基酸序列序列號3 重鏈⑶R2的氨基酸序列序列號4 重鏈⑶R3的氨基酸序列序列號5 重鏈可變區(qū)的堿基序列序列號6 輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列序列號7 輕鏈⑶Rl的氨基酸序列序列號8 輕鏈⑶R2的氨基酸序列序列號9 輕鏈⑶R3的氨基酸序列序列號10 輕鏈可變區(qū)的堿基序列[實施例9]對使用了 IVIS 200和三維CT的圖像分析的研究進行通過將計算機斷層攝影(CT)圖像整合得到動脈硬化病灶的三維(局部)圖 像的實驗。體內(nèi)熒光成像使用IVIS 200成像系統(tǒng)(Xenogen公司)進行熒光成像(在Cy5. 5的情況下， 激發(fā)640nm、發(fā)射:720nm ；在 Alexa Fluor 750 的情況下，激發(fā):745nm、發(fā)射:800nm)。將 Cy5. 5 標記 3H3 抗體(IgG)以 0. 25mg/ml、0. 15ml/ 只、或?qū)?Alexa Fluor750 標記 3H3 抗體 以1. 0 1. 5mg/ml、0. 15ml/只從尾靜脈給予高脂肪飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠，2 M小時 后，用IVIS 200在吸入麻醉下對體內(nèi)熒光進行觀察、攝影。由于ApoE-/-小鼠的黑色體毛 吸收熒光，因此剃掉體毛進行觀察。開始利用反射光進行熒光觀察，然后利用透射光進行熒 光觀察，制作小鼠的三維(3D)圖像，將光源信息融合(圖9A 整合前的IVIS所獲得的三維 圖像)。圖中的紅點部分為標記3H3的熒光信號，濃度越濃表示熒光強度越強，即成像劑越 局部分布。離體成像
24
3D-CT分析結(jié)束后對小鼠實施安樂死，用PBS IOml進行心臟灌流，摘出心臟和主 動脈，利用IVis 200得到反射熒光圖像。CT 成像利用eXplore Locus CT System(GE Healthcare)進行 CT 成像。使用與利用 IVIS200進行成像相同的小鼠個體，在吸入麻醉下進行X射線照射，得到CT圖像。熒光與CT的圖像整合將利用IVIS 200檢測的熒光成像圖像與用CT攝影得到的圖像用通用的3D可視 化軟件(Amira、Mercury Computer Systems)進行整合(圖9B 整合后的三維CT圖像)。另外，示意地示出了一個流程圖(圖8)。(A)利用IVIS 200獲得的使用了特異抗體的熒光成像(反射)。(B)整合前的利用IVIS 200獲得的使用了特異抗體的熒光成像(透射光 ’左)和 CT像(中)整合圖(右)熒光成像(透射光 ’左)中紅點的部分的濃度越濃、熒光強度越 強，即顯示為成像劑越局部地集中的部分(3H3結(jié)合反應(yīng)性高的部位)。(C)利用IVIS獲得的熒光信號與三維CT的整合圖像為在計算機的假想空間上 制作三維像的動畫(三維圖形的動畫)并從多角度確認其標記的位置的照片。由于可見光在生物體內(nèi)被吸收，因此為了進行體內(nèi)成像，使用難以被生物體吸收 的波長的近紅外的熒光標記。本實驗中通過將用Cy5. 5或AlexaFluor 750標記的抗體從 尾靜脈給予小鼠，然后利用IVIS200測定熒光，對反射和透射的熒光測定條件進行研究。在 利用Cy5. 5標記抗體的體內(nèi)成像的反射熒光圖像中，觀察到患有動脈硬化的ApoE-/-小鼠 的主動脈瓣和胸部主動脈的強的信號。此外，通過離體成像和離體熒光顯微鏡觀察，可見靜 脈給予的熒光標記抗體局部化到動脈硬化灶的局部分布。但是，在使用Cy5. 5標記抗體的 情況下，透射熒光的信號弱，難以確定立體圖像(三維)中的熒光位置。另一方面，在Alexa Fluor 750標記抗體中，靜脈內(nèi)給予2小時后在反射熒光圖像、透射熒光圖像二者中均獲 得強的特異性信號，當嘗試構(gòu)建為立體圖像時，可見胸的內(nèi)部有強的熒光信號(圖8A、B中 的左圖)。接著對同一小鼠進行CT攝影，得到利用CT圖像提取骨和肺的臟器而獲得的圖 像(將圖8B中和利用IVIS200構(gòu)建的熒光成像圖像利用Amira進行整合，得到整合3D圖 像(圖8B右)，結(jié)果觀察到在心臟和其附近的位置有熒光信號。圖中的紅點部分的濃度越 濃、熒光強度越強，即顯示成像劑局部分布。顯示了 CT (中央)與3D-CT整合的圖像(圖8B 右)。在計算機的假想空間上制作三維像的動畫(三維圖形的動畫)，從多角度確認了其標 記的位置(圖8C)。從上述實驗的結(jié)果可觀察到，在利用熒光標記3H3抗體的體內(nèi)成像的反射熒光圖 像中，患有動脈硬化的ApoE-/-小鼠的主動脈瓣和胸部主動脈有強的信號。此外，通過離體 成像和離體熒光顯微鏡觀察，靜脈給予的熒光標記抗體局部分布到動脈硬化灶。從本實驗可知，通過使用近紅外熒光物質(zhì)(Cy5. 5、Alexa750)標記抗體，不僅小鼠 的動脈硬化的成像成為可能，而且還能夠與利用三維CT獲得的圖像整合。另外還可知，該 種抗體能夠檢測人的動脈硬化灶，本實驗結(jié)果與臨床用的圖像診斷技術(shù)相關(guān)。并且，該小鼠 成像技術(shù)作為藥物開發(fā)用的篩選體系已能夠?qū)嵱?。產(chǎn)業(yè)上的可利用性以往的動脈硬化檢查方法無法確定動脈硬化的發(fā)病部位(存在部位)。與此不同，本發(fā)明提供了能夠視覺地獲得動脈硬化灶(特別是粥樣斑塊、粥樣動脈硬化)的存在部位 和其大小的非介入性診斷方法。通過使用動脈硬化多發(fā)小鼠模型(例如apoE缺失(ApoE-/-)小鼠通過維持高血 漿膽固醇濃度，即可患上自然發(fā)生的粥樣動脈硬化樣病變)和該成像用的抗體，能夠構(gòu)建 粥樣動脈硬化的治療藥的篩選體系。此外，通過將所述抗體替換為人源化抗體，能夠構(gòu)建臨床診斷用的成像體系。因 此，已知來自動脈粥樣斑塊的游離斑塊等是引起動脈塞栓從而引發(fā)腦塞栓、心肌梗塞的原 因，因此對慢性且無癥狀地不知不覺地進展的人的粥樣動脈硬化進行監(jiān)測的方法可以說能 夠有助于生活習(xí)慣病的預(yù)防、治療。
權(quán)利要求
1.一種下述(a) (e)中任一項所述的抗體，其與氧化LDL和β2_糖蛋白I的復(fù)合物 即氧化LDL/ β 2GPI復(fù)合物結(jié)合；(a)包含具有序列號2中記載的氨基酸序列作為CDR1、具有序列號3中記載的氨基 酸序列作為CDR2以及具有序列號4中記載的氨基酸序列作為CDR3的重鏈的抗體；(b)包含具有序列號1中記載的氨基酸序列作為重鏈可變區(qū)的重鏈的抗體；(c)包含具有序列號-J中記載的氨基酸序列作為CDR1、具有序列號8中記載的氨基 酸序列作為CDR2和具有序列號9中記載的氨基酸序列作為CDR3的輕鏈的抗體；(d)包含具有序列號6中記載的氨基酸序列作為輕鏈可變區(qū)的輕鏈的抗體(e)具有由上述(a)或(b)中記載的重鏈和上述(c)或(d)中記載的輕鏈構(gòu)成的對的 抗體。
2.一種抗體，其與和權(quán)利要求1所述的抗體所結(jié)合的表位相同的表位結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體，其為人源化抗體或嵌合抗體。
4.一種動脈硬化的存在部位的成像劑，其含有與氧化LDL和β2_糖蛋白I的復(fù)合物即 氧化LDL/ β 2GPI復(fù)合物結(jié)合的抗體。
5.一種動脈硬化的存在部位的成像劑，其含有權(quán)利要求1 3中任一項所述的抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的成像劑，其對動脈硬化的粥樣斑塊的位置和/或大小進 行成像。
7.一種動脈硬化的存在部位的成像用試劑盒，其包含與氧化LDL和β2_糖蛋白I的復(fù) 合物即氧化LDL/ β 2GPI復(fù)合物結(jié)合的抗體。
8.一種動脈硬化的存在部位的成像用試劑盒，其包含權(quán)利要求1 3中任一項所述的 抗體。
9.一種動脈硬化治療劑的候補化合物的篩選方法，其包含以下工序(a)向給予了權(quán)利要求1 3中任一項所述的抗體的動脈硬化患病非人動物模型給予 候補化合物的工序；(b)對給予了所述候補化合物的動脈硬化患病非人動物模型和未給予所述候補化合物 的動脈硬化患病非人動物模型的動脈硬化灶進行成像的工序；(c)對給予了所述候補化合物的動脈硬化患病非人動物模型和未給予所述候補化合物 的動脈硬化患病非人動物模型的動脈硬化灶的大小或存在部位進行比較的工序，和(d)從給予了所述候補化合物的動脈硬化患病非人動物模型中選擇與未給予所述候補 化合物的動脈硬化患病非人動物模型相比動脈硬化灶減少或消失的候補化合物的工序。
全文摘要
本發(fā)明人等對動脈硬化切片的可免疫染色的抗體中能適用于體內(nèi)成像的抗體進行了確定，并對其特異性進行了分析，結(jié)果證明對確定表位具有特異性的抗氧化LDL/β2GPI復(fù)合物抗體的熒光標記物對成像是有效的。
文檔編號A61K49/00GK102124030SQ20098013225
公開日2011年7月13日 申請日期2009年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月20日
發(fā)明者小島和夫, 松浦榮次 申請人:國立大學(xué)法人岡山大學(xué), 株式會社醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所