專利名稱：環(huán)巴胺的分離的制作方法
環(huán)巴胺的分離相關(guān)申請本申請要求于2008年7月2日提交的美國臨時專利申請61/077，703的優(yōu)先權(quán)， 將其全文引入作為參考。背景二十世紀50年代中期，在愛達荷中部報告了重度畸形的單眼羔羊的出生。美國農(nóng) 業(yè)部和FDA，歷經(jīng)11年的研究，確定由懷孕的母羊在妊娠第14天母源攝入野生藜蘆(corn lily)加州藜蘆(Veratrum californicum)誘導了羔羊的這種獨眼型(cyclopian-type) 畸形。加州藜蘆生長在海拔高度為5，000-11，000英尺之間的美國西部的開闊的亞高山 草甸和山坡上。加州藜蘆中誘導獨眼型畸形的主要致畸化合物隨后被分離出來，并被鑒 定為11-去氧介芬胺，稱之為“環(huán)巴胺(cyclopamine) ”。環(huán)巴胺作為刺猬(hedgehog) (Hh)通路抑制劑，阻斷胚胎發(fā)育所必需的音猬(Sonic hedgehog)基因的功能(Cooper 等人，Science(1998)280 :1603-1607 ;Chen 等人，Genes andDevelopment(2002) 16 2743-2748 ；Incardona 等人，Dev. Biol. (2000) 224 :440 ；和 Chen 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2002)99 14071)。在加州藜蘆中可能存在的其它藜蘆生物堿包括但不限于 cycloposine、藜蘆胺、藜蘆新堿、介芬胺和muldamine。盡管環(huán)巴胺具有致畸性質(zhì)，但其為有效的抗癌劑。在使用環(huán)巴胺的研究中，研究者 已使最致命的人腫瘤停止生長，各種形式的最致命的人腫瘤導致了 25%的癌癥死亡。目前 正在研究將環(huán)巴胺和環(huán)巴胺類似物作為一些不同癌癥(例如基底細胞癌、髓母細胞瘤、橫 紋肌肉瘤、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤)的治療劑和作為多發(fā)性骨髓瘤的治療劑。數(shù)年前由Keeler 及其同事們(Keeler，Phytochemistry (1968) 7 :303-306)描述了 從加州藜蘆中分離環(huán)巴胺的方法，但該方法從千克量級的干燥植物材料中僅能得到毫克量 級的環(huán)巴胺。因此，繼續(xù)需要新的和改進的環(huán)巴胺分離方法。概述顯著量的藜蘆生物堿作為糖基化衍生物貯存在加州藜蘆中。本發(fā)明提供了新的去 糖基化方法，該方法設(shè)計用來優(yōu)化得自藜蘆屬植物材料和/或藜蘆屬植物材料的提取物的 去糖基化藜蘆生物堿的收率。例如，提供了從藜蘆屬植物材料中分離去糖基化藜蘆生物堿的方法，該方法包括 下列步驟(i)提供包含糖基化藜蘆生物堿的藜蘆屬植物材料；(ii)使藜蘆屬植物材料與水溶液接觸；和(iii)用溶劑提取藜蘆屬植物材料以提供包含去糖基化藜蘆生物堿的提取物。還提供了去糖基化方法，該方法包括使糖基化的藜蘆生物堿與酶在緩沖溶液中接 觸以提供去糖基化的藜蘆生物堿。附圖簡述

圖1描述了 cycloposine (CS)、環(huán)巴胺(CA)、藜蘆新堿(VS)和藜蘆胺(VA)的化學結(jié)構(gòu)。
圖2描述了在加州藜蘆的不同生物質(zhì)(biomass)樣品中存在的環(huán)巴胺的量(以g/ kg 計)。圖3描述了在加州藜蘆的不同生物質(zhì)樣品中存在的環(huán)巴胺(CA)和 cycloposine (CS)的量(以 g/kg 計)。圖4描述了通過液相色譜-質(zhì)譜法(LCMS)監(jiān)測，使用β -葡糖醛酸糖苷酶(蓋罩 大蝸牛(Helix pomatia))在醋酸鹽緩沖液(pH 5. 1)中純化的cycloposine經(jīng)由去糖基化 向環(huán)巴胺的酶轉(zhuǎn)化。圖5描述了比較使用β -葡糖醛酸糖苷酶(蓋罩大蝸牛)在醋酸鹽緩沖液(pH 5. 1)和Tris緩沖液(pH 7. 2)中將純化的cycloposine經(jīng)酶轉(zhuǎn)化成環(huán)巴胺的效率的HPLC 描跡圖。圖6描述了表明相應(yīng)于在用β -葡糖醛酸糖苷酶(蓋罩大蝸牛)處理的粗藜蘆屬 提取物中的cycloposine、藜蘆新堿、環(huán)巴胺和藜蘆胺的峰的LCMS描跡圖。圖7描述了酶濃度對cycloposine向環(huán)巴胺轉(zhuǎn)化的影響。圖8描述了當先用水處理，接著用MeOH提取時粗藜蘆屬提取物中糖基化生物堿的轉(zhuǎn)化。圖9描述了從各種生物質(zhì)樣品中cycloposine向環(huán)巴胺的轉(zhuǎn)化。圖10描述了當用MeOH或50% MeOH的水溶液處理和提取時粗藜蘆屬提取物中糖 基化生物堿的轉(zhuǎn)化。圖11比較在各種條件下處理生物質(zhì)的結(jié)果(i)用50% MeOH的水溶液處理，接著 如圖10中所述的那樣提??；(ii)用100% MeOH處理，接著如圖10中所述的那樣提??；和 (iii)用水處理，接著用MeOH提取，如圖8中所述。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了具有創(chuàng)造性的去糖基化方法，該方法設(shè)計用來優(yōu)化從藜蘆屬植物材 料和/或從藜蘆屬植物材料的提取物中得到去糖基化藜蘆生物堿的收率。水溶液預處理方法顯著量的藜蘆生物堿例如環(huán)巴胺和藜蘆胺作為它們各自的糖基化衍生物(例如 cycloposine和藜蘆新堿)存在于加州藜蘆中。通常認為在藜蘆屬植物中存在的一種或多 種內(nèi)源酶促進了這些藜蘆生物堿向它們的糖基化衍生物轉(zhuǎn)化或由它們的糖基化衍生物轉(zhuǎn) 化而成，其取決于植物的需要。已發(fā)現(xiàn)一旦在提取之前用水溶液處理采集的干燥藜蘆屬植物材料，糖基化藜蘆生 物堿的量降低，而經(jīng)提取，去糖基化藜蘆生物堿的分離收率升高。不希望受到任何理論的限 制，表明在水溶液處理期間，藜蘆屬植物材料中存在的一種或多種內(nèi)源酶促進了糖基化藜 蘆生物堿的去糖基化，因此增加了去糖基化藜蘆生物堿的觀察到的分離收率。因此，提供了一種從藜蘆屬植物材料中分離去糖基化藜蘆生物堿的方法，該方法 包括下列步驟(i)提供包含糖基化藜蘆生物堿的藜蘆屬植物材料；(ii)使藜蘆屬植物材料與水溶液接觸；和(iii)用溶劑提取藜蘆屬植物材料以提供包含去糖基化藜蘆生物堿的提取物。在某些實施方案中，糖基化藜蘆生物堿為cycloposine，去糖基化藜蘆生物堿為環(huán)
5巴胺。在某些實施方案中，藜蘆屬植物材料包含cycloposine和環(huán)巴胺的混合物。在某些實施方案中，糖基化藜蘆生物堿為藜蘆新堿，去糖基化藜蘆生物堿為藜蘆 胺。在某些實施方案中，藜蘆屬植物材料包含藜蘆新堿和藜蘆胺的混合物。在某些實施方案中，藜蘆屬植物材料包含cycloposine和藜蘆新堿的混合物。在某些實施方案中，藜蘆屬植物材料包含cycloposine、環(huán)巴胺、藜蘆新堿和藜蘆 胺的混合物。 本文所用的“藜蘆屬植物材料”是指采集的加州藜蘆植物，例如Veratrum californicum var. californicum，其可以任選被干燥并任選被磨成細粉。藜蘆屬植物 材料還可以包括采集的用于生產(chǎn)或含有一種或多種藜蘆生物堿而遺傳工程改造的植物 (例如，遺傳工程改造的用于生產(chǎn)高水平的一種或多種藜蘆生物堿(例如環(huán)巴胺和/或 cycloposine)的植物)。在某些實施方案中，水溶液的pH為約pH 9或低于約pH 9。在某些實施方案中，水 溶液的PH為約pH 8或低于約pH 8。在某些實施方案中，水溶液的pH為約pH 7. 5或低于 約PH 7.5。在某些實施方案中，水溶液的pH為約pH 7或低于約pH 7。在某些實施方案中，水溶液的pH在約4到約9之間(包含約4和約9)。在某些實 施方案中，水溶液的PH在約4到約8之間(包含約4和約8)。在某些實施方案中，水溶液 的PH在約5到約8之間(包含約5和約8)。在某些實施方案中，水溶液的pH在約5到約 7. 5之間(包含約5和約7. 5)。在某些實施方案中，水溶液的pH在約5到約7之間(包含 約5和約7)。在某些實施方案中，水溶液的pH在約5到約6之間(包含約5和約6)。在 某些實施方案中，水溶液的PH在約6到約7. 5之間(包含約6和約7. 5)。在某些實施方案中，水溶液為中性的(即，pH為約7)。在某些實施方案中，水溶液為酸性的(即，pH低于約7)。在某些實施方案中，水溶液不包含堿。在某些實施方案中，水溶液不包含無機堿。在某些實施方案中，水溶液不包含有機 堿。在某些實施方案中，水溶液不包含氫氧化銨或碳酸鈉。在某些實施方案中，水溶液 不包含氫氧化銨。在某些實施方案中，水溶液是被緩沖的。示例性的緩沖劑包括但不限于3_{[三 (羥基甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPS)、N，N-二(2-羥基乙基)甘氨酸(Bicine)、三(羥 基甲基)甲胺(Tris)、N-三(羥基甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、4-2_羥基乙基-1-哌嗪 乙磺酸(HEPEQ、2-{[三(羥基甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TEQ、3-(N-嗎啉代)丙磺酸 (M0PS)、哌嗪-N，N' -二 乙磺酸)(PIPES)、二甲胂酸(二甲基胂酸鹽)、2_ (N-嗎啉代) 乙磺酸(MES)、碳酸緩沖劑、磷酸鹽緩沖液(PBS)、醋酸鹽緩沖液，和其鹽。在某些實施方案 中，緩沖劑為醋酸鹽緩沖液。在某些實施方案中，緩沖劑為Tris緩沖液。在某些實施方案中，水溶液包含大于約1%、大于約5%、大于約10%、大于約 15%、大于約20%、大于約25%、大于約30%、大于約35%、大于約40%、大于約45%、大于 約50%、大于約60%、大于約65%、大于約70%、大于約75%、大于約80%、大于約85%、大于約90 %、大于約95 %、大于約98 %或大于約99 %的水。在某些實施方案中，水溶液包含約5%到約100% (包括約5%和約100% )的水。 在某些實施方案中，水溶液包含約10%到約100% (包括約10%和約100% )的水。在某 些實施方案中，水溶液包含約20%到約100% (包括約20%和約100% )的水。在某些實 施方案中，水溶液包含約30%到約100% (包括約30%和約100% )的水。在某些實施方 案中，水溶液包含約40%到約100% (包括約40%和約100% )的水。在某些實施方案中， 水溶液包含約50%到約100% (包括約50%和約100% )的水。在某些實施方案中，水溶 液包含約60%到約100% (包括約60%和約100% )的水。在某些實施方案中，水溶液包 含約70%到約100% (包括約70%和約100% )的水。在某些實施方案中，水溶液包含約 80%到約100% (包括約80%和約100% )的水。在某些實施方案中，水溶液包含約90% 到約100% (包括約90%和約100% )的水。在某些實施方案中，水溶液包括水和共溶劑的混合物。示例性的共溶劑包括有機 醇，例如甲醇、乙醇和異丙醇。在某些實施方案中，水溶液為水和甲醇的混合物。在某些實施方案中，水溶液包括約1 1卜/力、約1 2 (ν/ν)、約1 3 (ν/ν)、約 1 4 (ν/ν)、約 1 5 (ν/ν)、約 1 6 (ν/ν)、約 1 7 (ν/ν)、約 1 8 (ν/ν)、約 1 9 (ν/ν) 或約1 10 (ν/ν)的水和共溶劑的混合物。在某些實施方案中，水溶液包括約1 1卜/力、約1 2 (ν/ν)、約1 3 (ν/ν)、約 1 4 (ν/ν)、約 1 5 (ν/ν)、約 1 6 (ν/ν)、約 1 7 (ν/ν)、約 1 8 (ν/ν)、約 1 9 (ν/ν) 或約1 10 (ν/ν)的共溶劑和水的混合物。在某些實施方案中，水溶液為100%的水。在某些實施方案中，水溶液的總重量為藜蘆屬植物材料重量的至少約1. 5倍(w/ w)、至少約2倍(w/w)、至少約3倍(w/w)、至少約4倍(w/w)或至少約5倍(w/w)。在某些實施方案中，水溶液是在低于約10(TC、低于約90°C、低于約80°C、低于約 70 V、低于約60 V、低于約50 V、低于約40 V、低于約30 V、低于約觀°C、低于約25 °C、低于 約20°C、低于約15°C、低于約10°C或低于約5°C的溫度下。在某些實施方案中，水溶液是在約0°C到約100°C (包括約0°C和約100°C )的溫 度下。在某些實施方案中，水溶液是在約0°c到約90°C (包括約0°C和約90°C)的溫度下。 在某些實施方案中，水溶液是在約0°C到約80°C (包括約0°C和約80°C )的溫度下。在某 些實施方案中，水溶液是在約0°C到約70°C (包括約0°C和約70°C)的溫度下。在某些實 施方案中，水溶液是在約0°C到約60°C (包括約0°C和約60°C )的溫度下。在某些實施方 案中，水溶液是在約0°C到約50°C (包括約0°C和約50°C)的溫度下。在某些實施方案中， 水溶液是在約0°C到約40°C (包括約0°C和約40°C )的溫度下。在某些實施方案中，水溶 液是在約0°C到約30°C (包括約0°C和約30°C)的溫度下。在某些實施方案中，水溶液是 在約0°C到約25°C (包括約0°C和約25°C)的溫度下。在某些實施方案中，水溶液是在約 25°C到約75°C (包括約25°C和約75°C)的溫度下。在某些實施方案中，水溶液是在約30°C 到約60°C (包括約30°C和約60°C )的溫度下。在某些實施方案中，在所述的接觸步驟期間，糖基化藜蘆生物堿的量降低。在某些 實施方案中，在所述的接觸步驟期間，去糖基化藜蘆生物堿的量增加。在某些實施方案中， 在所述的接觸步驟期間，糖基化藜蘆生物堿的量降低，且去糖基化藜蘆生物堿的量增加。
在某些實施方案中，在所述的接觸步驟期間，糖基化藜蘆生物堿被植物材料中存 在的一種或多種內(nèi)源酶轉(zhuǎn)化成去糖基化藜蘆生物堿。在某些實施方案中，接觸步驟包括使藜蘆屬植物材料與水溶液接觸足以將植物材 料中存在的約10%的糖基化藜蘆生物堿轉(zhuǎn)化成去糖基化藜蘆生物堿的一段時間。在某些實 施方案中，接觸步驟包括使藜蘆屬植物材料與水溶液接觸足以將植物材料中存在的至少約 25%的糖基化藜蘆生物堿轉(zhuǎn)化成去糖基化藜蘆生物堿的一段時間。在某些實施方案中，接 觸步驟包括使藜蘆屬植物材料與水溶液接觸足以將植物材料中存在的至少約50%的糖基 化藜蘆生物堿轉(zhuǎn)化成去糖基化藜蘆生物堿的一段時間。在某些實施方案中，接觸步驟包括 使藜蘆屬植物材料與水溶液接觸足以將植物材料中存在的至少約75%的糖基化藜蘆生物 堿轉(zhuǎn)化成去糖基化藜蘆生物堿的一段時間。在某些實施方案中，接觸步驟包括使藜蘆屬植 物材料與水溶液接觸足以將植物材料中存在的至少約95%的糖基化藜蘆生物堿轉(zhuǎn)化成去 糖基化藜蘆生物堿的一段時間。在某些實施方案中，將植物材料中存在的所有糖基化藜蘆生物堿轉(zhuǎn)化成去糖基化 藜蘆生物堿。在某些實施方案中，接觸步驟包括使藜蘆屬植物材料與水溶液接觸至少5分鐘。 在某些實施方案中，接觸步驟包括使藜蘆屬植物材料與水溶液接觸至少10分鐘。在某些實 施方案中，使藜蘆屬植物材料與水溶液接觸至少30分鐘。在某些實施方案中，使藜蘆屬植 物材料與水溶液接觸至少45分鐘。在某些實施方案中，使藜蘆屬植物材料與水溶液接觸至 少1小時。在某些實施方案中，使藜蘆屬植物材料與水溶液接觸至少1.5小時。在某些實 施方案中，使藜蘆屬植物材料與水溶液接觸至少2小時。在某些實施方案中，接觸步驟包括使藜蘆屬植物材料與水溶液接觸約5分鐘到約 5小時，包括約5分鐘和約5小時。在某些實施方案中，接觸步驟包括使藜蘆屬植物材料與 水溶液接觸約5分鐘到約2小時，包括約5分鐘和約2小時。在某些實施方案中，接觸步驟 包括使藜蘆屬植物材料與水溶液接觸約5分鐘到約1小時，包括約5分鐘和約1小時。在某些實施方案中，接觸步驟包括在水溶液中攪動藜蘆屬植物材料。在某些實施 方案中，攪動步驟包括在水溶液中振搖或攪拌植物材料。在其它實施方案中，接觸步驟不包 括攪動。在某些實施方案中，所述方法還包括在提取藜蘆屬植物材料之前從水溶液中除去 藜蘆屬植物材料的步驟。在某些實施方案中，除去步驟包括過濾或離心。在某些實施方案中，在第一個接觸步驟之后但在提取步驟之前，所述方法還包括 使植物材料與堿性水溶液接觸。在某些實施方案中，提取步驟包括用溶劑提取藜蘆屬植物材料以提供包含去糖基 化藜蘆生物堿的提取物，其中溶劑包括任選與水和/或堿混合的一種或多種有機溶劑。在某些實施方案中，有機溶劑為有機醇、酯、酮、醚、鹵代烴、烴、芳香族或芳雜族溶 劑，或者其兩種或更多種的混合物。示例性有機醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、2-丁醇和正丁醇。示例性酯 包括但不限于乙酸乙酯和醋酸異丙酯。示例性酮包括但不限于丙酮和甲乙酮(MEK)。示例 性醚包括但不限于四氫呋喃(THF)、二氧六環(huán)和乙醚。示例性鹵代烴包括但不限于二氯甲 烷、二氯乙烷和氯仿。示例性烴包括但不限于己烷類、庚烷類和戊烷類。示例性芳香族溶劑包括但不限于苯、苯甲醚、甲苯和二甲苯類。在某些實施方案中，有機溶劑為有機醇。在某些實施方案中，有機溶劑為甲醇。在某些實施方案中，在提取步驟中使用的溶劑包括有機溶劑和水的混合物。在一 些實施方案中，在提取步驟中使用的溶劑包括甲醇和水的混合物。在某些實施方案中，在提取步驟中使用的溶劑包括約1 l(v/v)、約1 2(v/v)、 約 1 3 (ν/ν)、約 1 4 (ν/ν)、約 1 5 (ν/ν)、約 1 6 (ν/ν)、約 1 7 (ν/ν)、約 1 8 (ν/ 力、約1 9 (ν/ν)或約1 10 (ν/ν)的水和有機溶劑的混合物。在某些實施方案中，在提取步驟中使用的溶劑包括約1 1(ν/ν)、約1 2(ν/ν)、 約 1 3 (ν/ν)、約 1 4 (ν/ν)、約 1 5 (ν/ν)、約 1 6 (ν/ν)、約 1 7 (ν/ν)、約 1 8 (ν/ 力、約1 9 (ν/ν)或約1 10 (ν/ν)的有機溶劑和水的混合物。在某些實施方案中，在提取步驟中使用的溶劑包括有機溶劑和堿的混合物。在一 些實施方案中，堿為堿性水溶液。在其它實施方案中，堿為非含水的。在某些實施方案中，在有機溶劑中存在的堿小于約20% (ν/ν)、小于約15% (ν/ ν)、小于約10% (ν/ν)、小于約5% (ν/ν)或小于約(ν/ν) 0在某些實施方案中，在有機 溶劑中存在的堿在約到約20% (ν/ν)之間(包含約和約20% )；在約到約10% (ν/ν)之間(包括約和約10% )；在約到約10% (ν/ν)之間(包括約和約10% ) 或在約到約5% (ν/ν)之間(包括約和約5% )。示例性的堿包括有機堿和無機堿。示例性的無機堿包括但不限于氫氧化銨、氫氧 化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、醋酸鈉、枸櫞酸鈉、氫氧化鉀、碳酸鉀、碳酸氫鉀、酒石酸鉀鈉(又 名羅謝爾鹽)和氫氧化鋰的水溶液。示例性的有機堿包括但不限于三乙胺、二乙基異丙胺 和吡啶。在某些實施方案中，堿為碳酸鈉的水溶液。在某些實施方案中，堿為三乙胺。在某 些實施方案中，堿為氫氧化鈉的水溶液。在一些實施方案中，在提取步驟中使用的溶劑包括甲醇和碳酸鈉水溶液的混合 物。在其它實施方案中，在提取步驟中使用的溶劑包括甲醇和三乙胺的混合物。在又一實 施方案中，在提取步驟中使用的溶劑包括甲醇和氫氧化鈉水溶液的混合物。在某些實施方 案中，所述方法還包括在提取步驟后濃縮溶劑以提供包含去糖基化藜蘆生物堿的提取物的步驟。在某些實施方案中，所述方法還包括純化從提取物中分離的去糖基化藜蘆生物 堿。在某些實施方案中，純化步驟包括提供具有大于約85 %的純度的去糖基化藜蘆生物堿。 在某些實施方案中，純化步驟包括提供具有大于約90%的純度的去糖基化藜蘆生物堿。在 某些實施方案中，純化步驟包括提供具有大于約92%的純度的去糖基化藜蘆生物堿。在某 些實施方案中，純化步驟包括提供具有大于約95%的純度的去糖基化藜蘆生物堿?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的各種分析技術(shù)例如液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MQ和高壓液相 色譜法(HPLC)測定有機化合物的總體純度。用于有機化合物的鑒定和純度測定的其它方 法包括熔點、旋光度和核磁共振波譜法(Mffi)。在某些實施方案中，純化步驟包括色譜純化。在某些實施方案中，色譜純化包括硅 膠色譜純化。在某些實施方案中，純化步驟包括研磨。在某些實施方案中，純化步驟包括結(jié)晶。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供從藜蘆屬植物材料中分離環(huán)巴胺的方法，該方法 包括下列步驟(i)提供包含cycloposine的藜蘆屬植物材料；(ii)使藜蘆屬植物材料與水溶液接觸；和(iii)用溶劑提取藜蘆屬植物材料以提供包含環(huán)巴胺的提取物。在某些實施方案中，在所述的接觸步驟期間，cycloposine的量降低。在某些實施 方案中，在所述的接觸步驟期間，環(huán)巴胺的量增加。在某些實施方案中，在所述的接觸步驟 期間，cycloposine的量降低而環(huán)巴胺的量增加。在某些實施方案中，在所述的接觸步驟期間，cycloposine被植物材料中存在的一 種或多種內(nèi)源酶轉(zhuǎn)化成環(huán)巴胺。在某些實施方案中，水溶液的pH為約pH 8或低于約pH 8。在某些實施方案中，水 溶液的PH在約4至約8之間，包括約4和約8。在某些實施方案中，水溶液不含有堿。在某些實施方案中，水溶液不含有氫氧化銨 或碳酸鈉。在某些實施方案中，水溶液包含大于約25 %的水。在某些實施方案中，水溶液包含 約30%到約100% (包括30%和100% )的水。在一些實施方案中，水溶液包含100%的 水。在某些實施方案中，水溶液包括水和共溶劑的混合物。在某些實施方案中，共溶劑 為甲醇。在某些實施方案中，所述方法還包括在提取藜蘆屬植物材料之前從水溶液中除去 藜蘆屬植物材料的步驟。在某些實施方案中，在提取步驟中使用的溶劑包括任選與水和/或堿混合的一種 或多種有機溶劑。在某些實施方案中，有機溶劑為甲醇。在某些實施方案中，在提取步驟中 使用的溶劑包括甲醇與水混合的混合物。在某些實施方案中，在提取步驟中使用的溶劑包 括甲醇與堿性水溶液(例如，碳酸鈉水溶液或氫氧化鈉水溶液)混合的混合物。在其它實 施方案中，在提取步驟中使用的溶劑包括甲醇與有機堿(例如，三乙胺)混合的混合物。外源酶法本發(fā)明還提供了去糖基化方法，該方法包括使糖基化藜蘆生物堿和酶在緩沖溶液 中接觸以提供去糖基化藜蘆生物堿。在某些實施方案中，糖基化藜蘆生物堿為cycloposine，去糖基化藜蘆生物堿為環(huán) 巴胺。在某些實施方案中，糖基化藜蘆生物堿為藜蘆新堿，去糖基化藜蘆生物堿為藜蘆 胺。在某些實施方案中，酶為從真核細胞中衍生或分離的酶(即，真核衍生的酶)。在 其它實施方案中，酶為從原核細胞中衍生或分離的酶(即，原核衍生的酶)。在某些實施方案中，酶為β-葡糖醛酸糖苷酶。在某些實施方案中，β-葡糖醛酸 糖苷酶選自蓋罩大蝸牛β-葡糖醛酸糖苷酶、散大蝸牛(Helixaspersa) β-葡糖醛酸糖苷 酶、歐洲帽貝(Patella vulgata) β -葡糖醛酸糖苷酶、牛10型肝臟β -葡糖醛酸糖苷酶或 來源于杏仁的β-葡糖醛酸糖苷酶。在某些實施方案中，β-葡糖醛酸糖苷酶為蓋罩大蝸牛β-葡糖醛酸糖苷酶。在某些實施方案中，緩沖溶液的ρΗ為約ρΗ 9或低于約ρΗ 9。在某些實施方案中， 緩沖溶液的PH為約ρΗ 8或低于約ρΗ 8。在某些實施方案中，緩沖溶液的ρΗ為約ρΗ 7. 5 或低于約PH 7.5。在某些實施方案中，緩沖溶液的ρΗ為約ρΗ 7或低于約ρΗ 7。在某些實 施方案中，緩沖溶液的PH為約ρΗ 6或低于約ρΗ 6。在某些實施方案中，緩沖溶液的ρΗ為 約ρΗ 5. 5或低于約ρΗ 5.5。在某些實施方案中，緩沖溶液的ρΗ在約4到約9之間(包括約4和約9)。在某 些實施方案中，緩沖溶液的PH在約5到約8之間(包括約5和約8)。在某些實施方案中， 緩沖溶液的PH在約5到約7. 5之間(包括約5和約7.5)。在某些實施方案中，緩沖溶液 的ρΗ在約5到約5. 5之間(包括約5和約5. 5)。在某些實施方案中，緩沖溶液的ρΗ在約 7到約7. 5之間(包括約7和約7. 5)。示例性的緩沖劑包括但不限于3_{[三(羥基甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPS)、 N，N-二(2-羥基乙基)甘氨酸(Bicine)、三(羥基甲基)甲胺(Tris)、N_三(羥基甲基) 甲基甘氨酸(Tricine)、4-2_羥基乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2_{[三(羥基甲基)甲 基]氨基}乙磺酸(TES)、3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)、哌嗪-N，N' -二 乙磺酸) (PIPES)、二甲胂酸(二甲基胂酸鹽)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MEQ、碳酸緩沖劑、磷酸鹽緩 沖液(PBS)、醋酸鹽緩沖液，和其鹽。在某些實施方案中，緩沖劑為醋酸鹽緩沖液。在某些實 施方案中，緩沖劑為Tris緩沖液。在某些實施方案中，緩沖溶液的溫度為低于約100°C、低于約90°C、低于約80°C、 低于約70°C、低于約60°C、低于約50°C或低于約40°C。在某些實施方案中，緩沖溶液的溫度為約25°C到約75°C (包括約25°C和約 750C )。在某些實施方案中，緩沖溶液的溫度為約25°C到約50°C (包括約25°C和約50°C )。 在某些實施方案中，緩沖溶液的溫度為約25°C到約40°C (包括約25°C和約40°C)。在某些 實施方案中，緩沖溶液的溫度為37°C或約37°C。在某些實施方案中，接觸步驟包括使糖基化藜蘆生物堿與酶接觸一段時間，該時 間足以使約10%的糖基化藜蘆生物堿轉(zhuǎn)化成去糖基化藜蘆生物堿。在某些實施方案中，接 觸步驟包括使糖基化藜蘆生物堿與酶接觸一段時間，該時間足以使至少約25%的糖基化藜 蘆生物堿轉(zhuǎn)化成去糖基化藜蘆生物堿。在某些實施方案中，接觸步驟包括使糖基化藜蘆生 物堿與酶接觸一段時間，該時間足以使至少約50%的糖基化藜蘆生物堿轉(zhuǎn)化成去糖基化藜 蘆生物堿。在某些實施方案中，接觸步驟包括使糖基化藜蘆生物堿與酶接觸一段時間，該時 間足以使至少約75%的糖基化藜蘆生物堿轉(zhuǎn)化成去糖基化藜蘆生物堿。在某些實施方案 中，接觸步驟包括使糖基化藜蘆生物堿與酶接觸一段時間，該時間足以使至少約95%的糖 基化藜蘆生物堿轉(zhuǎn)化成去糖基化藜蘆生物堿。在某些實施方案中，接觸步驟包括使糖基化藜蘆生物堿與酶接觸一段時間，該時 間足以使所有的糖基化藜蘆生物堿轉(zhuǎn)化成去糖基化藜蘆生物堿。在某些實施方案中，接觸步驟包括使糖基化藜蘆生物堿與酶接觸至少30分鐘。在 某些實施方案中，接觸步驟包括使糖基化藜蘆生物堿與酶接觸至少1小時。在某些實施方 案中，接觸步驟包括使糖基化藜蘆生物堿與酶接觸至少2小時。在某些實施方案中，接觸步 驟包括使糖基化藜蘆生物堿與酶接觸至少5小時。在某些實施方案中，接觸步驟包括使糖基化藜蘆生物堿與酶接觸至少10小時。在某些實施方案中，接觸步驟包括使糖基化藜蘆生 物堿與酶接觸至少15小時。在某些實施方案中，本發(fā)明提供去糖基化方法，該方法包括使cycloposine和 β-葡糖醛酸糖苷酶真核衍生的酶在緩沖溶液中接觸以提供環(huán)巴胺。在某些實施方案中，酶為蓋罩大蝸牛β-葡糖醛酸糖苷酶真核衍生的酶。
實施例設(shè)計了一系列研究來研究cycloposine能否經(jīng)由酶去糖基化轉(zhuǎn)化成環(huán)巴胺。這些 研究表明不僅cycloposine能在粗提取混合物中被酶促轉(zhuǎn)化成環(huán)巴胺，而且藜蘆新堿還能 被轉(zhuǎn)化成藜蘆胺。使用各種來源的不同的酶來證明酶轉(zhuǎn)化。還發(fā)現(xiàn)cycloposine向環(huán)巴胺的轉(zhuǎn)化以及藜蘆新堿向藜蘆胺的轉(zhuǎn)化可能被提 取之前用水溶液對采集的藜蘆屬植物材料處理所影響。以前的外源酶研究支持這一假 說當在提取之前用水處理時，在藜蘆屬植物材料中存在的一種或多種內(nèi)源酶可能影響到 cycloposine向環(huán)巴胺和藜蘆新堿向藜蘆胺的轉(zhuǎn)化。如本文所討論的，溫度和pH研究進一 步支持了這一假說。下列實施例僅用于例證本發(fā)明的某些方面和實施方案的目的，并不用于限制本文 的公開內(nèi)容。A.采集生物質(zhì)通常在每年的8月-10月采集加州藜蘆。手工和/或使用農(nóng)業(yè)設(shè)備(在可用的時 候和地方)將植物材料從地里挖出來。通常，將根部球莖、籽粒(corn)和根狀莖從植物中 分離出來，并手工切成小碎片，并進一步干燥2-4周。然后將干燥的材料磨成細顆粒(即， 生物質(zhì))。細顆粒的含水量在7%-10%之間。各批次的粗生物質(zhì)含有不同量的環(huán)巴胺和 cycloposine (參見圖2和圖3)。在提取前將生物質(zhì)在約2°C _8°C下貯存在用聚丙烯作內(nèi) 襯的密封不透明袋中。B.分析方法一般 HPLC 方法=Waters Symmetry C18 柱，4. 6x150mm，5 μ m，(P/N WAT045905)；流 動相從 0 時的 20/80MeCN/0. 1 % TFA 到 12min 時的 35/65MeCN/0. 1 % TFA,接著重新平衡 5 分鐘；流速:1. 5mL/min ；進樣=IOyL ；檢測器:215nm ；溫度40°C。C.外源酶研究所有酶作為純化的分離物或粗提取物提供，且以溶液或作為在緩沖溶液中稀釋的 固體提供?；谟晒?yīng)商在包裝信息上提供的信息計算酶活性濃度。進行適當?shù)南♂寔磉_ 到想要的酶濃度。反應(yīng)通常在溫控加熱塊中孵育的Eppendorf管中、在緩沖溶液中在約37°C下進 行，反應(yīng)進行約22小時。示例性的緩沖劑提供在表1中。表權(quán)利要求
1.從藜蘆屬植物材料中分離去糖基化藜蘆生物堿的方法，該方法包括下列步驟 (i)提供包含糖基化藜蘆生物堿的藜蘆屬植物材料；( )使藜蘆屬植物材料與水溶液接觸；和(iii)用溶劑提取藜蘆屬植物材料以提供包含去糖基化藜蘆生物堿的提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中水溶液的PH為約8或低于約8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中水溶液的PH為約4至約8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中水溶液是被緩沖的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中水溶液為中性的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中水溶液為酸性的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中水溶液包含大于約25%的水。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中水溶液為100%的水。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中水溶液在低于約100°C的溫度下。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中糖基化藜蘆生物堿為cyloposine，且去糖基化藜 蘆生物堿為環(huán)巴胺。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中糖基化藜蘆生物堿為藜蘆新堿，且去糖基化藜蘆 生物堿為藜蘆胺。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中接觸步驟包括使植物材料與水溶液接觸一段時 間，該時間足以使至少約50%的糖基化藜蘆生物堿轉(zhuǎn)化成去糖基化藜蘆生物堿。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在所述的接觸步驟期間，糖基化藜蘆生物堿被 植物材料中存在的一種或多種內(nèi)源酶轉(zhuǎn)化成去糖基化藜蘆生物堿。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中接觸步驟包括使藜蘆屬植物材料與水溶液接觸 至少約10分鐘。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述溶劑包括一種或多種有機溶劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中有機溶劑選自有機醇、酯、醚、鹵代烴、烴、芳香 族和芳雜族溶劑以及其中兩種或更多種的混合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中有機溶劑選自甲醇、乙醇、異丙醇、2-丁醇、正丁 醇、丙酮、甲乙酮、乙酸乙酯、醋酸異丙酯、二氯甲烷、氯仿、苯甲醚、苯、甲苯、二甲苯類、己烷 類、庚烷類、四氫呋喃、二氧六環(huán)和乙醚，以及其中兩種或更多種的混合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中有機溶劑為甲醇。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述溶劑包括一種或多種有機溶劑和水的混合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中溶劑包括甲醇和水的混合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述溶劑包括一種或多種有機溶劑和堿的混合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中堿為堿性水溶液。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中堿性水溶液包括氫氧化銨、氫氧化鈉、碳酸鈉、 碳酸氫鈉、醋酸鈉、枸櫞酸鈉、氫氧化鉀、碳酸鉀、碳酸氫鉀、酒石酸鉀鈉或氫氧化鋰的水溶 液。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中堿性水溶液包括氫氧化鈉或碳酸鈉的水溶液。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中有機溶劑為甲醇。
26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中堿為有機堿。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中有機堿選自三乙胺、二乙基異丙胺和吡啶。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中有機溶劑為甲醇。
29.去糖基化方法，該方法包括使糖基化藜蘆生物堿與酶在緩沖溶液中接觸以提供去 糖基化藜蘆生物堿。
30.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其中糖基化藜蘆生物堿為cycloposine，且去糖基化 藜蘆生物堿為環(huán)巴胺。
31.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其中酶為真核衍生的酶。
32.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其中酶為葡糖醛酸糖苷酶。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中葡糖醛酸糖苷酶為蓋罩大蝸牛葡糖醛 酸糖苷酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了去糖基化方法，該方法設(shè)計用來優(yōu)化從藜蘆屬植物材料和/或從藜蘆屬植物材料的提取物中得到的藜蘆生物堿的收率。
文檔編號A61P35/00GK102137679SQ200980133777
公開日2011年7月27日 申請日期2009年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月2日
發(fā)明者D·A·曼, G·S·賈亞蒂拉克, S·L·里什海默 申請人:英菲尼蒂制藥公司