專利名稱：黏著桿菌屬細(xì)菌用于群體淬滅的用途的制作方法
黏著桿菌屬細(xì)菌用于群體淬滅的用途本發(fā)明屬于生物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及能夠降解N-?；呓z氨酸 內(nèi)酯(AHL)，以控制感染性細(xì)菌病，且避免生物被膜(biofilm)形成的黏著桿菌屬 (Tenacibaculum)的禾中。
背景技術(shù)：
許多細(xì)菌種利用協(xié)調(diào)遺傳調(diào)控機(jī)制對(duì)環(huán)境變化作出響應(yīng)。該機(jī)制稱作群體感應(yīng) (QS)，存在于信號(hào)分子的產(chǎn)生并釋放入介質(zhì)中，信號(hào)分子在介質(zhì)中積聚從而控制多種基因 的表達(dá)(Fuqua等，1994.細(xì)菌學(xué)雜志176 :269-275)。通過(guò)QS通訊，細(xì)菌群體能夠協(xié)調(diào)以執(zhí) 行重要的生物功能，其中許多與重要病原體的毒性有關(guān)，例如遷移性，群游，聚集，發(fā)光，抗 生素的生物合成，毒性因子，共生，生物被膜的形成和分化，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移質(zhì)粒等(Williams 等，2007. Phil Trans R Soc B 362:1119-1134)。最為廣泛研究和了解的QS信號(hào)是許多革蘭氏陰性菌使用的N-?；?高絲氨酸 內(nèi)酯(AHL) (Williams 等，2007. Phil Trans R Soc B 362:1119-1134)。AHL 也被稱為自體 誘導(dǎo)物(Al)，是一類在許多細(xì)菌(主要是革蘭氏陰性菌)的QS系統(tǒng)中使用的信號(hào)分子，其 基于一具有不同長(zhǎng)度，在4-14個(gè)碳之間的?；鶄?cè)鏈的飽和或非飽和內(nèi)酯環(huán)，在第三個(gè)碳原 子上具有或不具有氧或羥基取代(Whitehead等，2001. FEMSMicrobiol Rev 25:365-404)。 隨著QS協(xié)調(diào)的細(xì)菌種群在其與其他原核生物或真核生物的多重作用中獲得重要的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu) 勢(shì)，它們的競(jìng)爭(zhēng)者會(huì)獲得干擾其通過(guò)QS系統(tǒng)通訊的機(jī)制；這些機(jī)制被稱為群體淬滅OiQ)。 它們基于模擬AHL封閉受體的抑制劑生產(chǎn)，例如海藻海洋紅藻(Delisea pulchra)產(chǎn)生的 呋喃酮(Givskov 等，1996. JBacteriol 178 :6618-6622)。另一種封閉 AHL 介導(dǎo)的 QS 系統(tǒng) 的策略是酶降解信號(hào)分子。迄今，已經(jīng)描述了兩大類能進(jìn)行這種降解的酶水解內(nèi)酯環(huán)的 內(nèi)酯酶和打斷內(nèi)酯環(huán)與側(cè)鏈之間的鍵的?；?Dong等，2007. Wiil Trans R Soc B 362 1201-1211)。雖然在上世紀(jì)，人工化療劑的合成和抗生素的開發(fā)和改進(jìn)意味著各種感染性疾病 治療中真正的醫(yī)學(xué)革命，但某些病原性細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素耐藥性成為了一個(gè)全球性的嚴(yán)重 問(wèn)題，迫使藥物工業(yè)開發(fā)新一代的更強(qiáng)大的抗生素，而產(chǎn)生了具有多重耐藥性的菌株，從 而使得治療耗時(shí)更長(zhǎng)，常常無(wú)效，甚至導(dǎo)致病人死亡。細(xì)菌環(huán)境中存在的選擇壓力，宿主的 免疫情況，細(xì)菌微環(huán)境和所涉及的細(xì)菌典型因子在耐藥性產(chǎn)生中起到了重要作用。由于大量人病原體(例如惡臭假單胞菌O^seudomonas putida)，沙雷氏菌 (Serratia spp)等)，植物病原體(例如農(nóng)桿菌(Agrobacterium spp.)，胡蘿卜軟腐歐 文氏菌(Erwinia carotovora)，...)和海洋病原體(例如(殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida),獲弧菌(Vibrio anguillarum), . .)(Williams 等，2007. Phil Trans R Soc B362 :1119-1134 ;Bruhn 等，2005. Dis Aquat Org 65 :43-52.)利用 AHL 控制毒性 因子的產(chǎn)生，干擾這些通訊系統(tǒng)構(gòu)成了控制感染性細(xì)菌病的一種感興趣而有前景的途徑 (Dong 和 Zhang. 2005. J Microbiol 43 :101-109 ;Dong 等，2007. Phil Trans R Soc B362 1201-1211)。另外，與抗生素聯(lián)用的這類機(jī)制可能是治療毒性機(jī)制的QS控制已有描述(Venturi，2006. FEMS Microbiol Rev 30 :274-291)的多重耐藥性病原體，例如銅綠假單胞 菌(I^eudomonas aeruginosa)或其他人、動(dòng)物和植物病原體所致感染性疾病的可能策略。 QQ策略對(duì)治療感染性疾病的感興趣之處在于，因?yàn)樗鼈儾恢苯佑绊懖≡w的生存，但影響 其毒性因子的表達(dá)，它們不會(huì)產(chǎn)生選擇壓力，因此避免了耐藥性的出現(xiàn)。發(fā)明簡(jiǎn)述大規(guī)模使用化療劑所代表的選擇壓力使得具有耐藥性機(jī)制的微生物菌株傳播，從 而在很多情況下阻礙了合適的臨床治療，甚至導(dǎo)致病人死亡。由于許多細(xì)菌利用QS信號(hào)系 統(tǒng)來(lái)同步群體內(nèi)的遺傳表達(dá)和協(xié)調(diào)生物活性，控制毒性和生物被膜形成等生物功能，一種 避免增加病原菌的耐藥性機(jī)制的途徑是控制這些QS信號(hào)系統(tǒng)。該信號(hào)系統(tǒng)的抑制被稱作 群體淬滅(QQ)。本發(fā)明提供了控制細(xì)菌感染的途徑，而不對(duì)這些細(xì)菌群體施加選擇壓力，因 此避免了耐藥性的出現(xiàn)，以及抑制涉及QS信號(hào)、AHL類型的其他細(xì)菌寄居過(guò)程，例如生物被 膜的形成。本發(fā)明首次公開了利用能夠降解N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)的黏著桿菌屬的 細(xì)菌細(xì)胞來(lái)控制感染性細(xì)菌病和抑制生物被膜的形成。因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及黏著桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞，其細(xì)胞粗提物，或其培養(yǎng)上 清液，或其任何組合在群體淬滅中的用途。在本發(fā)明該方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，黏著桿菌屬的細(xì)菌細(xì)胞，其細(xì)胞粗提物， 或其培養(yǎng)上清液，或其任意組合用于降解N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯(AHL)。任何細(xì)菌響應(yīng)不同的環(huán)境信號(hào)調(diào)節(jié)其基因表達(dá)，這是與其他生物體競(jìng)爭(zhēng)的必要 手段。在病原菌的特定情況下，基因調(diào)控是至關(guān)重要的，使得細(xì)菌能夠在其宿主提供的特定 環(huán)境下存活。細(xì)菌毒性基因通過(guò)復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制確保合適基因在合適時(shí)機(jī)表達(dá)。AHL是廣 泛研究和公知的QS信號(hào)，被許多人、植物和海洋病原菌用之以控制毒性因子的產(chǎn)生。因此，本發(fā)明該方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式是利用能夠降解N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯， 從而干擾細(xì)菌QS信號(hào)系統(tǒng)的黏著桿菌屬的細(xì)菌細(xì)胞，所述黏著桿菌屬細(xì)菌的細(xì)胞粗提物， 或其培養(yǎng)上清液，或其任意組合來(lái)制備藥物。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，藥物用于治療感染性 細(xì)菌疾病。本說(shuō)明書所定義的"生物被膜"是包埋在胞外多糖基質(zhì)，附著于惰性表面或活組 織上的微生物群落。它是附著在固體表面的細(xì)菌群落(包括一種或多種細(xì)菌)。抑制AHL 能夠抑制QS所控制的過(guò)程所形成的生物被膜。生物被膜產(chǎn)生大量胞外多糖，產(chǎn)生粘性的外觀，其特征是對(duì)抗生素具有很強(qiáng)的耐 藥性。該耐藥性可能是由于包埋細(xì)菌的胞外基質(zhì)對(duì)殺菌劑的滲透提供了屏障。另一種可能 性是大部分生物被膜細(xì)胞由于缺乏食物生長(zhǎng)非常緩慢，意味著對(duì)于抗微生物劑的效應(yīng)不敏 感。第三個(gè)方面可能是生物被膜中的細(xì)胞，例如通過(guò)表達(dá)藥物的排出泵而產(chǎn)生不同表型。表面的生物污染是常見的，而生物被膜能夠在疏水、親水、生物性或非生物性表面 產(chǎn)生，導(dǎo)致材料降解，污染產(chǎn)品，機(jī)械阻塞和阻礙水處理中的熱傳遞。生物被膜也是飲用 水分配系統(tǒng)和其他管道中生物污染的首要原因，在防火系統(tǒng)中控制生物被膜也尤其重要。 附著在食物上，或與食物接觸的表面上的細(xì)菌會(huì)引起嚴(yán)重的衛(wèi)生問(wèn)題，甚至導(dǎo)致食物毒性 感染的病例，以及由于產(chǎn)品丟棄所造成的大量經(jīng)濟(jì)損失(Carpentier和Cerf，1993. J App Bacter. 75 :499-511)。在養(yǎng)魚業(yè)中，生物被膜形成與水下構(gòu)造，例如籠、網(wǎng)和容器；或與設(shè)備例如管道、泵、濾器和收集罐，或與培養(yǎng)的物種，例如貽貝、蛤蜊、牡蠣等密切相關(guān)。這被稱為生物污著， 影響了歐洲漁業(yè)的各方面，由于殺生物制品指令EC98/8/EC的生效而成為日益嚴(yán)重的問(wèn) 題，并導(dǎo)致可觀的經(jīng)濟(jì)損失。它也造成了嚴(yán)重的生態(tài)危害，因?yàn)楦街诖瑲ど系乃镒?為生物污著的后果跟隨這些船到處散布。這意味著全球性的生態(tài)問(wèn)題，因?yàn)檫@些船將侵略 性物種帶到原來(lái)并不存在的湖泊、河流和海洋中。因此，用黏著桿菌屬的細(xì)菌細(xì)胞，所述細(xì)菌的細(xì)胞粗提物或培養(yǎng)上清液制造的抗 水垢涂料將減少涂有這些涂料的船殼的生物污著，而不包含對(duì)海洋生命有毒的化學(xué)元素。因此，在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，利用黏著桿菌屬的細(xì)菌細(xì)胞，所述黏著桿菌屬的 所述細(xì)菌的細(xì)胞粗提物或培養(yǎng)上清液抑制生物被膜的形成。有大量的流行病學(xué)證據(jù)將生物被膜與人中的不同感染過(guò)程聯(lián)系起來(lái)(表 1) (Wilson,2001. Sci Prog 84 :235-254 ；Costerton 1999.Science 1999 ；284 1318-1322)。生物被膜產(chǎn)生疾病癥狀的機(jī)制仍然不完全清楚，但是已經(jīng)有建議生物被膜細(xì) 菌能夠產(chǎn)生內(nèi)毒素，將細(xì)菌群釋放到血流中，對(duì)免疫系統(tǒng)細(xì)胞的吞噬作用產(chǎn)生抗性，以及在 另一方面，為耐受抗生素治療的細(xì)菌出現(xiàn)找到了機(jī)會(huì)。這最后一個(gè)方面可能是特別重要的， 因?yàn)樵从谏锉荒さ哪退幮约?xì)菌能夠通過(guò)護(hù)理人員的雙手從病人傳到另一個(gè)病人。另外，與抗生素聯(lián)合的這類機(jī)制可能是治療毒性機(jī)制的QS控制已有描述 (Venturi，2006. FEMS Microbiol Rev 30 :274-291)的多重耐藥性病原體，例如銅綠假單胞 菌，和其他人類、動(dòng)物和植物病原體所致感染性疾病的感興趣策略。因此，本發(fā)明該方面的 一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式是聯(lián)用能降解N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的黏著桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞，所述 黏著桿菌屬的所述細(xì)菌的細(xì)胞粗提物，或其培養(yǎng)上清液與抗生素來(lái)治療感染性細(xì)菌病或抑 制生物被膜的形成。
權(quán)利要求
1.黏著桿菌(Tenacibaculum)屬的細(xì)菌細(xì)胞、或其細(xì)胞粗提物、或其培養(yǎng)上清液，或它 們?nèi)我饨M合用于群體淬滅的用途，其中所述細(xì)菌細(xì)胞的rRNA的16S區(qū)與SEQ ID NO :1所包 含的同源性多核苷酸序列具有至少80%的相同性。
2.如前權(quán)利要求所述的細(xì)菌細(xì)胞，或其細(xì)胞粗提物、或其培養(yǎng)上清液，或它們?nèi)我饨M合 的用途，用于降解N-?；呓z氨酸內(nèi)酯。
3.如權(quán)利要求1-2任一所述的黏著桿菌屬的細(xì)菌細(xì)胞，或其細(xì)胞粗提物、或其培養(yǎng)上 清液，或它們?nèi)我饨M合的用途，用于制備藥物。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的黏著桿菌屬的細(xì)菌細(xì)胞，或其細(xì)胞粗提物、或其培養(yǎng)上 清液，或它們?nèi)我饨M合的用途，用于制備治療感染性細(xì)菌病的藥物。
5.如權(quán)利要求1-2任一所述的黏著桿菌屬的細(xì)菌細(xì)胞，或其細(xì)胞粗提物、或其培養(yǎng)上 清液，或它們?nèi)我饨M合的用途，用于抑制生物被膜的形成。
6.如權(quán)利要求1-4任一所述的黏著桿菌屬的細(xì)菌細(xì)胞，或其細(xì)胞粗提物、或其培養(yǎng)上 清液，或它們?nèi)我饨M合的用途，其特征在于，與抗生素或其它抗菌劑聯(lián)用。
7.如權(quán)利要求3-6任一所述的黏著桿菌屬的細(xì)菌細(xì)胞，或其細(xì)胞粗提物、或其培養(yǎng)上 清液，或它們?nèi)我饨M合的用途，其中導(dǎo)致感染性疾病或生物被膜形成的細(xì)菌是革蘭氏陰性 菌。
8.黏著桿菌屬的細(xì)菌細(xì)胞的菌株，其保藏于西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心(CECT)，保藏 號(hào)為CECT7似6。
9.保藏號(hào)為CECT7426的黏著桿菌屬的細(xì)菌細(xì)胞，或其細(xì)胞粗提物，或其培養(yǎng)上清液， 或它們?nèi)我饨M合的如權(quán)利要求1-7任一所述的用途。
10.組合物，其包含a.黏著桿菌屬的細(xì)菌細(xì)胞，b.a)的細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)菌培養(yǎng)物的細(xì)胞粗提物，c.b)的細(xì)菌提取物的上清液，或它們的任意組合，所述組合物用作抗菌劑。
11.如前權(quán)利要求所述的組合物的用途，，用于制造藥物。
12.如權(quán)利要求10-11任一所述的組合物的用途，其特征在于，用于制造治療細(xì)菌感染 的藥物。
13.如權(quán)利要求10-12任一所述的組合物的用途，其特征在于，與抗生素或其他抗菌劑聯(lián)用。
14.如權(quán)利要求8所述的組合物的用途，其特征在于，用于抑制生物被膜的形成。
15.如權(quán)利要求10-14任一所述的組合物的用途，其特征在于，所述生物被膜的形成或 細(xì)菌感染是革蘭氏陰性菌導(dǎo)致的。
全文摘要
來(lái)自細(xì)胞粗提物或其培養(yǎng)上清液的黏著桿菌屬的細(xì)菌細(xì)胞的用途，所述細(xì)胞能降解N-?；呓z氨酸內(nèi)酯，用于群體淬滅，用于治療感染性細(xì)疾病或抑制生物被膜形成。
文檔編號(hào)A61K35/74GK102149395SQ200980134158
公開日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2009年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月1日
發(fā)明者卡薩爾 A·M·奧特羅, 里瓦達(dá) A·羅加, 貝納德斯 M·羅梅羅 申請(qǐng)人:圣地亞哥聯(lián)合大學(xué)