專利名稱：使用哺乳動物β防御素的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療的制作方法
使用哺乳動物β防御素的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療涉及序列表本申請含有呈計算機(jī)可讀形式的序列表。該計算機(jī)可讀形式通過提述并入本文中。發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及通過施用人β防御素而預(yù)防與治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。背景在許多其它元件中，先天免疫的關(guān)鍵組分為個別顯示相當(dāng)大選擇性但集體能夠快速殺死廣譜的細(xì)菌、病毒及真菌的抗微生物肽(AMP)。AMP的生物重要性因其在自然界中之普遍分布而更為突出，且其有可能由所有多細(xì)胞生物體產(chǎn)生。在人類中，優(yōu)勢AMP為防御素。人防御素為陽離子小肽，基于其三個分子內(nèi)半胱氨酸二硫鍵之拓?fù)鋵W(xué)可分為α-防御素及β-防御素。α-防御素可進(jìn)一步細(xì)分為首先自嗜中性粒細(xì)胞顆粒分離的α-防御素 (ΗΝΡ1-4)及由Paneth細(xì)胞在小腸隱窩中表達(dá)的α -防御素(HD5及HD6)。β -防御素主要由多種組織及器官中的上皮細(xì)胞產(chǎn)生，所述組織及器官包括皮膚、氣管、胃腸道、泌尿生殖系統(tǒng)、腎、胰及乳腺。β-防御素家族最具特征的(best characterized)成員為hBDl_3。 然而，使用多種生物信息學(xué)工具，已在人基因組中注釋了幾乎40個編碼推定β -防御素同源物的開放閱讀框。一些人防御素是組成型產(chǎn)生的，而其它是由促炎性細(xì)胞因子或外源微生物產(chǎn)物誘導(dǎo)的。已經(jīng)越來越清楚的是，除直接抗微生物活性外，人防御素也具有寬范圍的免疫調(diào)節(jié)/替代性質(zhì)。所述性質(zhì)包括誘導(dǎo)多種趨化因子及細(xì)胞因子、趨化活性及細(xì)胞凋亡活性，誘導(dǎo)前列腺素、組胺及白細(xì)胞三烯釋放，抑制補(bǔ)體，通過鐸樣受體(toll-like receptor)信號傳導(dǎo)刺激樹突細(xì)胞成熟，以及刺激由嗜中性粒細(xì)胞的病原體清除。此外，人防御素也在傷口愈合、上皮及成纖維細(xì)胞的增殖、血管生成(angiogenesis)及血管發(fā)生(vasculogenesis) 中起作用。有越來越多的人防御素在許多感染性及炎性疾病中發(fā)揮重要作用的證據(jù)。發(fā)炎和 /或感染皮膚中通常觀察到人防御素之過表達(dá)，很可能是因為由微生物組分或內(nèi)源性促炎性細(xì)胞因子局部誘導(dǎo)。在牛皮癬(psoriasis)中，hBD2及hBD3過于充足，且在患有尋常痤瘡(acne vulgaris)或淺表性毛囊炎(superficial folliculitis)的患者的受損上皮中觀察到hBD2的顯著上調(diào)。另一方面，異位性/特應(yīng)性皮炎(topic dermatitis)與hBD2及 hBD3的下調(diào)相關(guān)。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎為一種慢性、全身性發(fā)炎病癥，其可影響許 多組織與器官，但主要侵襲關(guān)節(jié)，產(chǎn)生常常發(fā)展成關(guān)節(jié)軟骨之破壞與關(guān)節(jié)之僵硬的炎性滑膜炎。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎也可于肺、心包、胸膜、以及鞏膜產(chǎn)生彌漫性發(fā)炎、以及結(jié)節(jié)狀損害，其在皮膚下的皮下組織中最常見。雖然類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎之原因不明，自體免疫在其長期性與進(jìn)展中扮演重要的角色。
發(fā)明詳述定義防御素如本文所用之術(shù)語“防御素”系指本領(lǐng)域的技術(shù)人員公認(rèn)屬于抗微生物肽之防御素類之多肽。為確定多肽是否為根據(jù)本發(fā)明之防御素，可通過使用免費(fèi)可用之 HMMER軟件包將氨基酸序列與PFAM數(shù)據(jù)庫之隱馬爾可夫模型序型(hidden markov model profile) (HMM 序型)比較。PFAM防 御素家族包括例如防御素-1或“哺乳動物防御素”(登錄號PF00323)及防御素_2或防御素_3或“β防御素”(登錄號PF00711)。本發(fā)明之防御素屬于β防御素類。β防御素類之防御素享有共同的結(jié)構(gòu)特征，如半胱氨酸模式。根據(jù)本發(fā)明之防御素之實(shí)例包括人β防御素1 (hBDl ；參見SEQ ID NO :1)、人β 防御素2(hBD2 ；參見SEQ ID N0:2)、人β防御素3 (hBD3 ；參見SEQ ID N0:3)、人β防御素4_4 ；參見SEQ ID NO 4)及小鼠β防御素3(mBD3 ；參見SEQ ID NO 6)。同一性兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性由參數(shù)“同一性”描述。就本發(fā)明而言，通過使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS :The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等，2000,Trends in Genetics 16 276~277 ；http:// emboss, org)，優(yōu)選3. 0. 0版或更新版本之Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法 (Needleman及Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 443-453)確定兩個氨基酸序列之間的同一性程度。使用之任選參數(shù)為缺口開放罰分(10)、缺口延伸罰分(0. 5)及EBL0SUM62 (BL0SUM62 之EMBOSS版本)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記之“最長同一性”之輸出(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性且如下計算(相同殘基X100) / (比對長度_比對中之缺口總數(shù))。就本發(fā)明而言，通過使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS :The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice 等，2000，同上；http://emboss, org)、優(yōu)選 3. 0. 0版或更新版本之Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman及Wunsch，1970， 同上)確定兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度。使用之任選參數(shù)為缺口開放罰分(10)、缺口擴(kuò)展罰分(0.5)及EDNAFULL(NCBI NUC4. 4之EMBOSS版本)取代矩陣。使用 Needle標(biāo)記之“最長同一性”之輸出(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性且如下計算(相同脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度-比對中之缺口總數(shù))。如本文所用之術(shù)語“經(jīng)分離變體”或“經(jīng)分離多肽”系指自來源分離之變體或多肽。 在一方面中，如SDS-PAGE所測定的，變體或多肽為至少1 %純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少 10 %純，更優(yōu)選至少20 %純，更優(yōu)選至少40 %純，更優(yōu)選至少60 %純，甚至更優(yōu)選至少80 % 純，且最優(yōu)選至少90%純?；旧霞兊亩嚯男g(shù)語“基本上純的多肽”在本文中表示含有按重量計至多10%、 優(yōu)選至多8 %、更優(yōu)選至多6 %、更優(yōu)選至多5 %、更優(yōu)選至多4 %、更優(yōu)選至多3 %、甚至更優(yōu)選至多2%、最優(yōu)選至多且甚至最優(yōu)選至多0. 5%與之天然或重組相關(guān)之其它多肽物質(zhì)的多肽制備物。因此，優(yōu)選基本上純的多肽按制備物中所存在之總多肽物質(zhì)之重量計為至少92 %純，優(yōu)選至少94 %純，更優(yōu)選至少95 %純，更優(yōu)選至少96 %純，更優(yōu)選至少97 %純， 更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99. 5%純且甚至最優(yōu)選100%純。 本發(fā)明之多肽優(yōu)選呈實(shí)質(zhì)上純的形式。此可例如通過由眾所周知之重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽來實(shí)現(xiàn)。哺乳動物β防御素本發(fā)明涉及哺乳動物β防御素(如人β防御素和/或小鼠β防御素)在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的醫(yī)藥用途。治療優(yōu)選與降低所治療組織中之TNF-α活性相關(guān)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明之哺乳動物β防御素與SEQ ID NO =USEQ IDNO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5和/或SEQ ID NO 6中之任一氨基酸序列具有至少 80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%且最優(yōu)選至少95%的同一性程度。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明之哺乳動物β防御素與SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO 4中之任一氨基酸序列具有至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%且最優(yōu)選至少95%的同一性程度。在一更優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明之哺乳動物β防御素由人β防御素 1(SEQ ID NO :1)、人 β 防御素 2 (SEQ ID NO :2)、人 β 防御素 3 (SEQ ID NO :3)、人 β 防御素4(SEQ ID N0:4)、人β防御素4之變體(SEQ ID NO 5)和/或小鼠β防御素3(SEQ ID NO 6)組成。在一甚至更優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明之哺乳動物β防御素由人β防御素 KSEQ ID Ν0:1)、人 β 防御素 2 (SEQ ID N0:2)、人 β 防御素 3 (SEQ ID NO 3)和 / 或人 β 防御素4 (SEQ ID NO 4)組成。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明之哺乳動物β防御素與SEQ ID NO :2之氨基酸序列具有至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%且最優(yōu)選至少95%的同一性程度。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明之哺乳動物β防御素由人β防御素2(SEQ ID NO 2)組成。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明之哺乳動物β防御素由人β防御素和/或小鼠β防御素及其功能等效變體組成。優(yōu)選地，本發(fā)明之哺乳動物β防御素由人β防御素1、人β 防御素2、人β防御素3、人β防御素4及小鼠β防御素3及其功能等效變體組成。更優(yōu)選地，本發(fā)明之哺乳動物β防御素由人β防御素2及其功能等效變體組成。本發(fā)明之哺乳動物β防御素也稱為優(yōu)選實(shí)施方案之化合物。在本發(fā)明之上下文中，哺乳動物(例如人)β防御素之“功能等效變體 (functionally equivalent variant) ”為對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎展現(xiàn)與親本哺乳動物(例如人)β防御素大致相同之功效的經(jīng)修飾哺乳動物(例如人)β防御素。優(yōu)選，其也展現(xiàn)與哺乳動物(例如人)β防御素大致相同之對TNF-α活性之功效。根據(jù)本發(fā)明，哺乳動物(例如人)β防御素之功能等效變體與哺乳動物(例如人)β防御素氨基酸序列相比可包含1-5個氨基酸修飾，優(yōu)選1-4個氨基酸修飾，更優(yōu)選1-3個氨基酸修飾，最優(yōu)選1-2個氨基酸修飾且尤其1個氨基酸修飾。術(shù)語“修飾”在本文中意指哺乳動物(例如人)β防御素之任何化學(xué)修飾。修飾可為氨基酸之取代、缺失和/或插入以及氨基酸側(cè)鏈之置換；或在氨基酸序列中使用具有類似特性之非天然氨基酸。詳言之，修飾可為酰胺化，如C-末端酰胺化。優(yōu)選地，氨基酸修飾是性質(zhì)上較不重要的，其為不顯著影響多肽之折迭和/或活性之保守性氨基酸取代或插入；單缺失；氨基_或羧基_末端小延伸；至多約20-25個殘基之小接頭肽；或通過改變凈電荷或另一功能而有利于純化之小延伸，如多聚組氨酸標(biāo)記、抗原表位或結(jié)合域。保守取代的實(shí)例為在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、 蘇氨酸和甲硫氨酸)組內(nèi)的取代。通常不改變比活的氨基酸取代在本領(lǐng)域是已知的，并由， 例如，Neurath 和 Hill，1979 在 The Proteins,Academic Press,New York 中描述。最通常發(fā)生的交換為 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、 Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly。除了 20個標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2_氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基。“非天然氨基酸”在蛋白質(zhì)合成后已經(jīng)過修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學(xué)方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上可得到的，包括六氫吡啶羧酸 (pipecolic acid)、噻唑燒羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3- 二甲基脯氨酸。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和 Wells, 1989, Science 244:1081-1085)來鑒定哺乳動物β防御素中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的生物活性(即，對抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的活性)以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見 Hilton 等，1996，J. Biol. Chem. 271 4699-4708 必需氨基酸的身份(identity)也可由分析與相關(guān)于哺乳動物β防御素之多肽的同一性來推斷。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由 Reidhaar-Olson 和 Sauer，1988，Science 241 :53_57 ；Bowie 和 Sauer， 1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2152_2156 ；W095/17413 ；或 W 95/22625 公開的那些方法來進(jìn)行并測試單個或多個氨基酸取代。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示 (例如，Lowman 等，1991 ,Biochem. 30 10832-10837 ；美國專利 5，223，409 號；WO 92/06204) 和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire 等，1986，Gene 46 145 ；Ner 等，1988，DNA 7 127)。本發(fā)明之多肽之N-末端延伸可合適地由1至50個氨基酸、優(yōu)選2-20個氨基酸、 尤其3-15個氨基酸組成。在一實(shí)施方案中，N-末端肽延伸不含Arg(R)。在另一實(shí)施方案中，N-末端延伸包含如下文進(jìn)一步定義之kex2或kex2_樣切割位點(diǎn)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，N-末端延伸為包含至少兩個Glu (E)和/或Asp (D)氨基酸殘基之肽，如包含以下序列之一的N-末端延伸EAE、EE、DE及DD。方法及用途已發(fā)現(xiàn)人β防御素2在小鼠中于41天膠原蛋白誘導(dǎo)之類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型顯著地減輕疾病參數(shù)之嚴(yán)重性；因此顯示作為用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物的潛在活性。本發(fā)明因此提供治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，該治療包括向需要該治療之受試者施用有效量之例如藥物組合物形式之哺乳動物β防御素，優(yōu)選為人β防御素，更優(yōu)選為人 β防御素2。也提供者為哺乳動物β防御素(優(yōu)選為人β防御素，更優(yōu)選為人β防御素 2)，其用于制造藥物；及哺乳動物β防御素(優(yōu)選為人β防御素，更優(yōu)選為人β防御素2)用于制造治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物之用途。治療包括治療已有疾病或病癥以及預(yù)防 (prophylaxis 或 prevention)疾病或病癥。哺乳動物β防御素可治療性用于組合物中，所述組合物經(jīng)配制用于經(jīng)由任何常規(guī)途徑施用，常規(guī)途徑包括腸內(nèi)(例如經(jīng)頰、經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)直腸)、胃腸外(例如，靜脈內(nèi)、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi))或局部(例如，表皮、鼻內(nèi)或氣管內(nèi))。在其它實(shí)施方案中，本文中描述之組合物可作為持續(xù)釋放植入物之一部分施用。
在另外的其它實(shí)施方案中，可利用提供冷凍干燥物穩(wěn)定性之適當(dāng)賦形劑將優(yōu)選實(shí)施方案之組合物配制為冷凍干燥物，且接著復(fù)水。含有哺乳動物β防御素之藥物組合物可根據(jù)常規(guī)方法，例如通過混合、造粒、包覆、溶解或凍干過程制造。優(yōu)選實(shí)施方案之藥物組合物包含哺乳動物β防御素及藥學(xué)上可接受之載劑和/ 或稀釋劑。哺乳動物β防御素優(yōu)選在藥物組合物中以有效治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎之量，優(yōu)選具有對患者可接受之毒性之量使用。對于該治療，適當(dāng)劑量當(dāng)然依賴于例如所使用之本發(fā)明化合物之化學(xué)性質(zhì)及藥物動力學(xué)數(shù)據(jù)、個體宿主、施用模式及接受治療之病狀之性質(zhì)及嚴(yán)重性而變化。然而，一般而言，為在較大哺乳動物，例如人中獲得令人滿意的結(jié)果，指示每日劑量優(yōu)選為約0. 001mg/kg體重至約100mg/kg體重，優(yōu)選約0. 01mg/kg體重至50mg/kg體重，更優(yōu)選約0. 05mg/kg體重至20mg/kg體重，且最優(yōu)選約0. lmg/kg體重至約10mg/kg體重，例如以多至一天一、二、三、或四次之分開的劑量施用。優(yōu)選實(shí)施方案之化合物可以通常使用之類似施用模式及類似劑量向較大哺乳動物，例如人施用。在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選實(shí)施方案之藥物組合物可包括哺乳動物β防御素(如人 β防御素)，其量取決于施用途徑為每單位劑型約0.5mg或更少至約1500mg或更多，優(yōu)選約 0. 5,0. 6,0. 7,0. 8 或 0. 9mg 至約 150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900 或 IOOOmg,且更優(yōu)選約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20 或 25mg 至約 30、35、40、45、50、55、 60、65、70、75、80、85、90、95或100mg。然而，在一些實(shí)施方案中，比以上所提及之更低或更高的劑量可為優(yōu)選的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地確定適當(dāng)?shù)臐舛燃皠┝?。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知藥學(xué)上可接受之載劑和/或稀釋劑。對于配制成液體溶液之組合物，可接受之載劑和/或稀釋劑包括鹽水及無菌水，且可任選地包括抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑及其它常見添加劑。組合物也可配制成丸劑、膠囊、顆粒劑、片劑(包覆或未包覆)、(可注射)溶液、固體溶液、懸浮液、分散液、固態(tài)分散液(例如呈安瓿、小瓶、乳膏、 凝膠、糊狀物、吸入劑粉末、泡沫、酊劑、唇膏、滴劑、噴霧劑或栓劑的形式)。配制物可含有 (除哺乳動物β防御素及其它任選之活性成分外)載體、填充劑、崩解劑、流動調(diào)節(jié)劑、糖及甜味劑、芳香劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、增溶劑、調(diào)節(jié)滲透壓之鹽、緩沖劑、稀釋齊U、分散劑及表面活性劑、粘合劑、潤滑劑和/或如本領(lǐng)域已知之其它藥物賦形劑。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可進(jìn)一步以適當(dāng)方式且根據(jù)公認(rèn)操作法(如Remington' s Pharmaceutical Sciences, Gennaro 編，Mack Publishing 公司，Easton，PA 1990 中描述之操作法)配制哺乳動物β防御素。哺乳動物β防御素可單獨(dú)使用或與一種、兩種或更多其它藥物化合物或藥物物質(zhì)和/或一或多種藥學(xué)上可接受之賦形劑之組合療法使用。
體外合成哺乳動物β防御素可使用如本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法通過體外合成制備。多種商業(yè)合成裝置是可用的，例如Applied Biosystems公司、Beckman等之自動合成儀。通過使用合成儀，可用非天然氨基酸、尤其D-異構(gòu)物(或D-形式)(例如D-丙氨酸及D-異亮氨酸)、非對映異構(gòu)物、具有不同長度或官能團(tuán)之側(cè)鏈等取代天然存在之氨基酸。特定序列及制備方式將由適宜性、經(jīng)濟(jì)性、所需純度等確定?？商峁┡c包含便于鍵聯(lián)的官能團(tuán)之多種肽或蛋白質(zhì)之化學(xué)連接， 所述官能團(tuán)對于酰胺或經(jīng)取代胺形成(例如還原胺基化)而言為胺基，對于硫醚或二硫化物形成而言為硫醇基，對于酰胺形成而言為羧基等。如果需要，在合成期間或表達(dá)期間可向肽中引入多個允許與其它分子或表面連接之基團(tuán)。因此，可使用半胱氨酸制得硫醚，組氨酸用于連接于金屬離子復(fù)合物，羧基用于形成酰胺或酯，胺基用于形成酰胺及其類似物。也可根據(jù)重組合成之常規(guī)方法分離且純化哺乳動物β防御素。裂解物可由表達(dá)宿主制備，且裂解物可使用HPLC、排阻層析、凝膠電泳、親和層析或其它純化技術(shù)純化。本發(fā)明由下列實(shí)施例進(jìn)一步描述，所述實(shí)施例不應(yīng)理解為限制本發(fā)明之范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1評估膠原蛋白誘導(dǎo)之類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中之人β防御素2在測試hBD2之免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)期間，出乎意料地觀察到hBD2具有巨大的抗炎潛力。此處，我們已展示hBD2于小鼠中于膠原蛋白誘導(dǎo)之類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中有顯著的效果。人β 防御素 2 (hBD2)重組產(chǎn)生hBD2。將編碼hBD2之合成DNA片段(DNA 2. 0)克隆入pET_32(+)表達(dá)載體(Novagen)中。所得質(zhì)粒編碼翻譯融合肽，該翻譯融合肽含有N-末端硫氧還蛋白部分，繼之以his-標(biāo)記、腸激酶裂解位點(diǎn)且最后為hBD2肽。將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(E.coli) 菌株BL21中。在含有100微克/毫升氨芐青霉素之TB-甘油中將該菌株之過夜培養(yǎng)物稀釋100 倍且在37°C生長至0D600為約8且用0. 5mM IPTG誘導(dǎo)3小時，此后通過離心收集細(xì)胞。使用標(biāo)準(zhǔn)方案在Ni-NTA珠(QIAGEN)上純化his標(biāo)記之trx_hBD2融合肽。隨后將his-標(biāo)記純化融合肽過夜透析于腸激酶緩沖劑(50mM tris-HCKpH 7. 5) UmM CaCl2)中，且用腸激酶裂解以釋放成熟hBD2。使用Source 15S基質(zhì)(Amersham Biosciences)由陽離子交換層析進(jìn)一步純化hBD2肽。使用MALDI-T0F質(zhì)譜驗證hBD2之修正分子量。使用相同方案產(chǎn)生mBD3 (參見實(shí)施例5)。隨后使用與LC-MS及NMR光譜學(xué)偶聯(lián)之胰蛋白酶消化驗證hBD2分子之適當(dāng)折疊及二硫橋拓?fù)鋵W(xué)。由制備型RP-HPLC在低pH值移除內(nèi)毒素，且由LAL測定(Endosafe KTA2)測定內(nèi)毒素含量且發(fā)現(xiàn)該水平低于測定之檢測限(0.05EU/mg)。為確定低于內(nèi)毒素測定之檢測限之水平不能刺激PBMC，作以極有效脂多糖(大腸桿菌，0111 :B4，Sigma L4391)刺激之滴定曲線。極低水平之該LPS(0.06ng/ml)能夠刺激PBMC產(chǎn)生可檢測之細(xì)胞因子。以下研究之目的在于確定人β防御素2在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎之抗炎活性。測試系統(tǒng)物種/株小鼠/DBA/1來源Harlan，UK 性別雄性動物數(shù)目η = 50年齡年輕成鼠，研究起始時為6-8周齡。體重膠原蛋白誘導(dǎo)時研究動物之重量差異不超過平均體重之士20%。動物健康狀況到達(dá)時檢查該研究中所使用之動物之健康狀態(tài)。僅使健康的動物適應(yīng)實(shí)驗室條件且用于研究中。適應(yīng)至少7天。安置適應(yīng)期間及給藥后，將動物安置于入口受限之嚙齒動物設(shè)施中且分組飼養(yǎng)于配備有硬底且填充刨花作為鋪墊材料之聚丙烯籠(45CmX25CmX13Cm)中，每組最多10 只小鼠。每周更換籠一次。食物及水向動物提供可自由取得的商業(yè)嚙齒動物膳食且動物可自由獲取經(jīng)由具有不銹鋼吸管(sipper tube)之聚乙烯瓶供應(yīng)至各籠之飲用水。至少每3周更換水瓶。每周更換水3次。環(huán)境設(shè)定自動控制之環(huán)境條件維持在20-24°C，相對濕度(RH)為30-70 %，12/12 小時光照/黑暗循環(huán)，且研究房內(nèi)每小時換氣10-30次。由人工測量與控制計算機(jī)每天監(jiān)測溫度及RH。由控制計算機(jī)監(jiān)測光照循環(huán)。鑒定給予動物唯一的動物鑒定耳編號。該編號也呈現(xiàn)在各籠前端可見之籠卡上。 籠卡也含有研究編號。隨機(jī)性將動物隨機(jī)分配至實(shí)驗組中。終止研究結(jié)束時，通過吸入02/C02使存活動物安樂死，接著放血。理由選擇小鼠，因為其代表該實(shí)驗動物模型之精選物種。小鼠之DBA/1品系高度易罹患膠原蛋白誘導(dǎo)之關(guān)節(jié)炎(CIA)。材料人β防御素2(hBD2)；參見以上地塞米松(Sigma，目錄號D1756)第II 型牛膠原蛋白(MD Biosciences,目錄號 804001314)完全弗氏佐劑(CFA)(MD Biosciences,目錄號 5OlOO97O3)PBS (PAA,目錄號 H15-002)測試組之構(gòu)成表1 測試組及處理
權(quán)利要求
1.一種哺乳動物β防御素在制造用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中該哺乳動物β防御素系胃腸外施用，優(yōu)選系皮下或靜脈內(nèi)施用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項的用途，其中該哺乳動物β防御素系以約0.lmg/kg體重/天至約100mg/kg體重/天，優(yōu)選約0. lmg/kg體重/天至約10mg/kg體重/天之劑量施用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的用途，其中該哺乳動物β防御素為人β防御素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的用途，其中該哺乳動物β防御素與SEQIDNO=USEQ ID NO 2, SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4之氨基酸序列具有至少80%之同一性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項的用途，其中該人β防御素為人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3或人β防御素4。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的用途，其中該哺乳動物β防御素與SEQIDΝ0:2之氨基酸序列具有至少80%之同一性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的用途，其中該哺乳動物β防御素為人β防御素2。
9.一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，該方法包括向需要所述治療之受試者施用有效量之哺乳動物β防御素。
10.權(quán)利要求9的方法，其中該人β防御素系胃腸外施用，優(yōu)選系皮下或靜脈內(nèi)施用。
11.權(quán)利要求9的方法，其中該人β防御素或其功能等效變體系以約0.lmg/kg體重至約100mg/kg體重，優(yōu)選約0. lmg/kg體重至約10mg/kg體重之劑量施用。
12.權(quán)利要求9的方法，其中該哺乳動物β防御素為人β防御素。
13.權(quán)利要求9的方法，其中該哺乳動物β防御素與SEQID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4之氨基酸序列具有至少80%之同一性。
14.權(quán)利要求9的方法，其中該哺乳動物β防御素與SEQID NO :2之氨基酸序列具有至少80%之同一性。
15.權(quán)利要求9的方法，其中該人β防御素為人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3或人β防御素4。
全文摘要
本發(fā)明系關(guān)于使用哺乳動物β防御素治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
文檔編號A61K38/17GK102159234SQ200980136396
公開日2011年8月17日 申請日期2009年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月18日
發(fā)明者伯吉特·安德森, 卡羅琳·S·布林奇, 坦賈·M·R·凱爾, 托馬斯·克魯澤, 澤倫·凱拉爾夫, 珀爾·H·邁金德 申請人:諾維信阿德寧生物技術(shù)公司