專利名稱：用于治療阿爾茨海默氏病的免疫治療組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用以預(yù)防、減緩、停止或者逆轉(zhuǎn)阿爾茨海默氏病(Alzheimer’ s disease) (AD)的進(jìn)程的安全并有效的疫苗。AD以β淀粉狀蛋白(Αβ)沉積物沉積在腦中為特征。通過Αβ1-42疫苗(ΑΝ1792)的Αβ清除已經(jīng)顯示在臨床上是有希望的，但是一部分患者經(jīng)受了限制性炎癥作用。自身抗原如Αβ是低免疫原性的，需要有效的佐劑例如 QS21，在ΑΝ1792疫苗中使用的皂苷，其誘導(dǎo)Thl偏向的應(yīng)答。明鞏——經(jīng)批準(zhǔn)的Th2偏向的佐劑——對(duì)自身抗原表現(xiàn)不佳。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默氏病是以認(rèn)知功能的漸進(jìn)性損失為特征的神經(jīng)變性疾病，且是老年人中癡呆最常見的類型，影響了所有癡呆患者的幾乎一半。因此，高齡是AD的主要危險(xiǎn)因素。65歲的人之中，2-3%表現(xiàn)出疾病的病征，而 25-50% 85歲的人具有AD的癥狀，并且甚至更多的人在沒有特征性癥狀的情況下，具有該疾病的一些病理學(xué)特征。65歲以后，每5年，患病的可能性就翻一倍。在美國，85歲以上AD 的比例是AD人群的最快增長部分，盡管目前的估計(jì)表明75-84歲的老年人群與85歲以上的人群具有大約相同數(shù)目的患者(Herbert等，200 。阿爾茨海默氏病協(xié)會(huì)(Alzheimer's Association)最近報(bào)道，在美國存在多于5百萬患AD的人(阿爾茨海默氏病協(xié)會(huì)，2007)。 這一數(shù)字期望到2050年達(dá)到3倍。目前，政府機(jī)構(gòu)對(duì)AD患者的護(hù)理費(fèi)用是相當(dāng)大的，并且增長迅速到2010年，用于AD的醫(yī)療保險(xiǎn)方案支出期望增長到493億美元(比2000年的費(fèi)用增加)，并且醫(yī)療補(bǔ)助方案支出將增長到330億美元(比2000年增加80% )。已經(jīng)報(bào)道，AD每年花費(fèi)美國企業(yè)610億美元。在該數(shù)額中，由于工人成為AD患者的親屬的照顧者時(shí)的生產(chǎn)力損失和替代費(fèi)用的年度費(fèi)用估計(jì)為365億美元。這些費(fèi)用既不能反映家庭護(hù)理者的經(jīng)濟(jì)損失(例如，失去收入)，也不能反映與提供臨終護(hù)理的家庭成員中情緒壓抑相關(guān)的代價(jià)。目前還不能治愈AD，并且雖然可用的藥物為一些患者提供了相當(dāng)小的癥狀性益處，但是并沒有減緩疾病進(jìn)程。AD以腦淀粉狀蛋白β (Αβ)蛋白質(zhì)沉積、神經(jīng)斑、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化和由超磷酸化的tau蛋白組成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)為特征(SelkOe，2001)。流行病學(xué)的、病理學(xué)的和遺傳學(xué)的證據(jù)表明，Αβ在AD的發(fā)病機(jī)理中具有關(guān)鍵性的作用(Golde，2003)。用在弗氏佐劑中的聚集的Αβ 1-42肽腹膜內(nèi)注射免疫淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)(APP)轉(zhuǎn)基因小鼠導(dǎo)致腦 Αβ的降低(khenk等，1999)。也已經(jīng)報(bào)道了用Αβ 1_40肽鼻內(nèi)免疫接種后，在PDAPP-tg 小鼠中降低的腦A β水平(Lemere等，2000 Jeiner等，2000)。之后不久，一些報(bào)道證實(shí)了抗體介導(dǎo)的Αβ清除的重要性以及其在改善認(rèn)知中的作用(Bard等，2000;Janus等，2000 ；Morgan等，2000 ；Dodart等，2002)。此外，在用使用多種佐劑進(jìn)行A β免疫(Lemere 等，2002 ；Cribbs 等，2003 ；Lemere 等，2000，2002，0203 ；Spooner 等，2002 ；Maier 等，2005 ； Ghochikyan 等，2006)和通過 DNA 免疫(Ghochikyan 等，2003，Zhang 等，2003，Okura 等， 2006，F(xiàn)raZer等，2007)后已經(jīng)誘導(dǎo)了抗Αβ抗體。除主動(dòng)的免疫策略外，在AD的小鼠模型中，用針對(duì)Αβ的抗體的被動(dòng)免疫也已經(jīng)顯示出可以從腦清除Αβ，并與改善認(rèn)知功能有關(guān) (Bard等，2000，DeMattos等，2001)。這些令人鼓舞的動(dòng)物數(shù)據(jù)一起導(dǎo)致多中心Αβ疫苗 (ΑΝ1792)臨床試驗(yàn)(Schenk,2002 ；Orgogozo 等，2003 ；Gilman 等，2OO5)。ANl792疫苗在兩方面存在缺陷。首先，AN1792僅在300名接受治療的患者的59人中誘導(dǎo)了有效的免疫應(yīng)答，第二，當(dāng)18名(6%)經(jīng)治療的受試者經(jīng)歷腦膜腦炎癥狀時(shí)，臨床試驗(yàn)不得不終止(Schenk，2002 ；Orgogozo 等，2003 ；Gilman 等，2005)。來自接受了 AN1792 接種的受試者的尸檢病例報(bào)告顯示與對(duì)照相比具有強(qiáng)烈降低的斑塊數(shù)目的區(qū)域(Nicoll 等，2003疋errer等，2004 ;MaSliah等，2005)。然而，在兩例病例中，在柔腦脊膜、血管周圍間隙和腦實(shí)質(zhì)中存在T細(xì)胞浸潤(主要是CD4+和很少的CD8+細(xì)胞)，表明針對(duì)AN1792接種的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。盡管在臨床前研究中沒有觀察到神經(jīng)炎癥，但最近的報(bào)道表明，用A β和百日咳菌毒素免疫接種C57BL/6小鼠誘導(dǎo)了自身免疫腦膜腦炎，其具有與在用 ΑΝ1792免疫接種的人類中觀察到的那些癥狀類似的特征(Furlan等，2003)。對(duì)ΑΝ1792試驗(yàn)的隨訪研究顯示，產(chǎn)生了與Αβ斑塊結(jié)合的抗體的AD患者顯示出顯著放緩的認(rèn)知功能下降速率。這些發(fā)現(xiàn)表明，通過主動(dòng)免疫產(chǎn)生抗A β抗體是AD有希望的免疫治療方法，條件是可以在這些老年患者中誘導(dǎo)出強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，并且過多的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)最小以避免不想要的神經(jīng)炎癥。Αβ抗體降低腦中Αβ負(fù)擔(dān)的精確機(jī)制還不知道，但是假說包括通過小神經(jīng)膠質(zhì)的Fc受體介導(dǎo)的吞噬作用、淀粉狀蛋白纖絲的溶解或者循環(huán)Αβ的螯合導(dǎo)致了 Αβ從腦中增加的凈流出(Vasilevko和Cribbs，2006)。顯而易見，無論何種機(jī)制，主動(dòng)或被動(dòng)的免疫治療具有在AD中清除A β并改善認(rèn)知功能的潛力。已經(jīng)研發(fā)了主動(dòng)免疫方案以最小化T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)并最大化抗體產(chǎn)生。在人類(Geylis 等，2005)、猴子(Lemere 等，2004)和小鼠(Lemere 等，2000 ；McLaurin 等，2002 ；Agadjanyan等，2005)中B細(xì)胞表位位于Αβ 1-15區(qū)域，而T細(xì)胞表位已經(jīng)在 A β 15-42內(nèi)作圖(Cribbs等，2003 ;Monsonego等，2003)。因此，跨B細(xì)胞表位而非T細(xì)胞表位的Αβ片段可以是更安全的免疫原以潛在地避免有害的抗Αβ細(xì)胞免疫應(yīng)答。已經(jīng)研究了許多方法以增強(qiáng)這些較短的A β片段的免疫原性，例如綴和B細(xì)胞表位A β 1-15到通用輔助T細(xì)胞表位PADER上(Agadjanyan等，2005 ；Ghochikyan等，2006)、提供添加賴氨酸殘基擴(kuò)增和谷氨酸替代以降低β折疊含量(Siguardsson等，2001，2004)或者遞呈為多拷貝(Zhou等，2005)。最近，已經(jīng)描述了UBITh AD免疫治療疫苗，其中用外源UBITh . 表位取代了 Αβ 1-42固有的自身Th表位(Wang等，2007)。來自獼猴中重復(fù)計(jì)量毒性研究的結(jié)果沒有顯示出用這種A β 1-14 UBITh 疫苗免疫接種后的免疫毒性或者整體毒性的證據(jù)。樹狀聚體Αβ l-15(dAi3 1-15)是有效的免疫原，其由分枝賴氨酸核心上16個(gè)拷貝的Αβ1-15組成，所述核心包括Αβ特異的B細(xì)胞表位但缺乏T細(xì)胞表位。使用實(shí)驗(yàn)佐劑LT(R192G)(突變的大腸桿菌熱不穩(wěn)定的腸毒素)，用dAi3 1_15鼻內(nèi)(i. n.)免疫 (Dickinson和Clements，1995)，在J20APP_tg小鼠中造成了強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答，腦斑塊負(fù)擔(dān)顯著降低Geabrook等，2006)。當(dāng)在小鼠中用LT(R192G)佐劑皮下注射 Αβ 1-15時(shí)， 誘導(dǎo)了體液免疫應(yīng)答，具有主要是IgGl同種型和較低水平的IgG^i和IgG2b的抗A β抗體， 所述抗Αβ抗體與來自AD患者的腦組織中的腦Αβ斑塊結(jié)合Geabrook等，2006)。在另一研究中，使用LT(R192G)佐劑，用串聯(lián)重復(fù)的兩個(gè)賴氨酸連接的Αβ 1_15序列ΟΧΑβ 1-15) 鼻內(nèi)免疫接種，在hAPP小鼠中降低了腦Αβ負(fù)擔(dān)和認(rèn)知缺陷，不存Αβ特異的細(xì)胞免疫應(yīng)答(Maier 等，2006)。除使用具有較少固有神經(jīng)毒性的短Αβ衍生物外，可以將免疫應(yīng)答導(dǎo)向Th2表型的佐劑也對(duì)設(shè)計(jì)安全的、免疫原性強(qiáng)烈的且有效的AD疫苗是關(guān)鍵的(Cribbs等，2003; (ihochikyan等，2006)。QS21——已知誘導(dǎo)強(qiáng)的Thl體液免疫應(yīng)答(在小鼠中的化6加抗體)的佐劑用于AN1792試驗(yàn)中，并且可能有助于在其臨床評(píng)價(jià)期間觀察到的T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥。到目前為止，許多在動(dòng)物中的研究集中于通過使用產(chǎn)生混合的Thl/Th2免疫應(yīng)答的強(qiáng)佐劑，例如CFA/IFA得到好的抗體滴度。已經(jīng)顯示，當(dāng)配制于明礬(偏向Th2的佐劑)中時(shí)，與通用輔助T細(xì)胞表位(PADRE)串聯(lián)的A β 1-15 (PADRE A β 1-15-ΜΑΡ)主要產(chǎn)生了 IgGl 抗體同種型，但得到了比配制在Quil A(主要產(chǎn)生IgGh同種型的偏向Thl的佐劑)中時(shí)弱的免疫應(yīng)答((ihochikyan等，2006)。盡管還沒有報(bào)道皮下或者肌內(nèi)途徑后，針對(duì)A β的強(qiáng)烈Th2型體液應(yīng)答，但是在用使用LT(R192G)佐劑的A β肽鼻內(nèi)免疫接種后，在APP/TG小鼠中的Th2型體液應(yīng)答與顯著減少的腦Αβ斑塊負(fù)擔(dān)、減少的局部小神經(jīng)膠質(zhì)和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化以及降低的神經(jīng)炎性營養(yǎng)不良(neuritic dystrophy)相關(guān)(Weiner等，2000)。 因此，原則上，在AD人群中誘導(dǎo)強(qiáng)烈的Th2偏向的免疫應(yīng)答的抗A β疫苗應(yīng)當(dāng)對(duì)治療AD是有效的。發(fā)明概述誘導(dǎo)強(qiáng)烈的Th2偏向的免疫應(yīng)答而又避免有害的炎性Thl偏向的細(xì)胞免疫應(yīng)答的抗Αβ疫苗對(duì)治療AD可能是有效的。在合適的佐劑中的Αβ 1-42也可以達(dá)到這種結(jié)果。此外，缺乏Thl表位的B細(xì)胞特異的短Αβ肽表位由于避免了潛在有害的炎性細(xì)胞免疫應(yīng)答， 對(duì)用于AD的有效免疫治療方案是有希望的候選物。然而，此種肽自身表位需要額外的T細(xì)胞輔助，并額外地需要強(qiáng)的Th2偏向的佐劑以在人類中驅(qū)動(dòng)想要的免疫應(yīng)答和產(chǎn)生高滴度的抗Αβ抗體。本發(fā)明提供了在油包水乳液型Th2偏向的佐劑/遞送系統(tǒng)中的Αβ肽表位例如Αβ 1-42，以避免或者抑制Thl偏向的細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及缺少Thl表位、與免疫原性載體(DT)綴合以形成Αβ 15DT綴合物的自身表位(Αβ 1_15)，然后將其配制于油包水乳液佐劑/遞送系統(tǒng)中以誘導(dǎo)Th2偏向的免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)例中，免疫原性組合物可以通過皮下或者肌內(nèi)注射施用給患者。公開的免疫治療組合物涉及免疫原，其包括配制在油包水乳液型佐劑中的 Aβ 1-42或者來源于其的氨基酸殘基，包括通過C末端肽間隔區(qū)與免疫原性載體例如白喉毒素(DT-經(jīng)批準(zhǔn)的兒童和成人疫苗的組分)偶聯(lián)的Αβ的1-15個(gè)氨基酸殘基。組合物被設(shè)計(jì)成誘導(dǎo)針對(duì)Αβ的中和抗體同時(shí)避免Thl偏向的細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥。附圖簡述圖IA和B描述了免疫后血漿中的抗A β 1-42抗體水平和Ig同種型。圖2顯示了來自用在CFA/IFA、IFA或者M(jìn)AS-I佐劑中的Αβ 1_42免疫的小鼠的血漿與來自APP Tg小鼠的腦切片中的Αβ斑塊的結(jié)合。
圖3顯示了配制在MAS-I中的分別為7和22的肽與載體取代率的Αβ 15 QDT和 Αβ 15(22)DT綴合物在小鼠中的致免疫力。圖4顯示了配制在MAS-I中的分別為7和22的肽與載體取代率的A β 15 QDT和 Αβ 15(22)DT綴合物在小鼠中的致免疫力。圖5 描述了在 C57BL/6 小鼠中通過 MAS-1 中的 Αβ 1-42, A β 15(7)DT 禾口 Αβ 15 (22) DT誘導(dǎo)的抗A β同種型。圖6 顯示了通過MAS-I 中的 Αβ 1-42、Αβ 15(7)DT 和 Αβ 15(22)DT 誘導(dǎo)的抗 Αβ 特異性的表位作圖。圖7 顯示了來自用 MAS-I 中的抗 A β 1-42、A β 15 (7) DT 和 A β 15 (22) DT 免疫的 DBA 小鼠的血漿對(duì)人類AD斑塊可比較的抗A β免疫反應(yīng)性。圖8描述了 3 X Tg-AD小鼠中的抗A β水平。圖9顯示了脾細(xì)胞刺激測定。

圖10描述了 Aβ斑塊染色的每3XTg-AD小鼠的腦切片。發(fā)明詳述在發(fā)明詳述中提供的實(shí)施例和圖僅是例子，其不應(yīng)當(dāng)以任何權(quán)利要求構(gòu)造或者解釋限制權(quán)利要求的范圍。AD治療疫苗將小分子包括肽與免疫原性載體例如DT綴合是已建立的增強(qiáng)其免疫原性的方法。然而，為了使得自身抗原綴合物在人類中強(qiáng)的免疫原性，還需要用合適的佐劑配制。 MAS-I，是從Mercia Pharma公司可得到的包含二縮甘露醇一油酸酯、鯊烯和鯊?fù)榈挠桶橐鹤魟┫到y(tǒng)。研發(fā)了 MAS-I用于在人類中與自身抗原綴合物構(gòu)建體一起使用以產(chǎn)生治療性疫苗，所述治療性疫苗在不誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性或者破壞針對(duì)疫苗的自身組分的免疫自身耐受的情況下刺激對(duì)自身抗原持續(xù)的中和抗體應(yīng)答，并且是良好耐受的和無全身性毒性?；诙s甘露醇一油酸酯的佐劑是商業(yè)可得到的，例如從許多來源可得到的不完全弗氏佐劑(IFA)和從法國巴黎的SEPPIC公司可得到的ISA51和ISA 720。油包水型乳液佐劑也可以用從許多來源(例如Combe公司的Aelacel商標(biāo)下)商業(yè)可得到的二縮甘露醇一油酸酯以及鯊烯和鯊?fù)?來自一些商業(yè)來源)配制?？梢耘渲圃诠_的組合物中使用的油包水佐劑以便使在運(yùn)載抗原的乳液中的含水小球具有小于1微米的直徑中值(直徑中值范圍大約為100納米至大約1微米，且一般地平均直徑為大約300納米)。MAS-I的油性組分是可代謝的天然存在的生物油，不同于包含熟知的弗氏佐劑(不完全制劑和完全制劑二者)的油相的礦物油。許多載體蛋白質(zhì)例如但不限于，白喉毒素(DT)、CRM197 (Wyeth)-DT的突變形式、 破傷風(fēng)類毒素(TT)和匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)都可以在本發(fā)明的組合物中使用。DT是優(yōu)選的載體蛋白質(zhì)，因?yàn)樗慌鷾?zhǔn)在兒童和成人疫苗中使用，具有極好的安全記錄，并由許多商業(yè)來源根據(jù)cGMP大量生產(chǎn)。佐劑/遞送系統(tǒng)的特異性幾十年來，弗氏佐劑乳劑(CFA/IFA)是衡量其他佐劑的標(biāo)準(zhǔn)。CFA并不適合于在人類中使用，特別是因?yàn)槠浞种U菌組分誘導(dǎo)的強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)；盡管如此，IFA已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中使用，但是還沒有被批準(zhǔn)用于任何的人類適應(yīng)癥。然而，通常認(rèn)為這些油包水(W/0) 乳劑是有效的佐劑，并廣泛地在動(dòng)物研究中使用。明礬是目前美國唯一批準(zhǔn)的具有避免細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的Th2偏向的佐劑，但是由于致免疫力不足，明礬不適合作為用于自身表位綴合物疫苗的佐劑?；诘V物油的IFA 型佐劑例如ISA 51作為在治療慢性疾病情況中重復(fù)使用的佐劑存在缺點(diǎn)，因?yàn)镮FA的礦物油沉積物殘存在注射位點(diǎn)并可以導(dǎo)致囊腫的形成。特別研發(fā)了 MAS-I佐劑/遞送系統(tǒng)用于加強(qiáng)對(duì)人類中低免疫原性的自身抗原的體液應(yīng)答。在免疫原性方面，MAS-I佐劑乳劑比明礬明顯更有效，并且比得上或者優(yōu)于IFA乳劑，但是在肌內(nèi)或者皮下注射后，MAS-I比IFA被明顯更好地耐受并且具有極好的藥物物理化學(xué)特性。這些包括用于高效抗原遞呈的均質(zhì)小球大小分布、有助于低體積劑量的低黏度和在冷藏溫度下延長的穩(wěn)定性，有助于經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)冷鏈程序的分配。不同于IFA，MAS-I由天然且可代謝的組分組成，其提供了疫苗貯庫，并因此促進(jìn)延長的有效的免疫刺激。MAS-I最終從注射位點(diǎn)中清除。無論是大量制備還是作為點(diǎn)使用的單一單位，MAS-I乳劑都是強(qiáng)烈的、可再生的和穩(wěn)定的，并且可以以制劑生產(chǎn)，其具有攜帶直徑中值小于1微米和一般地大約300納米的抗原的含水小球。相比之下，IFA乳劑以制劑施用，所述制劑具有直徑大約3至10或者甚至50微米的含水小球，在乳劑穩(wěn)定性中伴隨著易變性，并且IFA是高粘度的，使得小體積給藥和大規(guī)模的批量生產(chǎn)很困難。在MAS-I中配制的A β 1-42肽疫苗將Αβ 1-42疫苗(ΑΝ1792)配制在基于QS21的佐劑中。QS21(強(qiáng)的Thl偏向的佐劑)可能有助于AN1792疫苗的炎癥副作用。評(píng)價(jià)了配制在MAS-I中的Αβ 1-42促進(jìn)針對(duì)腦組織中淀粉狀蛋白斑塊強(qiáng)烈的Th2偏向的抗體應(yīng)答，同時(shí)避免產(chǎn)生與Thl應(yīng)答有關(guān)的β 淀粉狀蛋白特異的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的能力。圖IA和B描述了免疫后的血漿中抗A β 1-42抗體水平和Ig同種型。1 (A)在第0天、第14天、第42天和第84天用IOOug A β 1-42皮下免疫接種雌性 DBA小鼠，并通過ELISA測量了在基線、第觀天、第56天和第98天血漿中的抗A β 1_42抗體和B)在第98天的Ig同種型。通過標(biāo)準(zhǔn)的固相肽合成方法合成Aβ 1-40和Αβ 1_42肽抗原。在第0天、第14天、 第42天和第84天用配制在MAS-I、CFA/1FA或者IFA中的100 μ g A β (75 μ g A β 1-40和 25 μ g A β 1-42)皮下(s. c.)注射DBA2小鼠(η = 4)。在第0天、第觀天、第56天和第98 天通過ELISA測定血漿中的抗體滴度。結(jié)果顯示，在第28天、第56天和第98天，配制在 MAS-I中的全長Αβ誘導(dǎo)了優(yōu)于IFA的強(qiáng)烈的抗體滴度(圖1Α)。通過標(biāo)準(zhǔn)的固相肽合成方法合成Aβ 1-40和Αβ 1_42肽抗原。在第0天、第14天、 第42天和第84天用配制在MAS-I、CFA/1FA或者IFA中的100 μ g A β (75 μ g A β 1-40和 25 μ g A β 1-42)皮下(s. c.)注射DBA2小鼠(η = 4)。在第0天、第觀天、第56天和第98 天通過ELISA測定血漿中的抗體滴度。結(jié)果顯示，在第28天、第56天和第98天，配制在 MAS-I中的全長A β誘導(dǎo)了優(yōu)于IFA的強(qiáng)烈抗體滴度(圖1Α)。在CFA/IFA中的A β 1-42(陽性對(duì)照)，如所期望地產(chǎn)生了比MAS-I或者IFA制劑更快速的和最初更高的抗體水平。對(duì) MAS-I和IFA制劑二者的應(yīng)答在整個(gè)研究中都在增加，并且在第98天取得最終的血液樣品的時(shí)候還沒有達(dá)到平臺(tái)期；第98天的樣品的同種型分型顯示，CFA/IFA誘發(fā)了混合型Thl/Th2免疫應(yīng)答，分別具有IgGh和IgG2b抗體的顯著滴度。然而，MAS-I和IFA制劑誘發(fā)了 Th2主導(dǎo)的應(yīng)答，以IgGl為優(yōu)勢(shì)的同種型，伴隨IgM、低水平的IgG2b，以及僅非常低水平的 Thl型IgG^i抗體(圖1B)。來自用CFA/IFA、IFA和MAS-I中的全長A β 1_42免疫的小鼠的血漿與來自APP Tg小鼠的腦切片中的人類Αβ斑塊顯示出同等水平的結(jié)合(圖2)，表明Th2優(yōu)勢(shì)抗體同種型有效地識(shí)別了淀粉狀蛋白斑塊，說明偏向Th2的疫苗具有降低淀粉狀蛋白斑塊負(fù)擔(dān)同時(shí)避免Thl介導(dǎo)的毒性的潛力。圖2顯示了來自用CFA/IFA、IFA或者M(jìn)AS-1佐劑中的A β 1-42免疫的小鼠的血漿與來自APP Tg小鼠的腦切片中的Αβ斑塊的結(jié)合。在第98天從在第0天、第14天、第42 天和第84天用CFA/IFA、IFA和MAS-I中的Aβ 1-42免疫的小鼠中取得的血漿同等地結(jié)合來自APP Tg小鼠的腦切片中的腦Αβ斑塊(下圖)。免疫前血漿用作對(duì)照且沒有結(jié)合腦 Αβ斑塊(上圖)。來自用CFA/IFA、IFA和MAS-I中的全長A β 1-42免疫的小鼠的血漿與來自APP Tg 小鼠的腦切片中人類Αβ斑塊顯示出同等水平的結(jié)合(圖2)，表明Th2優(yōu)勢(shì)抗體同種型有效地識(shí)別了淀粉狀蛋白斑塊，說明Th2偏向的疫苗具有降低淀粉狀蛋白斑塊負(fù)擔(dān)同時(shí)避免 Thl介導(dǎo)的毒性的潛力。A β DT綴合的疫苗肽表位選擇靶向Αβ B細(xì)胞表位同時(shí)避免Αβ特異的T細(xì)胞表位是一些研究者追求的策略，以避免在用纖絲狀的全長A β 1-42進(jìn)行的ΑΗ1792臨床試驗(yàn)中看到的一些副作用。已經(jīng)表明A β 1-15序列編碼有關(guān)B細(xì)胞表位(Geylis等，2005 ；Lemere等，2004 ；Lemere 等，2000 ；McLaurin等，2002 ；Agadjanyan等，2005)?？梢詫⒃撔蛄信c免疫原性載體綴合以
改善免疫原性。在圖1Α、1Β和2中顯示的數(shù)據(jù)表明，當(dāng)將Aβ 1-40和Αβ 1-42配制在MAS-1佐劑或者IFA佐劑中時(shí)，這些A β疫苗可以誘導(dǎo)Th2主導(dǎo)的免疫應(yīng)答。然而，配制在CFA中的 Aβ 1-40和Αβ 1-42也誘導(dǎo)了誘導(dǎo)顯著的Thl免疫應(yīng)答，其造成了如在ΑΝ1792疫苗中用配制在QS21佐劑中的A β 1-40和A β 1-42所報(bào)道的Thl細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥。因此，基于這些結(jié)果，包含來源于A β氨基酸殘基16到40和16到42的A β表位序列的綴合A β疫苗，當(dāng)與合適的免疫原性載體綴合時(shí)，當(dāng)配制為基于MAS-I或者IFA的疫苗時(shí)可以期望誘導(dǎo)強(qiáng)烈的且安全的Th2主導(dǎo)的免疫應(yīng)答。同樣地，當(dāng)將這些構(gòu)建體用明礬(經(jīng)批準(zhǔn)的Th2偏向的佐劑)配制時(shí)，也可以期望地產(chǎn)生Th2主導(dǎo)的免疫應(yīng)答。這些表位序列一般可以含有來源于 A β序列1-40和1-42的7至15個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。免疫原性載體選擇當(dāng)配制在Th2偏向的明礬佐劑中時(shí)，缺乏輔助T細(xì)胞表位的 A β 1-15肽是低免疫原性的(Agadjanyan等，2005)。這可能對(duì)于配制在MAS-1中的A β 1-15 肽是事實(shí)，因?yàn)榕渲圃贗FA中的A β 1-14在豚鼠中已經(jīng)顯示出為弱免疫原，除非通過與匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)載體蛋白質(zhì)或者外源UBITh表位連接來提供外來的T細(xì)胞輔助(Wang等， 2007)。類似地，包含來源于A β 1-40和A β 1-42的7至15個(gè)氨基酸殘基的A β肽，當(dāng)配制在IFA、MAS-I或者明礬佐劑中時(shí)，也被預(yù)測是低免疫原性的。短的非免疫原性的肽的免疫原性一般可以通過與Th表位例如合成的PADRE構(gòu)建體(Agadjanyan等，2005)或者與免疫原性載體蛋白例如突變的霍亂B毒素(CBT)、KLH、突變的白喉毒素(CRM)或者與類毒素例如破傷風(fēng)類毒素(TT)或者白喉類毒素偶聯(lián)來增強(qiáng)，所有這些物質(zhì)都含有Th表位以為IgG產(chǎn)生和免疫記憶提供T細(xì)胞輔助。在該AD疫苗中，挑選DT作為免疫原性載體，因?yàn)樗呀?jīng)被批準(zhǔn)在兒童和成人疫苗中使用，并且作為符合GMP 的組分是可得到的。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用雙功能交聯(lián)劑，將Αβ肽表位通過具有末端半胱氨酸殘基的7個(gè)殘基間隔區(qū)序列通過該末端半胱氨酸殘基的巰基部分與DT綴合。在其他的實(shí)施方案中，沒有7殘基間隔區(qū)序列但是以半胱氨酸殘基結(jié)束的Αβ表位可以通過其巰基部分與免疫原性載體綴合。備選的偶聯(lián)化學(xué)是本領(lǐng)域熟知的，例如碳二亞胺化學(xué)，也可以用于實(shí)現(xiàn)Aβ表位與免疫原性載體的綴合。Αβ 15DT綴合物的合成結(jié)果表明，免疫原性可能受到肽與載體取代率的影響。 Αβ 15肽序列和綴合方法提供如下?？偟膩碚f，22個(gè)殘基的Αβ 15聚體肽通過固相化學(xué)合成。Αβ 15DT綴合物以二 Αβ 15肽DT摩爾取代率制備。通過在SDS-PAGE上的遷移率確定的兩種A β 15DT綴合物的取代率為7. 6 (#1)和21. 1 (#2)(參見表1)。從每摩爾免疫原性載體大約5摩爾至大約30摩爾的肽的綴合率對(duì)組合物是有用的。表1 通過SDS-PAGE表征A β 15DT綴合物
權(quán)利要求
1.用于治療阿爾茨海默氏病的免疫治療組合物，其包括在包含Th2偏向的佐劑的油包水乳液中配制的來自人β淀粉狀蛋白蛋白質(zhì)的肽，其中所述油包水乳液經(jīng)配制使得在攜帶該肽的乳液中的含水小球具有大約100納米至大約1微米的直徑中值。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中平均含水小球直徑是大約300納米。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述肽是Aβ殘基1-42或者Αβ殘基1-15。
4.權(quán)利要求1的組合物，其包含免疫原性綴合物，其中所述肽與免疫原性載體蛋白綴I=I O
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述油包水乳液包含MAS-I。
6.權(quán)利要求4的組合物，其中所述免疫原性載體蛋白是DT、TT或者KLH。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述免疫原性綴合物包括免疫原性載體蛋白DT，并且Αβ 肽1-15殘基與載體的綴合率為每摩爾載體大約5至大約30摩爾的肽。
8.權(quán)利要求7的組合物，其包含免疫原性綴合物，所述免疫原性綴合物包含具有 7 1、22 1的綴合比的組合物或者是具有在大約5 1至大約25 1范圍內(nèi)綴合比的綴合物的組合。
9.治療或者預(yù)防人類患者中阿爾茨海默氏病的方法，所述方法包括對(duì)患者施用權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7或者8的免疫治療組合物。
全文摘要
公開了一種用于預(yù)防、減緩、終止或者逆轉(zhuǎn)人類患者中阿爾茨海默氏病的進(jìn)程的安全并有效的疫苗。疫苗包括配制在油包水Th2偏向的佐劑/遞送系統(tǒng)中的與免疫原性載體(例如DT)綴和的Aβ1-42或者β淀粉狀蛋白自身表位(例如，Aβ1-15或者其他來源于Aβ1-42的7聚體或者15聚體肽表位)。
文檔編號(hào)A61K39/385GK102256620SQ200980139326
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2009年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月7日
發(fā)明者P·布萊克本, S·格萊姆斯 申請(qǐng)人:莫西亞藥物公司