專利名稱：包含彈性蛋白樣肽的治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請公開了包含彈性蛋白樣肽的治療劑，并與國際申請日為2007年9月6日的 PCT/US2007/077767(2008年3月13日以WO 2008/030968公布)有關(guān)。本申請還與國際 申請日為 2006 年 12 月 20 日的 PCT/US2006/048572 (2007 年 6 月沘以 WO 2007/073486 公 布)有關(guān)。W02008/030968和WO 2007/073486通過引用其整體結(jié)合到本文中。電子提交文本文件的描述電子提交文本文件的內(nèi)容通過引用其整體結(jié)合到本文中序列表的計(jì)算機(jī)可讀格 式副本(文件名PHAS_010_01US_kqList_ST25. txt，錄入日期2009年6月洸日，文件大 小 50kb)。
背景技術(shù)：
天然狀態(tài)或重組產(chǎn)生的治療性蛋白質(zhì)或肽可能是不穩(wěn)定分子，特別是在機(jī)體內(nèi)具 有短周期的血清穩(wěn)定性、血清半壽期(即循環(huán)半壽期)或有限的持久性。在配制時這類分 子還可能極不穩(wěn)定，例如在水溶液中配制時。在某些情況下，聚乙二醇(PEG)與蛋白質(zhì)性分子綴合產(chǎn)生療效較久、活性持續(xù)的 分子。然而，PEG連接常?？纱蟠蠼档蜕踔疗茐牡鞍踪|(zhì)的治療活性。治療性蛋白質(zhì)和/ 或肽還通過與能夠延長血清半壽期的某些蛋白質(zhì)融合而得以穩(wěn)定。例如在某些情況下， 與非融合狀態(tài)的治療性蛋白質(zhì)相比，與白蛋白、運(yùn)鐵蛋白和抗體片段融合的治療性蛋白 質(zhì)的血清半壽期延長。參見美國專利號7，238，667(尤其是白蛋白綴合物)、美國專利號 7，176，278 (尤其是運(yùn)鐵蛋白綴合物)和美國專利號5，766，883，所述專利均通過引用其整 體結(jié)合到本文中。本領(lǐng)域仍需要更穩(wěn)定、更長作用時間和/或有效的蛋白質(zhì)分子。發(fā)明概述本發(fā)明提供包含彈性蛋白樣肽(ELP)成分和治療性蛋白質(zhì)性成分的治療劑。ELP 成分含有結(jié)構(gòu)性肽單元，其可以是重復(fù)單元，其在結(jié)構(gòu)上與彈性蛋白序列有關(guān)或來源于彈 性蛋白序列。這類ELP成分為治療劑提供某些治療優(yōu)勢，例如治療性蛋白質(zhì)性成分的相對 更好的穩(wěn)定性、溶解度、生物利用度、半壽期、持久性和/或生物作用。例如可與治療成分的 未融合或未綴合對應(yīng)物比較來確定這類性質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，ELP成分可進(jìn)行可逆的 逆相變，其可提供其它實(shí)用優(yōu)勢和/或治療優(yōu)勢。本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明的治療劑的多 核苷酸，以及治療或預(yù)防某些生物學(xué)病癥的方法。第一方面，本發(fā)明提供包含彈性蛋白樣肽(ELP)成分和治療性蛋白質(zhì)性成分的治 療劑，以及含有所述治療劑的用于遞送給有需要的受治療者或患者的藥物組合物。治療成 分可選自表1所列的治療性蛋白質(zhì)的活性部分或其功能類似物。在某些實(shí)施方案中，治療成分是GLP-I受體激動劑，例如GLP-1、毒蜥外泌肽-4或其功能類似物。一般來說，這類治 療成分包括但不限于以葡萄糖依賴性方式有效用于增加胰腺的胰島素分泌。在其它實(shí)施方 案中，治療成分是胰島素或其功能類似物，其一般有效用于促進(jìn)從血液中攝取葡萄糖并貯 存在細(xì)胞內(nèi)。在另一些實(shí)施方案中，治療成分是因子Vll/VIIa或其功能類似物，其一般通 過激活因子X或因子IX而有效促進(jìn)凝血。ELP和治療成分可以通過不同方法共價(jià)偶聯(lián)，包括化學(xué)偶聯(lián)(例如接合/綴合)和 重組融合技術(shù)。此外，每分子ELP或治療成分的數(shù)目及其在分子內(nèi)相應(yīng)的位置都可按需要 改變。治療劑還可包括一個或多個間隔基或接頭部分，其除了提供所需要的ELP與治療成 分的功能獨(dú)立性以外，還可任選提供其它的功能性，例如蛋白酶敏感特征，從而提供蛋白酶 水解性釋放或激活的治療成分。治療劑還可包括一個或多個尋靶成分，例如使治療劑靶向 特定細(xì)胞類型(例如癌細(xì)胞)或特定器官的肽或蛋白質(zhì)。第二方面，本發(fā)明提供多核苷酸，這類多核苷酸包含編碼本發(fā)明的治療劑的核苷 酸序列。例如核苷酸序列編碼具有表1所列的至少一種治療性蛋白質(zhì)的功能部分(或其功 能類似物)的ELP融合物。在某些實(shí)施方案中，治療成分是GLP-I受體激動劑(包括GLP-I 和毒蜥外泌肽-4)、胰島素、因子Vll/VIIa或其功能類似物。這類多核苷酸還可包含與核苷 酸序列有效連接的其它調(diào)控元件，例如啟動子元件和/或其它轉(zhuǎn)錄或表達(dá)相關(guān)信號。可將 多核苷酸插入各種載體中，載體可用于在宿主細(xì)胞(包括例如細(xì)菌和真核宿主細(xì)胞)中產(chǎn) 生治療劑。第三方面，本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防患者(例如哺乳動物患者，包括人類患者) 的疾病、障礙或病癥的方法。所述方法包括將有效量的本發(fā)明的治療劑(或含有本發(fā)明治 療劑的藥物組合物)給予需要它的受治療者或患者。例如，患者可能需要具有表1所列的 生物活性或優(yōu)選適應(yīng)癥的藥劑。在使用GLP-I受體激動劑/ELP化合物或使用胰島素/ELP 化合物的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療一種或多種障礙的方法，包括1型或2型糖 尿病、高血糖癥和葡萄糖耐量減低。在使用因子VII/VIIa/ELP化合物的某些其它實(shí)施方案 中，本發(fā)明提供用于治療一種或多種障礙的方法，包括血友病、手術(shù)后出血、抗凝血誘發(fā)性 出血、血小板減少、因子VII缺乏癥、因子XI缺乏癥和顱內(nèi)出血。根據(jù)下面的公開內(nèi)容和隨附權(quán)利要求書，本發(fā)明的不同的其它方面、特征和實(shí)施 方案將更清楚明了。附圖簡述

圖1圖示編碼具有10單元VPGXG(SEQ ID NO :3)重復(fù)基序的ELP成分的質(zhì)粒 pET24d-ELPl-90，其中客體位置(guest position)X 為 V、G 和 A，比例為 5 3 2。該基 序重復(fù)8次加上最終C端的10單元重復(fù)，其中X為V、G、A和W，比例為4 3 2 1。該 ELP成分一般表示為[(VPGXG) 10]9。圖2A圖示質(zhì)粒pET24d-Ex-4ELPl-90，其編碼具有與N端毒蜥外泌肽_4成分符 合讀框克隆的VPGXG(SEQ ID NO 3)重復(fù)基序(見圖1)的ELP成分。圖2B圖示毒蜥外泌 肽-4/ELP融合物(SEQ ID N0:23和24)的核苷酸和氨基酸序列。標(biāo)明了引物序列(SEQ ID NO 35-40)。圖3A圖示具有N端Tev(煙草蝕斑病毒半胱氨酸蛋白酶)切割位點(diǎn)的毒蜥外泌 肽-4構(gòu)建體的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID而25和沈)。標(biāo)明了引物序列(SEQ ID NO38、41、42)。圖;3B還顯示具有N端Tev切割位點(diǎn)而且Tev切割位點(diǎn)的N端還具有另外的序 列以提供更好地靶向蛋白酶的毒蜥外泌肽-4構(gòu)建體的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO 27和沘)。標(biāo)明了引物序列(SEQ ID NO :38、43、44)。圖4A圖示圖1-3中所示毒蜥外泌肽-4/ELP融合物而且還具有DsbA前導(dǎo)序列以 指導(dǎo)分泌到周質(zhì)間隙的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO : 和30)。標(biāo)明了引物序列(SEQ ID NO :38、45、46)。圖 4B 圖示編碼圖 4A 融合物的質(zhì)粒 pET24d-DsbA-Ex-4ELPl_90。圖5A圖示pPB0868，其編碼GLP-1 (A8G，7_37)ELP1_90。圖5B圖示該編碼融合蛋 白的核苷酸和氨基酸序列(分別為SEQ ID NO 53和54)。圖6A圖示pPB1022，其編碼GLP-1(A8G，7-37)ELP1-120。圖6B圖示該編碼融合蛋 白的核苷酸和氨基酸序列(分別為SEQ ID NO 55和56)。圖7A圖示pPB0788，其編碼因子VII-ELP1-90。圖7B圖示該編碼融合蛋白的核苷 酸和氨基酸序列(分別為SEQ ID NO 57和58)。圖8A圖示具有符合讀框克隆的ELP成分的胰島素(B鏈、C鏈和A鏈)的核苷酸 和氨基酸序歹Ij (SEQ ID N0:31禾口 32)。標(biāo)明了引物序列(SEQ ID NO :47和48)。圖8B圖示 表達(dá)圖8A的胰島素/ELP融合物的質(zhì)粒pET24d胰島素-ELP1-90。圖9是圖示用小鼠抗人FVII單克隆抗體檢測的得自瞬時轉(zhuǎn)染的Freestyle HEK293的FVII-ELP1-90的蛋白質(zhì)印跡。泳道為(1)培養(yǎng)基；(2)通過相變純化后的FVII ELP1-90 ；和 FVII 對照。圖10是圖示重組產(chǎn)生的毒蜥外泌肽-4/ELP4-60融合物的SDS-PAGE。泳道為(M) 蛋白質(zhì)標(biāo)記；(1)得自總裂解物的毒蜥外泌肽-4ELP4-60 ;(幻得自不溶性裂解物的毒蜥外 泌肽-4ELP4-60 ； ( 得自可溶性裂解物的毒蜥外泌肽-4 ELP4-60 ； (4)第一次相變的毒蜥 外泌肽-4 ELP4-60(等體積)；( 得自第二次相變的毒蜥外泌肽-4 ELP4-60 (富集)；(6) 得自第三次相變的毒蜥外泌肽-4 ELP4-60 (富集)。圖11圖示被因子VIIa-ELPl-90激活的因子X，被因子VIIa激活的因子X作為對 照。正如所顯示的一樣，因子VIIa-ELP保持完全活性。圖12圖示因子VIIa-ELPl-90靜脈內(nèi)給予大鼠時具有長的冊。與因子VIIaWTv2 約45-60分鐘相比，因子VIIar的T1/2約690分鐘。圖13圖示與毒蜥外泌肽的活性相比，GLPl-ELP和毒蜥外泌肽_4_ELP的體外活性高。圖14圖示當(dāng)通過靜脈內(nèi)給予大鼠時，GLPl-ELP的T1/2約為12. 9小時，當(dāng)皮下(SQ) 給予時，1/2約為8.6小時。圖15圖示當(dāng)靜脈給予兔時，GLP-IELP具有長的半壽期約20小時，當(dāng)皮下給予時 約24小時。圖16圖示GLP-I-ELP在糖尿病小鼠的持續(xù)血糖控制。發(fā)明詳述本發(fā)明提供包含彈性蛋白樣肽(ELP) ( “ELP成分”)和治療性成分的治療劑。治 療成分可選自表1 (例如選自表1所列的治療性蛋白質(zhì)或其功能部分或功能類似物)。在某 些實(shí)施方案中，治療成分是GLP-I受體激動劑，例如GLP-I或毒蜥外泌肽_4，或可以是胰島 素、因子Vll/VIIa或其功能類似物。ELP成分含有與彈性蛋白序列有關(guān)或來源于彈性蛋白序列的結(jié)構(gòu)單元，其提供某些治療優(yōu)勢，例如治療成分相對更好的持續(xù)性、穩(wěn)定性、溶解度、 生物利用度、半壽期和/或生物作用。根據(jù)例如治療成分的未融合或未綴合對應(yīng)物來確定 這類性質(zhì)。本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明的治療劑的多核苷酸，以及治療或預(yù)防某些生物學(xué)病 癥的方法，包括表1所列的優(yōu)選適應(yīng)癥，并且尤其包括糖尿病(例如I型和II型糖尿病)、 高血糖癥、流血(bleeding)、血友病和出血(hemorrhage)等。為了便于接下來的論述，下面給出在論述中出現(xiàn)的某些術(shù)語的定義。本文使用的術(shù)語“治療劑”或“治療成分”是指能夠在體內(nèi)和/或體外誘導(dǎo)生物效 應(yīng)的藥劑或成分。生物效應(yīng)可用于治療和/或預(yù)防受治療者或患者的病癥、障礙或疾病。本文使用的術(shù)語“偶聯(lián)”是指特定成分或者彼此直接共價(jià)結(jié)合(例如通過化學(xué)綴 合或重組融合技術(shù))，或者通過一個或多個間插部分(例如橋連基、間隔基或接頭)彼此間 接共價(jià)連接(例如通過化學(xué)綴合或重組融合技術(shù))。本文使用的“半壽期”(一般是指體內(nèi)半壽期或循環(huán)半壽期)是活性劑的生物活性 減少50%所需要的時間。術(shù)語“半壽期”不同于“持續(xù)性”，后者是指活性劑在機(jī)體內(nèi)的總 的持續(xù)時間；其也不同于“清除率”，“清除率”為與半壽期和持續(xù)性的數(shù)值可能相關(guān)或不相 關(guān)的動力學(xué)變量。術(shù)語“功能類似物”是指這樣的蛋白質(zhì)其是天然蛋白質(zhì)的活性類似物(例如化 學(xué)類似物或蛋白質(zhì)類似物)、衍生物、片段、截短同工型等。例如，功能類似物可以是表1所 列的治療性蛋白質(zhì)的功能類似物，或者可以是GLP-I受體激動劑(例如GLP-1、毒蜥外泌 肽)、胰島素或因子Vll/VIIa的功能類似物。當(dāng)多肽保持相應(yīng)的天然多肽的一些或全部生 物活性(活性體內(nèi)或者體外一種或多種指示性的測定法測定)時，該多肽是有活性的。測 定活性的、某些治療性蛋白質(zhì)的示例性活性測定法見表1。此外，本文其它部分詳細(xì)描述了 GLP-I受體激動劑、胰島素和因子Vll/VIIa的這類生物活性及測定給定分子是否是“功能 類似物”的測定法。本文使用的術(shù)語“天然(的)”當(dāng)用來指氨基酸序列時，是指天然存在的蛋白質(zhì)的
氨基酸序列。本文使用的術(shù)語“間隔基”是指可插入ELP成分和治療成分之間的任何部分、肽或 其它化學(xué)實(shí)體。例如，間隔基可以是在一端與ELP成分共價(jià)結(jié)合且在另一端與治療成分共 價(jià)結(jié)合的二價(jià)基團(tuán)。因此，治療劑可包括不會妨礙所述藥劑的預(yù)期目標(biāo)功效的其它化學(xué)結(jié) 構(gòu)。例如，間隔基可以是提供控制藥劑的藥代動力學(xué)特征的蛋白酶敏感性間隔基部分，或間 隔基可以是蛋白酶抗性部分。治療成分和ELP成分可以任何合適的共價(jià)方式(包括化學(xué)偶聯(lián)和重組技術(shù))彼此 偶聯(lián)，使得治療劑有效用于其預(yù)期目的，并使得存在的ELP成分在一些功能、治療或生理方 面強(qiáng)化治療成分。例如，ELP偶聯(lián)的治療成分可提高例如其生物利用度、生物不可利用度、 治療有效量、生物作用、制劑相容性、對蛋白酶解或其它降解方式的抗性、溶解度、半壽期或 給藥后在機(jī)體內(nèi)的持續(xù)性的其它測量值、給藥后從機(jī)體排除的清除率等。例如，可根據(jù)相應(yīng) 的未綴合或未融合對應(yīng)治療藥來測定這類加強(qiáng)作用(例如根據(jù)天然GLP-1、毒蜥外泌肽、胰 島素或因子Vll/VIIa或表1所列治療性蛋白質(zhì)來測定)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療劑以可溶性形式在機(jī)體內(nèi)循環(huán)或存在，并逃避 腎濾過從而以活性形式保持在機(jī)體內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明治療劑的分子量小于普遍公認(rèn)的腎濾過截止值，例如小于約60kD，或者，在一些實(shí)施方案中小于約55、50、45、40、 30或20kDa，并且在機(jī)體內(nèi)的持續(xù)時間比未偶聯(lián)的(例如未融合的或未綴合的)治療劑對 應(yīng)物長至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍或100倍。每分子的ELP和/或治療成分的數(shù)目及其在分子內(nèi)的相應(yīng)位置在本發(fā)明的實(shí)施方 案可以不同。例如，在其中藥劑是重組融合物的實(shí)施方案中，至少一個ELP成分可位于N端 和C端的一端或兩端。當(dāng)ELP成分位于融合物的N端和C端兩端時，ELP成分鄰接治療成 分?；蛘撸委煶煞挚晌挥贜端和C端的任一端或兩端。當(dāng)治療成分在N端和C端兩端時， 治療成分鄰接ELP成分。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，不同的治療成分位于分子的N端和C端。 正如本文詳細(xì)論述的一樣，在某些實(shí)施方案中，可通過蛋白酶解分隔ELP和治療成分的間 隔基部分而釋放這類治療成分。在某些實(shí)施方案中，治療成分在融合狀態(tài)下可能是無活性 的，而在蛋白酶解由ELP成分釋放時變得有活性。或者，治療成分在融合狀態(tài)下保持活性， 使得不必為了生物活性而對治療劑進(jìn)行蛋白酶解處理。當(dāng)作為重組融合物制備時，可通過已知的重組表達(dá)技術(shù)制備治療劑。例如，為了重 組產(chǎn)生治療劑，將編碼嵌合基因的核酸序列與合適的啟動子序列有效連接，使得編碼這類 融合蛋白的核酸序列可以在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和/或翻譯成所需要的融合蛋白。優(yōu)選的啟動 子是用于在大腸桿菌(E.coli)內(nèi)表達(dá)的啟動子，例如T7啟動子。可以使用任何常用的表 達(dá)系統(tǒng)，包括真核或原核系統(tǒng)。具體實(shí)例包括酵母(例如酵母菌(Saccharomyces spp.)、 畢赤酵母(Pichia spp.))、桿狀病毒、哺乳動物和細(xì)菌系統(tǒng)(例如大腸桿菌)和柄桿菌屬 (Caulobacter)0在下面各節(jié)中將更詳盡地描述本發(fā)明的各個方面和實(shí)施方案。彈件蛋白樣肽(ELP)成分本發(fā)明的治療劑可包含一種或多種ELP成分。ELP成分包含與彈性蛋白有關(guān)或來 源于彈性蛋白的結(jié)構(gòu)性肽單元或序列，或者由與彈性蛋白有關(guān)或來源于彈性蛋白的結(jié)構(gòu)性 肽單元或序列組成。這類序列可用于在以下的一個或多個方面改進(jìn)治療性蛋白質(zhì)例如表1 所列的治療性蛋白質(zhì)以及GLP-I受體激動劑(例如GLP-I或毒蜥外泌肽-4)、胰島素和因 子Vll/VIIa的性質(zhì)生物利用度、治療有效量、生物作用、制劑相容性、對蛋白酶解的抗性、 溶解度、半壽期或給藥后在機(jī)體內(nèi)的持久性的其它測量值和/或從機(jī)體排除的清除率。ELP成分由3個至約20個氨基酸的結(jié)構(gòu)單元構(gòu)建，或者在一些實(shí)施方案中，由4個 至10個氨基酸構(gòu)建，例如5個或6個氨基酸。在具體的ELP成分中，各個結(jié)構(gòu)單元的長度 可以不同或者相同。在某些實(shí)施方案中，ELP成分由重復(fù)性結(jié)構(gòu)單元的聚四肽、聚五肽、聚 六肽、聚七肽、聚八肽和聚九肽基序構(gòu)建。示例性結(jié)構(gòu)單元包括由SEQ ID NO :1-12定義的 單元(見下文)，其可用作重復(fù)性結(jié)構(gòu)單元，包括串聯(lián)重復(fù)單元，或者可用于某些組合以產(chǎn) 生有效改進(jìn)治療成分的性質(zhì)的ELP。因此，ELP成分可包含以下單元或者基本由以下單元組 成選自如下定義的SEQ ID NO 1-12的結(jié)構(gòu)單元。包含這類結(jié)構(gòu)單元的ELP成分可以是不同大小。例如，ELP成分可包含以下單元 或者基本由以下單元組成約10-約500個結(jié)構(gòu)單元，或者在某些實(shí)施方案中約15-約150 個結(jié)構(gòu)單元，或者在某些實(shí)施方案中約20-約100個結(jié)構(gòu)單元，或約50-約90個結(jié)構(gòu)單元， 包括由SEQ ID NO 1-12定義的一個單元或單元的組合。因此，ELP成分的長度為約50-約 2000個氨基酸殘基，或約100-約600個氨基酸殘基，或約200-約500個氨基酸殘基，或約200-約400個氨基酸殘基。在一些實(shí)施方案中，ELP成分(或在某些情況下為治療劑)的大小小于約65kDa， 或小于約60kDa，或小于約55kDa，或小于約50kDa，或小于約40kDa，或小于約30或25kDa。 已經(jīng)開發(fā)出延長蛋白質(zhì)和肽的半壽期以改進(jìn)治療用途的三種主要血液蛋白質(zhì)即人血清白 蛋白(HSA)、運(yùn)鐵蛋白(Tf)和IgG或其糖基化形式的IgG的Fc部分。這些分子的長度分別 為585、679和480個氨基酸，分子量為約66、77和約75kDa (包括糖基化)。它們各為球狀 且相對致密。這些分子的半壽期取決于多種因素，包括電荷分布、通過新生Fc受體(Fcfoi) (HSA和Fe)的分子拯救或通過Tf受體(TfR)的Tf循環(huán)及防止經(jīng)腎小球?yàn)V過的分子大小。 HSA略低于普遍認(rèn)可的經(jīng)腎濾過的截止值(約70kDa)，但其電荷分布有助于防止這一點(diǎn)?？?以預(yù)期，為了實(shí)現(xiàn)與用HSA、Tf和Fc實(shí)現(xiàn)的相同數(shù)量級的半壽期延長，至少這一分子量范圍 的蛋白質(zhì)可能是必需或需要的，即超過550個氨基酸和超過65kDa。然而，與HSA、Tf和Fc 相比，氨基酸數(shù)目少(例如約300-400的范圍)且30-40kDa左右的ELP的半壽期卻可具有 與HSA、Tf和Fc相當(dāng)或超過HSA、Tf和Fc的半壽期。在一些實(shí)施方案中，未轉(zhuǎn)變狀態(tài)下的ELP成分可具有伸展的相對非結(jié)構(gòu)化和非球 狀的形式，因此，與HSA、Tf和Fc相比，這類分子可具有大的膨脹結(jié)構(gòu)，使得可逃避腎濾過。 在這類實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療劑的分子量小于普遍公認(rèn)的通過腎濾過截止值，例如小 于約60kD，或者在一些實(shí)施方案中小于約55、50、45、40、30或25kDa，并且在機(jī)體內(nèi)的持續(xù) 時間比未偶聯(lián)的(例如未融合的或未綴合的)治療劑對應(yīng)物的長至少2倍、3倍、4倍、5倍、 10倍、20倍或100倍。在某些實(shí)施方案中，ELP成分進(jìn)行可逆的逆相變。也就是說，ELP成分在結(jié)構(gòu)上是 無序的，且在轉(zhuǎn)變溫度(Tt)以下極溶于水，但當(dāng)溫度升至Tt以上時具有急劇的范 圍)無序-有序相變，導(dǎo)致ELP成分去溶劑化和聚集。例如，ELP當(dāng)達(dá)到充分大小時形成不 溶性聚合物，這可容易地通過離心從溶液中除去和分離。這類相變是可逆的，當(dāng)溫度再次回 到ELP的Tt以下時，分離的不溶性ELP可完全再溶于緩沖溶液中。因此，在一些實(shí)施方案 中，可以采用逆轉(zhuǎn)變循環(huán)方法，例如利用治療劑依賴溫度的溶解度，或?qū)Ⅺ}加入培養(yǎng)基中， 從其它污染蛋白質(zhì)中分離出高純度的本發(fā)明的治療劑?？刹捎眠B續(xù)的逆相變循環(huán)來實(shí)現(xiàn)高 純度。除溫度和離子強(qiáng)度以外，用于調(diào)節(jié)治療劑逆轉(zhuǎn)變的其它環(huán)境變量包括PH、加入無機(jī)和 有機(jī)溶質(zhì)和溶劑、側(cè)鏈離子化或化學(xué)修飾和壓力。在某些實(shí)施方案中，ELP成分不進(jìn)行可逆的逆相變，或者不在生物學(xué)上相關(guān)的Tt 時進(jìn)行這類轉(zhuǎn)變，因此，分子的生物性質(zhì)和/或生理性質(zhì)的改進(jìn)(如本文其它部分所述)可 以完全獨(dú)立于或基本上獨(dú)立于任何相變性質(zhì)。而且，這類相變性質(zhì)可提供例如與這類分子 的回收和純化有關(guān)的其它實(shí)用優(yōu)勢。在某些實(shí)施方案中，ELP成分由包括但不限于以下的結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成(a)四肽 Val-Pro-Gly-Gly，即 VPGG(SEQ ID NO 1)；(b)四肽 Ile-Pro-Gly-Gly，即 IPGG(SEQ ID NO 2)；(c)五肽 Val-Pro-Gly-X-Gly (SEQ ID NO 3),即 VPGXG，其中 X 為任何天然或非天 然的氨基酸殘基，且其中X任選在聚合或寡聚重復(fù)序列中不同；(d)五肽 Ala-Val-Gly-Val-Pro，即 AVGVP (SEQ ID NO 4)；(e)五肽 Ile-Pro-Gly-X-Gly,即 IPGXG (SEQ ID NO :5)，其中 X 為任何天然或非天然的氨基酸殘基，且其中X任選在聚合或寡聚重復(fù)序列中不同；(e)五肽 Ile-Pro-Gly-Val-Gly, BP IPGVG (SEQ ID NO 6)；(f)五肽 Leu-Pro-Gly-X-Gly，即 LPGXG (SEQ ID NO :7)，其中 X 為任何天然或非天 然的氨基酸殘基，且其中X任選在聚合或寡聚重復(fù)序列中不同；(g)五肽 Leu-Pro-Gly-Val-Gly，即 LPGVG (SEQ ID NO 8)；(h)六肽 Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly，即 VAPGVG(SEQ ID NO 9)；(I)八肽 Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly，即 GVGVPGVG(SEQ IDNO :10)；(J)九肽 Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Val-Gly-Ala-Gly,即 VPGFGVGAG(SEQID NO :11)； 和(K)九肽 Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Gly,即 VPGVGVPGG (SEQID NO 12)。由SEQ ID NO 1_12定義的這類結(jié)構(gòu)單元可形成結(jié)構(gòu)重復(fù)單元，或者可組合使用形 成本發(fā)明的ELP成分。在一些實(shí)施方案中，ELP成分完全(或幾乎完全)由選自SEQ ID N0 1-12的一個結(jié)構(gòu)單元或其組合(例如2、3或4個)構(gòu)成。在其它實(shí)施方案中，至少75%， 或至少80%，或至少90%的ELP成分由選自SEQ ID NO :1_12的一個結(jié)構(gòu)單元或其組合結(jié) 構(gòu)單元構(gòu)成，其可以重復(fù)單元出現(xiàn)。在某些實(shí)施方案中，ELP成分含有重復(fù)單元，包括五肽Val-Pr0-Gly-X-Gly(SEQ ID NO 3)的串聯(lián)重復(fù)單元，其中X如上定義，且就整個ELP成分(其可包含VPGXG (SEQ ID N0: 3)以外的結(jié)構(gòu)單元)而言，其中Val-Pro-Gly-X-Gly (SEQ ID NO 3)五肽單元占整個ELP成 分的百分比大于約75%，或大于約85%，或大于約95%。ELP成分可含有具有SEQ IDNO 3 五肽的5-15個單元重復(fù)(例如約10個單元重復(fù))的基序，其客體殘基(guest residue) X 可在至少2個或至少3個單元中不同?？腕w殘基可獨(dú)立選自例如氨基酸V、I、L、A、G和W， 并且可以對客體殘基進(jìn)行選擇以保持所需要的逆相變性質(zhì)。重復(fù)基序本身可以重復(fù)例如約 5次-約12次，例如約8-10次，以產(chǎn)生示例性的ELP成分。當(dāng)然，本段落所描述的ELP成分 由SEQ ID NO :1-12定義的結(jié)構(gòu)單元中的任意一種或其組合構(gòu)建。在一些實(shí)施方案中，ELP成分可包括β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。適于產(chǎn)生β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的示例性 肽序列披露于國際專利申請PCT/US96/05186，其通過引用其整體結(jié)合到本文中。例如，可以 改變彈性蛋白五肽序列VPGXG(SEQ ID NO 3)的第四個殘基(X)而不破壞β轉(zhuǎn)角的形成。 或者，ELP成分可以沒有β轉(zhuǎn)角，或者具有不同的構(gòu)象和/或折疊性質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，ELP成分包括五肽VPGXG (SEQ ID NO 3)的聚合或寡聚重復(fù)序 列，其中客體殘基χ為任何氨基酸。χ可以為天然或非天然的氨基酸。在一些實(shí)施方案中， X選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、 異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。 在一些實(shí)施方案中，X是脯氨酸或半胱氨酸以外的天然氨基酸。客體殘基X (例如就SEQ ID NO :3而言，或其它ELP結(jié)構(gòu)單元)可以是非典型(非 遺傳編碼)氨基酸。非典型氨基酸的實(shí)例包括常見氨基酸的D-異構(gòu)體、2，4_ 二氨基丁酸、 α -氨基異丁酸、A-氨基丁酸、Abu、2_氨基丁酸、Y -Abu、ε -Ahx、6_氨基己酸、Aib、2_氨基 異丁酸、3-氨基丙酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半 胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、β -丙氨酸、氟-氨基酸、 設(shè)計(jì)的(designer)氨基酸例如β -甲基氨基酸、C α -甲基氨基酸、N α -甲基氨基酸和常用的氨基酸類似物。X的選擇在各ELP結(jié)構(gòu)單元(例如本文定義的具有客體殘基X的各結(jié)構(gòu)單元)中 是獨(dú)立的。例如，對于各結(jié)構(gòu)單元，X可獨(dú)立選取帶正電荷側(cè)鏈的氨基酸、具有帶負(fù)電荷側(cè) 鏈的氨基酸或具有中性側(cè)鏈的氨基酸，包括在一些實(shí)施方案中為疏水側(cè)鏈的氨基酸。在另一些實(shí)施方案中，ELP成分可包括五肽VPGXG(SEQ ID NO :3)、IPGXG(SEQ ID NO 5)或LPGXG(SEQ ID NO 7)或其組合的聚合或寡聚重復(fù)序列，其中X如上定義。在各個實(shí)施方案中，ELP序列的結(jié)構(gòu)單元，或在某些情況下為聚合或寡聚重復(fù)序 列，可被不會破壞分子整體作用的一個或多個氨基酸殘基分隔開來，其為所述治療成分提 供某些改進(jìn)。在某些實(shí)施方案中，這樣的一個或多個氨基酸也不會破壞或明顯影響ELP成 分的相變性質(zhì)(與缺乏這類一個或多個氨基酸相比)。在各個重復(fù)序列中，X是獨(dú)立選擇的。所得ELP成分的結(jié)構(gòu)可用符號ELPk [XiYj-Ii] 表示，其中k是指特定的ELP重復(fù)單元，括號內(nèi)的大寫字母是單字母氨基酸代碼，其相應(yīng)的 下標(biāo)是指結(jié)構(gòu)單元中各個客體殘基X(適用的話)的相對比，η是指多個結(jié)構(gòu)重復(fù)中ELP的 總長度。例如，ELPl [V5A2Q-IO]是指含有五肽VPGXG(SEQ ID NO 3)的10個重復(fù)單元的ELP 成分，其中X為纈氨酸、丙氨酸和甘氨酸，相對比為5 2 3 ；ELPl [K1V2F1^]是指含有五 肽VPGXG (SEQ ID NO 3)的4個重復(fù)單元的ELP成分，其中X為賴氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸， 相對比為1 2 1 ;ELP1 [K1V7F1-Q]是指含有五肽VPGXG(SEQ ID NO 3)的9個重復(fù)單元 的多肽，其中X為賴氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸，相對比為1 7 1 ;ELPl[V-5]是指含有五 肽VPGXG(SEQID NO 3)的5個重復(fù)單元的多肽，其中X全為纈氨酸；ELPl [V-20]是指含有 五肽VPGXG(SEQ ID NO 3)的20個重復(fù)單元的多肽，其中X全為纈氨酸；ELP2[5]是指含有 五肽AVGVP(SEQ ID NO 4)的5個重復(fù)單元的多肽；ELP3[V-5]是指含有五肽IPGXG(SEQ ID NO 5)的5個重復(fù)單元的多肽，其中X全為纈氨酸；ELP4[V-5]是指含有五肽LPGXG (SEQ ID NO 7)的5個重復(fù)單元的多肽，其中X全為纈氨酸。本段落描述的這類ELP成分可與本發(fā) 明聯(lián)用以增強(qiáng)治療成分的治療性質(zhì)。此外，Tt隨客體殘基的疏水性而變化。因此，通過改變客體殘基本身(identity) 及其克分子數(shù)，可以合成在0-100°C范圍內(nèi)能夠逆轉(zhuǎn)變的ELP。因此，可通過在ELP序列中 摻入較大量的疏水客體殘基來降低給定ELP長度的Tt。合適的疏水客體殘基的實(shí)例包括纈 氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。還可以使用中等疏水性的酪氨酸。 相反，可通過摻入例如選自以下的殘基來提高Tt 谷氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、丙 氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、精氨酸和谷氨酰胺；優(yōu)選選自丙氨酸、絲氨酸、蘇 氨酸和谷氨酸。在一些實(shí)施方案中，選擇或設(shè)計(jì)ELP成分以提供Tt范圍約10°C-約80°C，例如約 35°C -約60°C，或約38°C -約45°C。在一些實(shí)施方案中，Tt大于約40°C或大于約42°C，或 大于約45°C，或大于約50°C。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)變溫度超過受治療者或患者的體溫(例 如> 37°C )，從而在體內(nèi)保持可溶性，或者在其它實(shí)施方案中，Tt低于體溫(例如< 37°C ) 以提供替代性優(yōu)勢，例如體內(nèi)藥物庫形成用于治療劑的緩釋?？赏ㄟ^改變ELP鏈長來改變ELP成分的Tt，因?yàn)門t 一般隨麗降低而提高。對于 分子量> 100，000的多肽，由Urry等人開發(fā)的疏水標(biāo)度(PCT/US96/05186，通過引用其整 體結(jié)合到本文中)優(yōu)選用于預(yù)測特定ELP序列的Tt近似值。然而，在一些實(shí)施方案中，可通過在ELP序列中摻入較大量的疏水客體殘基(例如具有疏水側(cè)鏈的氨基酸殘基)來保持 相對較短的ELP成分長度，而同時保持目標(biāo)Tt。對于分子量< 100，000的多肽，可通過下 列二次方程式預(yù)測或確定Tt =Tt = MJM1XiM2X2,其中X為融合蛋白的MW, M0 = 116. 21 =-1. 7499 ；M2 = 0. 010349。ELP成分的Tt以及由此與治療成分偶聯(lián)的ELP成分的Tt在受客體殘基X的本身 (identity)和疏水性影響的同時，分子的其它性質(zhì)也可能會受到影響。這類性質(zhì)包括但不 限于分子的溶解度、生物利用度、持久性和半壽期。如PCT/US2007/077767 (以WO 2008/030968公布)所述(其通過引用其整體結(jié)合 到本文中)，ELP偶聯(lián)的治療成分可保持治療成分的生物活性。此外，ELP本身可具有長的 半壽期。因此，本發(fā)明的ELP成分大大延長(例如在具體實(shí)施方案中大于lO^JO^JO^、 so^uoo^doo^joo^或以上)與之綴合的治療成分的半壽期。與治療成分的游離(未 綴合或未融合)形式的半壽期相比較來確定這類半壽期(或者在一些實(shí)施方案中為持久性 或清除率)。此外，當(dāng)體內(nèi)給予時，ELP可靶向高血容量器官，因此，ELP可在機(jī)體內(nèi)分配，從 而在身體的不同器官或部位中提供預(yù)定的所需要的體內(nèi)分布，或提供所需要的治療劑的選 擇性或靶向性?？傊?，本發(fā)明設(shè)計(jì)了體內(nèi)給予或產(chǎn)生延長半壽期(例如循環(huán)半壽期)的治 療劑的活性組合物，包括本文所述的其它潛在益處。因此，本發(fā)明提供用于治療(體內(nèi))用途的各種藥物，其中治療成分具有生物活 性。這類治療成分包括表1所列的治療成分(例如全長或功能部分或其功能類似物)，以 及GLP-I受體激動劑(例如GLP-I或毒蜥外泌肽-4)、胰島素或因子Vll/VIIa及其功能類 似物。下面將詳細(xì)描述這類治療成分的結(jié)構(gòu)和活性。在治療劑的一些形式中，治療成分與 ELP成分的偶聯(lián)通過直接共價(jià)結(jié)合或間接(通過合適的間隔基)結(jié)合來實(shí)現(xiàn)(如本文其它 部分所述)。此外，治療成分和ELP成分可以任何合適的方式(包括所述彼此直接或間接共 價(jià)結(jié)合)結(jié)構(gòu)性排列。胰高血糖素樣肽(GLP)-I受體激動劑在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，治療劑包含與GLP-I受體激動劑(例如GLP-1、毒蜥 外泌肽-4或其功能類似物)融合或綴合的ELP成分。人GLP-I是37個氨基酸殘基的肽，來源于在回腸遠(yuǎn)端的L細(xì)胞、胰腺和腦中 合成的前胰高血糖素原(Pr印roglucagon)。主要在L細(xì)胞中加工前胰高血糖素原得到 GLP-I (7-36)酰胺、GLP-I (7-37)和GLP-2。采用一個簡單體系描述該肽的片段和類似物。 例如，Gly8-GLP-I (7-37)是指通過缺失第1_6號氨基酸殘基并用Gly取代8位的天然氨基 酸殘基(Ala)而從GLP-I得到GLP-I片段。同樣，Lys34(Νε-十四烷?；?-GLP-I (7_37)是 指其中34位Lys殘基的ε-氨基被十四烷?；腉LP-I (7-37)。當(dāng)在本文中提及C端延 伸的GLP-I類似物時，38位的氨基酸殘基為Arg，除非另有說明，39位的任選氨基酸殘基同 樣為Arg，除非另有說明，且40位的任選氨基酸殘基為Asp，除非另有說明。同樣，如果C端 延伸的類似物在41、42、43、44或45位上延伸，則這種延伸的氨基酸序列與人前胰高血糖素 原中的相應(yīng)序列一樣，除非另有說明。GLP-I的母體肽胰高血糖素原(PG)具有產(chǎn)生取決于組織來源的、不同肽產(chǎn)物的若 干切割位點(diǎn)，包括胰腺中的胰高血糖素(PG[32-62])和GLP-I [7-36]NH2(PG[72-107])和腸 L 細(xì)胞中的 GLP-I [7-37] (PG[78-108])和 GLP-I [7-36]NH2 (PG[78-107])，其中 GLP-I [7-36]NH2(78-107PG)是主要產(chǎn)物。本發(fā)明的GLP-I成分可以是胰高血糖素原(proglocagon) 的任何生物活性產(chǎn)物或衍生物或其功能類似物，包括GLP-1 (1-35)、GLP-I (1-36)、 GLP-I (1-36)酰胺、GLP-I (1-37)、GLP-I (1-38)、GLP-I (1-39)、GLP-I (1-40)、GLP-I (1-41)、 GLP-I (7-35)、GLP-I (7-36)、GLP-I (7-36)酰胺、GLP—1 (7-37)、GLP-I (7-38)、GLP-I (7-39)、 GLP-I (7-40)和GLP-I (7-41)或上述的類似物。在一些實(shí)施方案中，GLP-I成分一般可表示 為GLP-I (A-B)，其中A是1-7的整數(shù)，而B是38-45的整數(shù)，任選具有如下定義的一個或多 個氨基酸取代。綜上所述，在腸L細(xì)胞中加工后，GLP-I釋放到循環(huán)中，進(jìn)餐后最為顯著。GLP-I的 血漿濃度從約15pmol/L的空腹水平升至40pmol/L的餐后峰值水平。對于特定血漿葡萄糖 濃度的上升，口服給予葡萄糖的血漿胰島素水平與靜脈內(nèi)給予相比升高約3倍(Kreymarm 等，1987, Lancet 2(8571) :1300-4)。這種胰島素釋放的飲食性提高，稱為腸降血糖素效應(yīng)， 主要是體液性的，而且目前認(rèn)為GLP-I是人最有效的生理腸降血糖素。GLP-I通過與已知在 胰β細(xì)胞表達(dá)的GLP-I受體結(jié)合而介導(dǎo)胰島素產(chǎn)生。除促胰島素作用以外，GLP-I還抑制 胰高血糖素分泌，延緩胃排空(Wettergen等，1993，Dig Dis Sci 38 :665-73)，并可促進(jìn)外 周葡萄糖清除(D' Alessio 等，1994，J. ClinInvest 93 :2293-6)。綜合作用賦予GLP-I優(yōu)于當(dāng)前用于治療非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)的其它藥 劑的獨(dú)特的治療優(yōu)勢。首先，單次皮下劑量的GLP-I可使NIDDM患者的餐后葡萄糖水平完 全正?；?Gutniak等，1994，DiabetesCare 17:1039-44)?？赏ㄟ^增加胰島素釋放和通過 降低胰高血糖素分泌兩者介導(dǎo)這種作用。其次，GLP-I的靜脈內(nèi)輸注可延緩NIDDM患者的 餐后胃排空(Williams 等，1996，J.Clin Endo Metab 81:327-32)。第三，與磺酰脲不同， GLP-I的促胰島素作用依賴于血漿葡萄糖濃度(Holz等，1993，Nature 361 :362-5)。因此， 在低血漿葡萄糖濃度時GLP-I介導(dǎo)的胰島素釋放的喪失防止嚴(yán)重低血糖。當(dāng)給予健康受試者時，GLP-I有效地影響血糖水平以及胰島素和胰高血糖素濃 度(Orskov，1992，Diabetologia 35 :701-11)，這是葡萄糖依賴性的作用(Weir 等，1989， Diabetes 38:338-342)。此外，在糖尿病患者中也是有效的(Gutniak，M.，1992，N. Engl J Med 226 :1316-22)，能使2型糖尿病患者的血液葡萄糖水平正?；⒏纳?型患者的血糖 控制(Nauck 等，1993，Diabetologia 36 :741-4 ；Creutzfeldt 等，1996，Diabetes Care 19 580-6)。然而，GLP-I是代謝不穩(wěn)定的，體內(nèi)血漿半壽期(t1/2)僅1-2分鐘。此外，外部給予 的GLP-I也快速降解(Deacon等，1995，Diabetes 44 :1126-31)。這種代謝不穩(wěn)定性限制了 天然GLP-I的治療潛力。GLP-I [7-36] NH2 具有下列氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR (SEQ ID NO :13)，其可用作本發(fā)明的GLP-I成分。或者，GLP-I成分可在第2位含有甘氨酸(G)， 例如序列 HGEGTFTSDVS SYLEGQAAKEFIAffLVKGR(SEQ ID N0:17)。GLP-1 成分可以是例如公 開于US 2007/0041951的GLP-I的生物活性片段，其通過引用其整體結(jié)合到本文中。GLP-I 的其它片段和修飾序列是本領(lǐng)域已知的(美國專利號5，614，492、美國專利號5，545, 618、 歐洲專利申請公布號EP 0658568 Al、WO 93/25579，其均通過引用其整體結(jié)合到本文中)。 這類片段和修飾序列可與本發(fā)明的成分和下面描述的成分聯(lián)用。GLP-I的某些結(jié)構(gòu)及功能類似物是從大毒蜥(鈍尾毒蜥(Helodermasuspectum)和蛛毒蜥(Heloderma horridum))毒液中分離的，并已顯示出臨床效用。這類分子可用于本發(fā) 明。具體地講，毒蜥外泌肽-4是從鈍尾毒蜥毒液分離的39個氨基酸殘基肽，與人GLP-I有 約52%同源性。毒蜥外泌肽-4是刺激胰島素釋放從而降低血液葡萄糖水平的有效的GLP-I 受體激動劑。毒蜥外泌肽-4具有下列氨基酸序列HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFEWLKNGGPSSG APPPS (SEQ ID N0:14)。稱為艾塞那肽(商品名Byetta )的一種毒蜥外泌肽-4的合成形 式已獲準(zhǔn)用于治療2型糖尿病。雖然艾塞那肽在結(jié)構(gòu)上類似于天然GLP-I，但在注射后具有 較長的半壽期。雖然艾塞那肽本身具有降低血液葡萄糖水平的能力，但是它也可與例如二甲雙 胍、噻唑烷二酮(thiozolidinedione)、磺酰脲等其它藥物和/或胰島素組合以改善葡萄糖 控制。使用預(yù)灌裝注射筆式裝置，一天兩次通過皮下注射給予艾塞那肽。人對艾塞那肽的 反應(yīng)通常包括改進(jìn)最初的內(nèi)源胰島素快速釋放，增加β細(xì)胞生長和復(fù)制，抑制胰腺胰高血 糖素釋放，延緩胃排空和降低食欲一均起到降低血液葡萄糖的作用。與磺酰脲和美格列奈 (meglitinides)不同，艾塞那肽僅在葡萄糖存在時增加胰島素合成和分泌，從而降低低血 糖的風(fēng)險(xiǎn)。盡管艾塞那肽有治療效用，但它具有某些不良特征，包括一天注射兩次、胃腸外 副作用和類似于天然GLP-I的相對較短的半壽期(即2小時左右)。GLP-I和毒蜥外泌肽-4的各種功能類似物是已知的，且可用于本發(fā)明。這 些功能類似物包括利拉魯肽(Iiraglutide) (Novo Nordisk, W098/008871)、R1583/ taspoglutide (Roche, W000/034331)、CJC-1131 (ConjuChem, W000/069911)、ZP-IO/ AVEOOlO (Zealand Pharma, Sanofi-Aventis, W001/004156)禾口 LY548806(Eli Lilly, W003/018516)。利拉魯肽，亦稱NN2211，是設(shè)計(jì)為一天注射一次的GLP-I受體激動劑類似物 (Harder等，2004，Diabetes Care 27:1915-21)。在許多研究中，在2型糖尿病患者中測試 了利拉魯肽，已證實(shí)具有不同有效持續(xù)時間。在一項(xiàng)研究中，在用利拉魯肽治療2型糖尿 病患者1周后，治療改善了血糖控制，改進(jìn)了 β細(xì)胞功能，并降低了內(nèi)源葡萄糖釋放(Degn 等，2004，Diabetes53 :1187-94)。在類似研究中，8周0. 6mg利拉魯肽治療2型糖尿病患者 與使用安慰劑的患者相比顯著改善了血糖控制又沒有增加體重(Harder等，2004，Diabetes Care 27 :1915-21)。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的GLP-I受體激動劑與W098/008871(其通過引 用其整體結(jié)合到本文中)中披露的一樣。除相對于天然GLP-I有1、2或更多個氨基酸取 代以外，GLP-I受體激動劑還可具有至少一個親脂取代基。例如，親脂取代基可以是選自 CH3(CH2)nCO-的?；?，其中η為4-38的整數(shù)，例如4- 的整數(shù)。親脂取代基可以是直鏈或 支鏈烷基或脂肪酸的酰基(例如參見W098/008871，其通過引用結(jié)合到本文中)。在某些實(shí)施方案中，GLP-I成分為 Arg26-GLP-I (7-37)、Arg34-GLP-I (7-37)、 Lys36-GLP-I (7-37)、Arg26l34Lys36-GLP-I (7-37)、Arg26l34Lys38-GLP-I (7-38)、 Arg28l34Lys39-GLP-I (7-39)、Arg26l34Lys40-GLP-I (7-40)、Arg26Lys36-GLP-I (7-37)、 Arg34Lys36-GLP-I (7-37)、Arg26Lys39-GLP-I (7-39)、Arg34Lys40-GLP-I (7-40)、Arg26' 34Lys36l39-GLP-I (7-39)、Arg26,34Lys36,40-GLP_l (7-40)、Gly8Arg26-GLP-I (7-37)、 Gly8Arg34-GLP-I (7-37)、Gly8Lys38-GLP-I (7-37)、Gly8Arg26l34Lys36-GLP-I (7-37)、Gly8Arg26' 34Lys39-GLP-I (7-39)、Gly8Arg26,34Lys40-GLP-I (7-40)、Gly8Arg26Lys36-GLP-I (7-37)、Gly8Arg34Lys36-GLP-I (7-37)、Gly8Arg26Lys39-GLP-I (7-39)、Gly8Arg34Lys40-GLP-I (7-40)、 Gly8Arg28'34Lys36'39-GLP-l (7-39)和 Gly8Arg26’34Lys35’4°-GLP-l (7-40)，各自任選具有親脂取 代基。例如GLP-I受體激動劑可具有以下序列/結(jié)構(gòu)Arg34Lys26-(Ν-ε-(γ -Glu (N- α -十六 酰基)))-GLP-l(7-37)。 Taspoglutide，亦稱為R1583或BIM 51077，是在用二甲雙胍治療的2型糖尿病患 者中已經(jīng)證實(shí)改善血糖控制和降低體重的GLP-I受體激動劑(摘要編號A-1604，2008年6 月 7 日，68th American Diabetes AssociationMeeting(第 68 屆美國糖尿病協(xié)會會議)， San Francisco, CA)。因此，在某些實(shí)施方案中，GLP-I受體激動劑與W000/034331(其通過引用其整體 結(jié)合到本文中)中披露的一樣。在某些示例性實(shí)施方案中，GLP-I受體激動劑具有序列 [Aib8'35]hGLP-l (7-36) NH2 (例如 taspoglutide)，其中 Aib 是 α -氨基異丁酸。CJC-1131是GLP-I類似物，由GLP-I與反應(yīng)性化學(xué)接頭基團(tuán)連接的DPP-IV抗性 形式組成，該接頭基團(tuán)可供GLP-I在皮下注射后與血清白蛋白形成不可逆的共價(jià)健(Kim 等，2003，Diabetes 52 :751_9)。在12周的隨機(jī)雙盲安慰劑對照多中心研究中，CJC-1131 和二甲雙胍治療在降低2型糖尿病患者的空腹血液葡萄糖水平中是有效的(Ratner等， 摘要編號10-0R，2005年6月10-14日，第65屆美國糖尿病協(xié)會會議(65th American DiabetesAssociation Meeting), San Francisco, CA)。因此，在某些實(shí)施方案中，GLP-I受體激動劑與W000/069911(其通過引用其整體 結(jié)合到本文中)中披露的一樣。在一些實(shí)施方案中，GLP-I受體激動劑用反應(yīng)基團(tuán)修飾，所 述反應(yīng)基團(tuán)與血液成分中的氨基、羥基或巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。在某些實(shí)施方案中， GLP-I受體激動劑用選自琥珀酰亞胺基和馬來酰亞胺基的反應(yīng)基團(tuán)修飾。在某些示例性實(shí) 施方案中，GLP-I受體激動劑具有下列序列/結(jié)構(gòu)=D-Ala8Lys37- (2- (2- (2-馬來酰亞胺基丙 酰胺基(乙氧基)乙氧基)乙酰胺))_GLP-1 (7-37)(例如CJC-1131)。AVE0010，亦稱ZP-10，是可與本發(fā)明聯(lián)用的GLP-I受體激動劑。在最近的雙盲研究 中，用一天一次劑量的AVE0010治療的患者顯示HbAlc水平顯著降低(Ratner等，摘要編號 433-P，第68屆美國糖尿病協(xié)會會議(68thAmerican Diabetes Association Meeting) ,San Francisco,CA)。在研究結(jié)束時，對于一天一次給藥，與安慰劑的32%相比，HbAlc < 7%的 患者的百分比范圍為47-69%。此外，AVE0010治療的患者顯示體重和餐后血漿葡萄糖呈劑 量依賴性降低。因此，在某些實(shí)施方案中，GLP-I受體激動劑與W001/004156(其通過引用其整體 結(jié)合到本文中)中披露的一樣。例如，GLP-I受體激動劑可具有以下序列HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLKNGGPS SGAPPSKKKKKK-NH2 (SEQ ID NO 18)(例如 AVEOO10)。LY548806是設(shè)計(jì)成對二肽酶-肽基IV(DPP-IV)的蛋白酶解有抗性的GLP-I衍生 物(Jackson等，摘要編號562，2005年6月10-14日，第65屆美國糖尿病協(xié)會會議(65th American Diabetes Association Meeting), SanFrancisco, CA)。石if究表明，在高血糖癥 動物模型中，LY548806在高血糖期引起血液葡萄糖水平顯著降低(Saha等，2006，J. Pharm. Exp. Ther. 316 =1159-64) 此外，LY548806顯示引起胰島素水平顯著增加，這與已知的作用 機(jī)制一致，即在高血糖癥存在時刺激胰島素釋放。
因此，在某些實(shí)施方案中，GLP-I受體激動劑與W003/018516(其通過引用其整體 結(jié)合到本文中)中的披露的一樣。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療劑包含GLP-I類似物， 其中這類類似物或片段的主鏈在8位含有丙氨酸以外的氨基酸(8位類似物)。主鏈還可 包括L-組氨酸、D-組氨酸或組氨酸的修飾形式，例如脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、 β-羥基-組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基-組氨酸或在7位的α-甲基-組氨酸。在一些 實(shí)施方案中，與天然GLP-I相應(yīng)的氨基酸相比，這些8位類似物可在12、16、18、19、20、22、 25、27、30、33和37位上含有一個或多個其它的變化。在其它實(shí)施方案中，與天然GLP-I相 應(yīng)的氨基酸相比，這些8位類似物可在16、18、22、25和33位含有一個或多個其它變化。在 某些示例性實(shí)施方案中，GLP-I受體激動劑具有以下序列HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLI KGRG-OH (SEQ ID NO :19)(例如 LY548806)。因此，本發(fā)明提供包含彈性蛋白樣肽(ELP)和GLP-I受體激動劑的治療劑。例如， 在某些實(shí)施方案中，GLP-I受體激動劑是GLP-I (SEQ ID N0:13、17或59)或其功能類似物。 在其它實(shí)施方案中，GLP-I受體激動劑是毒蜥外泌肽-4 (SEQ ID NO 14)或其功能類似物。 GLP-I或毒蜥外泌肽-4的這類功能類似物包括在C端截短1-10個氨基酸(包括1、2、3或 多達(dá)約5個氨基酸)的功能片段(對應(yīng)于SEQ ID N0:13、14、17或59)。這類功能類似物 相對于天然序列(例如SEQ ID NOS 13、14和59)可含有1_10個氨基酸插入、缺失和/或 取代(總體上)，并且在每種情況下都保持肽的活性。例如，GLP-I或毒蜥外泌肽-4的功能 類似物相對于SEQ ID NO 13,59和14可具有1至約3、4或5個插入、缺失和/或取代(總 體上)，并且在每種情況下都保持肽的活性?？刹捎萌魏慰色@得的測定法(包括本文所述方 法)證實(shí)或測定這類活性。在這些或其它實(shí)施方案中，GLP-I受體激動劑成分與天然序列 (SEQ ID N0:13、59 和 14)有至少約 50%、75%、80%、85%、90%或 95% 同一性。兩個序列 之間(例如天然序列和功能類似物之間)序列同一性的測定可采用任何比對工具完成，包 Tatusova等，Blast 2 sequences—a new toolfor comparing protein and nucleotide sequences (Blast 2序列-一種比較蛋白質(zhì)和核苷酸序列的新型工具)，F(xiàn)EMS Microbiol Lett. 174 :247-250(1999)。這類功能類似物還可包含其它化學(xué)修飾，例如本節(jié)描述的修飾 和/或本領(lǐng)域已知的其它修飾。在某些實(shí)施方案中，GLPl-ELP融合物具有本文列舉的序列SEQ IDNO力4和56。當(dāng) 加工時，這類融合蛋白的成熟形式將以GLP的His7開始。另一方面，本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防以下疾病的方法2型糖尿病、葡萄糖耐量 減低、1型糖尿病、高血糖癥、肥胖癥、暴食癥、貪食癥、高血壓、X綜合征、血脂異常、認(rèn)知障 礙、動脈粥樣硬化、非脂肪肝疾病、心肌梗死、冠心病和其它心血管疾病。所述方法包括給予 需要這類治療的患者包含彈性蛋白樣肽(ELP)和GLP-I受體激動劑的治療劑(如上所述)。 在這些或其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于減少食物攝取、降低β細(xì)胞凋亡、增加β細(xì)胞 功能和β細(xì)胞量和/或用于恢復(fù)β細(xì)胞的葡萄糖敏感性的方法?；颊咭话憧蔀槿嘶蚍侨?類動物患者(例如狗、貓、牛或馬)。優(yōu)選患者為人。用本發(fā)明的ELP/GLP-1受體激動劑化合物的治療還可與一種或多種藥理活性物 質(zhì)組合，例如選自抗糖尿病藥、抗肥胖癥藥、食欲調(diào)節(jié)藥、抗高血壓藥、用于治療和/或預(yù)防 由糖尿病引起或與糖尿病有關(guān)的并發(fā)癥的藥物以及用于治療和/或預(yù)防由肥胖癥引起或 與肥胖癥有關(guān)的并發(fā)癥和障礙的藥物。在本文中，表述“抗糖尿病藥”包括用于治療和/或預(yù)防胰島素抵抗和其中胰島素抵抗是病理生理機(jī)制的疾病的化合物。GLP-I或毒蜥外泌肽-4類似物，或GLP-I受體激動劑/ELP化合物結(jié)合GLP-I受體的能力可通過標(biāo)準(zhǔn)方法測定，例如，通過受體結(jié)合活性篩選方法，該方法包括提供在其表 面表達(dá)GLP-I受體的合適細(xì)胞，例如胰島瘤細(xì)胞系，例如RINmSF細(xì)胞或INS-I細(xì)胞。除了 使用放射免疫測定方法測定示蹤劑與膜的特異性結(jié)合以外，還可測定cAMP活性或葡萄糖 依賴性的胰島素產(chǎn)生。在一種方法中，使用編碼GLP-I受體的多核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞，從而表達(dá) GLP-I受體蛋白。因此，這些方法還可用于測試或確定疑似GLP-I受體激動劑是否有活性。 本文更詳細(xì)地描述了示例性的測定法。此外，可采用已知方法測定或預(yù)測體內(nèi)生物活性的GLP-I受體激動劑或GLP-I受 體激動劑/ELP的水平(參見例如Siegel等，1999，Regul P印t79 (2-3) :93_102)。具體 地講，可以使用各種已知的測定GLP-I活性的方法來評價(jià)GLP-I受體激動劑或GLP-I受體 激動劑/ELP化合物體內(nèi)誘導(dǎo)胰島素產(chǎn)生的能力。例如，可將ELP/GLP-1受體激動劑化合 物導(dǎo)入細(xì)胞，例如無限增殖化β細(xì)胞，并可使所得細(xì)胞與葡萄糖接觸。如果細(xì)胞在響應(yīng) 葡萄糖時產(chǎn)生胰島素，則一般把修飾的GLP-I視為在體內(nèi)有生物活性(Fehmarm等，1992， Endocrinology 130:159-166)。本文更詳細(xì)地描述了示例性的測定法。還可采用已知測定法測定GLP-I受體激動劑/ELP化合物促進(jìn)β細(xì)胞增殖、抑 制β細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)胰島生長的能力。胰β細(xì)胞增殖可通過3H-胸苷或BrdU摻入測 定法評價(jià)(參見例如Buteau等，2003，Diabetes 52 124-32)，其中使胰β細(xì)胞(例如 INS (832/13)細(xì)胞與ELP/GLP-1受體激動劑化合物接觸，并分析3H-胸苷或BrdU摻入的增 力口。可在培養(yǎng)的胰島素分泌細(xì)胞中和/或在由于β細(xì)胞凋亡速率過快而發(fā)生糖尿病的動物 模型中測定ELP/GLP-1受體激動劑化合物的抗凋亡活性(參見例如Bulotta等，2004，Cell BiochemBiophys 40 (增刊 3) :65_78)。除GLP-I以外，該家族的其它肽(例如由胰高血糖素原基因加工得到的肽，例如 GLP-2、GIP和泌酸調(diào)節(jié)肽(oxyntomodulin))也可與ELP成分(如本文所述)綴合或融合 以提高其治療潛力。胰島素在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含ELP成分與胰島素偶聯(lián)(例如通過融合或綴 合)的治療劑。可以使用胰島素注射劑(例如人胰島素注射劑)治療糖尿病。機(jī)體的產(chǎn)胰 島素細(xì)胞稱為β細(xì)胞，而且它們存在于胰腺中。這些細(xì)胞聚集在一起形成“胰島”，以描述 胰島的德國醫(yī)科學(xué)生命名。胰島素的合成始于胰島素基因的翻譯，該基因位于11號染色體上。在翻譯期間， 兩個內(nèi)含子從mRNA產(chǎn)物中切割出來，其編碼長度為110個氨基酸的蛋白質(zhì)。這種主要的翻 譯產(chǎn)物稱為前胰島素原，并且是無活性的。它含有長度為24個氨基酸的信號肽，這是蛋白 質(zhì)跨過細(xì)胞膜所必需的。一旦前胰島素原到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，蛋白酶便切下信號肽以產(chǎn)生胰島素原。胰島素 原由3個結(jié)構(gòu)域組成氨基端B鏈、羧基端A鏈和中間稱為C肽的連接肽。胰島素由稱 為 A 鏈(21 個氨基酸-GIVEQCCASVCSLYQLENYCN) (SEQ ID NO 15)和 B 鏈(30 個氨基酸 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA) (SEQ ID NO 16)的兩條氨基酸鏈組成，兩條氨基酸鏈 兩個二硫鍵連接在一起。A鏈內(nèi)有第3個二硫鍵，將A鏈第6個和第11個殘基連接在一起。在大多數(shù)物種中，A鏈和B鏈的長度和氨基酸組成類似，3個二硫鍵的位置是極其保守的。 由于這個原因，豬胰島素可代替糖尿病患者的人胰島素水平不足。如今，豬胰島素在很大程 度上已經(jīng)被通過細(xì)菌大規(guī)模生產(chǎn)的人胰島素原(重組胰島素)代替。胰島素分子具有在溶液中形成二聚體的趨向，而且在鋅離子存在時胰島素二聚體 締合成六聚體。而胰島素單體容易通過血液擴(kuò)散并且快速起效，六聚體擴(kuò)散緩慢且起效延 遲。在設(shè)計(jì)重組胰島素時，可以降低胰島素分子形成二聚體和六聚體的趨勢但不會中斷與 胰島素受體結(jié)合的方式對胰島素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾。這樣，制成從短效到長效的各種制劑。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，胰島素原暴露于脫去C肽的若干特異性肽酶，從而產(chǎn)生成熟和活性 形式的胰島素。在高爾基體中，胰島素和游離的C肽被包裝到在β細(xì)胞的胞質(zhì)中蓄積的分 泌性顆粒中。分泌顆粒的胞吐作用由葡萄糖進(jìn)入β細(xì)胞觸發(fā)。胰島素的分泌對代謝具有 廣泛的影響。在響應(yīng)葡萄糖升高時，胰島素的釋放分兩個階段。第一是胰島素的立即釋放。這 可歸于貯存在分泌顆粒中的預(yù)先形成的胰島素的釋放。在短暫延遲后，便有新合成胰島素 的第二次更持久的釋放。一旦釋放，胰島素只是短暫具有活性，然后被酶降解。胰島素酶存在于肝和腎中， 其分解在血漿中的循環(huán)胰島素，因此，胰島素的半壽期僅約為6分鐘。這種短期作用導(dǎo)致循 環(huán)中的胰島素水平快速變化。已開發(fā)出具有改進(jìn)的治療性質(zhì)的胰島素類似物(Owens等，2001，Lancet358 739-46 ；Vajo等，2001 ,Endocr Rev 22 :706-17)，且這類類似物可與本發(fā)明聯(lián)用。采用各種 策略，包括延長胰島素B鏈的COOH端和改造對白蛋白具有相當(dāng)親和力的脂肪酸?；囊葝u 素，來產(chǎn)生更長效的胰島素類似物。然而，用可獲得的更長效的胰島素化合物進(jìn)行體內(nèi)治療 仍導(dǎo)致高頻率的低血糖和高血糖波動以及HbA1。的一般降低。因此，開發(fā)真正長效而穩(wěn)定的 人胰島素類似物仍是一項(xiàng)重要任務(wù)。可用于本發(fā)明的胰島素的功能類似物包括快速起效的類似物，例如賴脯胰島素、 門冬胰島素和格魯辛胰島素(glulisine)，它們在皮下注射后快速吸收(< 30分鐘)，1小 時達(dá)峰值，而且作用時間相對較短(3-4小時)。此外，已開發(fā)出可與本發(fā)明聯(lián)用的兩種長效 胰島素類似物甘精胰島素和地特胰島素。長效胰島素類似物大約2小時開始起效，4-6小 時生物作用達(dá)到平穩(wěn)期，并可持續(xù)長達(dá)M小時。因此，在一個實(shí)施方案中，胰島素成分可含有賴脯胰島素(亦稱Humalog，Eli Lilly)的A鏈和/或B鏈。賴脯胰島素因觀位上的脯氨酸被賴氨酸取代，且胰島素8鏈四 位上的賴氨酸被脯氨酸取代而不同于人胰島素。雖然這些修飾不改變受體結(jié)合，但它們有 助于阻斷胰島素二聚體和六聚體的形成，使得餐后注射可獲得較大量活性的單體胰島素。在另一個實(shí)施方案中，胰島素可含有門冬胰島素(亦稱NovologjovoNordisk)的 A鏈和/或B鏈。門冬胰島素被設(shè)計(jì)成在人胰島素B鏈觀位上的氨基酸脯氨酸被天冬氨酸 單一置換。這種修飾有助于阻斷胰島素六聚體的形成，產(chǎn)生更快速起效的胰島素。在又一個實(shí)施方案中，胰島素可含有格魯辛胰島素(亦稱Apidra， Sanofi-Aventis)的A鏈和/或B鏈。格魯辛胰島素是短效類似物，由人胰島素B鏈3位上 的天冬酰胺被賴氨酸取代，且四位的賴氨酸被谷氨酰胺取代而產(chǎn)生。與正常的人胰島素相 比，格魯辛胰島素起效更快，作用時間更短。
在另一個實(shí)施方案中，胰島素可含有甘精胰島素(亦稱Lantus，Sanof i-Aventis) 的A鏈和/或B鏈。甘精胰島素不同于人胰島素，因?yàn)锳鏈21位的氨基酸天冬酰胺被甘氨 酸置換，且將2個精氨酸加至B鏈C端。與睡前中性低精蛋白鋅(NPH)胰島素(一種中效 胰島素)相比，甘精胰島素與2型糖尿病患者較少的夜間低血糖有關(guān)。在又一個實(shí)施方案中，胰島素可含有地特胰島素(亦稱Levemir,NovoNordisk)的 A鏈和/或B鏈。地特胰島素是可溶性的(中性pH)長效胰島素類似物，其中去除B30位的 氨基酸蘇氨酸，且將14-碳肉豆蔻酰脂肪酸乙?；癁長ysB^W ε-氨基。在皮下注射后， 地特胰島素解離，從而暴露出能夠與白蛋白分子可逆結(jié)合的游離脂肪酸。因此在穩(wěn)定狀態(tài) 下，未結(jié)合的游離胰島素的濃度大大降低，導(dǎo)致穩(wěn)定的血漿葡萄糖水平。在一些實(shí)施方案中，胰島素可以是單鏈胰島素類似物(SIA)(例如參見6，630，438 和W008/019368，其通過引用其整體結(jié)合到本文中)。單鏈胰島素類似物包括一組結(jié)構(gòu)上相 關(guān)的蛋白質(zhì)，其中A鏈和B鏈與多肽接頭共價(jià)連接。多肽接頭將B鏈的C端連接至A鏈的 N端。接頭可以是任何長度，只要接頭提供對于SIA具有葡萄糖攝取和胰島素受體結(jié)合作 用所必需的結(jié)構(gòu)構(gòu)象。在一些實(shí)施方案中，接頭長度約為5-18個氨基酸。在其它實(shí)施方案 中，接頭長度約為9-15個氨基酸。在某些實(shí)施方案中，接頭長約12個氨基酸。在某些示例 性實(shí)施方案中，接頭具有序列 KDDNPNLraLVR(SEQ ID NO :20)或 GAGSSSRRAPQT (SEQ ID NO: 21)。然而，應(yīng)當(dāng)了解的是，這個序列可能有許多變化(例如氨基酸的長度(添加和缺失兩 者)和取代)但基本上不損害所產(chǎn)生的SIA在葡萄糖攝取和胰島素受體結(jié)合活性方面的功 效。例如，可在任一端添加或脫去若干不同的氨基酸殘基但基本上不降低所產(chǎn)生的SIA的 活性。目前處于臨床研發(fā)中的示例性單鏈胰島素類似物是albulin(Duttaroy等，2005， Diabetes 54 :251-8) 0 albulin可在酵母或哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生。它由經(jīng)十二肽接頭連接 在一起并與天然人血清白蛋白的NH2端融合的人胰島素的B鏈和A鏈(與天然人胰島素有 100%同一性)組成。為了表達(dá)和純化albulin，Duttaroy等人使用4個重疊引物和PCR擴(kuò) 增，構(gòu)建了編碼含有經(jīng)十二肽接頭連接在一起的成熟人胰島素的B鏈和A鏈的單鏈胰島素 的合成基因構(gòu)建體。將所得PCR產(chǎn)物在人血清白蛋白(HSA)的信號肽和成熟HSA的NH2端 之間符合讀框地連接，裝入PSAC35載體中用于在酵母內(nèi)表達(dá)。按照本發(fā)明，abulin的HSA 成分可用本文所述的ELP成分置換。因此，一方面，本發(fā)明提供包含彈性蛋白樣肽(ELP)和胰島素或其功能類似物的 治療劑。例如，在某些實(shí)施方案中，胰島素是哺乳動物胰島素，例如人胰島素或豬胰島素。按 照本發(fā)明，ELP成分可與胰島素A鏈、或B鏈、或兩條鏈偶聯(lián)(例如通過重組融合或化學(xué)綴 合)。胰島素可包含A鏈、B鏈和C鏈中的每條鏈(SEQ ID NO :51和52)，或者可包含僅含有A 鏈和B鏈的加工形式。在一些實(shí)施方案中，A鏈和B鏈通過短的連接肽連接產(chǎn)生單鏈胰島素。 胰島素可以是人胰島素的功能類似物，包括在N端和/或C端(A鏈和B鏈的任一條或兩條) 截短1-10個氨基酸(包括1、2、3個或約5個氨基酸)的功能片段。相對于天然序列(例如 SEQ ID NO 15和16)，功能類似物可含有1_10個氨基酸插入、缺失和/或取代(總體上)， 并且在每種情況下都保持肽的活性。例如，相對于天然序列(其可含有A鏈和B鏈，或A鏈、 B鏈和C鏈)，功能類似物可具有1、2、3、4或5個氨基酸插入、缺失和/或取代(總體上)。 可采用任何可獲得的測定法(包括本文所述方法)證實(shí)或測定這類活性。在這些或其它實(shí)施方案中，胰島素成分與A鏈和B鏈的每個天然序列(SEQ ID N0:15和16)有至少約75%、 80%、85%、90%、95%或98%同一性。兩個序列之間(例如天然序列和功能類似物之間) 序列同一性的測定可采用任何比對工具完成，包括Tatusova等，Blast 2 seguences-anew tool for comparinR protein and nucleotide sequences (Blast 2 序歹Ij _——禾中比較蛋白 質(zhì)和核苷酸序列的新型工具)，F(xiàn)EMS Microbiol Lett. 174 :247_250 (1999)。胰島素成分可 含有本領(lǐng)域已知的其它化學(xué)修飾。
另一方面，本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防以下疾病的方法糖尿病，包括I型和II型 糖尿病。所述方法包括給予有其需要的患者有效量的包含彈性蛋白樣肽(ELP)成分和胰島 素(或其功能類似物)成分的治療劑?；颊咭话憧梢允侨嘶蚍侨祟悇游?例如狗、貓、牛或 馬)患者。優(yōu)選患者是人。為了表征胰島素類似物或含有ELP的胰島素類似物的體外結(jié)合性質(zhì)，可以在表 達(dá)胰島素受體的各種細(xì)胞系中進(jìn)行競爭結(jié)合測定法(Jehle等，1996，Diabetologia 39: 421-432)。例如，可以采用使用CHO細(xì)胞過量表達(dá)人胰島素受體的競爭結(jié)合測定法。胰島 素還可以比胰島素受體低的親和力與IGF-I受體結(jié)合。為了測定含有ELP的胰島素類似物 的結(jié)合親和力，可以在L6細(xì)胞中使用125I標(biāo)記的IGF-I進(jìn)行競爭結(jié)合測定法。胰島素的活性包括刺激外周葡萄糖清除和抑制肝葡萄糖產(chǎn)生?？刹捎靡阎椒w 外測定含有ELP的胰島素類似物介導(dǎo)這些生物活性的能力。例如，可以在3T3-L1脂肪細(xì) 胞中測定含有ELP的類似物對葡萄糖攝取的作用，并與胰島素的作用進(jìn)行比較。細(xì)胞用生 物活性類似物預(yù)處理一般可在2-脫氧葡萄糖攝取時產(chǎn)生劑量依賴性的增加?？梢栽谠S多 細(xì)胞類型中測定含有ELP的胰島素類似物調(diào)節(jié)葡萄糖產(chǎn)生的能力，例如，H411e肝細(xì)胞瘤細(xì) 胞。在該測定法中，用生物活性類似物預(yù)處理一般將導(dǎo)致劑量依賴性地抑制葡萄糖釋放量。因子 VII(VIIa)在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含ELP成分與因子Vll/VIIa偶聯(lián)(例如通過融 合或綴合)的治療劑。凝血是血液凝塊形成的生物過程，涉及許多不同的絲氨酸蛋白酶及 其必需的輔因子和抑制劑。它始于因子VII (FVII)和因子Vlla(FVIIa)暴露于其膜結(jié)合 的輔因子即組織因子(TF)，導(dǎo)致因子Xa(FXa)和更多FVIIa的產(chǎn)生。該過程之后產(chǎn)生因子 IXa(FIXa)和進(jìn)一步的FXa，其與相應(yīng)的輔因子FVIIIa和FVa結(jié)合時形成血小板結(jié)合復(fù)合 物，最終導(dǎo)致形成凝血酶和血纖蛋白凝塊。凝血酶還通過激活輔因子(例如FV和FVII)和 酶原(例如因子XI)進(jìn)一步增強(qiáng)凝血。此外，凝血酶激活血小板導(dǎo)致血小板聚集，這是止血 栓子形成所需要的。因子VII在血液中以酶原形式循環(huán)，并通過因子IXa、因子Xa、因子Xlla、或凝血酶 通過輕微蛋白酶解轉(zhuǎn)化成其活性形式因子Vila。因子Vila為兩條鏈的50千道爾頓(kDa) 血漿絲氨酸蛋白酶。酶的活性形式包含重鏈(254個氨基酸殘基)和輕鏈(152個殘基)， 重鏈含有催化結(jié)構(gòu)域，輕鏈含有2個表皮生長因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)域。在血漿中循環(huán)的成熟 因子Vll/VIIa由406個氨基酸殘基組成(SEQ ID NO 33)。輕鏈和重鏈由二硫鍵連接在一 起。如上所述，因子VIIa由蛋白酶解其單鏈酶原因子VII的一個肽鍵而產(chǎn)生，因子 VII以約0.5 μ g/ml存在于血漿中。通過切割內(nèi)部肽鍵使酶原因子VII轉(zhuǎn)化成其活化的兩 條鏈分子。在人因子VII中，切割位點(diǎn)位于Argl52-Ilel53 (Hagen等，1986，PNAS USA 83 2412-6)。本申請使用的“因子Vll/VIIa”是指由未活化形式(因子VII)或活化形式(因子 Vila)或其混合物組成的產(chǎn)物。上述定義中的“因子Vll/VIIa”包括具有天然人因子VII / VIIa的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。它還包括具有稍加修飾的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，例如，修飾的 N末端包括N端氨基酸缺失或添加，只要這些蛋白質(zhì)基本上保持因子VIIa的活性。上述定 義中的“因子VII ”還包括可存在和發(fā)生在一個個體到另一個個體間的天然等位基因變異。 同樣，糖基化程度和位置或其它翻譯后修飾可以隨所選擇的宿主細(xì)胞和宿主細(xì)胞環(huán)境的性 質(zhì)而改變。在鈣離子存在時，因子VIIa以高親和力與TF結(jié)合。TF是263個氨基酸殘基糖蛋 白，由219個殘基胞外域、一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個短胞質(zhì)域組成(Morrissey等，1987，Cell 50 129-35)。TF胞外域由兩個各約105個氨基酸的纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域組成。FVIIa的 結(jié)合完全是由TF胞外域介導(dǎo)的(Muller等，1994, Biochem. 33 10864-70)。氨基酸16-26和 129-147區(qū)域的殘基有助于FVIIa的結(jié)合以及分子的促凝功能。殘基Lys20、Trp45、Asp58、 Tyr94和Phel40對FVIIa結(jié)合的自由能(AG)的貢獻(xiàn)較大(lkcal/mol)。TF在血漿分隔開的細(xì)胞和血管內(nèi)皮上組成型表達(dá)。通過暴露于炎性細(xì)胞因子或細(xì) 菌脂多糖誘導(dǎo)其在內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞上表達(dá)(Drake等，1989，J. Cell Biol. 109 389)。 在組織受損時，TF暴露的胞外域與FVII形成高親和力的鈣依賴性復(fù)合物。一旦與TF結(jié)合， 可通過肽鍵切割產(chǎn)生絲氨酸蛋白酶FVIIa而激活FVII。尚未闡明體內(nèi)催化這個步驟的酶， 但是體外FXa、凝血酶、TF FVIIa和FIXa可以催化這種切割。FVIIa對其生理底物FX和FIX 只有弱的活性，而TF:FVIIa復(fù)合物快速激活FX和FIX。TF:FVIIa復(fù)合物構(gòu)成血液凝固外源途徑的初級引發(fā)物。復(fù)合物通過激活FX成為 因子Xa (FXa)、激活FIX成為因子IXa (FIXa)及激活其它FVII成為FVIIa而啟動外源途徑。 TF:FVIIa的作用最終導(dǎo)致凝血酶原轉(zhuǎn)化成可進(jìn)行許多生物功能的凝血酶。凝血酶最重要的 活性是將血纖蛋白原轉(zhuǎn)化為血纖蛋白，而血纖蛋白聚合形成凝塊。TF:FVIIa復(fù)合物還作為 次級因子參與延伸接觸激活系統(tǒng)的生理效應(yīng)。凝血的初始調(diào)節(jié)和后續(xù)調(diào)節(jié)是復(fù)雜的，因?yàn)橹寡木S持對于生存是決定性的。在 止血(正常凝塊形成和溶解)和血栓形成(病理凝塊形成)之間存在微妙的平穩(wěn)。涉及凝 血異常的嚴(yán)重臨床病癥包括深靜脈血栓形成、心肌梗死、肺栓塞、中風(fēng)和彌散性血管內(nèi)凝血 (膿毒癥中)。還有許多流血性凝血病，其中凝塊形成不足。這些包括血友病A(FVIII缺乏 癥)或血友病B(FIX缺乏癥)，其中需要促凝血療法。這個治療領(lǐng)域的挑戰(zhàn)是在太多凝血和 太少凝血之間的窄窗位下操作。研究表明，用作治療劑的外源FVIIa在血友病A和血友病B患者中誘導(dǎo)止 血(Hedner，2001， Seminars Hematol. 38 ( ±曾干Ij 12) 43-7 ；Hedner, 2004, Seminars Hemat01.41(增刊1) :35_9)。它還被用來治療肝病患者的出血、抗凝血誘發(fā)性出血、夕卜 科手術(shù)、血小板減少、血小板機(jī)能不全、Bemard-Soulier綜合征、馮威勒布蘭特氏病(von Willebrand disease)和其它出血病癥(參見例如Roberts 等，2004，Blood 104 :3858_64)。人重組FVIIa的市售制劑以NovoSeven 銷售。NovoSeven 標(biāo)明用于治療血友病 A或B患者的出血，而且是現(xiàn)行唯一有效用于出血的重組FVIIa。在“Summary Basis for Approval for NovoSeven ”FDA參考號96-0597中報(bào)道了半壽期為2. 3小時的循環(huán)重組，重組FVIIa的半壽期在兒科患者中較短(約1.3小時)，這就表明在這個人群 中可能需要較高劑量的重組FVIIa (Roberts等，2004，Blood 104:3858-64)。因此，需要相 對較高劑量和頻率的給藥以達(dá)到和維持所需要的治療或預(yù)防效果。因此，難以獲得適當(dāng)?shù)?劑量調(diào)節(jié)，并且頻繁的靜脈內(nèi)給藥的需要給患者的生活方式帶來限制。具有較長循環(huán)半壽期的分子可減少需要的給藥次數(shù)?？紤]到現(xiàn)行可用的FVIIa療 法的頻繁注射問題以及為了獲得FVIIa的更佳治療水平以及伴隨的治療效果提高的潛力， 顯然需要體內(nèi)半壽期較長的改進(jìn)的FVII或FVIIa樣分子。已經(jīng)證實(shí)，重組人凝血因子 VIIa(rFVIIa，NovoSeven ；Novo NordiskA/S, Copenhagen, Denmark)與抑制劑一起有效治療血友病患者的出血。少部分患者可能對 rFVIIa治療無效，可能獲益于具有功效提高的遺傳修飾的FVIIa分子。為此，已經(jīng)對 固有活性提高的FVIIa類似物進(jìn)行了研究，其表現(xiàn)出上好的體外止血特性(參見例如 W002/077218或W005/074975，其通過引用其整體結(jié)合到本文中，以及Tranholm等，2003， Blood 102(10) :3615-20，同樣通過引用結(jié)合)。這些類似物還可以在其中已觀察到rFVIIa 功效的其它適應(yīng)癥(包括血小板減少和創(chuàng)傷)中用作更有效的止血藥。因此，在一些實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明的因子VIIa類似物與W002/077218或 W005/074975所描述的一樣。例如，F(xiàn)VIIa類似物可具有在298位取代甲硫氨酸的谷氨酰 胺(即iC98Q-FVIIa)。在某些示例性實(shí)施方案中，F(xiàn)VIIa類似物含有兩個其它突變，158位 的纈氨酸被天冬氨酸置換，296位的谷氨酸被纈氨酸置換(即V158D/E^6V/iC98Q-FVIIa)。 或者，因子VIIa類似物可具有在337位取代賴氨酸的丙氨酸殘基(即V158D/E^6V/iC98Q/ K337A-FVIIa)。在另一些實(shí)施方案中，因子Vila類似物具有選自Q250C、P406C和407C的 取代或插入，其中半胱氨酸也被引入C端序列(參見例如US 7，235，638，其通過引用其整體 結(jié)合到本文中)。因子VIIa類似物還可包含在M7J60、393、396和/或405位的一個或多 個位置上的取代或插入。在這些或其它實(shí)施方案中，因子VIIa類似物包含相對于天然因子VIIa序列的選 自以下的取代(a)Lysl57被選自Gly、Val、Ser、Thr、ASp和Glu的氨基酸取代；(b) Lys337 被選自 Ala、Gly、Val、Ser、Thr、Gin、Asp 和 Glu 的氨基酸取代；(c) Asp334 被 Ala 或 Asn 以外的任何氨基酸取代；和(d) Ser336被Ala或Cys以外的任何氨基酸取代(參見例如US 7，176，觀8，其通過引用其整體結(jié)合到本文中)?；蛘?，因子VIIa類似物包含因子VII 305位 上的Leu被選自以下的氨基酸殘基取代Val、lie、Met、Phe、Trp、Pro, Gly、Ser, Thr、Cys、 Tyr、Asn、Glu、Lys, Arg、His、Asp和Gln (參見例如US 6，905，683，其通過引用其整體結(jié)合 到本文中)。因此，一方面，本發(fā)明提供包含彈性蛋白樣肽(ELP)和因子Vll/VIIa或其功能類 似物的治療劑。例如，在某些實(shí)施方案中，因子Vll/VIIa是人因子Vll/VIIa(例如SEQ ID NO 33)。因子Vll/VIIa可以是人因子Vll/VIIa的功能類似物，包括在N端和/或C端截 短達(dá)1-10個氨基酸(包括1、2、3或約5個氨基酸)的功能片段。相對于天然序列(例如 SEQ ID NO 33)，功能類似物可含有1_10個氨基酸插入、缺失和/或取代(總體上)，并且 在每種情況下都保持肽的活性。例如，相對于天然全長序列，或相對于重鏈和輕鏈之一或兩 者，這類類似物可具有1個至約5個氨基酸插入、缺失和/或取代(總體上)?？刹捎萌魏?可獲得的測定法(包括本文所述方法)證實(shí)或測定這類活性。在這些或其它實(shí)施方案中，因子VII/VIIa成分與天然序列(SEQ ID NO :33)有至少約75%、80%、85%、90%、95%或 98%同一性。兩個序列之間(例如天然序列和功能類似物之間)序列同一性的測定可采 用7[壬 可比對工具完成，包f舌 Tatusova 等，Blast 2 seauences~a new tool for comparinR protein andnucleotide sequences (Blast 2序列一一禾中比較蛋白質(zhì)禾口核昔酸序列的新型 工具),FEMS Microbiol Lett. 174 :247-250(1999)。在示例性的實(shí)施方案中，因子VII-ELP融合物具有SEQ ID NO 58的氨基酸序列。 SEQ ID NO 58在因子VII和ELP序列之間還包含TEV蛋白酶切割位點(diǎn)，這可能對需要時在 表達(dá)后脫去ELP序列是有益的。然而，按照本發(fā)明，可完全脫去tev序列，或用如本文公開 的其它連接序列置換。另一方面，本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防出血相關(guān)疾病的方法。所述方法包括給予 有需要的患者有效量的包含彈性蛋白樣肽(ELP)和因子VII/VIIa或其功能類似物的治療 劑。在某些實(shí)施方案中，出血相關(guān)疾病是一種或多種血友病(A或B)、手術(shù)后出血、抗凝血 誘發(fā)性出血、血小板減少、因子VII缺乏癥、因子XI缺乏癥、肝病患者的出血、血小板機(jī)能不 全、Bemard-Soulier綜合征、馮威勒布蘭特氏病和顱內(nèi)出血?；颊咭话闶侨嘶蚍侨祟悇游?(例如狗、貓、?；蝰R)患者。優(yōu)選患者是人。為了表征疑似因子VII/VIIa類似物或含有ELP的因子VIIa類似物的體外結(jié)合 性質(zhì)，如前所述進(jìn)行TF結(jié)合測定(參見例如Chaing等，1994，Blood83 (12) =3524-35)。簡 單地講，可將重組人TF在碳酸鹽抗原緩沖液中于4°C過夜包被于Immulon II板上。同樣 將BSA包被于板上用作對照。將含有ELP的因子VIIa類似物以不同濃度加入TBS-T緩沖 液中。幾次洗滌后，加入單特異性多克隆兔抗人FVIIa血清，并于室溫溫育約1小時。接下 來，依次加入與堿性磷酸酶綴合的山羊抗兔IgG和用于檢測的堿性磷酸酶底物PNPP。減去 背景信號后，讀取約405nm下的吸光度，其與因子VIIa結(jié)合固定化TF的程度成正比。然后 將這些值與含有因子VIIa的對照血漿進(jìn)行比較。可以在人FVII缺乏癥血漿中測定因子VII/VIIa類似物或含有ELP的因子VIIa類 似物的凝血能力。在該測定法中，將稀釋成不同濃度的含有ELP的因子VIIa類似物直接加 入FVII缺乏癥血漿中。在血凝儀中，可將一份血漿士FVIIa類似物與2份hn0VinTM(Dade， Miami,Fla)凝血酶原時間試劑(具有磷脂和CaCl2的重組人組織因子)混合。目測凝塊形 成，測量凝固時間。將凝固時間(秒)與僅FVII缺乏癥血漿的平均凝固時間進(jìn)行比較，按 凝固時間相對于FVIIa類似物濃度作圖。治療性蛋白質(zhì)本發(fā)明還提供包含選自表1的ELP成分和至少一種治療性蛋白質(zhì)的治療劑。ELP 成分和治療性蛋白質(zhì)可通過本文所述的重組融合或化學(xué)綴合偶聯(lián)。這類治療性蛋白質(zhì)以蛋 白質(zhì)名稱和Geru^eq Accession號列于表1中。本領(lǐng)域已知的各治療性蛋白質(zhì)的氨基酸序 列，通過引用表1所列各治療性蛋白質(zhì)結(jié)合到本文中。同樣列于表1的美國專利或PCT公 開文本中進(jìn)一步描述了這類治療性蛋白質(zhì)，且這類美國專利和PCT公開文本，尤其有關(guān)這 類治療性蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和所描述的功能類似物通過引用結(jié)合到本文中。表1還記載了所列各種治療性蛋白質(zhì)的生物活性，以及測定本發(fā)明的功能類似物 或藥劑(例如與ELP成分的融合物)的活性的示例性測定法。通常，表1所列治療性蛋白 質(zhì)的功能類似物可包括在N端和/或C端截短1-10個氨基酸(包括1、2、3、4或約5個氨基酸)的功能片段。相對于基礎(chǔ)序列(例如表1所列基礎(chǔ)序列)，功能類似物可含有1-10 個氨基酸插入、缺失和/或取代(總體上)，并在每種情況下保持治療性蛋白質(zhì)的全部或部 分生物活性(如表1所列活性)。例如，與基礎(chǔ)序列相比，功能類似物可具有1、2、3、4或5 個氨基酸插入、缺失和/或取代(總體上)?？刹捎萌魏慰色@得的測定法(包括表中所述測 定法)證實(shí)或測定這類活性。在這些或其它實(shí)施方案中，治療性蛋白質(zhì)與相應(yīng)的基礎(chǔ)序列 有至少約75%、80%、85%、90%、95%或98%同一性。所述分子還可包含本領(lǐng)域已知的其 它化學(xué)修飾。在一些實(shí)施方案中，治療性蛋白質(zhì)(例如選自表1的治療性蛋白質(zhì))的大小小于 約25kDa，或小于約IOkDa,或小于約5kDa，本發(fā)明相應(yīng)的治療劑(例如包含ELP成分)的分 子量小于約 60kDa、55kDa、50kDa 或 40kDa。表1還列出各治療性蛋白質(zhì)優(yōu)選的適應(yīng)癥，其相應(yīng)的治療劑可用于例如有關(guān)這類 適應(yīng)癥的治療或預(yù)防方法中。
權(quán)利要求
1.一種治療劑，其包含彈性蛋白樣肽(ELP)成分和治療成分，當(dāng)與單獨(dú)的所述治療成 分相比時，所述治療成分具有延長的循環(huán)半壽期和/或較低的治療有效量。
2.權(quán)利要求1的治療劑，其中所述治療成分是表1所列的治療性蛋白質(zhì)或其功能部分 或功能類似物。
3.權(quán)利要求2的治療劑，其中ELP成分在其N端和/或C端共價(jià)結(jié)合所述治療性蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的治療劑，其中一個治療成分在所述ELP成分的N端與ELP 成分共價(jià)結(jié)合，而第二治療成分在所述ELP成分的C端與ELP成分共價(jià)結(jié)合。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的治療劑，其中治療成分在其N端和/或C端共價(jià)結(jié)合所述 ELP成分。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的治療劑，其中第一ELP成分在所述治療成分的N端與治療 成分共價(jià)結(jié)合，而第二 ELP成分在所述治療成分的C端與治療成分共價(jià)結(jié)合。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的治療劑，其還包含在所述ELP成分和治療成分之間的間隔 基部分。
8.權(quán)利要求7的治療劑，其中所述間隔基部分包含一個或多個蛋白酶抗性部分、非肽 化學(xué)部分和蛋白酶切割位點(diǎn)。
9.權(quán)利要求8的治療劑，其中所述蛋白酶切割位點(diǎn)是凝血酶切割位點(diǎn)、因子切割位 點(diǎn)、金屬蛋白酶切割位點(diǎn)、腸激酶切割位點(diǎn)、Tev切割位點(diǎn)和組織蛋白酶切割位點(diǎn)。
10.權(quán)利要求9的治療劑，其中所述間隔基部分包含具有式[(Gly)n-kr]m(SEQID NO 22)的不可切割部分，其中η為1-4;且m為1-4。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的治療劑，其中所述ELP包含至少一個選自SEQID NO: 1-12的重復(fù)單元。
12.權(quán)利要求11的治療劑，其中所述重復(fù)單元是VPGXG(SEQID NO :3)。
13.權(quán)利要求12的治療劑，其中X為任何天然或非天然的氨基酸殘基，且其中X在至少 兩個單元中不同。
14.權(quán)利要求13的治療劑，其中每個X獨(dú)立選自以下氨基酸殘基丙氨酸、精氨酸、天 冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨 酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的治療劑，其中所述治療劑的分子量小于約50kDa。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的治療劑，其中所述ELP成分的Tt大于37°C。
17.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的治療劑，其中所述治療劑是遺傳編碼的融合蛋白。
18.一種多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求17的治療劑的核苷酸序列。
19.權(quán)利要求18的多核苷酸，其還包含與所述核苷酸序列有效連接的表達(dá)調(diào)控元件。
20.權(quán)利要求19的多核苷酸，其中所述表達(dá)調(diào)控元件包含啟動子。
21.一種載體，其包含權(quán)利要求18-20中任一項(xiàng)的多核苷酸。
22.—種分離的宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求21的載體或權(quán)利要求18-20中任一項(xiàng)的多核苷酸。
23.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的治療劑和藥學(xué)上可接受的載體 和/或賦形劑。
24.一種治療或預(yù)防患者的疾病、障礙或病癥的方法，所述方法包括將有效量的權(quán)利要 求1-17中任一項(xiàng)的治療劑或權(quán)利要求23的藥物組合物給予需要它的患者。
25.權(quán)利要求M的方法，其中所述患者患有表1所列的適應(yīng)癥。
26.一種治療劑，其包含彈性蛋白樣肽(ELP)成分和胰高血糖素樣肽(GLP)-I受體激動劑。
27.權(quán)利要求沈的治療劑，其中所述GLP-I受體激動劑是GLP-I或其功能類似物。
28.權(quán)利要求沈的治療劑，其中所述GLP-I受體激動劑是毒蜥外泌肽-4或其功能類似物。
29.權(quán)利要求沈-觀中任一項(xiàng)的治療劑，其中所述ELP成分在其N端和/或C端共價(jià)結(jié) 合所述GLP-I受體激動劑。
30.權(quán)利要求沈-29中任一項(xiàng)的治療劑，其中第一GLP-I受體激動劑在所述ELP成分 的N端與ELP成分共價(jià)結(jié)合，而第二 GLP-I受體激動劑在所述ELP成分的C端與ELP成分 共價(jià)結(jié)合。
31.權(quán)利要求沈-30中任一項(xiàng)的治療劑，其中所述GLP-I受體激動劑在其N端和/或C 端共價(jià)結(jié)合所述ELP成分。
32.權(quán)利要求沈-31中任一項(xiàng)的治療劑，其中第一ELP成分在所述GLP-I受體激動劑 的N端與GLP-I受體激動劑共價(jià)結(jié)合，而第二 ELP成分在所述GLP-I受體激動劑的C端與 GLP-I受體激動劑共價(jià)結(jié)合。
33.權(quán)利要求沈-32中任一項(xiàng)的治療劑，其還包含在所述ELP成分和GLP-受體激動劑 之間的間隔基部分。
34.權(quán)利要求33的治療劑，其中所述間隔基部分包含一個或多個蛋白酶抗性部分、非 肽化學(xué)部分和蛋白酶切割位點(diǎn)。
35.權(quán)利要求34的治療劑，其中所述蛋白酶切割位點(diǎn)是凝血酶切割位點(diǎn)、因子fe切割 位點(diǎn)、金屬蛋白酶切割位點(diǎn)、腸激酶切割位點(diǎn)、Tev切割位點(diǎn)和組織蛋白酶切割位點(diǎn)。
36.權(quán)利要求34的治療劑，其中所述間隔基部分包含具有式[(Gly)n-kr]m(SEQID NO 22)的不可切割部分，其中η為1-4 ；且m為1_4。
37.權(quán)利要求沈-36中任一項(xiàng)的治療劑，其中所述ELP包含至少一個選自SEQID NO: 1-12的重復(fù)單元。
38.權(quán)利要求37的治療劑，其中所述重復(fù)單元是VPGXG(SEQID NO :3)。
39.權(quán)利要求38的治療劑，其中X為任何天然或非天然的氨基酸殘基，且其中X在至少 兩個單元中不同。
40.權(quán)利要求38的治療劑，其中每個X獨(dú)立選自以下氨基酸殘基丙氨酸、精氨酸、天 冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨 酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。
41.權(quán)利要求沈-40中任一項(xiàng)的治療劑，其中所述治療劑的分子量小于約50kDa。
42.權(quán)利要求沈-40中任一項(xiàng)的治療劑，其中所述ELP成分的Tt大于37°C。
43.權(quán)利要求沈-42中任一項(xiàng)的治療劑，其中所述治療劑是遺傳編碼的融合蛋白。
44.一種多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求43的治療劑的核苷酸序列。
45.權(quán)利要求44的多核苷酸，其還包含與所述核苷酸序列有效連接的表達(dá)調(diào)控元件。
46.權(quán)利要求45的多核苷酸，其中所述表達(dá)調(diào)控元件包含啟動子。
47.一種載體，其包含權(quán)利要求44-46中任一項(xiàng)的多核苷酸。
48.一種分離的宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求47的載體或權(quán)利要求44-46中任一項(xiàng)的多 核苷酸。
49.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求沈-43中任一項(xiàng)的治療劑和藥學(xué)上可接受的載 體和/或賦形劑。
50.一種治療或預(yù)防患者的生物學(xué)病癥、障礙或疾病的方法，所述方法包括將有效量的 權(quán)利要求26-43中任一項(xiàng)的治療劑或權(quán)利要求49的藥物組合物給予需要它的患者。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述患者患有糖尿病。
52.一種治療劑，其包含彈性蛋白樣肽(ELP)成分和胰島素或其功能類似物。
53.權(quán)利要求52的治療劑，其中所述ELP成分在其N端和/或C端共價(jià)結(jié)合所述胰島 素或功能類似物。
54.權(quán)利要求52或53的治療劑，其中第一胰島素或功能類似物在所述ELP成分的N端 與ELP成分共價(jià)結(jié)合，而第二胰島素或功能類似物在所述ELP成分的C端與ELP成分共價(jià)結(jié)合。
55.權(quán)利要求52的治療劑，其中所述胰島素或功能類似物在其N端和/或C端共價(jià)結(jié) 合所述ELP成分。
56.權(quán)利要求52或53的治療劑，其中第一ELP成分在其N端共價(jià)結(jié)合所述胰島素或功 能類似物，而第二 ELP成分在其C端共價(jià)結(jié)合所述胰島素或功能類似物。
57.權(quán)利要求52-56中任一項(xiàng)的治療劑，其還包含在所述ELP成分和所述胰島素或功能 類似物之間的間隔基部分。
58.權(quán)利要求57的治療劑，其中所述間隔基部分包含一個或多個蛋白酶抗性部分、非 肽化學(xué)部分和蛋白酶切割位點(diǎn)。
59.權(quán)利要求58的治療劑，其中所述蛋白酶切割位點(diǎn)是凝血酶切割位點(diǎn)、因子fe切割 位點(diǎn)、金屬蛋白酶切割位點(diǎn)、腸激酶切割位點(diǎn)、Tev切割位點(diǎn)或組織蛋白酶切割位點(diǎn)。
60.權(quán)利要求58的治療劑，其中所述間隔基部分包含具有式[(Gly)n-kr]m(SEQID NO 22)的不可切割部分，其中η為1-4 ；且m為1_4。
61.權(quán)利要求52-60中任一項(xiàng)的治療劑，其中所述ELP成分包含至少一個選自SEQID NO 1-12的重復(fù)單元。
62.權(quán)利要求61的治療劑，其中所述重復(fù)單元是VGPXG(SEQID NO :3)。
63.權(quán)利要求61的治療劑，其中所述重復(fù)單元是Ile-Pro-Gly-X-Gly(SEQ ID NO :5)或 Leu-Pro-Gly-X-Gly (SEQ ID NO :7)，其中X為任何天然或非天然的氨基酸殘基，且其中X在 至少兩個單元中不同。
64.權(quán)利要求62或63的治療劑，其中每個X獨(dú)立選自以下氨基酸殘基丙氨酸、精氨 酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲 硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。
65.權(quán)利要求52-64中任一項(xiàng)的治療劑，其中所述治療劑的分子量小于約50kDa。
66.權(quán)利要求52-65中任一項(xiàng)的治療劑，其中所述ELP成分的Tt大于37°C。
67.權(quán)利要求52-66中任一項(xiàng)的治療劑，其中所述治療劑是遺傳編碼的融合蛋白。
68.一種多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求67的治療劑的核苷酸序列。
69.權(quán)利要求68的多核苷酸，其還包含與所述核苷酸序列有效連接的表達(dá)調(diào)控元件。
70.權(quán)利要求69的多核苷酸，其中所述表達(dá)調(diào)控元件包含啟動子。
71.一種載體，其包含權(quán)利要求68-70中任一項(xiàng)的多核苷酸。
72.—種分離的宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求71的載體或權(quán)利要求68-70中任一項(xiàng)的多核苷酸。
73.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求52-67中任一項(xiàng)的治療劑和藥學(xué)上可接受的載 體和/或賦形劑。
74.一種預(yù)防或治療患者的生物學(xué)病癥、障礙或疾病的方法，所述方法包括將有效量的 權(quán)利要求52-67中任一項(xiàng)的治療劑或權(quán)利要求73的藥物組合物給予需要它的患者。
75.權(quán)利要求74的方法，其中所述患者患有糖尿病。
76.一種治療劑，其包含彈性蛋白樣肽(ELP)成分和因子Vll/VIIa或其功能類似物。
77.權(quán)利要求76的治療劑，其中所述ELP成分與所述因子Vll/VIIa或功能類似物在因 子Vll/VIIa的N端和/或C端共價(jià)結(jié)合。
78.權(quán)利要求76或77的治療劑，其中第一因子Vll/VIIa或功能類似物在所述ELP成 分的N端與ELP共價(jià)結(jié)合，而第二因子Vll/VIIa或功能類似物在所述ELP成分的C端與 ELP成分共價(jià)結(jié)合。
79.權(quán)利要求76的治療劑，其中所述因子Vll/VIIa或功能類似物與所述ELP成分在 ELP成分的N端和/或C端共價(jià)結(jié)合。
80.權(quán)利要求76或77的治療劑，其中第一ELP成分在其N端共價(jià)結(jié)合所述因子VII/ VIIa或功能類似物，而第二 ELP成分在其C端共價(jià)結(jié)合所述因子Vll/VIIa或功能類似物。
81.權(quán)利要求76-80中任一項(xiàng)的治療劑，其還包含在所述ELP成分和因子Vll/VIIa或 功能類似物之間的間隔基部分。
82.權(quán)利要求81的治療劑，其中所述間隔基部分包含一個或多個蛋白酶抗性部分、非 肽化學(xué)部分和蛋白酶切割位點(diǎn)。
83.權(quán)利要求82的治療劑，其中所述蛋白酶切割位點(diǎn)是凝血酶切割位點(diǎn)、因子fe切割 位點(diǎn)、金屬蛋白酶切割位點(diǎn)、腸激酶切割位點(diǎn)、Tev切割位點(diǎn)和組織蛋白酶切割位點(diǎn)。
84.權(quán)利要求82的治療劑，其中所述間隔基部分包含具有式[(Gly)n-kr]m(SEQID NO 22)的不可切割部分，其中η為1-4 ；且m為1_4。
85.權(quán)利要求76-84中任一項(xiàng)的治療劑，其中所述ELP成分包含至少一個選自SEQID NO 1-12的重復(fù)單元。
86.權(quán)利要求85的治療劑，其中所述重復(fù)單元是VPGXG(SEQID NO 3)。
87.權(quán)利要求86的治療劑，其中X為任何天然或非天然的氨基酸殘基，且其中X在至少 兩個單元中不同。
88.權(quán)利要求86的治療劑，其中每個X獨(dú)立選自以下氨基酸殘基丙氨酸、精氨酸、天 冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨 酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。
89.權(quán)利要求76-88中任一項(xiàng)的治療劑，其中所述治療劑的分子量小于約70kDa。
90.權(quán)利要求76-89中任一項(xiàng)的治療劑，其中所述ELP成分的Tt大于37°C。
91.權(quán)利要求76-90中任一項(xiàng)的治療劑，其中所述治療劑是遺傳編碼的融合蛋白。
92.一種多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求91的治療劑的核苷酸序列。
93.權(quán)利要求92的多核苷酸，其還包含與所述核苷酸序列有效連接的表達(dá)調(diào)控元件。
94.權(quán)利要求93的多核苷酸，其中所述表達(dá)調(diào)控元件包含啟動子。
95.一種載體，其包含權(quán)利要求92-94中任一項(xiàng)的多核苷酸。
96.一種分離的宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求95的載體或權(quán)利要求92-95中任一項(xiàng)的多核苷酸。
97.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求76-91中任一項(xiàng)的治療劑和藥學(xué)上可接受的載 體和/或賦形劑。
98.一種預(yù)防或治療患者的生物學(xué)病癥、障礙或疾病的方法，所述方法包括將有效量的 權(quán)利要求76-91中任一項(xiàng)的治療劑或權(quán)利要求97的藥物組合物給予需要它的患者。
99.權(quán)利要求98的方法，其中所述患者患有出血癥。
100.權(quán)利要求98或99的方法，其中所述患者患有血友病。
全文摘要
本發(fā)明提供包含彈性蛋白樣肽(ELP)和治療性蛋白質(zhì)的治療劑和組合物。在一些實(shí)施方案中，治療性蛋白質(zhì)是GLP-1受體激動劑、胰島素或因子VII/VIIa，包括功能類似物。本發(fā)明還提供編碼多核苷酸，以及制備和使用所述治療劑的方法。就其用作治療劑的用途而言，本發(fā)明治療劑具有改進(jìn)性質(zhì)，特別包括體內(nèi)半壽期、清除率和/或持久性、溶解度和生物利用度中的一種或多種改進(jìn)性質(zhì)。
文檔編號A61K38/00GK102131516SQ200980134124
公開日2011年7月20日 申請日期2009年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月27日
發(fā)明者A·基爾科蒂 申請人:杜克大學(xué)