專利名稱：：基于人類notch3的融合蛋白作為notch3信號的誘餌抑制劑的制作方法基于人類N0TCH3的融合蛋白作為N0TCH3信號的誘餌抑制劑本發(fā)明所公開的技術(shù)得到了美國政府的支持，包括來自美國國立衛(wèi)生研究院的授權(quán)碼ROlHL62454以及來自美國國防部的授權(quán)碼DAMRDCW81XWH-04-1-054，因此，美國政府對本專利擁有一定的專利權(quán)。在整個申請文件中，通過括號內(nèi)的阿拉伯數(shù)字或者在括號內(nèi)標注作者和出版日期的形式，引用了各種出版物。這些出版物的完整的引用信息在說明書的末尾有記載。為了更加充分的描述本發(fā)明所屬的領(lǐng)域，這些出版物所公開的內(nèi)容在本申請中被引用。
背景技術(shù)：
：血管發(fā)育在哺乳動物胚胎發(fā)育過程中，血管系統(tǒng)的形成是一個早期的和必要的過程。在胚胎階段，血管發(fā)育是從起源于近軸和側(cè)板中胚層的多功能成血管細胞開始的。成血管細胞有潛力分化成造血祖細胞或內(nèi)皮祖細胞，被稱為成血管細胞。血管發(fā)育起始于一個稱為血管生成的過程，由此成血管細胞分化為內(nèi)皮細胞并遷移到一起以形成原始血管叢。該初始的血管網(wǎng)絡由大小均勻、并全部由內(nèi)皮細胞組成的血管構(gòu)成。該血管叢然后通過血管生成而重塑。血管生成包括新血管的萌發(fā)、這些心血管遷移進入無血管區(qū)，以及輔助細胞、周細胞和平滑肌細胞的募集補充(GaleandYancopoulos，1999)，這些分化并形成收縮血管壁的平滑肌細胞起源于多種祖細胞，這些祖細胞包括神經(jīng)嵴細胞、間質(zhì)細胞、甚至內(nèi)皮細胞(Owens,1995)。在成人階段，血管生成涉及卵泡發(fā)育、傷口愈合和病變過程比如腫瘤血管生成以及心臟病。Notch家族和Notch配體對于果蠅、線蟲、斑馬魚和哺乳動物的研究表明，Notch途徑是一種進化上保守的信號機制，其對于調(diào)整許多的細胞命運決定(cell-fatedecisions)起作用。需要Notch信號來從所有三個胚層起源合適的構(gòu)建細胞。根據(jù)不同的細胞環(huán)境，Notch信號可能會抑制和誘導分化、誘導增殖和促進細胞存活(Artavanis-Tsakonas等，1995；Lewis,1998；Weinmaster,1997)。在果蠅中，單個Notch蛋白被2個配體激活，這兩個配體是Serrate和Delta。在哺乳動物中，這些家族已經(jīng)被擴展到4個Notch基因(Notchl，Notch2,Notch3和Notch4)，以及5個配體，即2個類似于Serrate配體(即Jaggedl-2)，3個Delta配體(即Dll,3,4)(Bettenhausen等，1995；Dunwoodie等，1997；Gallahan和Callahan,1997；Lardelli等，1994；Lindsell等，1995；Shawber等，1996a；Shutter等，2000a；Uyttendaele等，1996；Weinmaster等，1992；Weinmaster等，1991)。在胚胎發(fā)育過程中，Notch受體和配體都在動態(tài)空間和時間形式上得以表達。但是，是否所有的配體激活了所有的受體是未知的。Notch信號和功能Notch信號影響許多不同類型的細胞命運決定，其影響的途徑為根據(jù)不同的環(huán)境提供抑制、誘導或者增殖信號(參見Artavanis-Tsakonas等，1995；Greenwald,1998；Robey,1997；Vervoort等，1997)。這種多效性的功能表明，Notch通過時空的方式調(diào)節(jié)多種信號途徑。與Notch調(diào)節(jié)細胞命運決定一致，無論是受體還是配體都是具有單跨膜結(jié)構(gòu)域的細胞表面蛋白(圖1)。Notch蛋白的調(diào)整性的胞外域主要由串聯(lián)排列的表皮生長因子樣(EGF-Iike)的重復片段組成，這對于配體結(jié)合是必需的(Artavanis-Tsakonas等，1995；Weinmaster,1998)。表皮生長因子樣的重復片段的C-端是另外三個富含半胱氨酸的重復片段，指定了Lmi2/Notch重復片段(LNR)(Greenwald,1994)。下游的LNR位于具有解蛋白的裂解序列(RXRR)，該裂解序列被弗林蛋白酶樣轉(zhuǎn)化酶所識別。對于Notchl，在該位點的裂解產(chǎn)生180KD(千道爾頓)的細胞外肽和120KD的細胞內(nèi)肽，其聚在一起在細胞表面產(chǎn)生異二聚體受體(Blaumueller等，1997；Kopan等，1996；Logeat等，1998).Notch的細胞內(nèi)域(NotchI⑶，圖1)救援功能缺失的Notch顯型表明這種形式的Notch信號構(gòu)成的(FortiniandArtavanis-Tsakonas,1993；LymanandYoung,1993；Rebay等，1993；Struhl等，1993)。Notch的細胞質(zhì)域包含三個可識別的域RAM域、錨蛋白重復域和C-末端PEST域(見圖1)。在配體激活之上Notch經(jīng)歷兩個額外的解蛋白裂解，這種裂解導致胞質(zhì)域的釋放(Weinmaster，1998)。Notch肽移位到核，與被稱為CSL(￡BF，Su(H)，Lag-2)的轉(zhuǎn)錄抑制因子相互作用，并將其轉(zhuǎn)換為轉(zhuǎn)錄激活因子。CSL與Notch的相互作用取決于Notch的RAM域的存在；同時，轉(zhuǎn)錄激活也需要錨蛋白重復域的存在(Hsieh等，1996；Hsieh等，1997；Roehl等，1996；Tamura等，1995；Wettstein等，1997)。體內(nèi)和體外研究都表明，HES和Hey基因是Notch/CSL依賴信號的直接目標(BaileyandPosakony,1995；Eastman等，1997；Henderson等，2001Jarriault等，1995；Nakagawa等，2000；Wettstein等，1997)。HES和Hey基因是與DNA在N-盒結(jié)合的bHLH轉(zhuǎn)錄抑制因子(Nakagawa等，2000；Sasai等，1992；Tietze等，1992)。Notch也被提出通過獨立于CSL的途徑表征信號。事實上，對于某些形式的Notch信號，僅僅錨蛋白重復域的表達是必要和充分的(Lieber等，1993；Matsuno等，1997；Shawber等，1996b)。最后，PEST域被暗示與蛋白轉(zhuǎn)換有關(guān)，這種蛋白轉(zhuǎn)換通過SEL-IO/泛素依賴的途徑進行(Greenwald,1994；Oberg等，2001；Rogers等，1986；Wu等，1998；Wu等，2001)。與受體相似的，Notch配體的胞外域也主要是由串聯(lián)排列的表皮生長因子樣重復片段組成(圖1)，這些重復片段的上游是分開的表皮生長因子樣重復片段已知的DSL(2elta，Serrate,Lag-2)的，這在與配體結(jié)合和激活受體時是必需的(Artavanis-Tsakonas等，1995)。Notch信號與血管發(fā)育雖然已經(jīng)確定很多基因都具有誘導血管生成和血管再生的功能，但是對于在血管發(fā)育過程中細胞命運決定是如何被指定的卻了解很少。很多觀察顯示，Notch信號途徑可能在細胞命運決定和血管系統(tǒng)的構(gòu)建中起作用。Notchl，Notch4,Jaggedl和D114都在脈管系統(tǒng)發(fā)育中被表達，而Notch3則在附屬的平滑肌細胞中被表達(Krebs等，2000；Shutter等，2000b；Uyttendaele等，1996；Villa等，2001;Xue等，1999)。小鼠缺乏Jaggedl會致胚胎死亡，同時有嚴重的血管缺陷(Xue等，1999)。缺乏Notchl的小鼠會致胚胎死亡，并會死于嚴重的神經(jīng)缺陷，還有血管生成缺陷(Krebs等，2000；Swiatek等，1994)。缺乏Notch4的小鼠出生后看似正常，但是已經(jīng)失去Notchl和Notch4的胚胎，因為嚴重出血和血管構(gòu)建缺陷，死于E9.5，這表明Notchl和Notch4可能在血管發(fā)明過程中有其他的功能(Krebs等，2000)。在內(nèi)皮細胞層的Notch4以活化形式的外源表達也會導致血管缺陷，這種血管缺陷類似于在同時缺失Notchl和Notch4的小鼠上觀察到的，所以，這些現(xiàn)在表明合適水平的Notch信號在胚胎脈管系統(tǒng)發(fā)育過程中是至關(guān)重要的(Uyttendaele等，2001)。綜上，因為Notch/Ntch信號成分而造成的小鼠突變的數(shù)據(jù)揭示了依賴于Notch的幾個過程，包括血管重塑、動脈靜脈定型、血管平滑肌細胞的募集補充和心臟/心臟流出血管發(fā)育。最近的實驗已經(jīng)暗示Notch信號在動脈/靜脈內(nèi)皮細胞的定型。在E13.5胚胎的原位分析發(fā)現(xiàn)，Notchl，Notch3,Notch4,D14，Jaggedl和Jagged2的表達被限制在動脈而不在靜脈表達(Villa等，2001)。與表達數(shù)據(jù)一致，在斑馬魚上的Notch信號干擾與缺失動脈標記ephrinB2有關(guān)；而激活形式的Notch的異位表達導致靜脈細胞內(nèi)的標記EphB4在背大動脈的缺失(Lawson等，2001)。這些數(shù)據(jù)表明，Notch信號可能有助于血管生成過程中動脈和靜脈細胞的定型。綜上，因為Notch/Notch信號成分而造成的小鼠突變的數(shù)據(jù)揭示了依賴于Notch的幾個過程，包括血管重塑、動脈靜脈定型、血管平滑肌細胞的募集補充和心臟/心臟流出血管發(fā)育。有人認為Notch信號在成人血管系統(tǒng)中也起作用。在人類中，在Notch3的胞外域的錯義突變與變性的血管疾病CADASIL的發(fā)展有關(guān)(Caronti等，1998；Desmond等，1998；Joutel等，2000Joutel等，1996)。在傷口愈合模型中，傷口邊緣的內(nèi)皮細胞的再生中觀察到Jaggedl表達的增加，這表明Notch信號可能在成人的血管生成過程中起作用(Lindner等，2001)。綜上，這些數(shù)據(jù)表明Notch信號在血管發(fā)育的許多重要步驟中起作用，這些步驟包括血管再生、血管構(gòu)建/血管生成、動脈/靜脈定型。但是，Notch信號途徑影響這些不同的步驟的分子機制尚未闡明。意義Shimizu等(J.Biol.Chem.274(46):32961_32969(1999))描述了NotchlECD/Fc、Notch2E⑶/Fe和Notch3E⑶/Fe在結(jié)合研究中的用途，然而，Shimizu等沒有提及這些蛋白在抑制血管生成中的作用。美國專利號為6，379，925、于2002年4月30號公告的專利中，Kitajewski等描述了小鼠Notch4。但是，它沒有描述像本申請?zhí)岢龅幕贜otch的融合蛋白。Notch蛋白在發(fā)育的決策中起著關(guān)鍵的作用，涉及脈管系統(tǒng)、造血系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)。因此，對他們的功能的認識是認識如何進行細胞命運決定和在發(fā)育以及成人組織中如何控制任務的關(guān)鍵。到目前為止，若干關(guān)于Notch或Notch配體基因破壞的報道已經(jīng)描述了血管表型，并強調(diào)這一途徑是指導血管發(fā)育的基本機制。異常Notch活動已被證實與人類疾病，包括癌癥和血管疾病(CADASIL)有關(guān)。Notch在腫瘤血管生成中的分析最近才剛剛開始，但是，我們對Notch的潛在的下游目標的發(fā)現(xiàn)表明了其在血管生成相關(guān)的病理過程中的作用。比如，VEGFR-3已經(jīng)被認為與腫瘤血管的生成和腫瘤淋巴管生成有關(guān)。幾個其他潛在的Notch目標的表達或者功能也已經(jīng)與腫瘤血管的生產(chǎn)聯(lián)系起來，包括印hrinB2，Id3，血管生成素1，andPDGF-B。這些Notch基因功能的見解，有助于將來明確Notch在人類疾病中的作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種融合蛋白，這種融合蛋白包含一個信號肽；人類Notch3受體蛋白的胞外域的I-X表皮生長因子重復片段(EGFrepeats1_X)，其中X是12_34的任意整數(shù)；以及一個與之結(jié)合的抗體的Fc片段。本發(fā)明提供一種融合蛋白，這種融合蛋白包含一個信號肽；人類Notch3受體蛋白的胞外域的I-X表皮生長因子重復片段，其中X是1-10的任意整數(shù)；以及一個與之結(jié)合的抗體的Fc片段。本發(fā)明提供一種融合蛋白，這種融合蛋白包含一個信號肽；人類Notch3受體的胞外域的至少12個表皮生長因子重復片段；以及一個與之結(jié)合的抗體的Fc片段。本發(fā)明提供一種融合蛋白，這種融合蛋白包含一個信號肽；人類Notch3受體蛋白的胞外域的表皮生長因子重復片段，其中至少有12個重復片段；以及一個與之結(jié)合的抗體的Fc片段。本發(fā)明提供一種治療患有癌癥的主體的方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白以治療主體，從而治療患有癌癥的主體。本發(fā)明提供一種抑制主體血管生成的方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白以抑制血管生成，從而抑制主體血管生成。本發(fā)明提供一種治療患有卵巢癌的主體的方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白以治療主體，從而治療患有卵巢癌的主體。本發(fā)明提供上述融合蛋白在制備用于治療腫瘤的藥物組合物中的應用。本發(fā)明提供上述融合蛋白在制備用于抑制血管生成的藥物組合物中的應用。本發(fā)明提供上述融合蛋白在制備用于治療卵巢癌的藥物組合物中的應用。本發(fā)明提供上述融合蛋白在制備用于治療代謝紊亂的藥物組合物中的應用。本發(fā)明提供一種抑制主體生理淋巴管生成或者病理淋巴管生成的方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白以抑制主體生理淋巴管生成或者病理淋巴管生成。本發(fā)明提供一種抑制主體腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白以抑制主體腫瘤轉(zhuǎn)移。本發(fā)明提供一種抑制主體繼發(fā)性腫瘤生長的方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白以抑制主體繼發(fā)性腫瘤生長。本發(fā)明提供一種抑制主體血管被腫瘤共擇的方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白以抑制主體血管被腫瘤共擇。本發(fā)明提供一種治療患有腫瘤的主體方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白和有效劑量的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抑制劑以治療患有腫瘤的主體。本發(fā)明提供一種治療患有腫瘤的主體方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白和有效劑量的VEGF受體抑制劑以治療患有腫瘤的主體。本發(fā)明提供一種治療患有腫瘤的主體方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白和有效劑量的血小板衍生生長因子(PDGF)抑制劑以治療患有腫瘤的主體。本發(fā)明提供一種治療患有腫瘤的主體方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白和有效劑量的PDGF受體拮抗劑以治療患有腫瘤的主體。本發(fā)明提供一種治療患有腫瘤的主體方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白和有效劑量的HER2/neU抑制劑以治療患有腫瘤的主體。本發(fā)明提供一種治療患有乳腺癌的主體方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白以治療患有乳腺癌的主體。本發(fā)明提供上述融合蛋白在制備用于治療乳腺癌的藥物組合物中的應用。S1本圖顯示了Notch和Notch配體的概要結(jié)構(gòu)Notchl，Notch2,Notch3,Notch4,Jagged-I,Jagged-2,Delta-#1(Delta-like1)，Delta-#3,Delta-#4。S2本圖顯示了基于Notch的融合蛋白(NotchE⑶/Fe)的方案設計。包含了EGF重復片段的Notchl，Notch2,Notch3或Notch4的胞外域被融合到抗體的Fc部分。圖3本圖顯示了一個共培養(yǎng)實驗，以便于測試基于Notch的融合蛋白的活性。Notch和Notch響應轉(zhuǎn)錄報告都在一個“Notch響應”細胞中表達，HeLa.Notch配體，Jagged-I,Delta-樣1，或Delta-樣4都在一個“配體呈現(xiàn)”細胞中表達，293。表達被個別細胞群的轉(zhuǎn)染介導調(diào)節(jié)，細胞被共同培養(yǎng)，然后測試依賴于Notch的報告的活性。圖4本圖顯示了基于Notch的融合蛋白相對于在Notch和Notch配體相互作用下的Notch信號的抑制活性。通過共同培養(yǎng)Notchl和3類型的Notch配體表達細胞發(fā)現(xiàn)了Notch信號的誘導現(xiàn)象，同時，基于Notch的融合蛋白表達載體進入Notchl表達細胞的共同轉(zhuǎn)染對這種誘導現(xiàn)象有抑制作用。因此，基于Notch的融合蛋白能夠用于Notch抑制劑，基于抑制Notch和Notch配體相互作用。圖5本圖顯示了基于Notchl的融合蛋白(NotchlECD/Fc)在293位的表達。A在細胞溶解液(Iystates)(Iys)中表達或分泌到培養(yǎng)基(media)(sup)。B在NECD/Fcs的293溶解液中表達，S6本圖顯示了Notch信號在HUVEC的活化作用，HUVEC被腺病毒編碼的VEGF-165感染。通過使用CBFl啟動子活性，監(jiān)測到了Notch信號的活化作用。CBFl啟動子的轉(zhuǎn)錄活性被Notch-IC與CBFl的結(jié)合激活。我們在HUVEC中測量了CBFl啟動子活性，其中HUVEC在不同的感染復數(shù)下被腺病毒編碼的VEGF-165感染。CBFl啟動子的誘導作用在被Ad-VEGF感染的HUVEC中發(fā)現(xiàn)，與Ad-LacZ感染的細胞在感染復數(shù)依賴的方式形成對比。這個數(shù)據(jù)顯示，在HUVEC，VEGF的過度表達能激活Notch信號。S7本圖顯示基于Notch的融合蛋白對于VEGF誘導的Notch信號的活化作用?；贏d-Notch的融合蛋白與Ad-VEGF的共同感染，很明顯的降低了由Ad-VEGF單獨感染誘導的CBFl啟動子活性的活化作用。在A中，發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染報告后24小時時有60%的抑制，48小時時有90%的抑制。Notch誘餌的抑制活性取決于基于Ad-Notch融合蛋白的感染復數(shù)。圖8本圖顯示了一個實驗，該實驗評估了基于Notch的融合蛋白對于在HUVEC中過度表達的VEGF-165對萌芽誘導的影響。當感染Ad-VEGF的HUVEC在膠原蛋白凝膠中培養(yǎng)8天，在膠原蛋白凝膠中誘導出了萌芽。過度表達VEGF的萌芽誘導作用被腺病毒編碼的基于Notch的融合蛋白的共同感染明顯抑制?；贏d-Notch的融合蛋白本身對于形態(tài)幾乎沒有影響。圖9本圖顯示了在顯微鏡下每場的萌芽計數(shù)結(jié)果。感染Ad-VEGF加入HUVEC中增加了萌芽的數(shù)量取決于所采用的感染復數(shù)。即使有一半感染復數(shù)的基于Notch的融合蛋白被使用，與Ad-VEGF相比，Ad-VEGF誘導的萌芽被明顯抑制。這些數(shù)據(jù)顯示，通過Notch信號的活化作用，VEGF誘導了HUVEC萌芽，同時，基于Notch的融合蛋白能抑制VEGF誘導的萌芽。圖10本圖顯示了大鼠(rat)Notchl蛋白的胞外域的氨基酸序列(SEQIDNO1)和一個連接子(linker)序列(SEQIDNO:2)。圖11本圖顯示了大鼠Notch2蛋白的胞外域的氨基酸序列(SEQIDNO3)和一個連接子序列(SEQIDNO:2)。圖12本圖顯示了鼠(mouse)Notch3蛋白的胞外域的氨基酸序列(SEQIDNO:4)。圖13本圖顯示了鼠Notch4蛋白的胞外域的氨基酸序列(SEQIDNO5)和一個連接子序歹丨J(SEQIDNO:2)。圖14A和14B本圖顯示了大鼠Notchl基因的胞外域的核苷酸序列(SEQIDNO6)。圖15A和15B本圖顯示了大鼠Notch2基因的胞外域的核苷酸序列(SEQIDNO7)。圖16A和16B本圖顯示了鼠Notch3基因的胞外域的核苷酸序列(SEQIDNO8)。圖17A和17B本圖顯示了鼠Notch4基因的胞外域的核苷酸序列(SEQIDNO9)和一個連接子序列的核苷酸序列(SEQIDNO10)和氨基酸序列(SEQIDNO:2)。圖18A和18B本圖顯示了人類Notchl基因的胞外域的核苷酸序列(SEQIDNO11)。圖19A和19B本圖顯示了人類Notch2基因的胞外域的核苷酸序列(SEQIDNO12)。圖20A和20B本圖顯示了人類Notch3基因的胞外域的核苷酸序列(SEQIDNO13)。圖21A和21B本圖顯示了人類Notch4基因的胞外域的核苷酸序列(SEQIDN0:14)。圖22A-22I這些圖顯示了VEGF激活Notch信號來誘導HUVEC萌芽。HUVEC在感染復數(shù)為40(圖22A，22H，221)或20(圖22C，22G)的情況下與Ad-VEGF進行轉(zhuǎn)導。為了得到相同數(shù)量的腺病毒總數(shù)，在感染復數(shù)為60(圖22G)、80(圖22A)和100(圖22H，22I)情況下，Ad-LacZ被共同轉(zhuǎn)導給HUVEC。圖22A顯示了Notch和Notch配體表達的RT-PCR分析。數(shù)字表示PCR周期。圖22B顯示了轉(zhuǎn)導的VEGF對CSL報告活性的影響。圖22C顯示了SU5416對CSL報告活性的影響，CSL報告活性被Ad-VEGF反式激活。圖22D顯示了Notch誘餌(NlE⑶Fe)的構(gòu)建。圖22E顯示了來自HUVEC的NIECDFc的分泌，其中HUVEC被Ad-NlECDFc轉(zhuǎn)導。圖22F顯示了在共同培養(yǎng)法中，NlE⑶Fc對抗配體介導的CSL報告活性的影響(□:(_)；·0.33ngPHyTC-NlECDFc；·0.67ngpHyTC-NlECDFc)。圖22G-I顯示了NIECDFc對抗Ad-VEGF轉(zhuǎn)導的HUVEC的影響。在缺少或者存在指明的劑量的Ad-NlECDFc共同轉(zhuǎn)導的情況下，在HUVEC中Ad-VEGF的轉(zhuǎn)導激活Notch信號。圖22G顯示了NlE⑶Fc對CSL報告活性的影響，CSL報告活性被Ad-VEGF反式激活。圖22H顯示了在感染復數(shù)為40的條件下，Ad-VEGF轉(zhuǎn)導的HUVEC和Ad-NlE⑶Fc的共同轉(zhuǎn)導的萌芽的抑制作用。圖221顯示了NlE⑶Fc對Ad-VEGF轉(zhuǎn)導的HUVEC的萌芽的影響的量化情況(口萌芽；·細胞數(shù))。圖23A-23J這些圖顯示了Notch信號上調(diào)Fltl表達來誘導HUVEC萌芽。在感染復數(shù)為40的條件下，HUVEC被Ad-LacZ或Ad-NlIC轉(zhuǎn)導。圖23A-23C顯示了受體酪氨酸激酶抑制劑對Notch誘導的HUVEC萌芽的影響。圖23A是一張Ad-NlIC轉(zhuǎn)導的HUVEC萌芽的照片，該HUVEC采用了1μM的PD166866，1μM的ZD1893和0.5μM的SU5416進行處理。圖23Β顯示了以IyM的抑制劑的效果的量化情況(口萌芽；·細胞數(shù))。圖23C顯示了SU5416的效果的劑量依賴性(口萌芽；·細胞數(shù))。圖23D-E顯示了Flt-I表達在Ad-NlIC轉(zhuǎn)導的HUVEC的誘導作用。圖23D顯示了Flt-ImRNA表達的RT-PCR分析。圖23Ε顯示了Flt-I蛋白表達的WB分析。圖23F-G顯示了在PlGF刺激下，Notch誘導的HUVEC萌芽的增加。Ad-NlIC轉(zhuǎn)導的HUVEC用SFM而不是完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)在膠原蛋白凝膠中，加入或者不加入50ng/ml的P1GF。圖23F顯示了PlGF誘導Ad-NlIC轉(zhuǎn)導的HUVEC的萌芽(箭頭頭部單絲狀偽足芽；箭頭多絲狀偽足芽)。圖23G顯示了PlGF對Ad-NlIC轉(zhuǎn)導的HUVEC萌芽的影響的量化情況(口多個；·總計)。圖23H-I顯示了Flt-IsiRNA轉(zhuǎn)染對Fltl表達的影響。Ad-NlIC轉(zhuǎn)導的HUVEC用200pmol的對照(control)(CT)或者Flt-IsiRNA轉(zhuǎn)染。圖23H顯示了Flt-ImRNA表達的減少。圖231顯示了Flt-I蛋白表達的減少。圖23J顯示了Flt-IsiRNA轉(zhuǎn)染對Notch誘導的HUVEC萌芽的影響。Ad-NlIC轉(zhuǎn)導的HUVEC被100或者200pmol的siRNA轉(zhuǎn)染，并在膠原蛋白凝膠中培養(yǎng)2天。圖24A-24E這些圖顯示了通過采用上調(diào)MMP-9和MTl-MMP的方式，VEGF通過Notch信號調(diào)節(jié)明膠酶活性。圖24A-B顯示了由在HUVEC中的VEGF刺激的MMP-9和MMP-2的活性的明膠酶譜分析。圖24A顯示了NlE⑶Fc對MMP-9活性的影響。將被轉(zhuǎn)導的HUVEC培養(yǎng)在纖維蛋白凝膠中，培養(yǎng)指定的天數(shù)(即2天，4天，6天，8天)。使用膠原蛋白凝膠培養(yǎng)也得到了相似的結(jié)果，雖然MMP-9的誘導作用在纖維蛋白凝膠中比在膠原蛋白凝膠中強(數(shù)據(jù)沒有顯示出來)。圖24B顯示了NlE⑶Fc對MMP-2活性的影響。在指定的劑量下HUVEC被Ad-NlE⑶Fc轉(zhuǎn)導，并且第4天收集在膠原蛋白凝膠中培養(yǎng)HUVEC的條件培養(yǎng)基。圖24C-D顯示了用Notch信號上調(diào)MMP-9和MT1-MMP。在感染復數(shù)為40的條件下，HUVEC被Ad-LacZ或Ad-NlIC轉(zhuǎn)導。數(shù)據(jù)顯示了PCR周期。圖24C顯示了Notch信號對MMP-9和MMP-2表達的影響的RT-PCR分析。圖24D顯示了在Notch信號作用下轉(zhuǎn)錄物和蛋白的MTl-MMP表達的誘導作用。圖24E顯示了用Ad-NlECDFc的共同轉(zhuǎn)導下在Ad-VEGF-HUVEC中MMP-9和MTl-MMP表達的RT-PCR分析。在各自感染復數(shù)為40下，在不存在或存在Ad-NlE⑶Fc共同轉(zhuǎn)導時，HUVEC被Ad-VEGF轉(zhuǎn)導。為了得到相同總數(shù)的腺病毒，在感染復數(shù)為80的條件下Ad-LacZ被共同轉(zhuǎn)導。圖25A-25D這些圖顯示了Notch信號在依賴VEGF體內(nèi)血管生成中所扮演的角色。圖25A-25D顯示了在小鼠的DAS試驗中，NlE⑶Fc對VEDF誘導的血管生成的抑制作用。顯示了代表性的照片。圖25A顯示了用293/VEGF轉(zhuǎn)染子皮下誘導血管生成，與293/VEGF表達Notch誘餌(基于Notch的融合蛋白)N1E⑶Fc形成對比。圖25B顯示了在對照組用293/VEGF誘導的血管化的量化等級，與293表達Notch誘餌(基于Notch的融合蛋白)NlECDFc形成對比。圖25C顯示了用Ad-LacZ感染的MDA-MB-231細胞皮下誘導的血管生成，與Ad-NlE⑶Fc(基于Notch的融合蛋白)感染的MDA-MB-231細胞形成對比。MDA-MB-231乳腺癌細胞產(chǎn)生VEGF(數(shù)據(jù)沒有顯示出來)。圖25D顯示了用Ad-LacZ感染的MDA-MB-231細胞誘導的血管化的量化等級，與Ad-NlECDFc(基于Notch的融合蛋白)感染的MDA-MB-231細胞形成對比。圖26A和26B這些圖顯示了Ad_VEGF165轉(zhuǎn)導的HUVEC增殖情況。在指定的劑量下，HUVEC被Ad-VEGF165轉(zhuǎn)導。為了達到相同總數(shù)的腺病毒，在感染復數(shù)為40pfu/細胞的條件下，Ad-LacZ被共同感染。將HUVEC懸浮于增加了FBS的SFM中，然后接種于1x104細胞/孔的24孔的板上，并加入0.4ml培養(yǎng)基。4天后，使用CCK-8試劑盒來確定細胞數(shù)量，其結(jié)果以測定的細胞數(shù)量與對照組細胞數(shù)量的比率的形式顯示，該對照組在感染復數(shù)為40pfu/細胞的條件下被Ad-GFP轉(zhuǎn)導。圖26A顯示了轉(zhuǎn)導的VEGF對增殖的影響。圖26B顯示了SU5416的抑制效果。在指定的劑量下，Ad-VEGF轉(zhuǎn)導的HUVEC采用SU5416進行處理。圖27A和圖27B這些圖顯示了在I型膠原蛋白凝膠中HUVEC萌芽的誘導作用。在指定的劑量下，HUVEC被Ad-VEGF165或AD-NlIC轉(zhuǎn)導。為了達到相同總數(shù)的腺病毒，在感染復數(shù)為40pfu/細胞的條件下，Ad-LacZ被共同感染。被轉(zhuǎn)導的HUVEC用完全培養(yǎng)基中在膠原蛋白凝膠中進行培養(yǎng)。第7天在顯微鏡下觀察萌芽的數(shù)量。圖28A和28B這些圖顯示了Notch信號的改變對細胞增殖的影響。這些細胞都被指定的腺病毒轉(zhuǎn)導。為了達到相同總數(shù)的腺病毒，在感染復數(shù)為60pfu/細胞的條件下，Ad-GFP被共同感染。4天后，使用CCK-8試劑盒來確定細胞數(shù)量，其結(jié)果以測定的細胞數(shù)量與對照組細胞數(shù)量的比率的形式顯示，該對照組在感染復數(shù)為60pfu/細胞的條件下被AD-GFP轉(zhuǎn)導。圖28A顯示了被轉(zhuǎn)導的miC和Notch融合蛋白對HUVEC增殖的影響。將轉(zhuǎn)導的HUVEC懸浮于完全培養(yǎng)基，然后接種于1x104細胞/孔的24孔的板上，并加入0.4ml指定的培養(yǎng)基(口Ad-NlIC；■:Ad-NlECDFc)。圖28B顯示了Notch融合蛋白對KP1/VEGF轉(zhuǎn)染子增殖的影響。將被轉(zhuǎn)導的KP1/VEGF轉(zhuǎn)染子懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基中，然后接種于2x104細胞/孔的24孔的板上，并加入0.5ml培養(yǎng)基。圖29本圖顯示了PIGF表達在Ad-NlIC轉(zhuǎn)導的HUVEC的誘導作用的RT-PCR分析。在感染復數(shù)為40pfu/細胞的條件下，HUVEC被Ad-LacZ或Ad-NlIC感染?？俁NA從被轉(zhuǎn)導的HUVEC中分離出來，其中所述的HUVEC用完整的培養(yǎng)基中在膠原蛋白凝膠中培養(yǎng)5天。圖30A-30C這些圖顯示了Ad-NlIC或者Ad-VEGF轉(zhuǎn)導的由Flk-IsiRNA轉(zhuǎn)染的HUVEC的萌芽抑制作用。圖30A顯示了在用200pmol的Flk-IsiRNA轉(zhuǎn)染的Ad-VEGF-HUVEC中Flk-ImRNA和蛋白表達的減少。在感染復數(shù)為40pfu/細胞的條件下，Ad-VEGF-HUVEC被200pmol的控制劑(CT)或Flk-IsiRNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時總RNA被分離。轉(zhuǎn)染48小時后，用SFM從血清饑餓細胞中收集總細胞裂解液。圖30B和30C顯示了Flk-IsiRNA轉(zhuǎn)染對VEGF或Notch誘導的HUVEC萌芽的抑制作用。在感染復數(shù)為40pfu/細胞的條件下，Ad-NlIC或Ad-VEGF-HUVEC被轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時采用200pmol的siRNA并在膠原蛋白凝膠中培養(yǎng)5天。圖30B顯示了Flk-IsiRNA轉(zhuǎn)染對HUVEC萌芽的影響(口Ad_VEGF；·=Ad-NlIC)。圖30C顯示了Flk-IsiRNA轉(zhuǎn)染抑制效果的定量情況。圖31A和31B這些圖顯示了對采用基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑GM6001處理的Ad-NlIC轉(zhuǎn)導的HUVEC的萌芽抑制。在感染復數(shù)為40pfu/細胞的條件下，將EitherAd-LacZ或Ad-NlIC-HUVEC在膠原蛋白凝膠中培養(yǎng)5天，培養(yǎng)時不加或者加入50μm的GM6001。圖31A顯示了GM6001對Notch誘導的HUVEC萌芽的影響。圖31B顯示了GM6001抑制效果的量化情況。圖32A、32B和32C本圖顯示了人類Notch3全長核苷酸序列(SEQIDNO15)，起始于ATG(nt1)，以TGA(nt6964)結(jié)束。信號肽和第一個34EGF樣重復域在這個序列的nt1-4158得到體現(xiàn)。核苷酸1-4158用于設計人類Notch3誘餌蛋白，在這里有描述。包含EGF樣重復片段1_34的核苷酸有下劃線。圖33本圖顯示了人類Notch3全長氨基酸(aa)序列(SEQIDNO16)，從aal(M為蛋氨酸)，到aa2555(K為賴氨酸)。信號肽和第一個34EGF樣重復域在這個序列的aa1-1386得到體現(xiàn)。氨基酸1-1386用于設計人類Notch3誘餌蛋白，在接下來的部分有描述。包含EGF樣重復片段1-34的氨基酸有下劃線。圖34本圖顯示了兩個人類Notch3誘餌蛋白的圖示，即h_Notch3(1_34)誘餌和h-spHC-Notch3(1-34)誘餌。圖35本圖顯示了用人類Fc核苷酸序列在Notch3誘餌蛋白(SEQIDNO17)上產(chǎn)生Fc標記。人類Fc的713核苷酸，被融合到Notch3誘餌構(gòu)建的3‘端，剛好是Notch3EGF樣重復的下游。人類Fc區(qū)域便于Notch誘餌的檢測和純化，并用于穩(wěn)定分泌的人類Notch3-人類Fc融合蛋白。圖36本圖顯示了用人類Fc氨基酸序列在Notch3誘餌蛋白(SEQIDNO18)上產(chǎn)生Fc標記。人類Fc的237氨基酸，被融合到所有Notch誘餌構(gòu)建的C端，剛好是Notch3EGF樣重復的下游。人類Fc區(qū)域便于Notch誘餌的檢測和純化，并用于穩(wěn)定分泌的人類Notch3-人類Fc融合蛋白。圖37本圖顯示了人類Notch3/Fc融合序列構(gòu)建人類Notch3的EGF重復片段34位的末端。圖38本圖顯示了被預計包含人類Notch3的氨基酸1-40的人類Notch3信號肽的信號序列分析。本測定是采用丹麥科技大學提供的IP3.0服務器程序進行的。這些結(jié)果預測位于丙氨酸39(A39)和丙氨酸40(A40)之間的裂解的主要位點。如圖所示，在人類Notch3的氨基酸序列1-40中用“/”將該裂解位點隔開。圖39本圖顯示了被預計包含人類Hc的氨基酸1-22的人類Hc信號肽的信號序列分析。本測定是采用丹麥科技大學提供的IP3.0服務器程序進行的。這些結(jié)果預測位于丙氨酸21(A21)和丙氨酸22(A22)之間的裂解的主要位點。如圖所示，在人類Hc的氨基酸序列1-22中用“/’將該裂解位點隔開。圖40A和40B本圖顯示了h-N0tch3a_34)誘餌蛋白(SEQIDNO31)的核苷酸序列。預測的人類Notch3信號肽有下劃線(nt1-120)。Notch3EGF重復片段1-34是從nt121-4158編碼。融合連接點、BglII位于nt4158-4163。Fc標記序列為斜體并有下劃線。圖41本圖顯示了h-Notch3(1-34)誘餌蛋白(SEQIDNO32)的氨基酸序列。預測的人類Notch3信號肽有下劃線(AA1-40)。Notch3EGF重復片段1-34是從aa41-1386編碼。Fc標記序列為斜體并有下劃線。圖42本圖顯示了h-spHGN0tch3(1_34)誘餌蛋白(SEQIDNO33)的氨基酸序列。預測的人類Notch3信號肽有下劃線(AA1-22)。Notch3EGF重復片段1-34是從aa22-1386編碼。Fc標記序列為斜體并有下劃線。圖43A和43B本圖顯示了h-SpHGN0tch3(1_34)誘餌蛋白(SEQIDNO34)的核苷酸序列。預測的人類HC信號肽有下劃線(nt1-66)。Notch3EGF重復片段是從nt67-4104編碼。融合鏈接點，BglII位點為nt5004到5009。Fc標記序列為斜體并有下劃線。圖44本圖顯示了Notch蛋白和配體在血液和淋巴內(nèi)皮細胞中的表達。對由HMVEC純化得到的淋巴內(nèi)皮細胞(LEC)和血液內(nèi)皮細胞(BEC)的RNA中的Notchl-4，Dili，D114和Jaggedl進行了RT-PCR實驗。Notchl，Notch2,Notch4,D114和Jaggedl在BEC和LEC都有相似水平的表達。Notch3的表達看似被限定在LEC，暗示Notch3信號在淋巴內(nèi)皮細胞中起作用。圖45本圖顯示在胚胎的胚齡13.5天，Notch3與淋巴內(nèi)皮細胞標記LYVE-I和Proxl—起共同表達。胚齡13.5天的小鼠胚胎的10微米的連續(xù)切片被LYVE-l，Proxl或Notch3免疫染色。Notch3被表達在同時表達了淋巴內(nèi)皮細胞標記LYVE-I和ftOxl的細胞上。圖46本圖顯示了在血管內(nèi)皮細胞中ftOxl誘導Notch3表達。(A).檢驗了的異位表達是否會改變Notch蛋白或者配體的表達。腺病毒感染Ad-Proxl或Ad-LacZM小時后，HUVEC總RNA被分離，并進行了Notchl-4，D114和Jaggedl的定量RT-PCR。有力地上調(diào)了Notch3的表達。Notchl、Notch2、Notch4、D114和Jaggedl表達沒有被明顯地影響。(B).化合物E(cE)，抑制Notch信號的早老素(I^resenlin)抑制劑，在Ad-LacZ或Ad-Proxl感染的HUVEC中孵育M小時。分離總RNA，并做了定量PCR實驗以便于測定Notch3的表達。Proxl誘導Notch3的表達，而且這個誘導通過添加化合物E而被抑制。這表明Notch3的Proxl誘導取決于Notch信號的活化作用。圖47本圖顯示了在血液內(nèi)皮細胞中ftOxl誘導Notch靶向基因。HUVEC被腺病毒編碼、LacZ,ProxUNlIC或N4/int_3感染，感染M小時后分離總RNA。為了測定內(nèi)皮的Notch靶向基因、VEGFR-3、EphrinB2、Heyl和Hey2，進行了定量RT-PCR實驗。與Notchl和Notch4信號活化作用相似，Proxl誘導了所有4個基因(A和B)。Heyl和Hey2在淋巴內(nèi)皮細胞中的表達未知。圖48本圖顯示了Proxl誘導Notch靶向基因取決于在血液內(nèi)皮細胞中的Notch信號。HUVEC被腺病毒編碼、LacZJroxljllc或N4/int_3感染。化合物E(cE)，抑制Notch信號的早老素抑制劑，在Ad-LacZ或Ad-Proxl感染的HUVEC中孵育M小時，然后分離總RNA。為了測定內(nèi)皮的Notch靶向基因、VEGFR-3、EphrinB2和Hey2，進行了定量RT-PCR實驗。Prox-I介導的誘導Notch靶向基因、印hrinB2、VEGFR_3和Hey2被抑制，通過添加Notch信號抑制劑化合物E。因此，Proxl通過Notch調(diào)節(jié)印hrinB2、VEGFR-3和Hey2的表達。圖49本圖顯示了一個miC敲入的示意圖?；罨问降腘otchl被插入到EFlα基因座(locus)位于兩個LoxP位點側(cè)面。當Cre重組酶的表達時，neo/tpA盒丟失，并且在無處不在的EFlα啟動子的控制下miC被表達。圖50本圖顯示了胚胎發(fā)育10.5天前，Notch的活化作用在SM22表達的血管平滑肌細胞導致胚胎死亡。在出生后21天(P21)，，沒有發(fā)現(xiàn)成活SM22Cre/+；EFlαNlIC/+小鼠，P值小于0.001。在胚胎發(fā)育的9.5天(Ε9.5)，觀察到了SM22Cre/+；EFlαNlIC/+胚胎的可預測數(shù)量，但是與它們處于對照的同伴相比，它們生長嚴重遲緩(下面的圖)。圖51本圖顯示了Notch的活化作用在SM22表達的血管平滑肌細胞改變α平滑肌細胞肌動蛋白的表達。胚齡9.5天的胚胎α平滑肌細胞肌動蛋白被整體免疫染色。與WT對照組相比，α平滑肌細胞肌動蛋白的表達在SM22Cre/+;EFlamiC/+胚胎中改變。因此，在血管平滑肌細胞中的Notch信號的活化作用破壞了心血管生長。具體實施例方式術(shù)語本申請中使用的下列用語，除另有明確說明外，應具有以下所列的含義“給藥”可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何方法來實現(xiàn)或完成。這些方法比如包括病灶內(nèi)、肌肉、皮下、靜脈、腹腔內(nèi)、脂質(zhì)體介導、經(jīng)粘膜、腸、外用、鼻腔、口腔、肛門、眼或耳等給藥途徑?！案街笔侵敢匀魏畏绞竭B接。在一個實施例中，附著是指由共價鍵連接，在另一個實施例中，附著是指以非共價鍵連接?！鞍被帷薄ⅰ鞍被釟埢焙汀皻埢痹诖嘶Q使用是指一種氨基酸與蛋白質(zhì)、多肽或者肽結(jié)合。氨基酸，例如，可以是一種天然氨基酸，或者是一個能起類似于天然氨基酸的作用的天然氨基酸類似物?！翱贵w“應包括但不限于(a)包括兩個重鏈和輕鏈以及識別抗原的免疫球蛋白分子；(b)多克隆或單克隆免疫球蛋白分子；及(c)一價或二價片段。免疫球蛋白分子可能來自任何常見的種類，包括但不限于IgA，分泌型IgA，IgG,IgE和IgM。IgG亞類是本領(lǐng)域所熟知的，包括但不限于，人類IgGl，IgG2，IgG3和IgG4?？贵w可以是天然存在的和非天然存在的。此外，抗體包括嵌合抗體(chimericantibodies)，全合成抗體，單鏈抗體和其片段?？贵w可能是人類抗體或非人類抗體。非人類抗體可能通過重組方法進行人源化，以減少其對人類的免疫原性?？贵w片段包括但不限Fab和Fc片段?！翱贵w的Fc部分”，在一個實施例中，是一個可結(jié)晶片段，該可結(jié)晶片段通過免疫球蛋白的木瓜蛋白酶消化得到的，該免疫球蛋白是由通過二硫鍵連接的兩個重鏈的一半C-末端和以“效應物區(qū)域”“effectorregion”著稱的的免疫球蛋白組成的。在另一個實施例中，“抗體的Fc部分”是指全部或?qū)嵸|(zhì)上全部的，一個重鏈的一半C-末端?！叭嗽椿?，對于抗體來說，是指抗體CDR域外部的某些、大部分或者全部氨基酸被相應的來源于人類免疫球蛋白分子取代。只要不廢除抗體與特定抗原結(jié)合的能力，氨基酸小的添加、刪除、插入、替換或修改是允許的。合適的人類免疫球蛋白分子包括但不限于IgGl,IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgM分子。各種出版物描述了如何制造人源化抗體，例如，美國專利號4816567，5225539，5585089和5693761，和PCT國際公布號W090/07861的出版物。本申請中所使用的術(shù)語“組合物”，作為藥物組合物，是包含由有效成分和非有效成分構(gòu)成的載體的產(chǎn)品，以及任何直接或者間接通過兩個或者多個組分化合、絡合或者聚合得到的產(chǎn)品，或由一個或更多的成分分解得到的產(chǎn)品，或從一個或多個成分通過其他類型的反應或相互作用得到的產(chǎn)品。在本申請中，“有效量”指的能治療患有腫瘤、疾病或紊亂的主體的使用量。因此，有效量將隨主體的不同和治療的條件的不同而改變。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以進行常規(guī)滴定實驗，以確定這種有效量。一個化合物的有效量將因主體的不同和給藥途徑的不同而變化。根據(jù)不同化合物，給藥量可不斷輸送，如通過連續(xù)輸送，或每隔一段時間(比如一個或多個分開的時機)。某一特定化合物的多種劑量所需的時間間隔可以通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過適當?shù)膶嶒灉y得。在一個實施例中，有效量約為1μg/kg-10mg/kg。在另一個實施例中，有效量約為10μg/kg-lmg/kg。在進一步的實施例中，有效量約為100μg/kg。用于與Notch受體蛋白有關(guān)的“胞外域”“Extracellulardomain"是指全部或部分(i)存在于細胞外(即既不作為一個跨膜部分也不作為細胞內(nèi)部分存在)的Notch和(ii)結(jié)合到與完整的Notch受體蛋白結(jié)合的胞外配體的Notch。Notch的胞外域可以選擇性的包括一個信號肽?！鞍庥颉?，“E⑶”和“胞外區(qū)”“Ectodomain"是同義的?！鞍胨テ谠黾硬糠帧笔侵敢徊糠之斊淇刹僮鞯剡B接到第二部分，增加第二部分的體內(nèi)半衰期。半衰期增加部分包括，例如，抗體的Fc部分，糖基化標記(glycosylationtags)(即糖化多肽)，聚乙二醇(PEG)，連接有PEG的多肽及脂質(zhì)修飾的多肽?！耙种啤币环N疾病或不良的生物過程的發(fā)作意味著減輕這種疾病或過程發(fā)作的可能性，或完全防止這種疾病或過程的發(fā)作。在優(yōu)選實施例中，抑制疾病或者過程的發(fā)作意味著完全阻止其發(fā)作?！癗otch”，“Notch蛋白”和“Notch受體蛋白”是同義的。此外，術(shù)語“基于Notch的融合蛋白”與“Notch誘餌”(“Notchdecoy”)是同義的。下面的Notch氨基酸序列是已知的，在此列出供參考=Notchl(美國國立衛(wèi)生研究院維護的基因序列數(shù)據(jù)庫(Genbank)登錄號S18188(大鼠))；Notch2(Genbank登錄號NP_077334(大鼠))；Notch3(Genbank登錄號Q61982(鼠))；和Notch4(Genbank登錄號T09059(鼠))。下面的Notch氨基酸序列是已知的，在此列出供參考Notchl(Genbank登錄號XM_342392(大鼠)和NM_017617(人類))；Notch2(Genbank登錄號NM_024358(鼠)，M99437(人類和AF3O86Ol(人類))；Notch3(Genbank登錄號NM_008716(鼠)和XM_009303(人類))；和Notch4(Genbank登錄號匪_010汜9(鼠)和NM_004557(人類))。術(shù)語“核酸”，“多核苷酸”和“核酸序列”在本申請中互換使用，每個都指的是脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸聚合物。該脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸可以是天然的或人工合成的類似物?！昂怂帷笔侵溉魏魏怂幔渲邪ǖ幌抻?，DNA，RNA和其雜交物。形成核酸分子的核酸堿基可以是A，C，T和U堿基，以及其衍生物。這些堿基的衍生物都是本領(lǐng)域公知的，并在PCR系統(tǒng)，試劑和耗材(PerkinElmerCatalogue1996-1997年，羅氏分子系統(tǒng)公司，Branchburg，新澤西州，美國)中有例證。核酸包括但不限于反義分子(anti-sensemolecules)和催化核酸分子，比如核酶(ribozymes)和脫氧核酶(DNAzymes)。核酸也包括為肽類似物，碎片或衍生物編碼的核酸，所述衍生物不同于天然存在的形式，為一個或多個氨基酸殘基(刪除的類似物包含少于全部指定的殘基；取代的類似物，其中一個或多個殘基被一個或多個殘留替換；和加成類似物，其中一個或多個殘基添加到肽末端或肽中間部分)，它們具有部分或者全部的天然存在形式的核酸的性質(zhì)。“可操作地連接”(〃operablyaffixed")是指，對于第一個部分，連接到第二個部分，其連接的方式，允許第一個部分具有其不被連接時的功能(例如結(jié)合性能)。術(shù)語“多肽”、”肽”和“蛋白質(zhì)”在本申請中可互換使用，每個都指的是氨基酸殘基的聚合物。氨基酸殘基可以是天然存在的或其化學類似物。多肽，肽和蛋白質(zhì)也可以包括比如糖基化、脂質(zhì)附著、硫酸化、羥基化和ADP-核糖基化作用的變體。本申請中使用的“藥學上可接收的載體”，是指與劑型的其他成分相容的并對其接受者無害的載體，包括任何標準的藥學上可接受的載體。這些載體包括，例如，0.01-0.IM最好是0.05M的磷酸鹽緩沖液或者是0.8%鹽水。此外，這些藥學上可接受的載體，可以是水或者非水溶液，懸浮液和乳液。非水溶劑比如丙二醇，聚乙二醇，橄欖油等植物油，以及可注射有機酯比如油酸乙酯。水性載體，包括水，酒精/水溶液，乳液和懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。非腸道途徑包括氯化鈉溶液，林格氏葡萄糖，葡萄糖和氯化鈉，乳酸林格氏和不揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)途徑包括液體和營養(yǎng)補充劑、電解質(zhì)補充劑，如以林格氏葡萄糖為基礎的物質(zhì)，及其類似物。防腐劑和其他添加劑也可能存在，例如，抗菌藥、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等等?！爸黧w”是指任何有機體，包括但不限于哺乳動物如鼠，大鼠，狗，豚鼠，雪貂，兔子和靈長類動物。在優(yōu)選實施例中，主體是指人類。“治療”是指減慢、停止或逆轉(zhuǎn)疾病或紊亂的進程。本申請中，“治療”也指與疾病或紊亂有關(guān)的癥狀的改善。疾病包括但不限于腫瘤血管生成，動脈粥樣硬化，傷口愈合，黃斑變性，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變，先兆子癇，糖尿病視網(wǎng)膜病變，缺血，中風，心血管疾病和牛皮癬。在傷口愈合過程中、女性月經(jīng)周期、子宮內(nèi)膜重塑，以及在胚胎發(fā)育和器官生長中會遇到血管生成。在病理環(huán)境中，血管生成在不同疾病，比如類風濕關(guān)節(jié)炎，牛皮癬，黃斑變性，糖尿病視網(wǎng)膜病變和腫瘤生長中起著重要的作用。目前已經(jīng)有大量的體內(nèi)證據(jù)，包括臨床觀察，顯示不正常的血管生成與大量的疾病有關(guān)，其中包括類風濕性關(guān)節(jié)炎，炎癥，癌癥，牛皮癬，退化性眼部疾病等。單位、前綴和符號可以用國際單位制允許的形式表示。除非另有說明，核酸序列都是從左到右5'到3'方向書寫，氨基酸序列從左至右按氨基到羧基端的方向書寫。氨基酸可以用UPAC-IUB生化命名委員會推薦的公知的三個字母符號或一個字母符號的形式表示。同樣，核苷可以用普遍接受的單字母代碼表示。以下是在本申請中的縮寫E⑶胞外域；IC胞內(nèi)域；NE⑶/Fe基于Notch的融合蛋白；Nl=Notchl；N2:Notch2；N3:Notch3；N4=Notch4；Dll=Delta樣(Delta-like)；EC內(nèi)皮細胞；FGF成纖維細胞生長因子；FGFR成纖維細胞生長因子受體；HUVEC人類臍靜脈內(nèi)皮細胞；m.ο.i.感染復數(shù)；VMC血管壁細胞；VEGF血管內(nèi)皮細胞生長因子；VEGFR血管內(nèi)皮細胞生長因子受體；sp信號肽；HC或Hc重鏈IgG；PDGF血小板衍生生長因子；PlGF胎盤生長因子。發(fā)明實施例本發(fā)明提供一種融合蛋白，這種融合蛋白包含一個信號肽；人類Notch3受體蛋白的胞外域的I-X表皮生長因子重復片段，其中X是12-34的任意整數(shù)；以及一個與之結(jié)合的抗體的Fc片段。本發(fā)明提供一種融合蛋白，這種融合蛋白包含一個信號肽；人類Notch3受體蛋白的胞外域的I-X表皮生長因子重復片段，其中X是1-10的任意整數(shù)；以及一個與之結(jié)合的抗體的Fc片段。本發(fā)明提供一種融合蛋白，這種融合蛋白包含一個信號肽；人類Notch3受體的胞外域至少12個表皮生長因子重復片段；以及一個與之結(jié)合的抗體的Fc片段。本發(fā)明提供一種融合蛋白，這種融合蛋白包含一個信號肽；人類Notch3受體蛋白的胞外域的表皮生長因子重復片段，其中至少有12個重復片段；以及一個與之結(jié)合的抗體的Fc片段。在這種融合蛋白的一個實施例中，Notch3受體蛋白的胞外域包括表皮生長因子樣重復片段1-34。在這種融合蛋白的一個實施例中，抗體的Fc片段是人類抗體的Fc片段。在這種融合蛋白的一個實施例中，信號肽是Notch3或一個抗體的Hc(HC；重鏈)片段的信號肽。在一個實施例中，融合蛋白包括連續(xù)氨基酸，連續(xù)氨基酸的序列在SEQIDN0:32中列出。在另一個實施例中，連續(xù)氨基酸的序列在SEQIDN0:33中列出。在一個實施例中，融合蛋白由連續(xù)的核苷酸編碼，核苷酸的序列在SEQIDNO31中列出。在另一個實施例中，融合蛋白由連續(xù)的核苷酸編碼，核苷酸的序列在SEQIDNO34中列出。本發(fā)明提供一種治療患有癌癥的主體的方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白以治療主體，從而治療患有癌癥的主體。本發(fā)明提供一種抑制主體血管生成的方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白以抑制血管生成，從而抑制主體血管生成。本發(fā)明提供一種治療患有卵巢癌的主體的方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白以治療主體，從而治療患有卵巢癌的主體。本發(fā)明提供上述融合蛋白在制備用于治療心血管疾病的藥物組合物中的應用。在一個實施例中，心血管疾病是動脈粥樣硬化、缺血或中風。本發(fā)明提供上述融合蛋白在制備用于治療腫瘤的藥物組合物中的應用。本發(fā)明提供上述融合蛋白在制備用于抑制血管生成的藥物組合物中的應用。本發(fā)明提供上述融合蛋白在制備用于治療卵巢癌的藥物組合物中的應用。本發(fā)明提供一種抑制主體生理淋巴管生成或者病理淋巴管生成的方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白以抑制主體生理淋巴管生成或者病理淋巴管生成。在一個實施例中，病理淋巴管是腫瘤淋巴管生成或者是可能依賴腫瘤淋巴管生成的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本發(fā)明提供一種抑制主體腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白以抑制主體腫瘤轉(zhuǎn)移。在一個實施例中，腫瘤轉(zhuǎn)移是通過血管、淋巴脈管系統(tǒng)或淋巴結(jié)。腫瘤轉(zhuǎn)移是癌癥從一個器官擴散到另一個不相鄰的器官。本發(fā)明提供一種抑制主體繼發(fā)性腫瘤生長的方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白以抑制主體繼發(fā)性腫瘤生長。也可能是對與繼發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤相關(guān)的腫瘤血管生成的抑制。在一個實施例中，通過與繼發(fā)性腫瘤相關(guān)的血管生成的抑制作用，繼發(fā)性的腫瘤生長得到抑制。本發(fā)明提供一種抑制主體血管被腫瘤共擇的方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白以抑制主體血管被腫瘤共擇。血管共擇的過程是一個腫瘤細胞與在先存在的血管聯(lián)合并在共擇血管的協(xié)助下生長的過程。腫瘤依賴共擇血管的生長可能在缺乏、先于或者與腫瘤血管生成一起進行。本發(fā)明提供一種治療患有腫瘤的主體的方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白和有效劑量的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抑制劑以治療患有腫瘤的主體。在一個實施例中，VEGF抑制劑是VEGF-A抑制劑、PGIF抑制劑、VEGF-B抑制劑、VEGF-C抑制劑或者VEGF-D抑制劑。VEGF抑制劑的例子包括但不限于貝伐單抗(bevacizumab)，PTK787，Bay43-9006，SUl1248，AG013676，ZD6474，VEGF-誘餌(VEGF-trap)和抗VEGFR2。這些的抑制劑的例子在下列文獻中有詳細描述Ferrara等，(2004)NatureReviewsDrugDiscovery,Vol.3:391-400和Ellis等.(2008)NatureReviewsCancerVol8:579_591，其目錄并入?yún)⒖嘉墨I中。本發(fā)明提供一種治療患有腫瘤的主體的方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白和有效劑量的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體抑制劑以治療患有腫瘤的主體。在一個實施例中，VEGF受體抑制劑是VEGFR-I抑制劑，VEGFR-2抑制劑，VEGFR-3抑制劑或任何VEGFR類組合的抑制劑。本發(fā)明提供一種治療患有腫瘤的主體方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白和有效劑量的血小板衍生生長因子(PDGF)抑制劑以治療患有腫瘤的主體。在一個實施例中，PDGF抑制劑是PDGF-A抑制劑或者PDGF-B抑制劑。本發(fā)明提供一種治療患有腫瘤的主體方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白和有效劑量的PDGF受體拮抗劑以治療患有腫瘤的主體。在一個實施例中，PDGF受體拮抗劑是PDGF受體-B拮抗劑。本發(fā)明提供一種治療患有腫瘤的主體方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白和有效劑量的HER2/neU抑制劑以治療患有腫瘤的主體。本發(fā)明提供一種治療患有乳腺癌的主體方法，包括給主體采用有效劑量的上述融合蛋白以治療患有乳腺癌的主體。本發(fā)明提供上述融合蛋白在制備用于治療乳腺癌的藥物組合物中的應用。本發(fā)明提供的第一種方法是用于治療患有癌癥的主體，所述方法包括給主體采用有效劑量的物質(zhì)，這種物質(zhì)是由Notch受體蛋白的胞外域可操作地連接到半衰期增加的部分組成，從而治療主體。本發(fā)明也提供了第二種方法是用于抑制主體的血管生成，所述方法包括給主體采用有效劑量的物質(zhì)，這種物質(zhì)是由Notch受體蛋白的胞外域可操作地連接到半衰期增加的部分組成，從而抑制主體的血管生成。在上述方法的第一個實施例中，Notch受體蛋白是Notchl受體蛋白。在一個實施例中，Notchl受體蛋白是人類Notchl受體蛋白。在另一個實施例中，半衰期增加的部分是抗體的Fc部分。在另一個實施例中，抗體的Fc部分是人類抗體的Fc部分。在進一步的實施例中，胞外域和半衰期增加的部分在相同的多肽鏈內(nèi)。在上述方法的第二個實施例中，Notch受體蛋白是Notch2受體蛋白。在一個實施例中，Notch2受體蛋白是人類Notch2受體蛋白。在另一個實施例中，半衰期增加的部分是抗體的Fc部分。在另一個實施例中，抗體的Fc部分是人類抗體的Fc部分。在進一步的實施例中，胞外域和半衰期增加的部分在相同的多肽鏈內(nèi)。在上述方法的第三個實施例中，Notch受體蛋白是Notch3受體蛋白。在一個實施例中，Notch3受體蛋白是人類Notch3受體蛋白。在另一個實施例中，半衰期增加的部分是抗體的Fc部分。在另一個實施例中，抗體的Fc部分是人類抗體的Fc部分。在進一步的實施例中，胞外域和半衰期增加的部分在相同的多肽鏈內(nèi)。在上述方法的第四個實施例中，Notch受體蛋白是Notch4受體蛋白。在一個實施例中，Notch4受體蛋白是人類Notch4受體蛋白。在另一個實施例中，半衰期增加的部分是抗體的Fc部分。在另一個實施例中，抗體的Fc部分是人類抗體的Fc部分。在進一步的實施例中，胞外域和半衰期增加的部分在相同的多肽鏈內(nèi)。在上述方法的第五個實施例中，主體是哺乳動物。在一個實施例中，哺乳動物是人。在上述方法的第六個實施例中，血管生成是腫瘤血管生成。在第二種方法的進一步的實施例中，主體患有腫瘤。在另一個實施例中，主體患有病理性血管增生。在一個實施例中，病理性血管增生是良性血管瘤。在進一步的實施例中，主體患有淋巴血管增生性疾病。本發(fā)明提供了第一種組合物，它是由Notch4受體蛋白的胞外域可操作地連接到半衰期增加的部分組成。在一個實施例中，胞外域是通過共價鍵結(jié)合到半衰期增加的部分上的。在另一個實施例中，胞外域和半衰期增加的部分在相同的多肽鏈內(nèi)。本發(fā)明提供了第二種組合物，它包括由Notch4受體蛋白的胞外域可操作地連接到半衰期增加的部分的物質(zhì)和藥學上可接受的載體組成。本發(fā)明進一步提供了生產(chǎn)條款，包括(i)一種包裝材料，這種材料其中包含Notch受體蛋白的胞外域可操作地連接到一個半衰期增加的部分上的組合物和(ii)一個標簽，該標簽顯示了這種組合物是可通過抑制主體的血管生成用于治療患有腫瘤或其他疾病的主體。在上述條款的第一個實施例中，Notch受體蛋白是Notchl受體蛋白。在一個實施例中，Notchl受體蛋白是人類Notchl受體蛋白。在另一個實施例中，半衰期增加的部分是抗體的Fc部分。在另一個實施例中，抗體的Fc部分是人類抗體的Fc部分。在進一步的實施例中，胞外域和半衰期增加的部分在相同的多肽鏈內(nèi)。在上述條款的第二個實施例中，Notch受體蛋白是Notch2受體蛋白。在一個實施例中，Notch2受體蛋白是人類Notch2受體蛋白。在另一個實施例中，半衰期增加的部分是抗體的Fc部分。在另一個實施例中，抗體的Fc部分是人類抗體的Fc部分。在進一步的實施例中，胞外域和半衰期增加的部分在相同的多肽鏈內(nèi)。在上述條款的第三個實施例中，Notch受體蛋白是Notch3受體蛋白。在一個實施例中，Notch3受體蛋白是人類Notch3受體蛋白。在另一個實施例中，半衰期增加的部分是抗體的Fc部分。在另一個實施例中，抗體的Fc部分是人類抗體的Fc部分。在進一步的實施例中，胞外域和半衰期增加的部分在相同的多肽鏈內(nèi)。在上述條款的第四個實施例中，Notch受體蛋白是Notch4受體蛋白。在一個實施例中，Notch4受體蛋白是人類Notch4受體蛋白。在另一個實施例中，半衰期增加的部分是抗體的Fc部分。在另一個實施例中，抗體的Fc部分是人類抗體的Fc部分。在進一步的實施例中，胞外域和半衰期增加的部分在相同的多肽鏈內(nèi)。在上述條款的另一個實施例中，組合物混合了藥學上可接受的載體。在最后的實施例中，主體是人。本發(fā)明提供了一種編碼多肽的可復制的載體，該多肽包括Notch3受體蛋白胞外域可操作地連接到一個半衰期增加的部分上。在一個實施例里面，半衰期增加的部分是抗體的Fc部分。在另一個實施例里面，載體包括但不限于質(zhì)粒、黏粒、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、噬菌體或者YAC。本發(fā)明還提供一個宿主載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括一個可復制的載體，該載體編碼一個多肽，該多肽包括Notch受體蛋白的胞外域可操作地連接到一個半衰期增加的部分和一個合適的宿主細胞上。在一個實施例中，宿主細胞是真核細胞。在另一個實施例中，真核細胞是CHO細胞。在另一個實施例中，真核細胞是HeLa細胞。在進一步的實施例中，宿主細胞是一種細菌細胞。最后，本發(fā)明提供了第三種方法，這種方法是生產(chǎn)一種多肽，這種多肽包括增長一個宿主載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括一個可復制的載體，該載體編碼一個多肽，該多肽包括Notch受體蛋白的胞外域可操作地連接到一個半衰期增加的部分和一個合適的宿主細胞上，在允許生產(chǎn)該多肽的條件下進行，并再生所生產(chǎn)的多肽。在下述的詳細實驗部分將對本發(fā)明進行解釋說明。這部分是用于幫助理解本發(fā)明而不是、也不應該解釋為以任何方式對本發(fā)明作出限制，本發(fā)明的權(quán)利要求在詳細實驗部分的后面提出。詳細實驗第一部分實騎人類Notch3融合蛋白(Notch誘餌)Notch3誘餌的組裝是使用序列編碼一個信號肽，一個包含所有ECF樣的重復域的Notch3胞外域部分，以及人類Fc蛋白(1-237氨基酸)的一部分。圖32顯示了人類Notch3的完整的全長核苷酸序列。圖33顯示了人類Notch3的完整的全長氨基酸序列。利用的信號肽可以是原生Notch3信號肽或者人類Hc信號肽，兩者分別融合到一個Notch3域。信號肽允許Notch誘餌蛋白的分泌。使用的Notch3胞外域被設計成與Notch配體結(jié)合，并且由人類Notch3蛋白的34EGF樣重復域的全部或者子集組成。Fc標記(Fetag)融合到人類Notch3的給定的EGF樣重復片段的C端，以便Notch3誘餌蛋白的純化、監(jiān)測和穩(wěn)定。人類Notch3誘餌的總體設計，兩種配方，編碼為(1)信號肽，以便Notch3誘餌蛋白分泌到真核細胞的胞外媒介，用于產(chǎn)生蛋白；(2)全部人類Notch3的ER；樣重復片段的胞外域的一部分，以便與Notch配體關(guān)聯(lián)和(人類Fc蛋白的一部分，以便用于檢測。下面描述了人類Notch3誘餌的兩種配方，并在圖34中表示出來。l)h-Notch3(1-34)誘餌4)h-spHCNotch3(1_34)誘餌人類Notch3序列人類Notch3全長核苷酸(nt)序列，如圖32所示，起始于ATG(nt1)，以TGA(nt6964)結(jié)束。信號肽和第一個34EGF樣重復域在這個序列的nt1-4158得到體現(xiàn)。核苷酸1-4158用于設計人類Notch3誘餌蛋白，在接下來的部分有描述。包含EGF樣重復片段1_34的核苷酸有下劃線。人類Notch3全長氨基酸(aa)序列，如圖33所示，從aal(M為蛋氨酸)，到aa2555(K為賴氨酸)。信號肽和第一個34EGF樣重復域在這個序列的aa1-1386得到體現(xiàn)。氨基酸1-1386用于設計人類Notch3誘餌蛋白，在接下來的部分有描述。包含EGF樣重復片段1-34的氨基酸有下劃線。人類Fc序列用于在Notch3誘餌蛋白上產(chǎn)牛Fc標記圖35顯示了人類Fc的713核苷酸，被融合到Notch3誘餌構(gòu)建的3'端，剛好是Notch3EGF樣重復片段的下游。人類Fc區(qū)域便于Notch誘餌的檢測和純化，并用于穩(wěn)定分泌的人類Notch3-人類Fc融合蛋白。圖36顯示了人類Fc的237氨基酸，被融合到所有Notch誘餌構(gòu)建的C端，剛好是Notch3EGF樣重復片段的下游。人類Fc區(qū)域便于Notch誘餌的檢測和純化，并用于穩(wěn)定分泌的人類Notch3-人類Fc融合蛋白。信號肽用于Notch3誘餌蛋白兩個不同的信號肽序列被納入人Notchl誘餌蛋白的設計。第一個是人類Notch3itm，其預計將包含人類Notch3的氨基酸1-40。本測定是采用丹麥科技大學提供的信號IP3.0服務器程序進行的。第二個是人類Hc信號妝，其預計將句,含人IgG重鏈(HC)信號肽的氨基酸1-22。1.人類Notch3信號肽(ntl-20)MGPGARGRRRRRRPMSPPPPPPPVRALPLLLLLAGPGAA/A(SEQIDNO:27)圖37顯示了預測的人類Notch3信號肽的氨基酸序列。分析的預測結(jié)果是利用丹麥科技大學在線提供的信號IP3.0服務器得到的，如圖37所示。這些結(jié)果預測位于丙氨酸39(A39)和丙氨酸40(A40)之間的裂解的主要位點。這些裂解位點用“/”在人類Notch3的氨基酸序列1-40中標出，如上所示。2.人類Hc信號肽(aal-22)預測的人類Hc信號肽的氨基酸序列是MWGWKCLLFWAVLVTATLCTA/R(SEQIDNO:29)。預測的人類Hc信號肽的核苷酸序列是分析的預測結(jié)果是利用丹麥科技大學在線提供的信號IP3.0服務器得到的，如上所示。這些結(jié)果預測位于丙氨酸21(A21)和丙氨酸22(A22)之間的裂解的主要位點。這個裂解位點用“/”在人類Hc的氨基酸序列1-22中標出，如上所示。h-NotchS11^誘餌h-Notchl(1_34)誘餌表示包括Notch3的EGF樣重復片段1_；34的人類Notch3誘餌。圖41顯示了h-N0tch3a_34)誘餌蛋白的氨基酸序列。預測的人類Notch3信號肽有下劃線(AA1-40)。Notch3EGF重復片段1_；34被從aa41_1386編碼。Fc標記序列為下劃線并且斜體。圖40顯示了h_Notch3(1_34)誘餌蛋白的核苷酸序列。預測的人類Notch3信號肽有下劃線(ntl-120)。Notch3EGF重復片段1-；34被從ntl21-4158編碼。融合鏈接點，BglII位點為nt4158到4163。Fc標記序列為下劃線并且斜體。Ii-SPlisNotchI11zm誘餌h-spHcNotchl(1-34)誘餌表示包括EGF樣重復片段1_；34的人類Notch3誘餌。簡寫的spHe表示人類Hc信號肽。圖42顯示了h-Notch3(1_34)誘餌蛋白的氨基酸序列。預測的人類Hc信號肽有下劃線(AA1-22)。Notch3EGF重復片段1_；34被從aa22_1386編碼。Fc標記序列為下劃線并且斜體。圖43顯示了h-Notch3(1_34)誘餌蛋白的核苷酸序列。預測的人類Hc信號肽有下劃線(ntl-66)。Notch3EGF重復片段1-34被從nt67-4104編碼。融合鏈接點，BglII位點為nt4104到4109。Fc標記序列為下劃線并且斜體。Tffe人類Notch3誘餌的構(gòu)建來自于人主動脈平滑肌細胞(aorticsmoothmusclecells)(AoSMC)或過度表達Proxl的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(umbilicalvenousendothelialcells)(HUVEC)的總RNA被用于產(chǎn)生人類Notch3誘餌變種?？俁NA與M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和隨機引物或Notch3誘餌特異性引物反轉(zhuǎn)錄。合成的cDNA然后和Notch3誘餌特異性上游(正義)引物和下游(反義)引物擴增。Notch3誘餌由4個單獨的擴增子構(gòu)建而來。3-prime擴增子與下游引物一起擴增，該下游引物編碼BglII限制位點，在5-prime端連接在Fc序列的BglII位點，以便于產(chǎn)生一個人類Notch3/Fc嵌合體。在Notch3誘餌在核苷酸序列編碼EGF樣重復片段34后產(chǎn)生融合的情況下，BglII位點將被生成以創(chuàng)造融合位點，提供該融合序列(Notch3，圖37)。這適合于形成h-N0tch3a_34)誘餌和h-SpHGN0tch3a_34)誘餌。擴增的PCR產(chǎn)品被亞克隆到epBluescriptSKIIFe，以產(chǎn)生不同的人類Notch3/Fc嵌合體。人類Notch3/Fc誘餌序列然后被穿梭到哺乳動物表達載體(pAd-lox，pCCL或pcDNA3)以便于人類Notch3誘餌蛋白的表達和純化。第二部分實驗材料和方法質(zhì)粒構(gòu)建腺病毒構(gòu)建編碼LacZ，全長Notch4，或已如前所述的活化形式的Notch4/int3(Shawber等，2003)。一活化型的NotchlcDNA與6myc標記同框融合(Kopan等，1994)被克隆到腺病毒表達載體，pAd-lox。VEGF165和WE⑶Fc也都被克隆到pAd-lox。如前所述產(chǎn)生并滴定檢測了腺病毒家族(Hardy等，1997)。之前已描述，逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pHyTc編碼LacZ，Notch4/int3的活化形式，JLDlll和D114(Uyttendaele等，2000,Shawber等，2003，Das等，2004年已出版)。質(zhì)粒編碼Notchl的胞內(nèi)域(bp5479_7833，Genbank登錄號X57405)和D114胞外域(bpl_lM5，Genbank登錄號AF253468，由Chiron公司提供)與myc/His標記同框融合，被設計成為pHyTC。NotchIECD，Notch2ECD,Notch3ECD和Notch4ECD被設計到Fe，該Fc包含質(zhì)粒pCMX-sFRl-IgG，使用了Clin.Exp.Immunol.(1992)87(1):105-110中提出的方法，以創(chuàng)造基于Notch的融合蛋白，即NotchlECD/Fc，Notch2ECD/Fc，Notch3ECD/Fc和Notch4ECD/Fc。腺病毒基因轉(zhuǎn)移在腺病毒感染前，在第三通道的7.5XIO5的HUVEC細胞被接種于I型膠原蛋白涂層的6孔板上。在指示的感染復數(shù)下，腺病毒感染與Ad-lacZ，Ad-VEGF165或Ad-NlE⑶Fc一起感染，并且在隨機旋轉(zhuǎn)的板子上，在37°C下孵育1小時。熒光素酶報告分析為了測定配體誘導的Notch信號，采用HeLa和四3_衍生的Bosc細胞進行了共同培養(yǎng)實驗。通過磷酸鈣沉淀進行了瞬時轉(zhuǎn)染實驗。1天前以1.5XIO6接種于IOcm板上的Hela細胞與333ng的pBOSNotchl轉(zhuǎn)染，333ng的pGA981_6和83ngpLNCIacZ與666ng的pCMV-Fc或pHyTC-NlECDFc(333ngX1，666ngX2)轉(zhuǎn)染。1天前以4XIO6接種于IOcm板上的Bosc細胞與680ng的pHyiTc-Jaggedl，pHyTc-Dll1，pHyiTc-Dl14，或pHyiTc-X(空載體)進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染一天后，一式三份(HeLaBosc,12)，細胞在12孔板上共同培養(yǎng)M小時。轉(zhuǎn)染兩天后，收獲細胞并且采用增強的熒光素酶檢測試劑盒(BDPharMingen)進行熒光素酶活性測定，并采用乳光加強試劑盒(Galacto-LightPluskit)(ΡΕBiosysterns)測定半乳糖苷酶的活性。所有的實驗都是在Berthold復式噴射光度計下進行的。為了測定VEGF誘導的Notch信號，使用感染了腺病毒的HUVEC。1天前以8.OXIO5接種于6孔板上的HUVEC與Ad-LacZ作為對照或與Ad-VEGF在指示的感染復數(shù)下被感染，在存在或不存在Ad-NIECD/Fc的條件下。感染兩天后，被感染的HUVEC被重新接種于M孔板的1.5XIO5細胞，一式三份，并培育對小時，然后用轉(zhuǎn)染試劑Oliagen)與12.5ng的PRL-SV40(Promega)和137.5ng的pGA981_6進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后1天或者2天，收獲細胞，并且采用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)(!Iomega)檢測熒光素酶的活性。萌芽實騎為了制得膠原蛋白凝膠，豬I型膠原蛋白(Nitta明膠，東京，日本)冰冷溶液與10XRPMI1640培養(yǎng)基以及中和緩沖溶液以811的比例混合。400μ1膠原蛋白凝膠等份加入到M孔板并讓凝膠在37°C下放1小時。在腺病毒感染之后(上面)，收獲HUVEC并被接種在1.3XIO5細胞/孔膠原蛋白凝膠上面，在M孔板上在0.8ml的EGM2培養(yǎng)基中。種植48小時后HUVEC變得幾乎融合。播種后，在1周內(nèi)每兩天改變一次培養(yǎng)基。8天后，用安裝了顯微鏡的奧林巴斯數(shù)碼相機觀察萌芽并拍照。為了將萌芽的數(shù)量進行量化，每孔隨機選擇了5個場，兩個觀察者用盲法在顯微鏡下數(shù)萌芽的個數(shù)。結(jié)果與討論NOTCHECD/Fc融合蛋白作為Notch拮抗劑的功能Notch拮抗劑-NotchECD/Fc融合蛋白我們制得了若干Notch拮抗劑(圖幻。我們的策略是融合編碼序列到人或者鼠的Fc結(jié)構(gòu)域，所述的編碼序列是在胞外域(EOT)的NotchEGF重復片段的編碼序列。這個設計制得了沒有信號功能但保留了配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的分泌蛋白，因此它可以結(jié)合并抑制配體功能。我們把這些蛋白稱為“NotchECD/Fc”，并且制得了所有四個N0tchl-4ECD/Fc。Fc結(jié)構(gòu)域促進了采用免疫印跡法或者免疫組織化學法進行的親和純化和蛋白檢測。測定Notch抗體—個體外共培養(yǎng)系統(tǒng)(圖幻用于測定Notch途徑的轉(zhuǎn)錄活性，該體外共培養(yǎng)系統(tǒng)有表達于一個細胞的配體和活性標記在另一個細胞的Notch受體。我們利用這個共培養(yǎng)實驗來顯示NotchIE⑶/Fe對配體依賴的Notch信號起阻礙作用(圖4)。NlE⑶/Fe表達載體以不同的比率與全長Notchl和在Hela細胞中報告的CSL-熒光素酶共轉(zhuǎn)染，然后與表達293細胞的配體共培養(yǎng)。我們觀察到，Notch配體的Notchl信號的活化作用被WE⑶/Fe表達減弱。這種效應顯示出了濃度依賴性，NlE⑶/Fe與Notchl以21的比率時比11的比率時能更有效抑制信號。NotchlECD/Fc能由Jaggedl，Delta樣l(Delta-like1)或Delta樣4(Delta-like4)介導阻礙信號。表汰和純化Notch拮抗劑為了純化蛋白的目的，通過使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體我們制得了CHO和HeLa細胞系表達NotchECD/FCs。N1ECD/Fc被分泌(圖5)，見收集于HeLa-NotchECD/Fc系的條件培養(yǎng)基，并用蛋白-A(pA)瓊脂糖進行純化。pA純化樣品(Sup)和整個細胞溶解產(chǎn)物(Lys)都與α-Fc抗體一起進行免疫印跡，(圖5，Α)證明NlE⑶/Fe被分泌到培養(yǎng)基。NotchE⑶/Fe的腺病毒載體被用于感染HeLa細胞，并且來自于這些細胞的溶解產(chǎn)物都與α-Fc抗體一起進行免疫印跡，證明他們表達NotchE⑶/Fe(1，2，3，4)蛋白(圖5，Β)。我們目前正在用pA親和色譜法純化來自于CHO細胞條件培養(yǎng)基的NIECD/Fc。使用Notch融合蛋白定義血管牛成抑制Notch信號的活化作用可以誦過#用CBFl啟動子活件來檢測丨通過測量CBFl啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，可以測量Notch信號功能，CBFl啟動子是通過Notch-IC與CBFl的結(jié)合而被激活。我們在HUVEC中測定CBFl啟動子活性，該HUVEC與在不同的感染復數(shù)(MOI)下的腺病毒編碼的VEGF-165進行感染(圖6)。CBFl啟動子的誘導作用在Ad-VEGF感染的HUVEC中可以清楚檢測到，相對于Ad-LacZ-感染的細胞在MOI上的依賴行為。這個數(shù)據(jù)顯示VEGF的過度表達可以活化HUVEC中的Notch信號。因此，VEGF誘導了Notch信號的活性。我們想考察Notch融合蛋白是否會阻礙Notch信號的VEGF誘導的活化作用。Ad-Notch融合蛋白與Ad-VEGF的共同感染明顯的減小了由Ad-VEGF單獨感染誘導的CBFl啟動子活性的活化作用(圖7)。在每個腺病毒在感染復數(shù)為40的感染的情況下(圖7，A)，發(fā)現(xiàn)報告基因轉(zhuǎn)染后M小時時有60%的抑制，48小時時有90%的抑制，同樣Notch誘餌的抑制活性取決于基于Ad-Notch融合蛋白的感染復數(shù)。Notch融合蛋白阻礙由VEGF誘導的血管牛成萌芽的啟動在本實驗中，我們用HUVEC中過度表達的VEGF-165評估了Notch誘餌對萌芽(萌芽的啟動)誘導的影響。當Ad-VEGF感染的HUVEC在膠原蛋白凝膠中培養(yǎng)8天，在膠原蛋白凝膠中萌芽被誘導。過度表達VEGF的萌芽誘導作用被腺病毒編碼的Notch融合蛋白的共同感染明顯抑制(圖8)。Ad-Notch融合蛋白自身在形態(tài)上幾乎沒有影響。在圖9中我們采用顯微鏡對每場的萌芽進行了計數(shù)。Ad-VEGF感染進入HUVEC增加了萌芽數(shù)，取決于所采用的感染復數(shù)。Ad-VEGF誘導的萌芽被明顯抑制。這些數(shù)據(jù)表明，VEGF通過Notch信號的活化作用誘導了HUVEC的萌芽，并且Notch融合蛋白能抑制VEGF誘導的萌芽。第二部分實驗中引用的參考文獻1.Artavanis-Tsakonas,S.，K.Matsuno,andΜ.Ε.Fortini.1995.Notchsignaling.Science268:225-232.2.Bailey,A.M.，andJ.W.Posakony.1995.SuppressorofhairlessdirectlyactivatestranscriptionofenhancerofsplitcomplexgenesinresponsetoNotchreceptoractivity.Genes&Development9:2609-22.3.Bettenhausen,B.，M.HrabedeAngelis,D.Simon，J.L.Guenet,andA.Gossler.1995.TransientandrestrictedexpressionduringmouseembryogenesisofDII，amurinegenecloselyrelatedtoDrosophilaDelta.Development1212407-18.4.Blaumueller,CM.，H.Qi,P.Zagouras,andS.Artavanis-Tsakonas.1997.IntracellularcleavageofNotchleadstoaheterodimericreceptorontheplasmamembrane.Cell90:281-91.5.Caronti，B.，L.Calandriello，A.Francia，L.Scorretti，M.Manfredi，T.Sansolini，Ε.M.Pennisi，C.Calderarο，andG.Palladini.1998.Cerebralautosomaldominantarteriopathywithsubcorticalinfarctsandleucoencephalopathy(CADASIL).Neuropathologicalandinvitrostudiesofabnormalelastogenesis.ActaNeurolScand.98:259-67.6.Desmond，D.W.，J.T.Moroney,T.Lynch,S.Chan，S.S.Chin，D.C.Shungu,A.B.Naini，andJ.P.Mohr.1998.CADASILinaNorthAmericanfamily:clinical，pathologic，andradiologicfindings[seecomments].Neurology51:844-9.7.Dunwoodie，S.L.，D.Henrique，S.M.Harrison，andR.S.Beddintron.1997.MouseD113:anoveldivergentDeltagenewhichmaycomplementthefunctionofotherDeltahomologuesduringearlypatternformationinthemouseembryo.Development124:3065-76.8.Eastman，D.S.，R.Slee，E.Skoufοs,L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GF-HUVEC)中D14和Notch4mRNA都被上調(diào)，與腺病毒轉(zhuǎn)導的LacZHUVEC(Ad-LacZ-HUVEC)相比(圖22)。轉(zhuǎn)導的VEGF沒有誘導Jaggedl和Notchl表達。通過測量CSL熒光素酶報告活性，轉(zhuǎn)導的VEGF以劑量依賴的方式也激活了Notch信號(圖22B)，用Notch信號被反式激活(8)。與增殖相比，在更高劑量的Ad-VEGF條件下，Notch被激活(圖^A)。由于作為VEGFR激酶抑制劑的STO416降低了VEGF誘導的CSL-熒光素酶報告活性(圖22C)，通過受體激酶的活化作用，VEGF誘導了Notch信號。由于同時缺少橫跨膜域和細胞質(zhì)域的Notch突變體作為主導的對抗Notch信號的負面抑制劑起作用(9)，我們制備了基于Notch的融合蛋白或者誘餌(NIECDFc)以抑制Notch信號(圖22D)。Ad-NlECDFc轉(zhuǎn)導的HUVEC(Ad-mECDFc-HUVEC)條件培養(yǎng)基(conditionedmedium)的蛋白印跡實驗表明，NlECDFc被很好地表達和分泌(圖22E)。通過使用共同培養(yǎng)法，Bosc細胞表達Notch配體(Jl，Dll或D14)激活的Notch信號，該Notch信號在HeLa細胞中表達Notchl，相對于對照的Bosc細胞，利用NlECDFc表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，我們測定了Notch信號的抑制作用(圖22F)。然后，在HUVEC中，我們檢測了NlECDFc是否會被轉(zhuǎn)導的VEGF抑制Notch信號的活化作用(圖22G)。Ad-NlECDFc與Ad-VEGF共同轉(zhuǎn)導入HUVEC明顯降低了由VEGF誘導的CSL熒光素酶活性。Gerhardt等報道VEGF通過指導血管萌芽末端的絲狀偽足的擴展控制在出生早期視網(wǎng)膜的血管生成(10)。在血管生成的萌芽過程中，一個專門的內(nèi)皮細胞的形成使得絲狀偽足突起于靜態(tài)內(nèi)皮細胞，可能是早期的事件之一。這里我們指一個使絲狀偽足凸起為萌芽的單一內(nèi)皮細胞的形成。原始內(nèi)皮細胞的萌芽是被在纖維蛋白凝膠或者膠原蛋白凝膠中三維培養(yǎng)誘導的(11)。在Ad-VEGF-HUVEC在膠原蛋白凝膠用全部培養(yǎng)基培養(yǎng)的情況下，轉(zhuǎn)導的HUVEC使得絲狀偽足擴展到膠原蛋白凝膠中5天(圖22H)，在劑量依賴的形式下萌芽數(shù)量增加(圖27A)。由腺病毒編碼的活化形式的Notch4(Ad-Notch4/int3)的Notch信號的活化作用誘導HUVEC萌芽(12)，同時Notchl(Ad-NlIC)也誘導HUVEC萌芽(圖23A和27B)。既然VEGF和Notch信號都誘導HUVEC萌芽，我們測驗了NlE⑶Fc是否會抑制VEGF-誘導的HUVEC萌芽(圖22H-I)。通過Ad-NlECDFc的共同轉(zhuǎn)導，Ad-VEGF-HUVEC的萌芽被明顯抑制。Ad-LacZ或Ad-NlE⑶Fc轉(zhuǎn)導的HUVEC都沒有形成萌芽(圖22H)。NlE⑶Fc抑制了VEGF誘導的HUVEC萌芽而不影響細胞數(shù)量(圖221)。轉(zhuǎn)導的NlE⑶Fc沒有明顯改變HUVEC的增殖，同時Ad-NlIC轉(zhuǎn)導的HUVEC在劑量依賴的模式下被抑制(圖28A)，這與Notch信號對內(nèi)皮細胞增殖的抑制效果一致(13)。為了測試Notch信號是否是VEGF的下游，我們評估了三種不同的受體酪氨酸激酶抑制劑，包括在NlIC-誘導的HUVEC萌芽上的VEGFR，因為三個生長因子存在于完全培養(yǎng)基中。(圖23A-C)當濃度為1μm時，每個化合物都顯示出對每個激酶選擇性抑制(數(shù)據(jù)未給出)。PD166866和ZD1893都沒有影響Ad-NlIC-HUVEC的萌芽，但是SU5416明顯地抑制了Ad-NlIC-HUVEC的萌芽(圖23A-B)。STO416選擇性地抑制了Ad-NlIC-HUVEC的萌芽在低濃度時較少地降低其發(fā)育能力(圖23C)。由于Taylor等報道了Notch下調(diào)了Flkl/KDR/VEGFR2的表達(14),Notch與Flkl協(xié)作不太可能促進萌芽。因此，我們測試了Notch信號的活化作用是否影響了Fltl/VEGFRl在HUVEC的表達，因為STO416可抑制Fltl和Flkl激酶的活性(15)。RT-PCR分析證明=FltlmRNA的表達在Ad-NlIC-HUVEC中被上調(diào)，而內(nèi)皮細胞制造者⑶31mRNA的表達卻不能與在Ad-LacZ-HUVEC中的相比(圖23D)。蛋白質(zhì)印記分析也顯示Fltl蛋白的表達在Ad-NlIC-HUVEC被上調(diào)(圖23E)。因此，我們測試了PlGF是否促進了HUVEC萌芽，其中PlGF是Fltl的選擇性配體，在HUVEC中Fltl通過Notch信號的活化作用被上調(diào)(圖23F-G)。與沒有PlGF相比，PlGF增加了150%的Ad-NlIC-HUVEC萌芽(圖23F)。另外，PlGF增加了250%的包含多絲狀偽足的HUVEC萌芽(圖23G)。使用Fltl小分子干擾RNA(siRNA)的Fltl表達的減少抑制了Ad-NlIC-HUVEC萌芽(圖23J)，它的轉(zhuǎn)染選擇性的減少了FltlmRNA表達(圖23H)和Fltl蛋白的表達(圖231)。雖然用FlklsiRNA減少Flkl的表達也抑制Ad-NlIC-HUVEC的萌芽(圖30B)，但是FlklsiRNA的抑制效應少于FltlsiRNA(圖23J)。FlklsiRNA的效果，對于Ad-VEGF-HUVEC的萌芽影響比對Ad-NlIC-HUVEC的萌芽影響更大(圖30B-C)。與FltlsiRNA的轉(zhuǎn)染對Ad-NlIC和Ad-VEGF-HUVEC的萌芽都有相似程度的抑制(數(shù)據(jù)未給出)。一些研究表明，VEGF調(diào)節(jié)明膠酶在內(nèi)皮細胞中的活性，并且明膠酶類似于MMP-2和MMP-9的活性已經(jīng)確定地建立以用于誘導血管生成的萌芽(16)。我們測定了VEGF是否通過Notch信號在HUVEC中調(diào)節(jié)明膠酶的活性。在明膠酶譜法中，Ad-VEGF-HUVEC的條件培養(yǎng)基顯示了在第6天開始檢測的MMP9的誘導作用和活化作用(圖24A)，在第4天開始檢測的MMP2的活化作用(圖24B)，與Ad-LacZ-HUVEC形成對比。Ad-NlECDFc與Ad-VEGF的共同轉(zhuǎn)導顯示了抑制MMP9的誘導作用和活化作用(圖24A)和MMP2的活化作用(圖MB)。RT-PCR分析證明，MMP9mRNA的表達在Ad-NlIC-HUVEC中被上調(diào)，但是MMP2mRNA的表達在Ad-NlIC-HUVEC中被下調(diào)(圖MC)。由于MMP2活性的誘導在明膠酶譜法中不能檢測(圖MB)，這是一個可能的結(jié)果。在Ad-NlIC-HUVEC中，MTl-MMP的表達在轉(zhuǎn)錄本和蛋白水平都被上調(diào)(圖MD)，其中MTl-MMP能在細胞表面激活MMP2(17)。由于VEGF能調(diào)節(jié)明膠酶和MTl-MMP的表達(16)。RT-PCR分析證明，在Ad-VEGF-HUVEC中，MMP9和MT1-MMP都被上調(diào)，相對于Ad-LacZ-HUVEC，這個誘導被Ad-NlECDFc的共同轉(zhuǎn)導所抑制(圖ME)。Ad-NlECDFc單獨感染不會影響MMP9或MTl-MMP在感染了Ad-LacZ的HUVEC中的表達(數(shù)據(jù)未給出)。將MMPs用于血管生成萌芽已經(jīng)通過合成MMP抑制劑的方式建立(16)。GM6001是對抗MMPs的廣譜抑制劑，MMPs包括ΜΜΡ2、ΜΜΡ9ΠΜΤ1-ΜΜΡ(18)。GM6001明顯減少Ad-NlIC-HUVEC在膠原蛋白凝膠(圖31A-B)和纖維蛋白凝膠(數(shù)據(jù)未給出)中的萌芽。在鼠背部氣囊(DorsaAirSac)(DAS)實驗(19)中，過度表達VEGF121的293細胞Q93/VEGF)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染顯著誘導了體內(nèi)血管生成(圖25A，左圖)。該VEGF誘導的血管生成被WE⑶Fc的共同表達所抑制，相對于單獨^3/VEGF(圖25A)。測量了血管密度，并且在圖25B中給出了血管生成指數(shù)，顯示了^3/VEGF誘導的血管生成被⑶Fc的共同表達所抑制(圖25B)。此外，鼠背部氣囊實驗(DAS)(19)中，人類乳腺癌細胞系，MDA_MB_231，顯著誘導了體內(nèi)血管生成，根據(jù)推測可能是通過VEGF的分泌來實現(xiàn)的(圖25C，左圖)。這個VEGF誘導的血管生成明顯被WE⑶Fc的腺病毒調(diào)節(jié)表達所抑制，相對于腺病毒表達LacZ(圖25C)。測量了血管密度，并且在圖25D中給出了血管生成指數(shù)，顯示了MDA-MB-231誘導的血管生成被NlE⑶Fc的表達所抑制。Flkl對于血管生成是一個主要的積極信號轉(zhuǎn)導者，它通過在胚胎中的強大的酪氨酸激酶活性轉(zhuǎn)導，而Fltl被認為是對于血管生成來說是一個消極的信號轉(zhuǎn)導者。但是，在成年鼠中，F(xiàn)lt-I被證明是一個積極的角色，由于在缺乏細胞質(zhì)Flt-I激酶結(jié)構(gòu)域的小鼠身上，LLC過度表達P1GF2的體內(nèi)生長被嚴重地損害00)。Notch可能通過誘導Flt-I信號而改變VEGF信號和中和Flk-I信號起作用，要么誘導絲狀偽足擴展或者加強血管生成萌芽，由于PIGF/Flt-Ι信號改變了Flk-I的磷酸化位點，并加強缺血心肌的血管生成Ql)。有趣的是，Notch信號也上調(diào)了PlGF表達(圖四)。但是，Notch信號的連續(xù)激活抑制了多細胞含腔血管生成萌芽的形成，就像以前報道的那樣0幻。Notch信號在萌芽或者絲狀偽足形成后應該關(guān)閉，并且Notch途徑可能需要瞬時激活。在胰腺β細胞癌變的轉(zhuǎn)基因老鼠模型(RiplTag2鼠)，其腫瘤血管生成是VEGF依賴的，VEGF表達水平?jīng)]有增加，但是出現(xiàn)了儲存在基質(zhì)中的胞外VEGF到VEGF受體的移動。MMP-9引起了這個移動的發(fā)生，并且，在RiplTag23MMP-9-null雙轉(zhuǎn)基因小鼠身上，腫瘤生長被抑制。Notch上調(diào)MMP-9表達，并且可能增加血管生成萌芽位點局部的VEGF水平。Notch同時上調(diào)MTl-MMP表達，胞外MMP-2可能以Notch激活的內(nèi)皮細胞的細胞膜為靶點。Notch可能通過調(diào)節(jié)明膠酶活性和VEGF濃度來決定血管生成萌芽的位點。由于內(nèi)皮的MMP-9被肺特定轉(zhuǎn)移的Flt-I所調(diào)節(jié)00)，F(xiàn)lt-I可能間接參與了MMP-9的誘導。第三部分實驗中弓I用的參考文獻1.Artavanis-TsakonasS,RandMD,LakeRJ.NotchSignaling:CellFateControlandSignalIntegrationinDevelopment.Science1999；284(5415):770-776.2.ShawberCJ,J.K.Notchfunctioninthevasculature:insightsfromzebrafish,mouseandman.Bioessays.200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)節(jié)印hrinB2、VEGFR_3和Hey2的表達。·第五部分實騎
背景技術(shù)：
：要深入了解Notch在血管平衡中的作用，可以從人神經(jīng)血管疾病，伴有皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動脈病(CADASIL)談起。在大多數(shù)患者中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CADASIL與Notch3的錯義突變有關(guān)。CADASIL是一種遲發(fā)性的(平均發(fā)病年齡45歲)常染色體顯性遺傳疾病，它的特征有偏頭痛，經(jīng)常性中風，導致精神癥狀，逐漸認知衰退，癡呆和死亡(81)。這些神經(jīng)病理癥狀出現(xiàn)繼發(fā)于緩慢發(fā)展動脈病，與腦動脈和細動脈周圍的血管平滑肌細胞的解體和破壞有關(guān)。血管平滑肌細胞的退化與血管壁的厚度減少、細胞外基質(zhì)的損失和血管壁薄弱有關(guān)(82)。在血管平滑肌細胞，有Notch3的胞外域的積累和在細胞外基質(zhì)中，顆粒的異常沉積被稱為顆粒狀滲透材料(GOM)(83)。在這種疾病中，動脈病變并不僅限于大腦，還在皮膚和視網(wǎng)膜動脈發(fā)現(xiàn)(83_85)。CADASIL表型與Notch3在血管平滑肌細胞中的表達有關(guān)(7°’81)。假說認為，Notch3對保持血管平滑肌細胞與動脈內(nèi)皮細胞的相互作用或者聯(lián)系起著作用。最近的一項研究在轉(zhuǎn)基因的小鼠身上重新創(chuàng)造了CADASIL血管病理學說，這種小鼠在血管平滑肌細胞表達Notch3轉(zhuǎn)基因編碼CADASILR90C突變(86)。這些小鼠的脈管系統(tǒng)顯示了經(jīng)典的CADASIL動脈病，包括GOM沉積和Notch3累積。但是，這些特點通過停泊干擾和血管平滑肌細胞粘附到相鄰細胞并且血管平滑肌細胞退化而被預見。因此，CADASIL是因為降低血管平滑肌細胞的接觸和活力，另外GOM沉積和Notch3胞外域的累積是細胞退化的次生結(jié)果。與Notch3在細胞存活中的角色一致，在大鼠主動脈平滑肌細胞中的Notch3的組成型激活形式的表達導致cFlip誘導，cFlip是Fas依賴的凋亡的拮抗劑(87)。此外，Heyl在培養(yǎng)的血管平滑肌細胞的異位表達促進了細胞存活，通過Akt因此抑制凋亡響應血清饑餓和Fas配體(88)。總的來說，這些數(shù)據(jù)顯示，Notch3通過促進血管平滑肌細胞存活來維持動脈血管動態(tài)平衡。由于血管平滑肌細胞的死亡或血管平滑肌細胞未能傳達給鄰近血管內(nèi)皮細胞將可能引起動脈血管壁的泄漏。小鼠Notch3活性的破壞，可能有助于確定這一缺陷的性質(zhì)。CADASIL突變Notch3蛋白的特定活性目前仍然了解很少。一項解釋突變的Notch3功能的體外研究顯示，截去了細胞質(zhì)的Notch3能抑制或者激活CSL轉(zhuǎn)錄因子(89_9(1)。Notch信號在血管平滑肌細胞中的活化作用導致胚胎死亡Notch3在血管周圍細胞、平滑肌細胞和周細胞中表達和激活。平滑肌細胞對心血管功能非常重要，他們必須是健康的以便于防止中風。周細胞能有助于腫瘤血管生長。Notchl和Notch4被認為在這些細胞型中不起作用。因此這里描述的Notch3融合蛋白可能通過阻止不正常的Notch3活性從而有助于防止中風。此外，Notch3融合蛋白可能通過調(diào)節(jié)周細胞功能而被用于保持血管平滑肌細胞、抑制腫瘤周細胞的生長或其功能、或者影響視網(wǎng)膜血管生成。我們已經(jīng)構(gòu)建了一個轉(zhuǎn)基因的老鼠，該老鼠在組織中在延伸因子Ι-α啟動子(EFla)的控制下表達活化形式的Notchl(N1IC)，該組織表達Cre-重組酶，即EFlαN1IG/+(圖49)。EF1αN11…能養(yǎng)活并且繁殖能力強(圖50)。我們通過用SM22-Cre老鼠系(SM22Cre/+)跨過EFlαN1IC/+的方法在血管平滑肌細胞中表達miC。結(jié)果SM22gW+；EFlαN1IC/+雙轉(zhuǎn)基因的鼠在胚胎發(fā)育的9.5天死亡(圖50)。SM22&eA;EFlaN11…胚胎表現(xiàn)出了心肌缺陷，我們認為是胚胎死亡的原因。與這些心肌平滑肌細胞缺陷一致，在胚胎發(fā)育9.5天，SM22GW+;EFlaN11…轉(zhuǎn)基因動物中，我們觀測到了血管平滑肌細胞標記，α平滑肌細胞肌動蛋白的表達的改變(圖51)。這些結(jié)果證明，在血管平滑肌細胞中增加的Notch信號破壞了胚胎心臟血管發(fā)育。第五部分實驗中引用的參考文獻81.ViitanenM,KaIimoH.CADASIL:Hereditaryarteriopathyleadingtomultiplebraininfarctsanddementia.Ann.N.Y.Acad.Sci.2000；903:273-84.82.BrulinP,GodfraindC,LeteurtreΕ,RuchouxMM.MorphometricanalysisofultrastructuralvascularchangesinCADASILanalysisof50skinbiopsyspecimensandpathogenicimplications.Acta.Neuropathol.2002；104:241-8.83.UyamaΕ,TokunagaΜ,SuenagaA,KotoriiS,KamimuraK,TakahashiK,TabiraΤ,UchinoΜ.Argl33CysmutationofNotch.3intwounrelatedJapanesefamilieswithCADASIL.Intern.Med.2000；39(9):732-7.84.JoutelA,FavroleP,LabaugeP,ChabriatH,LescoatC,AndreuxF,DomengaV,CecillonM,VahediK,DucrosAandothers.SkinbiospyimmunostainingwithaNotch3monoclonalantibodyforCADASILdiagnosis.Lancet2001；358:2049-51.85.SmithBff,HenneberryJ,ConnollyT.SkinbiopsyfindingsinCADASIL.Neurology2002；59(6):961.86.RuchouxMM,DomengaV,BrulinP,MaciazekJ,LimolS,Tournier-LasserveE,JoutelA.TransgenicmiceexpressingmutantNotch3developvascularalterationscharacteristicofcerebralautosomaldominantarteriopathywithsubcorticalinfarctsandleuckoencephalopathy.Am.J.Path.2003；162(1):329-42.87.WangW,PrinceCZ,MouY,PollmanMJ.Notch3signalinginvascularsmoothmusclecellsinducesc-FLIPexpressionviaERK/MAPKactivation.JBiolChem2002；277(24):21723-9.88.WangW,PrinceCZ,HuX,PollmanMJ.HRTlmodulatesvascularsmoothmuscleeel!proliferationandapoptosis.BiochemBiophysResCommun2003；308(3)596-601.89.BeatusP,LundkvistJ,ObergC,LendahlU.TheNotch3intracellulardomainrepressesNotchl-mediatedactivationthroughHairy/Enhancerofsplit(HES)promoters.Development1999；126(17):3925-35.90.SaxenaMT,SchroeterEH,MummJS,KopanR.Murinenotchhomologs(Nl—4)undergopresenilin—dependentproteolysis.J.Biol.Chem.2001；276(43):40268-73.權(quán)利要求1.一種融合蛋白，所述融合蛋白包含一個信號肽；人類Notch3受體蛋白的胞外域的I-X表皮生長因子重復片段，其中X是12-34的任意整數(shù)；以及一個與之結(jié)合的抗體的Fc片段。2.一種融合蛋白，所述融合蛋白包含一個信號肽；人類Notch3受體蛋白的胞外域的I-X表皮生長因子重復片段，其中X是1-10的任意整數(shù)；以及一個與之結(jié)合的抗體的Fc片段。3.一種融合蛋白，所述融合蛋白包含一個信號肽；人類Notch3受體的胞外域的至少12個表皮生長因子重復片段；以及一個與之結(jié)合的抗體的Fc片段。4.一種融合蛋白，所述融合蛋白包含一個信號肽；人類Notch3受體蛋白的胞外域的表皮生長因子重復片段，其中至少存在12個重復片段；以及一個與之結(jié)合的抗體的Fc片段。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的融合蛋白，其特征在于所述抗體的Fc片段是人抗體的Fc片段。6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的融合蛋白，其特征在于所述信號肽是Notch3信號肽或IgG重鏈信號肽。7.根據(jù)權(quán)利要求1、3或4所述的融合蛋白，其特征在于=Notchl受體蛋白胞外域包括EGF樣重復片段1-.8.根據(jù)權(quán)利要求1、3或4所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包含連續(xù)氨基酸，其序列如SEQIDNO32所示。9.根據(jù)權(quán)利要求1、3或4所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包含連續(xù)氨基酸，其序列如SEQIDN0:33所示。10.根據(jù)權(quán)利要求1、3或4所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白由連續(xù)核苷酸編碼，連續(xù)核苷酸的序列如SEQIDN0:31所示。11.根據(jù)權(quán)利要求1、3或4所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白由連續(xù)核苷酸編碼，連續(xù)核苷酸的序列如SEQIDN0:34所示。12.—種治療患有腫瘤的主體的方法，其特征在于給主體采用有效劑量的權(quán)利要求1-11所述的融合蛋白以治療主體，從而治療患有腫瘤的主體。13.—種抑制主體血管生成的方法，其特征在于給主體采用有效劑量的權(quán)利要求1-11所述的融合蛋白以抑制主體血管生成。14.一種治療患有卵巢癌的主體的方法，其特征在于給主體采用有效劑量的權(quán)利要求1-11所述的融合蛋白以治療主體，從而治療患有卵巢癌的主體。15.一種治療代謝紊亂的主體的方法，其特征在于給主體采用有效劑量的權(quán)利要求1-11所述的融合蛋白以治療主體，從而治療代謝紊亂的主體。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于所述代謝紊亂包括糖尿病、肥胖、動脈硬化、缺血、中風或心血管疾病。17.權(quán)利要求1-11所述的融合蛋白在制備用于治療腫瘤的藥物組合物中的應用。18.權(quán)利要求1-11所述的融合蛋白在制備用于抑制血管生成的藥物組合物中的應用。19.一種抑制主體生理淋巴管生成或者病理淋巴管生成的方法，其特征在于給主體采用有效劑量的權(quán)利要求1-11所述的融合蛋白以抑制主體生理淋巴管生成或者病理淋巴管生成。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于所述病理淋巴管生成是腫瘤淋巴管生成或者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。21.—種抑制主體腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于給主體采用有效劑量的權(quán)利要求1-11所述的融合蛋白以抑制主體腫瘤轉(zhuǎn)移。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)移的發(fā)生是通過血管、淋巴脈管系統(tǒng)或者淋巴結(jié)。23.—種抑制主體繼發(fā)性腫瘤生長的方法，其特征在于給主體采用有效劑量的權(quán)利要求1-11所述的融合蛋白以抑制主體繼發(fā)性腫瘤生長。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于通過對與繼發(fā)性腫瘤有關(guān)的血管生成的抑制作用抑制繼發(fā)性腫瘤生長。25.—種抑制主體血管被腫瘤共擇的方法，其特征在于給主體采用有效劑量的權(quán)利要求1-11所述的融合蛋白以抑制主體血管被腫瘤共擇。26.一種治療患有癌癥的主體的方法，其特征在于給主體采用有效劑量的權(quán)利要求1-11所述的融合蛋白和有效劑量的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抑制劑以治療患有癌癥的主體。27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的方法，其特征在于所述的VEGF抑制劑是VEGF-A抑制劑、PGIF抑制劑、VEGF-B抑制劑、VEGF-C抑制劑或VEGF-D抑制劑。28.一種治療患有癌癥的主體的方法，其特征在于給主體采用有效劑量的權(quán)利要求1-11所述的融合蛋白和有效劑量的VEGF受體抑制劑以治療患有癌癥的主體。29.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其特征在于所述的VEGF受體抑制劑是VEGFR-I抑制劑、VEGFR-2抑制劑或VEGFR-2抑制劑。30.一種治療患有癌癥的主體的方法，其特征在于給主體采用有效劑量的權(quán)利要求1-11所述的融合蛋白和有效劑量的血小板衍生生長因子(PDGF)抑制劑以治療患有癌癥的主體。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于所述的血小板衍生生長因子抑制劑是PDGF-A抑制劑或PDGF-B抑制劑。32.—種治療患有癌癥的主體的方法，其特征在于給主體采用有效劑量的權(quán)利要求1-11所述的融合蛋白和有效劑量的PDGF受體拮抗劑以治療患有癌癥的主體。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于所述的PDGF受體拮抗劑是PDGF受體B拮抗劑。34.一種治療患有癌癥的主體的方法，其特征在于給主體采用有效劑量的權(quán)利要求1-11所述的融合蛋白和有效劑量的HER2/neU抑制劑以治療患有癌癥的主體。35.一種治療患有乳腺癌的主體的方法，其特征在于給主體采用有效劑量的權(quán)利要求1-11所述的融合蛋白以治療患有乳腺癌的主體。36.權(quán)利要求1-11所述的融合蛋白在制備用于治療乳腺癌的藥物組合物中的應用。全文摘要本發(fā)明提供一種融合蛋白，這種融合蛋白包含一個信號肽；人類Notch3受體蛋白的胞外域的1-X表皮生長因子重復片段，其中X是12-34的任意整數(shù)；以及一個與之結(jié)合的抗體的Fc片段。本發(fā)明還提供一種治療患有腫瘤的主體的方法；一種在主體內(nèi)抑制血管生成的方法；一種治療患有卵巢癌的主體的方法；以及一種治療主體代謝紊亂的方法，這些方法包括給予主體一定有效量的上述融合蛋白來治療主體。本發(fā)明進一步提供上述融合蛋白在制備用于治療腫瘤、抑制血管生成、治療卵巢癌以及治療代謝紊亂的藥物組合物中的應用。文檔編號A61K39/00GK102131520SQ200980133121公開日2011年7月20日申請日期2009年8月21日優(yōu)先權(quán)日2008年8月22日發(fā)明者卡麗·肖波爾,簡·基塔吉斯科申請人:紐約哥倫比亞大學理事會