專利名稱：抗高致病性豬生殖與呼吸綜合征(hp prrs)的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及抗傳染病的疫苗。更具體地，本發(fā)明涉及抵抗高致病性豬生殖與呼吸綜合征(Highly Pathogenic Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome, HP PRRS)的疫苗，所述HP PRRS是一種感染豬的病毒性疾病。
背景技術(shù)：
It^M^nf^^^ln (Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS) 被認(rèn)為是嚴(yán)重的豬疾病，特征在于懷孕母豬流產(chǎn)，或呼吸道窘迫(distress)，尤其見于吃奶的豬(sucking pigs)。該病毒性疾病首先是在1987年的美國被發(fā)現(xiàn)，隨后在歐洲發(fā)現(xiàn)，二十世紀(jì)九十年代早期在亞洲被鑒定。迄今，PRRS已在全球傳播，在養(yǎng)豬的國家引起地方性流行，每年造成巨大經(jīng)濟損失。PRRS的病因是豬生殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)， 其與小鼠的乳酸脫氫酶病毒(lactate dehydrogenase-elevating virus, LDEV)，馬動脈炎病毒(EAV)，以及猴出血熱病毒(simian hemorrhagic fever, SHFV)，都屬于套病毒目 (Nidovirales)白勺云力禾4* (Arteriviridae)。PRRSV是一種小的包膜病毒，有近15. 1-15. 5kb的單鏈正鏈RNA(+ssRNA)基因組，包含至少8個開放讀框(ORF)，編碼約20個公認(rèn)蛋白。該基因組還包含兩個非翻譯區(qū) (UTR)，位于5'-和3'-端。詳言之，ORFl (ORFla和ORFlb)位于5' -UTR下游，占據(jù)了整個基因組的三分之二還多。ORFla是直接翻譯，而ORFlb是通過核糖體進行的框架移動來翻譯，產(chǎn)生大的ORFlab聚蛋白，經(jīng)蛋白水解而形成與病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制機制有關(guān)的產(chǎn)物。 ORFs 2-7位于3' -UTR上游，編碼一系列與病毒體有關(guān)的病毒結(jié)構(gòu)蛋白，如包膜蛋白(E) 和核衣殼蛋白(N)。這些蛋白都從亞基因組(sgmRNA)的3'-同末端套式組合(coterminal nested set)來番羽譯。對來自全球不同地理區(qū)域的PRRSV分離物進行系統(tǒng)發(fā)生分析，結(jié)果清楚表明存在兩種主要基因型1型代表歐洲原型(Lelystad病毒，LV)，II型以北美株ATCC VR2332 (其基因組序列參見 GenBank 登錄號 AY150564)為原型(Murtaugh et al.，Arch Virol. 1995 ； 140 :1451-1460)。此外，一些研究顯示，0RF5以及非結(jié)構(gòu)蛋白2(NSP2)-編碼基因(nsp2) 可能代表PRRSV基因組中最具有遺傳可變性的區(qū)域。VR2332的NSP2序列參見SwissProt 登錄號Q9WJB2或SEQ ID NO :2。很多文獻也記載了，不同的PRRSV株在致病性方面差異很大。2006年，空前大規(guī)模地爆發(fā)了一種起源不明、帶有PRRS癥狀的所謂“高熱(high fever) ”疾病，它傳播了 10個以上的省，感染了超過2，000, 000頭豬，約400，000例是致命的病例。與傳統(tǒng)的PRRS不同，很多成年母豬也被這種“高熱”病感染。這種非典型的 PRRS大流行最初被認(rèn)為是豬霍亂樣疾病，表現(xiàn)出神經(jīng)學(xué)癥狀(如戰(zhàn)栗(shivering))，高熱 (40-42°C )，紅斑轉(zhuǎn)白疹(erythematousblanching rash)等。尸檢聯(lián)合免疫學(xué)分析清楚表明，多個器官受到高致病性PRRSV感染，觀察到嚴(yán)重的病理學(xué)改變(Tian et al. , PLoS ONE. 2007 ；2 (6) :e526)。對分離的病毒進行全基因組分析，結(jié)果顯示，這些PRRSV分離物歸屬于II型，且都與HB-1(PRRSV的中國株)高度同源(96.5%核苷酸同一性)，也與見143 高度同源(Yuan et al，2007 International PRRS Symposium,Chicago)。JX143 的基因組序列參見SEQ ID NO :1或EMBL/GenBank登錄號EU7087^。還發(fā)現(xiàn)，這些病毒分離物包含特有的分子標(biāo)記在非結(jié)構(gòu)蛋白2(NSP2)之中間斷有30個氨基酸的缺失(Tian et al. ,PLoS ONE. 2007 ；2 (6) :e526)。PRRS的“高熱疾病”形式現(xiàn)也稱“高致病性PRRS"或HP PRRS0已有多篇文獻描述了 PRRS病毒(PRRSV)的分離，以及含改良活(減毒)PRRSV或滅活 PRRSV 的抗 PRRS 疫苗的制備(W0 92/21375，W093/06211, W093/03760, WO 93/07898，WO 96/36356)。具體地，WO 93/03760披露了 PRRS病毒的分離、培養(yǎng)、減毒、以及制備相應(yīng)疫苗的方法，尤其是PRRS II型原型分離物ATCC VR-2332。WO 96/36356披露了上述分離物的一種特別有用的減毒后代，是通過在猴細胞中進行一系列傳代得到的，其已被保藏，保藏號為 ATCC VR-2495。還可以從 Boehringer Ingelheim 以商標(biāo)名Ingelvac PRRS MLV 購買一種改良活(MLV)疫苗產(chǎn)品。另一種基于II型分離物的MLV疫苗可以以商標(biāo)名Ingelvac PRRS ATP 買到。預(yù)防PRRS的合適策略是免疫接種。但是，目前尚不清楚是否免疫接種能有效抵抗 HP PRRS，以及可以采用何種形式的疫苗。發(fā)明描述本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，減毒的PRRS 11型病毒株可以用于對豬接種，保護豬免受與豬生殖與呼吸綜合征有關(guān)的高熱疾病形式的影響。對PRRS II型病毒減毒株的預(yù)防特征的鑒定使得能夠治療那些處在例如HP PRRS的高風(fēng)險之中的豬。這樣的免疫接種或治療可能有助于減少那些與2006年毀掉中國豬產(chǎn)業(yè)、并導(dǎo)致滅殺將近兩千萬頭豬的HP PRRS相似的其它HP PRRS爆發(fā)的概率或影響。本發(fā)明一個方面在此提供預(yù)防性保護豬免受高熱疾病影響的方法，包括對有相應(yīng)需要的豬施用含有效量PRRS II型病毒，優(yōu)選減毒PRRS II型病毒的致免疫組合物。所述組合物還可包含可藥用載體。所述組合物還可包含佐劑。所述方法可以作為預(yù)防或治療措施來使用。此外，給予有效量的所述致免疫組合物導(dǎo)致PRRS的高熱疾病形式的發(fā)生率減少， 或其臨床癥狀的嚴(yán)重程度減弱。還在此提供了對豬免疫接種以抵抗高熱疾病的方法，包對豬施用含有效量PRRS II型病毒的致免疫組合物，所述病毒優(yōu)選減毒的PRRS II型病毒。所述組合物還包含可藥用載體。所述組合物還包含佐劑。所述用有效量致免疫組合物進行的免疫接種優(yōu)選導(dǎo)致 PRRS的高熱疾病形式的發(fā)生率減少，或其臨床癥狀的嚴(yán)重程度減輕。所述高熱疾病可以是與豬生殖與呼吸綜合征有關(guān)的形式。豬生殖與呼吸綜合征可以是高致病性的(“HP PRRS”)。HP PRRS或高熱疾病形式可以在顯示以下一或多種臨床癥狀的豬中檢測到皮膚發(fā)紅(rubefaction)，出血點(blood spots)，瘀斑(petechiae)，紅斑轉(zhuǎn)白疹，和小膿包(Pimple)，常見于耳，口，鼻，背，和大腿內(nèi)側(cè)(inner thigh)。其它常見癥狀可包括高熱(超過40°C )，抑郁(d印ression)，厭食(anorexia)，咳嗽(cough)，哮喘 (asthma)，跛行(lameness)，戰(zhàn)栗，呼吸道疾病，和腹瀉(diarrhea)。HP PRRS 由 HP PRRS 病
毒弓I起。本發(fā)明另一方面在此提供了包括預(yù)防性保護豬免受HP PRRS感染的方法，包括對有相應(yīng)需要的豬施用含有效量PRRS II型病毒的致免疫組合物，所述病毒優(yōu)選減毒的PRRS II型病毒。于2002年在中國變得明朗的作為PRRS 2型基因型成員的HP PRRS病毒與所謂高熱疾病有關(guān)。HP PRRS病毒因此在中國數(shù)省變得突出，表明在受感染的豬群內(nèi)傳播時，相比于其它PRRS病毒而言有選擇優(yōu)勢。術(shù)語“HP PRRS病毒”是指，但不限于，具有與SEQ ID NO :1基本相同的核苷酸序列的PRRS病毒株。優(yōu)選地，HP PRRS病毒是具有與SEQ ID NO :1基本相同的核苷酸序列的 PRRS病毒株。與SEQ ID NO=I基本相同是指，PRRS病毒株的核苷酸序列優(yōu)選包含與SEQ ID NO :1有85%-100%相同的序列，優(yōu)選在HP PRRS病毒并非本文所述PRRS II型病毒的條件下，例如與作為參考病毒分離物的VR2332相比，ORF 5的核苷酸同源性低于91 %，優(yōu)選低于92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%。HP PRRS病毒株核苷酸序列優(yōu)選有超
80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, or 89% 與 SEQ ID N0:1 相同，同樣優(yōu)選在HP PRRS病毒并非本文所述PRRS II型病毒的條件下，例如與作為參考病毒分離物的VR2332相比，ORF 5的核苷酸同源性低于91%，優(yōu)選低于92%，93%，94%，95%，96%， 97%，98%或99%。還更優(yōu)選地，PRRS病毒株核苷酸序列有超過90%，91%，92%，93%， 94%，95%，96%，97%，98%或超過99%與SEQ ID NO :1相同，優(yōu)選在HP PRRS病毒并非本文所述PRRS II型病毒的條件下，例如與作為參考病毒分離物的VR2332相比，ORF 5的核苷酸同源性低于91%，優(yōu)選低于92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%。術(shù)語HP PRRS病毒還指任何在NSP2蛋白中具有指定修飾的PRRS病毒株。根據(jù)該定義，HP PRRS病毒株是編碼NSP2蛋白的PRRS病毒株，其中對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸位置482的亮氨酸缺失，而且它引起高熱臨床癥狀。或者，或除了 SEQ ID NO 2的氨基酸位置的亮氨酸缺失以外，對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸534-562的氨基酸可以從PRRS病毒編碼的NSP2蛋白中刪除。在此上下文中，SEQ ID NO 2也應(yīng)被理解為是一種舉例，術(shù)語NSP2 蛋白不應(yīng)限于SEQ ID NO :2所示的NSP2蛋白。根據(jù)以上教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易在具有與SEQ ID NO :2不同的NSP2蛋白序列、但具有相同修飾的PRRS病毒株中鑒別出任意相應(yīng)修飾，這意味著，缺失與SEQ IDNO 2的482位亮氨酸對應(yīng)的亮氨酸，和/或缺失與SEQ ID NO 2的氨基酸534-562對應(yīng)的氨基酸。此外，術(shù)語HP PRRS病毒還指，具有與SEQ ID NO 1(如上述定義)基本相同的核苷酸序列、且編碼NSP2蛋白的PRRS病毒株，其中與SEQ ID NO :2的氨基酸位置482的亮氨酸對應(yīng)的氨基酸，和/或與SEQ ID NO 2的氨基酸534-562對應(yīng)的氨基酸從PRRS病毒編碼的NSP2蛋白中刪除。此外，術(shù)語HP PRRS病毒還指，作為具有與SEQ ID NO :1基本相同核苷酸序列的 PRRS病毒株的HP PRRS病毒，在HP PRRS病毒并非本文所述PRRS II型病毒的條件下，例如與作為參考病毒分離物的VR2332(如上述)相比，ORF 5的核苷酸同源性低于91 %，優(yōu)選低于 92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99%，且編碼 NSP2 蛋白，其中與 SEQ ID NO 2
6的氨基酸位置482的亮氨酸對應(yīng)的氨基酸和/或與SEQ ID NO 2的氨基酸534-562對應(yīng)的氨基酸從PRRS病毒編碼的NSP2蛋白中刪除。此外，術(shù)語HP PRRS病毒還指，作為具有與SEQ ID NO :1基本相同核苷酸序列的 PRRS病毒株的HP PRRS病毒，優(yōu)選在HP PRRS病毒并非本文所述PRRS 2型病毒的條件下， 例如與作為參考病毒分離物的VR2332(如上述)相比，ORF 5的核苷酸同源性低于91 %，優(yōu)選低于92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%，且編碼NSP2蛋白，其中與對應(yīng)于氨基酸位置536-550或546-560或476-490的肽反應(yīng)的抗體顯示無反應(yīng)性。此外，以下PRRS病毒分離物已知是HP PRRS病毒株。因此，術(shù)語HPPRRS病毒株在本文中應(yīng)包括這些病毒株中的任一種，以及它們的后代=HPPRRS病毒株AH-I ；AHCFSH ； AHCFZC；BB07 ；BD-8 ；BQ07 ；CL07 ；CX07 ；CZ07 ；FY060915 ；FY080108 ；GC-2 ；GCH-3 ；GDl ； GD2 ；GD2007 ；GD3 ；GD4 ；GDSDl ；GDY卜2007 ；GDY2-2007 ；GDYFl ；GS2008 ；GXHZ12 ；GXHZ13 ； GXHZ14 ；GXHZ16 ；GXHZ19 ；GXHZ2 ；GXHZ21 ；GXHZ4 ；GXLZ5 ；GXLZ7 ；GY ；GZCJ ；GZDJ ；GZHffl ； GZHW2 ；GZHX ；GZJS ；GZKB ；GZKY ；GZLJl ；GZffB ；GZWM ；GZZB ；Hainan-I ；Hainan—2 ；HBl ；HB2 ； HB3 ；HB-Tshl ；HB-Xtl ；HEN46 ；HeN-KF ；HeN-LH ；HeN-LY ；HLJDF ；HLJMZl ；HLJMZ2 ；HLJMZ3 ； HLJZY ；HM-I ；HN2 ；HN2007 ；HN3 ；HNld ；HNly ；HNLYOl ；HNNXOl ；HNPJOl ；HNsp ；HNXTl ；HNyy ； HNyz ；HQ-5 ；HQ-6 ；HUB ；HuN ；HUNl ；HUNll ；HUN15 ；HUN16 ；HUN17 ；HUN2 ；HUN3 ；HUN4 ；HUN5 ； HUN6 ；HUN7 ；Hunan-I ；Hunan-2 ；Hunan-3 ；HUNH2 ；HUNH4 ；HuNhl ；HUNLl ；HUNX4；HZ061226 ； HZ070105 ；Jiangsu-I ；Jiangsu-2 ；Jiangsu-3 ； Jiangxi-2 ；Jiangxi-4；JLYS ； JN ； JXl ； JX143 ； JX2 ； JX-2 ；JX2006 ； JX3 ； JX4 ；JX5 ；JXAl ；KS06 ；LC07 ；LJ ；LS06 ；LS-4 ；LY07 ； NB070319 ；SC07 ；SD ；SD14 ；SDWF2 ；SHO2 ；ST-7 ；SX2007 ；SY0608 ；TJDMJ ；TJZHJ2 ；TJZHJ3 ； TQ ；TQ07 ；TW07 ；WF07 ；XJ07 ；XL2008 ；YN2008 ；YNBS ；YNDL ；YNMG ；YNWS ；YNYS ；YNYXl ；YNYX3 ； ZJ06 ；ZJCJ ；ZJffL ；ZX07 ；ZS070921。后代是指，但不限于，來源于上述任一種親代病毒、且與相應(yīng)的親本病毒株有超過 86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%, 97 %，98 %和99 %的核苷酸序列同一性的病毒。術(shù)語“PRRS II型病毒”是指，但不限于，與作為ATCC-VR2332保藏的病毒分離株或其任何后代基本相同的PRRS病毒株?；鞠嗤诒疚闹惺侵福幋a0RF5蛋白的核苷酸序列與作為ATCC-VR2332保藏的病毒分離株的核苷酸序列、即SEQ ID NO :3所示序列有85%-100%相同。0RF5核苷酸序列優(yōu)選與SEQ ID NO :3有超過86 %，87 %，88 %，或 89%相同。還更優(yōu)選地，0RF5核苷酸序列與SEQ ID NO :3有超過90%，91 %，92%，93%， 94%，95%，96%，97%，98%或超過99%相同。優(yōu)選地，本文所用PRRS II型病毒是，與作為ATCC-VR2332保藏的病毒分離株或其任何后代(如上述)基本相同、但在與SEQ ID NO 2之氨基酸534-562對應(yīng)的氨基酸的NSP2基因中不具有缺失的PRRS病毒株。PRRS病毒 ATCC-VR2332的完整序列可見于GenBank登錄號U87392。術(shù)語PRRS II型病毒還應(yīng)包括來源于上述任一種PRRS II型病毒株的任何減毒病毒。例如，術(shù)語PRRS II型病毒還應(yīng)包括作為ATCC-VR2495保藏的PRRS II型病毒。此外， 減毒的PRRS II型病毒可以是作為ATCC-VR2332保藏的病毒分離株的任何減毒后代。在一些優(yōu)選形式中，PRRS II型病毒和可藥用載體可以是Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. (St. Joseph,MO)的Ingelvac PRRS MLV 疫苗(系列號 JA-A64A-149)。術(shù)語PRRS II 型病毒還可包括已知為如下的分離物HB-1 ；BJ-4 ；CH-Ia ；CH-IR ；CH-1R01 ；HB-2 ；HNl ；HT06 ；HZO7 ；LS05 ；LY03 ；NH04 ；PL97-1 ；Sl ；SH061130 ；SX071226 ；TW07-1 ；WFO3 ；XXO3 ；ZJJ04 ； ZJJ05 ；ZJJ07，它們都是起源于中國的非-HP PRRS病毒株。本發(fā)明另一方面在此提供了包括預(yù)防豬感染HP PRRS的方法，包括對有該需要的豬施用含有效量PRRS II型病毒的致免疫組合物，所述病毒優(yōu)選減毒PRRS II型病毒，其中所述PRRS II型病毒是與作為ATCC-VR2332保藏的病毒分離株或其任何后代基本相同的PRRS病毒株。優(yōu)選地，PRRS II型病毒在與SEQ ID NO :2之氨基酸534-562對應(yīng)的氨基酸的NSP2基因中不具有缺失。還更優(yōu)選，PRRS II型病毒是作為ATCC-VR2495保藏的減毒 PRRSII 型病毒。此外，PRRS II 型病毒是Ingelvac PRRS MLV 疫苗(系列號 JA-A64A-149) 的病毒。PRRS II型病毒的有效量可以是該病毒在施用了有效劑量的該病毒的動物中激發(fā)或能夠激發(fā)免疫應(yīng)答的量。有效量可取決于疫苗的成分和給藥時間表。如果采用滅活病毒或改良活病毒制劑，可以推薦每劑含約102_°-109_ tlTCID5tl (組織培養(yǎng)感染劑量50%終點)，更優(yōu)選 103_°-104_°TCID5Q，還更優(yōu)選，約 104_°-108_tlTCID5tl 的疫苗量。本文所述PRRS II型病毒可以作為PRRS II型病毒的滅活的完整被殺滅病毒或減毒形式用于在豬中預(yù)防本文所述高熱疾病的影響。此外，亞單位，包括PRRS II型病毒的免疫原性片段或組分，也可用于于在豬中預(yù)防高熱疾病的影響。本文所述減毒PRRS II型病毒可以是，在可藥用載體中含一或多種活的上述病毒株的改良活疫苗(MLV)。此外，或或者，可以用滅活病毒制備上述被殺滅的疫苗(KV)。MLV 可以被配制為允許每劑給予IO1-IO7個病毒粒子，更優(yōu)選IO3-IO5個病毒粒子，還更優(yōu)選 IO4-IO5個病毒粒子。KV可以按照每劑IO3-IOiq, IO4-IO9, IO5-IO8,或IO6-IO7個病毒粒子的預(yù)滅活滴度來配制PRRS II型病毒，優(yōu)選減毒的PRRS II型病毒，可以在豬暴露于引起HPPRRS的 PRRS病毒株之前作為預(yù)防措施來施用，在豬暴露于引起HP PRRS的PRRS病毒株的同時施用，或在豬暴露于引起HP PRRS的PRRS病毒株之后作為治療措施來施用。目標(biāo)豬可以表現(xiàn)HP PRRS或上述高熱疾病形式的一或多種臨床癥狀或常見表現(xiàn)。目標(biāo)豬可以特別易感于與HP PRRS有關(guān)的高熱疾病。目標(biāo)豬可以特別易感于HP PRRS。目標(biāo)豬可以因免疫缺陷而易感于HP PRRS0目標(biāo)豬可以因飼養(yǎng)場地而易感于HP PRRS0易感的豬可以是在中國飼養(yǎng)的。易感的豬可以是在中國的諸如江西省、河北省或上海市飼養(yǎng)的。見Tian et al. ,PloS ONE. 2007 ；2 (6) :e526，其內(nèi)容引入本文做參考。減毒的PRRS II型病毒可以通過注射、吸入、或植入來給藥，特別優(yōu)選注射。根據(jù)免疫接種和治療所需持續(xù)時間以及效力，PRRS II 型病毒，優(yōu)選減毒PRRS II型病毒，可以施用一次或數(shù)次，也是間歇地，例如按每日施用的基礎(chǔ)施用數(shù)日、周、或月，并且是施用不同的劑量。這其中，優(yōu)選施用單一劑量。注射可以是在末梢靜脈或中央靜脈，以所需量進行，或者連續(xù)輸注。PRRSII型病毒，優(yōu)減毒PRRS II型病毒，可以口服、胃腸外給藥、皮下給藥、肌肉給藥、皮內(nèi)給藥、舌下給藥、透皮給藥、直腸給藥、 透粘膜給藥、局部吸入、口腔給藥(buccal administration)，或采用組合方式。PRRS II型病毒，優(yōu)選減毒PRRS II型病毒還可以作為植入物來給藥，其可以允許釋放減毒病毒。肌肉注射可以應(yīng)用0. 5-3mL，更優(yōu)選1-2. 5mL，還更優(yōu)選1. 5_2mL。最優(yōu)選肌肉注射2mL。皮內(nèi)注射可以應(yīng)用0. 05-lmL，更優(yōu)選0. 1-0. 8mL，還更優(yōu)選0. 1-0. 5mL，還更優(yōu)選0. 2-0. 4mL。最優(yōu)選皮內(nèi)注射0. 2mL。鼻內(nèi)應(yīng)用可以是0. 5-5mL，更優(yōu)選l-4mL，還更優(yōu)2-3mL PRRS II型病毒。最優(yōu)選鼻內(nèi)應(yīng)用3mL?？伤幱幂d體可包括溶劑、分散介質(zhì)、包衣、穩(wěn)定劑、稀釋劑、保存劑、抗細菌和抗真菌劑、等滲劑，吸收延遲劑，等等中的任一種或全部?！白魟痹诒疚闹锌砂溲趸X和磷酸鋁，皂苷(saponin)如Quil A， QS-21(Cambridge Biotech Inc. , Cambridge ΜΑ), GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals, Inc.，Birmingham, AL)，油包水乳劑，水包油乳劑，水包油包水乳劑。乳劑可尤其基于輕液體石蠟油(歐洲藥典(European Pharmacopea)類型)；因烯烴寡聚產(chǎn)生的類異戊二烯油 (isoprenoid oil)如角鯊?fù)?squalane)或角鯊烯油(squalene oil)，尤其異丁烯或葵烯； 酸或醇的含線性烷基的酯，更尤其植物油，油酸乙酯，丙二醇二 _(辛酸酯/葵酸酯)，甘油三_(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支鏈脂肪酸或醇的酯，尤其異硬脂酸酯。油與乳化劑組合使用以便形成乳劑。乳化劑優(yōu)選非離子表面活性劑，尤其山梨聚糖的酯、二縮甘露醇(marmide)的酯(例如無水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油 (polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、異硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羥基硬脂酸的酯，它們?nèi)芜x乙氧基化，還有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic產(chǎn)品，特別是 L121。參見 Hunter 等，The Theoryand Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tul1,D. E. S. ). Johnffileyand Sons,NY, pp51~94(1995)and Todd et al. ,Vaccine 15 :564-570(1997)。例如，可使用〃 Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach ", M-Powell和M. Newman編，Plenum Press, 1995的第147頁描述的SPT乳劑，以及該書第183 頁所述的MF59乳劑。另一例佐劑是從丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及順丁烯二酸酐和鏈烯基 (alkenyl)衍生物的共聚物選出的化合物。有利的佐劑化合物是交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是與糖(sugar)的聚鏈烯基醚或聚醇交聯(lián)。這些化合物已知被稱為卡波姆 (Phameuropa Vol. 8，No. 2，June 1996)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可參見美國專利2，909，462， 它描述了這類丙烯酸聚合物，其與聚羥基化的化合物交聯(lián)，所述化合物具有至少3個羥基，優(yōu)選不超過8個，其中至少3個羥基的氫原子被具有至少2個碳原子的不飽和脂烴基 (aliphaticradical)取代。優(yōu)選的基團是那些含有2_4個碳原子的基團，例如乙烯基，烯丙基，和其它烯屬不飽和基團(ethylenically unsaturated group)。所述不飽和基團自身可包含其它取代基，如甲基。這些產(chǎn)品以卡波普的名義出售；(BreOOdriCh，0hiO，USA)特別合適。它們與烯丙基蔗糖或與烯丙基季戊四醇(allylpentaerythritol)交聯(lián)。這其中，可提及卡波普974P，934P和971P。最優(yōu)選使用卡波普971P。在順丁烯二酸酐和鏈烯基衍生物的眾多共聚物中，順丁烯二酸酐與乙烯的共聚物EMA(Monsanto)也可以考慮。這些聚合物在水中溶解產(chǎn)生酸性溶液，經(jīng)中和，優(yōu)選中和至生理PH，以便產(chǎn)生佐劑溶液，能向其中摻入免疫原性、致免疫性或疫苗性組合物本身。其它合適的佐劑包括，但不限于，α -生育酚醋酸酯，RIBI佐劑系統(tǒng)(RibHnc.)， Block co-polymer (CytRx, Atlanta GA), SAF-M(Chiron, Emeryville CA)，單磷酰脂質(zhì) A(monophosphoryl lipid A) ,Avridine脂質(zhì)-胺佐劑，大腸桿菌不耐熱腸毒素(重組或其它)，霍亂毒素，IMS 1314或胞壁酰二肽，等等。優(yōu)選地，佐劑添加量為約100 μ g-約IOmg/劑。還更優(yōu)選地，佐劑添加量為約100 μ g"約IOmg/劑。還更優(yōu)選地，佐劑添加量為約500 μ g-約5mg/劑。還更優(yōu)選地，佐劑添加量為約750 μ g-約2. 5mg/劑。最優(yōu)選地，佐劑添加量為約Img/劑。本文還提供了制備減毒PRRS II型病毒的方法，所述病毒能治療或免疫目標(biāo)豬以抵抗HP PRRS0所述方法可包括一或多個下述步驟(a)將ATCC-VR2332或與ATCC-VR2332 基本相同的任何PRRS II型傳代，如下述，以修飾病毒，使病毒無毒力、且能免疫目標(biāo)豬以抵抗HP PRRS，(b)收獲產(chǎn)病毒的細胞或細胞培養(yǎng)物，(c)向該產(chǎn)病毒的培養(yǎng)物中添加穩(wěn)定劑；和/或(d)凍干所述產(chǎn)病毒的培養(yǎng)物。病毒傳代可以包括傳統(tǒng)的繁殖和選擇技術(shù)；例如，在穩(wěn)定的宿主細胞中持續(xù)繁殖以延伸減毒表型。傳代可以產(chǎn)生具有獲得性突變的病毒株，其中很多并不顯著改變親代株的特性。減毒PRRS II型病毒可以是，在宿主細胞中， 將ATCC-VR2332或與ATCC-VR2332基本相同的任何PRRS 11型傳代至少60，65，70，75，80， 或更多次后得到的。減毒的PRRSII型病毒可以是，在宿主細胞中，將ATCC-VR2332或與 ATCC-VR2332基本相同的任何PRRS II型傳代50-100次，60-90次，70-80次，或65-75次而得到的。減毒PRRS II型病毒可以是，在宿主細胞中，將ATCC-VR2332或與ATCC-VR2332 基本相同的任何PRRS II型傳代70或75次而得到的。合適的宿主細胞可包括猴(simian) 細胞系，Vero細胞，或豬肺泡巨噬細胞。優(yōu)選的猴細胞系是MA-104。宿主細胞可以是細胞培養(yǎng)物。細胞系可以用需要傳代的病毒感染。每次傳代可能需要將所得的被病毒感染的細胞系或細胞培養(yǎng)物在MO -40°C，更優(yōu)選35°C -39°C，還更優(yōu)選36°C _38°C，還更優(yōu)選 35°C _37°C溫育。最優(yōu)選，每次傳代可能需要將所得的被病毒感染的細胞系或細胞培養(yǎng)物在 37°C溫育。收獲步驟可以包括冷凍被病毒感染的細胞培養(yǎng)物。凍干可以包括，將被病毒感染的細胞培養(yǎng)物的凍存樣品抽除水分(subliming moisture) 0病毒修飾也可以用于產(chǎn)生減毒的PRRS II型病毒，可以通過用合適的基因工程技術(shù)直接突變該病毒株的核酸序列來實現(xiàn)。這樣的技術(shù)可以利用構(gòu)建病毒基因組的全長互補核酸拷貝的技術(shù)，所述拷貝可以用核酸重組和操作方法進行修飾。這樣的方法可以利用定點誘變技術(shù)。病毒蛋白的抗原性位點或酶特性因此被修飾。本文還提供了進行上述任一種方法的試劑盒。該試劑盒可包含容器，致免疫組合物(優(yōu)選含減毒PRRS II型病毒)，可藥用載體，佐劑，以及對有相應(yīng)需要的動物施用該致免疫組合物、以減少PRRS感染的發(fā)生率或減輕其臨床癥狀的嚴(yán)重程度的說明，和優(yōu)選地， PRRS的高熱疾病形式或HP-PRRS。該試劑盒還可包含注射工具和/或另一種給藥形式的用途。該試劑盒還可包含溶劑。減毒的疫苗可以凍干，并可以用該溶劑重建，得到注射溶液和/或吸入溶液。所述溶劑可以是水，生理鹽水，緩沖液，或輔助溶劑。所述試劑盒還可包含分開的多個容器，用于容納減毒病毒，溶劑，和/或可藥用載體。所述說明可以是傳單 (leaflet)和/或貼在一或多個容器上的標(biāo)簽。


圖1描述如何對肺進行評分，以及通過目測肺炎評估受感染區(qū)域所占百分比；圖2比較了接種組和未接種組的豬的直腸溫度；圖3比較了接種組和未接種組的豬的平均S/P比，其中，用平均組ELISAS/P比恒量各個組對PRRSV的血清學(xué)反應(yīng)；圖4比較了接種組和未接種組的豬的組平均臨床評分，其中，記錄了接種組和未接種組的豬的呼吸疾病評分；圖5比較了接種組和未接種組的豬的平均日增重(ADG)；和圖6概述了接種MLV的豬和未接種/受攻擊的豬中PRRSV RT-PCR陽性區(qū)域的百分比。發(fā)明詳述定義本文所用術(shù)語僅僅是為了描述具體的實施方式，不應(yīng)被理解為限制。如說明書和權(quán)利要求中所用，除非另有明確說明，單數(shù)形式“a，”，“and”和“the”包括復(fù)數(shù)含義。就本文引述的數(shù)值范圍而言，居間的每一個具有相同精確程度的中間數(shù)值都明確要考慮。例如，對于6-9這個范圍，除了 6和9以外，7和8也要考慮，對于6. 0-7.0這個范圍，數(shù)值 6. 0,6. 1,6. 2,6. 3,6. 4,6. 5,6. 6,6. 7,6. 8，6，9，和 7. 0 都要明確考慮?！皽p毒病毒”在本文中可以表示不引起PRRS病的臨床癥狀、但能在目標(biāo)哺乳動物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的無毒力病毒，還可以表示，被減毒PRRS病毒感染的動物與被非減毒的這種病毒感染、且未接受該減毒病毒的“對照組”動物相比，臨床癥狀的發(fā)生率減少或嚴(yán)重程度減輕。在該上下文中，術(shù)語“減少”表示，與上述對照組相比，減少至少10%，優(yōu)選25%，更優(yōu)選50 %，最優(yōu)選優(yōu)選超過100 %。“免疫原性片段”在本文中可表示，PRRS II型病毒的能在宿主中激發(fā)抗PRRSV免疫應(yīng)答(包括細胞免疫應(yīng)答和/或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答)的肽或多肽或核酸序列的一個部分?！跋嗤被颉巴恍浴痹诒疚闹忻枋鰞蓚€或更多個多肽或核苷酸序列時，可以表示， 這些序列在特定區(qū)域具有特定百分比的相同殘基或核苷酸。所述百分比可以如下計算優(yōu)化地比對這兩個序列，比較這兩個序列的所述特定區(qū)域，確定這兩個序列中出現(xiàn)相同殘基的位置的數(shù)量，以此得到匹配位置數(shù)，將該匹配位置數(shù)除以該特定區(qū)域的位置總數(shù)，將結(jié)果乘以100，得到序列同一性的百分比。當(dāng)這兩個序列長度不同，或比對時出現(xiàn)一或多個錯開的末端，以及所比較的該特定區(qū)域僅包括單個序列時，將單個序列的殘基包括在計算公式的分母而非分子中。PRRS分離株ATCC VR-2332于1992年7月7日按照布達佩斯條約的規(guī)定保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville, Maryland，保藏號為ATCCVR-2332。PRRS分離株ATCC VR-2495于1995年1月觀日按照布達佩斯條約的規(guī)定保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville, Maryland，保藏號為ATCCVR-M95。“致免疫組合物”或“疫苗”在本文中表示一種組合物，其包含PRRS II型病毒(MLV 或滅活病毒)或其任何免疫原性片段或組分，優(yōu)選減毒PRRS II型病毒，如hgelvac PRRS MLV或hgelvac PRRS ATP，其在宿主中激發(fā)“免疫應(yīng)答”，是抗PRRSV的細胞免疫應(yīng)答和/ 或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，該致免疫組合物能賦予保護性免疫力以抵抗PRRSV感染和與此相關(guān)的臨床癥狀?！凹ぐl(fā)免疫學(xué)應(yīng)答或免疫應(yīng)答”在本文中是指，針對致免疫組合物或疫苗的任何細胞免疫應(yīng)答和/或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，所述致免疫組合物或疫苗被施用給接受該致免疫組合物或疫苗的動物。通常，“免疫應(yīng)答"包括但不限于下列一或多種效應(yīng)產(chǎn)生或激活抗體，B細胞，T輔助細胞，T抑制細胞，和/或細胞毒T細胞和/或yd T細胞，它們特異性針對目標(biāo)組合物或疫苗中所含的一或多種抗原。優(yōu)選地，宿主表現(xiàn)出治療性或保護性免疫學(xué)應(yīng)答，從而與未接受所述致免疫組合物或疫苗的對照相比，增強對新感染的抵抗力，和/ 或減弱疾病的臨床嚴(yán)重程度。這樣的保護作用通過上述與宿主感染有關(guān)的癥狀的發(fā)生率減少、或嚴(yán)重程度減弱、或直至癥狀消失來證實?！氨Ｗo性免疫力”在本文中是指，一組動物對PRRS (優(yōu)選HP PRRS)感染的抵抗力與對照組動物相比增強，所述對照組動物被HP PRRS感染、但未接受含PRRS (優(yōu)選PRRS II 型)的致免疫組合物或疫苗。術(shù)語“抵抗力增強”在本文中是指，接受本發(fā)明致免疫組合物或疫苗的動物，與感染了 PRRS但未接受所述致免疫組合物或疫苗的一組動物相比，有不到10 %，優(yōu)選不到20 %，更優(yōu)選不到30 %，更優(yōu)選不到40 %，更優(yōu)選不到50 %，更優(yōu)選不到 75%，更優(yōu)選不到100%，出現(xiàn)一或多種與高熱(優(yōu)選本文所述HP PRRS所致高熱)有關(guān)的臨床癥狀。“基本互補"在本文中可以表示，第一個序列在有8，9，10，11，12，13，14，15，16， 17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100 個或更多個核苷酸的區(qū)域內(nèi)，至少 60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，97%，98%或 99 %與第二個序列的互補序列相同，或這兩個序列在嚴(yán)格雜交條件下雜交?！盎鞠嗤ㄔ诒疚闹锌梢员硎?，第一個序列和第二個序列，在有8，9，10，11， 12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80， 85，90，95，100個或更多個核苷酸或氨基酸的區(qū)域內(nèi)，有至少60%，65 %，70%，75 %，80%， 85 %，90 %，95 %，97 %，98 %或99 %相同，或者，在核酸的情況下，第一個序列與第二個序列的互補序列基本互補?！柏i(Swine) ”，“豬(pig) ”和“豬(piglet) ”在本文中可互換使用。“接種”是指，在暴露于PRRS的高熱疾病形式或HP-PRRS之前，施用本文所述致免疫組合物或疫苗?！氨Ｗo，，或“保護作用，，是指，因被施用本發(fā)明的致免疫組合物，使HP-PRRS感染或 PRRS的高熱疾病形式的臨床癥狀的嚴(yán)重程度減弱或發(fā)生率減少。嚴(yán)重程度的減弱或發(fā)生率的減少，是與一或多個未接受本發(fā)明致免疫組合物的動物相比。優(yōu)選實施方案以下實施例描述了本發(fā)明優(yōu)選的材料和方法。盡管與本文所述相似或等同的任何材料和方法都可以用于實施或檢驗本發(fā)明，這里描述的是優(yōu)選的方法，裝置，和材料。但是， 應(yīng)理解，這些實施例只是以舉例說明的形式提供，它們中的任何內(nèi)容都不應(yīng)被視為限制本發(fā)明的總體范圍。
實施例以下實施例舉例說明PRRSV分離物JX143的強毒力特性。接種Ingelvac PRRS MLV的豬與未接種的豬相比，在用強毒力PRRSV株攻擊后，100 %存活，抗體應(yīng)答水平顯著較高，臨床PRRS和病毒血癥比例較低，肺損傷較不嚴(yán)重，臨床癥狀較輕且持續(xù)時間較短，直腸溫度高的時間較短。1.材料和方法1. 1疫苗和病毒
Ingelvac PRRS MLV 疫苗(系列號 JA-A64A-149)來自 BoehringerIngelheim Vetmedica0強毒力PRRSV分離物JX143由上海獸醫(yī)研究所分離。PRRSV JX143組織培養(yǎng)物 (105. 2TCID50/ml)用DMEM稀釋5倍，以便對豬進行接種。1.2引物和試劑逆轉(zhuǎn)錄聚合酶和DNA 序列梯從 Tiangen biotechnology company 購買。2XPCR Mix 來自 Dongsheng company。Trizol 禾口弓I物來自 Invitrogencompany0表1. RT-PCR擴增所用的引物
權(quán)利要求
1.對豬進行接種以抵抗PRRS的高熱疾病形式的影響的方法，包括對豬施用含有效量 PRRS II型病毒的致免疫組合物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述PRRS的高熱疾病形式來自中國PRRSV，所述中國PRRSV 具有與HB-I或JX143的核酸序列至少95%同源的核酸序列。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述高熱疾病形式由HPPRRS病毒引起。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述PRRSII型病毒是減毒的。
5.權(quán)利要求3的方法，特征在于，所述PRRSII型病毒是保藏號為ATCCVR-2332的病毒株的減毒形式，或其后代。
6.權(quán)利要求4的方法，特征在于，所述PRRSII型病毒是保藏號為ATCCVR-M95的病毒株的減毒形式，或其后代。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述中國PRRSV株選自AH-1；AHCFSH ；AHCFZC ；BB07 BD-8 ；BQ07 ；CL07 ；CXO7 ；CZ07 ；FY060915 ；FY080108 ；GC-2 ；GCH-3 ；GDl ；GD2 ；GD2007 ；GD3 GD4 ；GDSDl ；GDY1-2007 ；GDY2-2007 ；GDYFl ；GS2008 ；GXHZ12 ；GXHZ13 ；GXHZ14 ；GXHZ16 GXHZ19 ；GXHZ2 ；GXHZ21 ；GXHZ4 ；GXLZ5 ；GXLZ7 ；GY ；GZCJ ；GZDJ ；GZHffl ；GZHW2 ；GZHX ；GZJS GZKB；GZKY ；GZLJl ；GZffB ；GZffM ；GZZB ；Hainan-I ；Hainan-2 ；HBl ；HB2 ；HB3 ；HB-Tshl HB-Xtl ；HEN46 ；HeN-KF ；HeN-LH ；HeN-LY ；HLJDF ；HLJMZl ；HLJMZ2 ；HLJMZ3 ；HLJZY ；HM-I HN2 ；HN2007 ；HN3 ；HNld ；HNly ；HNLYOl ；HNNXOl ；HNPJOl ；HNsp ；HNXTl ；HNyy ；HNyz ；HQ-5 HQ-6 ；HUB ；HuN ；HUNl ；HUNll ；HUNl 5 ；HUN16 ；HUN17 ；HUN2 ；HUN3 ；HUN4 ；HUN5 ；HUN6 ；HUN7 Hunan-I ；Hunan-2 ；Hunan-3 ；HUNH2 ；HUNH4 ；HuNhl ；HUNLl ；HUNX4 ；HZ061226 ；HZ070105 Jiangsu-I ；Jiangsu-2 ；Jiangsu-3 ；Jiangxi-2 ；Jiangxi-4 ；JLYS ；JN ；JXl ；JX143 ；JX2 JX-2 ；JX2006 ；JX3 ；JX4 JX5 ；JXAl ；KS06 ；LC07 ；LJ ；LS06 ；LS-4 ；LY07 ；NB070319 ；SC07 SD ；SD14 ；SDWF2 ；SH02 ；ST-7 ；SX2007 ；SY0608 ；TJDMJ ；TJZHJ2 ；TJZHJ3 ；TQ ；TQ07 ；Tff07 WFO7 ；XJ07 ；XL2008 ；YN2008 ；YNBS ；YNDL ；YNMG ；YNffS ；YNYS ；YNYXl ；YNYX3 ；ZJ06 ；ZJCJ ZJffL ；ZX07 ；和 ZS070921。
8.權(quán)利要求1-7之一的方法，其中所述組合物還包含佐劑。
9.對豬進行接種以抵抗PRRS病毒JX143的高熱疾病形式的影響的方法，包括對豬施用含有效量I3RRS II型病毒的致免疫組合物。
10.減少PRRS的高熱疾病形式的發(fā)病率或減輕其臨床癥狀的嚴(yán)重程度的方法，包括對需要該方法處理的豬施用含有效量PRRS II型病毒的致免疫組合物。
11.減少PRRS的高熱疾病形式的發(fā)病率或減輕其臨床癥狀的嚴(yán)重程度的方法，包括對需要該方法處理的豬施用含有效量PRRS II型病毒的致免疫組合物，其中所述PRRS的高熱疾病形式來自中國PRRSV，所述中國PRRSV具有與HB-I或JX143的核酸序列至少95 %同源的核酸序列。
12.PRRS II型病毒對豬進行接種以抵抗PRRS的高熱疾病形式的影響的用途，包括對豬施用含有效量PRRS II型病毒的致免疫組合物。
13.權(quán)利要求12的用途，其中所述PRRS的高熱疾病形式來自中國PRRSV，所述中國 PRRSV具有與HB-I或JX143的核酸序列至少95%同源的核酸序列。
14.PRRS II型病毒用于制備藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于對豬進行接種以抵抗PRRS的高熱疾病形式的影響，包括對豬施用含有效量PRRS II型病毒的致免疫組合物。
15.權(quán)利要求14的用途，其中所述PRRS的高熱疾病形式來自中國PRRSV，所述中國 PRRSV具有與HB-I或JX143的核酸序列至少95%同源的核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及方法和減毒病毒組合物，它們用于預(yù)防和治療與豬生殖與呼吸綜合征(PRRS)，如高致病性豬生殖與呼吸綜合征(HP PRRS)這種感染豬的疾病有關(guān)的高熱型疾病形式。
文檔編號A61K39/12GK102316895SQ200980133325
公開日2012年1月11日 申請日期2009年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月25日
發(fā)明者埃里克.沃恩, 邁克爾.B.魯夫 申請人:貝林格爾.英格海姆維特梅迪卡有限公司