專利名稱：結(jié)合淋巴細胞活化基因3(lag-3)之人類抗體及其用途的制作方法
結(jié)合淋巴細胞活化基因3(LAG-(3)之人類抗體及其用途
背景技術(shù)：
淋巴細胞活化基因3或LAG_3(也稱作⑶223)系免疫球蛋白超基因家族之一員， 并且在結(jié)構(gòu)上以及遺傳上與⑶4有關(guān)。LAG-3并不在休眠的外周血淋巴細胞上表達，但在被活化的T細胞以及NK細胞上表達。LAG-3系由位于染色體12的短臂的遠程部分、在⑶4 基因附近的一基因進行編碼的膜蛋白，表明該LAG-3基因可能已經(jīng)藉由基因重復而進化 (Triebel et al. (1990) T. Exp. Med. 171 1393-1405)。類似于⑶4，LAG-3已被證明與MHC II類分子進行相互作用，但不像⑶4，LAG-3不與人類免疫缺陷病毒gpl20蛋白進行相互作用(Baixeras et al. (1992) J. Exp. Med. 176 327-337)。使用可溶的LAG-3免疫球蛋白融合蛋白(sLAG_3Ig)的研究證明了 LAG-3與在細胞表面上的MHC II類直接并且特異的結(jié)合(Huard et al. (1996)Eur. J. Immunol. 26 1180-1186)。在抗原特異性T細胞應答的體外研究中，加入抗LAG-3抗體導致T細胞增殖增加、活化抗原(如CD25)的更高表達、以及更高濃度的細胞因子(例如干擾素、以及白介素4)，從而支持LAG-/MHC II類分子相互作用在下調(diào)CD4+T淋巴細胞的抗原依賴性刺激中的作用(Huard et al. (1994)Eur. J. Immunol. 24 :3216-3221)。已經(jīng)證明 LAG-3 的胞質(zhì)內(nèi)區(qū)與名為LAP的蛋白進行相互作用，此蛋白被認為是與CD3/TCR活化途徑的下調(diào)有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導分子(Iouzalen et al. Q001) Eur. J. Immunol. M :2885-2891)。此外，已顯示 ⑶4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(TMg)在活化時表達LAG-3，并且針對LAG-3之抗體在體內(nèi)以及體外均抑制由所誘導的TMg細胞所產(chǎn)生的阻抑，表明LAG-3有助于TMg細胞的阻抑活性(Huang，
C.et al. (2004) Immunity 21:503-513)。另外，已顯示LAG-3藉由調(diào)節(jié)性T細胞以T細胞依賴性以及非依賴性這兩種機制對T細胞穩(wěn)態(tài)進行負向調(diào)節(jié)(Workman，C. J. and Vignali,
D.Α. (2005) J. Immunol. IU :688-695)。在某些情況下，LAG-3還已顯示出具有免疫刺激作用。例如，當與未經(jīng)轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞相比時，移植到同系基因小鼠中的轉(zhuǎn)染了 LAG-3的腫瘤細胞顯示出顯著的生長下降或完全消退，表明LAG-3在腫瘤細胞上的表達藉由經(jīng)由MHC II類分子觸發(fā)抗原呈遞細胞而刺激了抗腫瘤應答(Prigent et al. (1999)Eur. J. Immunol. 29 :3867-3876) 另外地， 當與抗原一起被給予小鼠時，已顯示可溶性LAG-3Ig融合蛋白刺激體液免疫反應以及細胞免疫反應，說明可溶性LAG-3 Ig可作為疫苗佐劑發(fā)揮作用(El Mir and Triebel (2000) J. Immunol. IM :5583-5589)。此外，已顯示可溶性人類LAG_3Ig擴大了在體外產(chǎn)生I型腫瘤特異性免疫(Casati et al. (2006) Cancer Res.巡4450-4460)。在 Triebel Q003) Trends Immunol. 24 :619-622中對LAG-3的功能活性進行了進一步綜述。鑒于以上原因，用于調(diào)整 LAG-3活性的另外的藥劑系令人感興趣的。發(fā)明概述本披露提供了分離的單克隆抗體，特別是人類單克隆抗體，該等人類單克隆抗體特異性結(jié)合LAG-3并且具有所希望的功能特性。該等特性包括與人類LAG-3的高親和力結(jié)合，與人類和猴類LAG-3 (獼猴和/或恒河猴LAG-3)結(jié)合，但不與小鼠LAG-3結(jié)合，抑制LAG-3與主要組織相容性(MHC) II類分子的結(jié)合和/或刺激抗原特異性T細胞應答的能力。例如，本發(fā)明之抗體可被用于(如，在攜帶腫瘤的受試者或攜帶病毒的受試者中)檢測 LAG-3蛋白或刺激抗原特性性T細胞應答。一方面，本發(fā)明涉及分離的之人類單克隆抗體、或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體結(jié)合人類LAG-3，并且表現(xiàn)出以下特性中的至少一種(a)結(jié)合猴類 LAG-3 ；(b)不結(jié)合小鼠LAG-3 ；(c)抑制LAG-3與主要組織相容性(MHC) II類分子的結(jié)合；以及(d)刺激免疫反應。較佳的是，該抗體表現(xiàn)出特性(a)、(b)、(c)以及(d)中的至少兩種。更佳的是，該抗體表現(xiàn)出特性(a)、(b)、(c)以及(d)中的至少三種。甚至更佳的是，該抗體表現(xiàn)出特性 (a)、(b)、(c)以及(d)中的全部四種。在一較佳的實施方案中，該抗體刺激抗原特異性T細胞應答，例如抗原特異性T細胞應答中白介素2(IL-2)之產(chǎn)生。在其它實施方案中，該抗體刺激免疫反應，例如抗腫瘤應答(例如在體內(nèi)腫瘤移植物模型中抑制腫瘤生長)或自身免疫反應(例如在NOD小鼠中促進糖尿病的形成)。在另一較佳的實施方案中，該抗體結(jié)合人類LAG-3的表位，該表位包括氨基酸序列PGHPLAPG(SEQ ID NO :76)。在又另一較佳的實施方案中，該抗體結(jié)合人類 LAG-3 的表位，該表位包括氨基酸序列 HPAPPSSW(SEQ ID NO :77)或 PAAPSSWG (SEQ ID NO: 78)。在仍又其它的實施方案中，該抗體以IX 10- 或更小的Kd與人類LAG-3相結(jié)合，或以 1 X 10、或更小的Kd與人類LAG-3相結(jié)合，或以5 X 1(Γ9Μ或更小的Kd與人類LAG-3相結(jié)合， 或以IX 101或更小的Kd與人類LAG-3相結(jié)合。在一實施方案中，該抗體藉由免疫組織化學法使垂體組織染色，而在另一實施方案中，該抗體藉由免疫組織化學法不使垂體組織染色。在另一方面，本發(fā)明涉及分離的人類單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體與參考抗體交叉競爭而結(jié)合人類LAG-3，其中該參考抗體包括(a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO :37，以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列 SEQ ID NO 43 ；(b)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO :38，以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列 SEQ ID NO 44 ；(c)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO :39，以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列 SEQ ID NO 45 ；(d)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO -AO,以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列 SEQ ID NO 46 ；(e)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO :41，以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列 SEQ ID NO 47 ；或者(f)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO :42，以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列 SEQ ID NO :48ο在一較佳的實施方案中，該參照抗體包括包含氨基酸序列SEQ ID Ν0:37的重鏈可變區(qū)以及包含氨基酸序列SEQ ID NO :43的輕鏈可變區(qū)。在另一較佳的實施方案中，該參照抗體包括包含氨基酸序列SEQ ID NO :38的重鏈可變區(qū)以及包含氨基酸序列SEQ ID NO 44 的輕鏈可變區(qū)。在另一較佳的實施方案中，該參照抗體包括包含氨基酸序列SEQ ID N0:39 的重鏈可變區(qū)以及包含氨基酸序列SEQ ID NO :45的輕鏈可變區(qū)。在另一較佳的實施方案中，該參照抗體包括包含氨基酸序列SEQ ID NO :40的重鏈可變區(qū)以及包含氨基酸序列SEQ ID NO :46的輕鏈可變區(qū)。在另一較佳的實施方案中，該參照抗體包括包含氨基酸序列SEQ ID NO 41的重鏈可變區(qū)以及包含氨基酸序列SEQ ID NO 47的輕鏈可變區(qū)。在另一較佳的實施方案中，該參照抗體包括包含氨基酸序列SEQ ID NO :42的重鏈可變區(qū)以及包含氨基酸序列SEQ IDNO 48的輕鏈可變區(qū)。在另一方面，本發(fā)明涉及分離的單克隆抗體、或其抗原結(jié)合部分，包括重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類Vh 3-20基因、人類Vh 4-34基因、人類Vh 3_33基因或Vh 1- 基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，其中該抗體特異地結(jié)合人類LAG-3。在另一方面，本發(fā)明涉及分離的單克隆抗體、或其抗原結(jié)合部分，包括輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類Vk L18基因、 人類Vk L6基因或人類Vk A27基因的產(chǎn)物或是衍生于該基因，其中該抗體特異地結(jié)合人類 LAG-3。在一較佳的實施方案中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體、或其抗原結(jié)合部分，包括(a)重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類Vh 4-34基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，以及輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類Vk L6基因的產(chǎn)物或衍生于該基因；(b)重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類Vh 3-33基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，以及輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類Vk A27基因的產(chǎn)物或衍生于該基因；(c)重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類Vh 3-20基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，以及輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類Vk L18基因的產(chǎn)物或衍生于該基因；(d)重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類Vh I-M基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，以及輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類Vk L6基因的產(chǎn)物或衍生于該基因；或者(e)重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類Vh 3-33基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，以及輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類Vk L6基因的產(chǎn)物或衍生于該基因；其中該抗體特異地結(jié)合人類LAG-3。在另一方面，本發(fā)明涉及分離的單克隆抗體、或其抗原結(jié)合部分，包括(a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列，該氨基酸序列選自下組，其構(gòu)成為SEQ ID NO 37 至 42 ；(b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列，該氨基酸序列選自下組，其構(gòu)成為SEQ ID NO 43 至 48 ；其中該抗體特異性結(jié)合人類LAG-3。一較佳的組合包括(a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ(b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ另一較佳的組合包括(a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ(b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ另一較佳的組合包括
ID NO 37 ；以及 ID NO :43。
ID NO 38 ；以及 ID NO :44。
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(a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO 39 ；以及(b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO :45。另一較佳的組合包括(a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO 40 ；以及(b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO :46。另一較佳的組合包括(a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO 41 ；以及(b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO :47。另一較佳的組合包括(a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO 42 ；以及(b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO :48。本發(fā)明之抗體可以是例如全長抗體，例如IgGl、IgG2或IgG4同種型。在一較佳的實施方案中，該抗體系IgG4同種型。在另一較佳的實施方案中，該抗體系IgG4同種型，其在重鏈恒定區(qū)的鉸鏈區(qū)(在與如Angal et al. (1993)Mol. Immunol.巡105_108中所說明的位置241對應的位置)具有從絲氨酸到脯氨酸的突變，這樣重鏈之間二硫橋的異質(zhì)性被減小或消除?？商娲?，該抗體可以是諸如Fab、Fab’或Fab’ 2片段之抗體片段，或單鏈抗體。本披露還提供了免疫綴合物，該免疫綴合物包括連接到治療劑(例如細胞毒素或放射性同位素)的本發(fā)明之抗體、或其抗原結(jié)合部分。本披露還提供了雙特異性分子，該雙特異性分子包括本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體或其抗原結(jié)合部分與第二功能模塊相連接，該第二功能模塊具有與所述抗體或其抗原結(jié)合部分相比不同的結(jié)合特異性。還提供了含有本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合部分、或免疫綴合物、或雙特異性分子，以及藥學上可接受的載體的組合物。本披露還涵蓋了對本發(fā)明之抗體、或其抗原結(jié)合部分進行編碼的核酸分子，連同包括此類核酸的表達載體以及包括此類表達載體的宿主細胞。還提供了使用包括此類表達載體的宿主細胞制備抗LAG-3抗體的方法，并且該等方法可包括以下步驟(i)在該宿主細胞中表達該抗體以及(ii)從該宿主細胞中分離該抗體。在另一方面，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的抗LAG-3抗體來刺激免疫反應的方法。例如，在一實施方案中，本發(fā)明提供了刺激抗原特異性T細胞應答的方法，該方法包括使所述 T細胞與本發(fā)明的抗體相接觸，這樣刺激了抗原特異性T細胞應答。在一較佳的實施方案中，刺激了由抗原特異性T細胞進行的白介素2之產(chǎn)生。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了在受試者中刺激免疫反應(例如，抗原特異性T細胞應答)的方法，該方法包括給予該受試者本發(fā)明之抗體，這樣刺激了該受試者中的免疫反應(例如，抗原特異性T細胞應答)。在一較佳的實施方案中，該受試者系攜帶腫瘤的受試者，并且刺激了針對該腫瘤的免疫反應。 在另一較佳的實施方案中，該受試者系攜帶病毒的受試者，并且刺激了針對該病毒的免疫反應。在另一方面，本發(fā)明提供了抑制受試者中腫瘤細胞生長的方法，該方法包括給予該受試者本發(fā)明之抗體，這樣該受試者中的腫瘤生長受到抑制。又在另一方面，本發(fā)明提供了治療受試者中病毒感染的方法，該方法包括給予該受試者本發(fā)明之抗體，這樣該受試者中的病毒感染得到治療。又在另一方面，本發(fā)明提供了在受試者中刺激免疫反應的方法，該方法包括給予該受試者抗LAG-3抗體以及至少一種另外的免疫刺激性抗體，如抗PD-I抗體、抗PD-Ll抗體和/或抗CTLA-4抗體，這樣在該受試者中刺激了免疫反應，例如以抑制腫瘤生長或刺激抗病毒應答。在一實施方案中，給予受試者抗LAG-3抗體以及抗PD-I抗體。在另一實施方案中，給予受試者抗LAG-3抗體以及抗PD-Ll抗體。在另一實施方案中，給予受試者抗LAG-3 抗體以及抗CTLA-4抗體。在一實施方案中，抗LAG-3抗體系人類抗體，如本披露的抗體。可替代地，該抗LAG-3抗體可以是例如嵌合或人源化抗體。在另一實施方案中，至少一種另外的免疫刺激性抗體(例如，抗PD-1、抗PD-Ll和/或抗CTLA-4抗體)系人類抗體?？商娲?，至少一種另外的免疫刺激性抗體可以是例如嵌合或人源化抗體。又在另一方面中，本發(fā)明涉及制備抗LAG-3抗體的方法。該方法包括(a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，包括選自下組的CDRl序列，該組的構(gòu)成為 SEQ ID NO :1至6，選自下組的⑶R2序列，該組的構(gòu)成為SEQ ID NO :7至12，和/或選自下組的CDR3序列，該組的構(gòu)成為SEQ IDNO :13至14、GGY、16至18 ；和/或(ii)輕鏈可變區(qū)抗體序列，包括選自下組的CDRl序列，該組的構(gòu)成為SEQ ID NO 19至M，選自下組的 ⑶R2序列，該組的構(gòu)成為SEQ ID NO :25至30，和/或選自下組的⑶R3序列，該組的構(gòu)成為=SEQ ID NO 31 至 36 ；(b)改變在重鏈可變區(qū)抗體序列和/或輕鏈可變區(qū)抗體序列中的至少一個氨基酸殘基，以產(chǎn)生至少一種被改變之抗體序列；并且(c)將被改變之抗體序列表達成蛋白質(zhì)。從以下詳細的說明以及實施例中本披露的其它特征及優(yōu)點將是清楚的，該等說明與實施例不得被解釋為限制性的。本申請全文引用的所有參考文獻、Genbank條目、專禾IJ、 以及已公開的專利申請的內(nèi)容都明確地藉由引用結(jié)合在此。附圖簡述圖IA示出了 25F7人類單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNO 49)以及氨基酸序列(SEQ ID N0:37)。描繪了 CDRl (SEQ ID NO 1)、CDR2 (SEQ ID N0:7)、以及 CDR3 (SEQ ID NO :13)區(qū)，并指明了 V、D、以及J的種系來源。圖IB示出了 25F7人類單克隆抗體的κ輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQID NO 55) 以及氨基酸序歹 Ij (SEQ ID Ν0:43)。描繪了 CDRl (SEQ ID NO 19)、CDR2 (SEQ ID NO: 25)、以及⑶R3(SEQ ID NO :31)區(qū)，并指明了 V與J的種系來源。圖2A示出了 ^HlO人類單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQID NO 50) 以及氨基酸序歹Ij (SEQ ID N0:38)。描繪了 CDRl (SEQ ID NO :2)、CDR2 (SEQ ID NO :8)、以及 CDR3 (SEQ ID NO :14)區(qū)，并指明了 V、D、以及J的種系來源。圖2B示出了 26H10人類單克隆抗體的κ輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQID NO 56)以及氨基酸序歹Ij (SEQ ID NO 44)。描繪了 CDRl (SEQ ID NO :20)、CDR2 (SEQ ID NO :26)、 以及CDR3(SEQ ID NO :32)區(qū)，并指明了 V與J的種系來源。圖3A示出了 25E3人類單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNO 51)以及氨基酸序列(SEQ ID N0:39)。描繪了 CDRl (SEQ ID NO :3)、CDR2 (SEQ ID NO :9)、以及CDR3區(qū)，并指明了 V、D、以及J的種系來源。圖3B示出了 25E3人類單克隆抗體的κ輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQID NO 57) 以及氨基酸序歹Ij (SEQ ID Ν0:45)。描繪了 CDRl (SEQ ID NO :21)、CDR2 (SEQ ID N0:27)、以 R CDR3 (SEQ ID NO 33)區(qū)，并指明了 V與J的種系來源。圖4A示出了 8B7人類單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNO 52)以及氨基酸序歹Ij (SEQ ID N0:40)。描繪了 CDRl (SEQ ID NO :4)、CDR2 (SEQ ID N0:10)、以及 CDR3 (SEQ ID NO: 16)區(qū)，并指明了 V、D、以及J的種系來源。圖4B示出了 8B7人類單克隆抗體的κ輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNO 58) 以及氨基酸序歹Ij (SEQ ID Ν0:46)。描繪了 CDRl (SEQ ID NO :22)、CDR2 (SEQ ID N0:28)、以及CDR3(SEQ ID NO 34)區(qū)，并指明了 V與J的種系來源。圖5A示出了 11F2人類單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNO 53)以及氨基酸序列(SEQ ID N0:41)。描繪了 CDRl (SEQ ID NO :5)、CDR2 (SEQ ID NO: 11)、以及 CDR3 (SEQ ID NO: 17)區(qū)，并指明了 V、D、以及J的種系來源。圖5B示出了 11F2人類單克隆抗體的κ輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQID NO 59) 以及氨基酸序歹Ij (SEQ ID Ν0:47)。描繪了 CDRl (SEQ ID NO :23)、CDR2 (SEQ ID N0:29)、以 R CDR3 (SEQ ID NO 35)區(qū)，并指明了 V與J的種系來源。圖6A示出了 17E5人類單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNO 54)以及氨基酸序歹Ij (SEQ ID N0:42)。描繪了 CDRl (SEQ ID NO :6)、CDR2 (SEQ ID N0:12)、以及 CDR3 (SEQ ID NO: 18)區(qū)，并指明了 V、D、以及J的種系來源。圖6B示出了 17E5人類單克隆抗體的κ輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQID NO 60) 以及氨基酸序列(SEQ ID N0:48)。描繪了 CDRl (SEQ ID NO :24)、CDR2 (SEQ ID N0:30)、以 R CDR3 (SEQ ID NO 36)區(qū)，并指明了 V與J的種系來源。圖7示出了 25F7的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO 37)與人類種系Vh 4-34 以及JH5b氨基酸序列(分別是SEQ ID N0:61以及62)的比對。圖8示出了 25F7的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO 43)與人類種系Vk L6 以及JK2氨基酸序列(分別是SEQ ID NO 63以及64)的比對。圖9示出了 26H10的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO 38)與人類種系Vh 3-33以及JH6B氨基酸序列(分別是SEQ ID NO 65以及66)的比對。

圖10示出了 26H10的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO 44)與人類種系Vk A27以及JK3氨基酸序列(分別是SEQ ID NO 67以及68)的比對。圖11示出了 25E3的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO 39)與人類種系Vh 3-20以及JH4b氨基酸序列(分別是SEQ ID NO 69以及70)的比對。圖12示出了 25E3的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO 45)與人類種系Vk L18 以及JK2氨基酸序列(分別是SEQ ID NO 71以及64)的比對。圖13示出了 8B7的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO 40)與人類種系Vh 4-34 以及JH5b氨基酸序列(分別是SEQ ID N0:61以及62)的比對。圖14示出了 8B7的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO 46)與人類種系Vk L6 以及JK4氨基酸序列(分別是SEQ ID NO 63以及72)的比對。圖15示出了 11F2的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO 41)與人類種系Vh1-24以及JH4b氨基酸序列(分別是SEQ ID NO 73以及70)的比對。圖16示出了 11F2的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO 47)與人類種系Vk L6 以及JKl氨基酸序列(分別是SEQ ID NO 63以及74)的比對。圖17示出了 17E5的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO 42)與人類種系Vh 3-33以及2-2氨基酸序列(分別是SEQ ID NO 65以及70)的比對。圖18示出了 17E5的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO 48)與人類種系Vk L6 氨基酸序列(分別是SEQ ID NO 63以及75)的比對。圖19示出由猴類LAG-3cDNA的克隆pa23-5(SEQ ID NO :93)編碼的蛋白質(zhì)序列與 Genbank 存儲的恒河猴 LAG-3 蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO 94) (Genbank 登錄號 ΧΜ_001108923) 的比對。外環(huán)肽區(qū)以及跨膜結(jié)構(gòu)域標有下劃線。在兩條序列之間的一處氨基酸差異(氨基酸位置419)以加粗強調(diào)。發(fā)明詳述本披露涉及分離的單克隆抗體，特別是人類單克隆抗體，該等抗體結(jié)合人類LAG-3 并且具有所希望的功能特性。在某些實施方案中，本發(fā)明之抗體來源于特定的重鏈和輕鏈種系序列和/或包含特定的結(jié)構(gòu)特征，例如包括特定氨基酸序列的CDR區(qū)。本披露提供了分離的抗體、制備這種抗體的方法、包括這種抗體的免疫綴合物以及雙特異性分子以及包括本發(fā)明之抗體、免疫綴合物或雙特異性分子的藥物組合物。本披露還涉及使用該等抗體 (例如檢測LAG-3蛋白)的多種方法，連同使用本發(fā)明的抗LAG-3抗體(單獨或與其它免疫刺激性抗體組合)來刺激免疫反應的多種方法。因此，本披露還提供了使用本發(fā)明的抗 LAG-3抗體來例如抑制腫瘤生長或治療病毒感染的多種方法。為了可以更容易地理解本披露，首先定義了某些術(shù)語。其它定義在整個詳細說明中給出。術(shù)語“LAG-3”指淋巴細胞活化基因3。術(shù)語“LAG-3”包括變體、同等型、同源物、 直向同源物、以及旁系同源物。例如，在某些情況下，對人類LAG-3蛋白特異之抗體可能與來自于非人類的物種的LAG-3蛋白進行交叉反應。在其它實施方案中，對人類LAG-3蛋白特異之抗體可能對人類LAG-3蛋白完全特異，并且可能不表現(xiàn)出物種或其它類型的交叉反應性，或可能與來自某些其它物種但不是所有其它物種的LAG-3進行交叉反應(例如與猴類LAG-3而非小鼠LAG-3進行交叉反應)。術(shù)語“人類LAG-3”指人類序列LAG-3，如具有 Genbank登錄號NP_002277的人類LAG-3的完整氨基酸序列。術(shù)語“小鼠LAG-3”指小鼠序列LAG-3，如具有Genbank登錄號NP_032505的小鼠LAG-3的完整氨基酸序列。LAG-3在本領域還稱作例如CD223。人類LAG-3序列可通過具有例如保守的突變或在非保守區(qū)的突變而不同于Genbank登錄號NP_002277的人類LAG-3，而LAG-3具有基本上與Genbank登錄號NP_002277的人類LAG-3的生物功能相同的生物功能。例如，人類LAG-3的一項生物功能系在LAG-3的細胞外結(jié)構(gòu)域中具有一個表位，該表位被本披露的一種抗體特異性地結(jié)合或者人類LAG-3的一項生物功能系與MHC II類分子結(jié)合。術(shù)語“猴類LAG-3 ”旨在涵蓋由舊世界猴以及新世界猴所表達的LAG-3蛋白， 包括但不限于獼猴LAG-3以及恒河猴LAG-3。猴類LAG-3的一種代表性序列系在圖19 以及SEQ ID NO 85中示出的恒河猴LAG-3氨基酸序列，它還被儲存為Genbank登錄號 XM_001108923。猴類LAG-3的另一種代表性序列系在圖19以及SEQ ID NO 84中示出的克隆pa23-5的可替代的恒河猴序列，如在實施例3A第3小節(jié)所說明而被分離。當與Genbank 所存儲的序列比較時，這個可替代的恒河猴序列在位置419上顯示出一處單個氨基酸的差別。一種特定的人類LAG-3序列與Genbank登錄號為NP_002277的人類LAG-3在氨基酸序列上通常會有至少90%的同一性，并且包含多個氨基酸殘基，當與其它物種(如鼠類) 的LAG-3氨基酸序列相比時，該等氨基酸殘基將該氨基酸序列鑒定為是人源的。在某些情況下，一種人類LAG-3與Genbank登錄號為NP_002277的LAG-3在氨基酸序列上可具有至少 95 %，或者甚至至少96 %、97 %、98 %或99 %的同一性。在某些實施方案中，與Genbank登錄號為NP_002277的LAG-3序列相比，一種人類LAG-3序列會展示出不超過10個氨基酸差異。在某些實施方案中，與Genbank登錄號為NP_002277的LAG-3序列相比，該人類LAG-3 可展示出不超過5個，或者甚至不超過4、3、2或1個氨基酸差異。百分比同一性可以如在此處所說明進行確定。術(shù)語“免疫反應”指例如淋巴細胞、抗原呈遞細胞、吞噬細胞、粒細胞、以及由以上細胞或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細胞因子、以及補體)的作用，該作用導致對侵入性病原體、被病原體感染的細胞或組織、癌性細胞、或者在自身免疫或病理炎癥情況下的正常人類細胞或組織的選擇性損害、破壞或?qū)⑺鼈儚娜梭w中清除?！翱乖禺愋訲細胞應答”指由T細胞產(chǎn)生的應答，該應答產(chǎn)生于用對該T細胞特異的抗原對該T細胞的刺激。由T細胞在抗原特異性刺激時產(chǎn)生的反應的非限制性實例包括增殖以及細胞因子的產(chǎn)生(例如IL-2的產(chǎn)生)。此處所指之術(shù)語“抗體”包括完整抗體以及它們的任何抗原結(jié)合片段(即“抗原結(jié)合部分”)或它們的單鏈。完整抗體系包括由二硫鍵相互連接的至少兩條重(H)鏈以及兩條輕(L)鏈的糖蛋白。每一條重鏈均包括一個重鏈可變區(qū)(在此縮寫為Vh)以及一個重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)由三個結(jié)構(gòu)域CH1、CH2、以及CH3構(gòu)成。每一條輕鏈均包括一個輕鏈可變區(qū)(在此縮寫為以及一個輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包括一個結(jié)構(gòu)域，Q。Vh以及八區(qū)可以進一步被細分為多個高可變性區(qū)，被稱為互補決定區(qū)(CDR)，其間散布有更為保守的被稱為框架區(qū)(FR)的多個區(qū)。每個Vh以及\均由三個CDR及四個FR構(gòu)成，按照以下順序從氨基端至羧基端排布FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該等抗體的恒定區(qū)能介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，該等宿主組織或因子包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如效應細胞)以及經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一成分(Clq)。此處使用之術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡稱為“抗體部分”)，是指抗體保留特異性結(jié)合抗原(例如LAG-3蛋白)的能力的一或多種片段。已發(fā)現(xiàn)抗體的抗原結(jié)合功能可以由全長抗體的片段來進行。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”所涵蓋的結(jié)合片段的實例包括(i)Fab片段，由Vl、VH、Cl及ChI結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單價片段；(ii)F(ab' )2片段，包括通過在鉸鏈區(qū)的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)Fab'片段，它實質(zhì)上是帶有鉸鏈區(qū)部分的 Fab (見，F(xiàn)UNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed. ,3. sup. rd ed. 1993) ； (iv)由 Vh 及 ChI結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fd片段；(ν)由抗體的單臂的\及Vh結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fv片段；(vi) dAb片段(Ward et al.，(1989) Nature 341 :544_546)，它由 V11 結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；(vii)分離的互補決定區(qū)(CDR)；以及(viii)納米抗體(nanobody)，含有單個可變結(jié)構(gòu)域及兩個恒定結(jié)構(gòu)域的
15重鏈可變區(qū)。此外，雖然Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域\和￥11系由多個分開的基因進行編碼的，但是使用重組方法藉由合成接頭可以將它們連接起來，使它們形成單條蛋白鏈，其中\(zhòng)和Vh 區(qū)進行配對形成單價分子(被稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird et al. (1988) Science 242 :423-426 以及 Huston et al. (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 迎5879-5883)。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”也旨在涵蓋此類單鏈抗體。該等抗體片段系使用本領域中技術(shù)人員已知的常規(guī)方法獲得，并且對該等片段采用與完整抗體相同的方式進行有用性篩選。此處所使用之“分離之抗體”旨在表示如下的抗體，它基本上不含具備不同的抗原特異性的其它抗體(例如，特異性結(jié)合LAG-3蛋白的分離之抗體基本上不含特異性結(jié)合除 LAG-3蛋白以外的抗原之抗體)。然而，特異性結(jié)合人類LAG-3蛋白的分離之抗體對于其它抗原(如來自其它物種的LAG-3蛋白)可具有交叉反應性。此外，分離之抗體可以基本上不含其它細胞材料和/或化學物。此處使用之術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指具有單一分子組成之抗體分子的制備物。單克隆抗體組合物展示了針對某一特定表位的單一結(jié)合特異性及親和力。此處使用之術(shù)語“人類抗體”旨在包括具有如下可變區(qū)之抗體，在該等可變區(qū)中， 框架區(qū)及CDR區(qū)均衍生自人類種系免疫蛋白序列。此外，如果該抗體包括恒定區(qū)，則該恒定區(qū)也衍生自人類種系免疫球蛋白序列。本發(fā)明的人類抗體可以包含不是由人類種系免疫球蛋白序列所編碼的氨基酸殘基(例如，由體外隨機誘變或定點誘變引入的突變或藉由體內(nèi)體細胞突變引入的突變)。然而，在此所使用之術(shù)語“人類抗體”并非旨在包括這樣之抗體， 其中衍生自另外的哺乳動物物種(如小鼠)的種系的CDR序列已經(jīng)被移植到人類框架序列上。術(shù)語“人類單克隆抗體”指展示出單一結(jié)合特異性之抗體，該等抗體具有如下可變區(qū)，其中框架區(qū)以及CDR區(qū)均衍生自人類種系免疫球蛋白序列。在一實施方案中，人類單克隆抗體系由雜交瘤產(chǎn)生的，該雜交瘤包括融合至永生化細胞的從轉(zhuǎn)基因的非人類動物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)處獲得的B細胞，具有包括人類重鏈轉(zhuǎn)基因及輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。此處使用之術(shù)語“重組人類抗體”包括藉由重組的手段制備、表達、產(chǎn)生、或分離的所有人類抗體，例如(a)從動物(例如小鼠)或由其制備出的雜交瘤(以下將進一步說明) 中分離之抗體，該動物對于人類免疫球蛋白基因系轉(zhuǎn)基因性的或轉(zhuǎn)染色體性的、(b)從被轉(zhuǎn)化以表達人類抗體的宿主細胞(例如，從轉(zhuǎn)染瘤)中分離之抗體、(c)從重組的組合的人類抗體文庫中分離之抗體、以及(d)藉由任何其它方法制備、表達、產(chǎn)生或分離之抗體，該等方法涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列上。此類重組的人類抗體具有如下可變區(qū)，其中框架區(qū)及CDR區(qū)均衍生自人類種系免疫球蛋白序列。然而，在某些實施方案中，此類重組的人類抗體能經(jīng)受體外誘變(或者，當使用對于人類Ig序列而言轉(zhuǎn)基因的動物時，經(jīng)受體內(nèi)體細胞誘變)，并且因此，重組抗體的區(qū)的氨基酸序列系這樣的序列， 該等序列也許并不自然地存在于體內(nèi)的人類抗體種系全集之中，盡管該等序列衍生自人類種系的Vh和\序列及與其相關(guān)。術(shù)語“同種型”指由重鏈恒定區(qū)基因進行編碼之抗體的種類(例如IgM或IgGl)。短語“識別抗原的抗體”以及“對抗原特異的抗體”此處可以與術(shù)語“特異地結(jié)合抗原的抗體”互換使用。
術(shù)語“人類抗體衍生物”指人類抗體的任何已修飾的形式，例如，該抗體與另一試劑或抗體的綴合物。術(shù)語“人源化抗體”旨在表示以下抗體，其中衍生自另一哺乳動物物種(如小鼠) 的種系的CDR序列已被移植到人類框架序列上?？梢栽谌祟惪蚣苄蛄兄羞M行另外的框架區(qū)修飾。術(shù)語“嵌合抗體”旨在表示以下抗體，其中可變區(qū)序列系衍生于一物種而恒定區(qū)序列系衍生于另一物種，例如如下抗體，其中可變區(qū)序列衍生于小鼠抗體而恒定區(qū)序列衍生于人類抗體。在此所使用“特異性結(jié)合人類LAG-3”之抗體意指如下抗體，它結(jié)合人類LAG-3蛋白(并且可能是來自一或多種非人類物種的LAG-3蛋白)，但基本上不結(jié)合非LAG-3蛋白。 較佳的是，該抗體以“高親和力”(也就是以IX ICT7M或更小的Kd)結(jié)合人類LAG-3蛋白， 更佳地為5 X 10_8M或更小，更佳地為3 X 10_8M或更小，更佳地為1 X 10_8M或更小，更佳地為 5X 10_9M或更小，或甚至更佳地為1 X 10_9M或更小。此處使用之術(shù)語“基本上不結(jié)合”蛋白質(zhì)或細胞是指不結(jié)合或不以高親和力結(jié)合蛋白質(zhì)或細胞，即，以IX 10_6M或更大，更佳地為1X10_5M或更大，更佳地為1X10_4M或更大，更佳地為1X10_3M或更大，甚至更佳地為1X10_2M或更大的Kd結(jié)合蛋白質(zhì)或細胞。此處使用之術(shù)語"Kass。。”或“Ka”旨在表示特定之抗體-抗原相互作用的結(jié)合速率， 而此處使用之術(shù)語"Kdis”或“Kd，，，旨在表示特定之抗體-抗原相互作用的解離速率。此處使用之術(shù)語“KD，”旨在表示解離常數(shù)，它系由&與1之比(即Kd/Ka)得到，并被表示為摩爾濃度(M)?？贵w的Kd值可以使用本領域已經(jīng)充分確認的方法進行確定。確定抗體的Kd的一較佳方法系藉由使用表面等離子共振，較佳地是使用例如Biaeore 系統(tǒng)的生物傳感器系統(tǒng)。術(shù)語IgG抗體的“高親和力，，是指對于靶抗原而言抗體具有的Kd為1 X IO-7M或更小，更佳地為5 X 10_8M或更小，甚至更佳地為1 X 10_8M或更小，甚至更佳地為5 X 10_9M或更小，并且甚至更佳地為IXlO-9M或更小。然而，對于其它抗體同種型而言，“高親和力”結(jié)合可以發(fā)生變化。例如，對于IgM同種型而言，“高親和力”結(jié)合是指抗體具有的Kd為10_6M或更小，更佳地為IiT7M或更小，甚至更佳地為ICT8M或更小。術(shù)語“受試者”包括任何人類或非人類動物。術(shù)語“非人類動物”包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，如非人靈長類、綿羊、犬、貓、牛、馬、雞、兩棲動物、以及爬行動物，盡管哺乳動物系較佳的，如非人類的靈長類、綿羊、犬、貓、牛、以及馬。在以下各分部中進一步詳細地說明了本發(fā)明的不同方面。具有特定功能特性的抗LAG-3抗體本發(fā)明抗體之特征為抗體特定的功能性特征或特性。例如，該等抗體與人類LAG-3 特異地結(jié)合，并且可與來自某些其它物種的LAG-3相結(jié)合，例如猴類LAG-3 (例如獼猴、恒河猴)，但是基本上不與來自某些其它物種的LAG-3(例如小鼠LAG-3)相結(jié)合。較佳的是，本發(fā)明之抗體以高親和力與人類LAG-3相結(jié)合。該抗體刺激免疫反應(如抗原特異性T細胞應答)的能力可藉由(例如)該抗體在抗原特異性T細胞應答中刺激白介素2 (IL-2)的產(chǎn)生來說明。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體與人類LAG-3結(jié)合并且表現(xiàn)出刺激抗原特異性T細胞應答的能力。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體與人類LAG-3結(jié)合但并不表現(xiàn)出刺激抗原特異性T細胞應答的能力。評估抗體刺激免疫反應的能力的其它手段包括該抗體(如在體內(nèi)腫瘤移植物模型中)抑制腫瘤生長的能力(參見，例如實施例6)或該抗體刺激自身免疫反應的能力，例如在自身免疫模型中促進自身免疫疾病的發(fā)生的能力，例如在NOD小鼠模型中促進糖尿病的發(fā)生的能力 (參見，例如實施例7)。本發(fā)明之抗體與LAG-3的結(jié)合可用本領域已充分確認的一或多種技術(shù)進行評估。 例如，在一較佳的實施方案中，抗體可用流式細胞術(shù)測定法進行測試，其中該抗體與表達人類LAG-3的細胞系進行反應，例如已經(jīng)被轉(zhuǎn)染而能在它們的細胞表面表達LAG-3 (例如人類 LAG-3、猴類LAG-3 (例如，恒河猴或獼猴)或小鼠LAG-3)的CHO細胞(參見，例如實施例3A 中適宜的測定)。在流式細胞術(shù)測定中使用的其它適宜的細胞包括表達天然LAG-3的由抗 CD3刺激的CD4+活化的T細胞。另外地或可替代地，抗體的結(jié)合，包括結(jié)合動力學(例如Kd 值)可在BIAcore結(jié)合測定中進行測試(參見，例如實施例中適宜的測定)。還有其它適宜的結(jié)合測定包括ELISA測定，例如使用重組的LAG-3蛋白(參見，例如實施例1中適宜的測定)。較佳的是，本發(fā)明之抗體以5X 10_8M或更小的Kd與LAG-3蛋白結(jié)合，以2X 10_8M 或更小的Kd與LAG-3蛋白結(jié)合，以5 X IO-9M或更小的Kd與LAG-3蛋白結(jié)合，以4 X 1(Γ9Μ或更小的Kd與LAG-3蛋白結(jié)合，以3X 10_9M或更小的Kd與LAG-3蛋白結(jié)合，以2X 10_9M或更小的Kd與LAG-3蛋白結(jié)合，以1 X 10_9M或更小的Kd與LAG-3蛋白結(jié)合，以5X 10_1(IM或更小的Kd與LAG-3蛋白結(jié)合，或1 X IO^10M或更小的Kd與LAG-3蛋白結(jié)合。典型地，本發(fā)明的抗體與淋巴樣組織(如扁桃體、脾臟或胸腺)中的LAG-3相結(jié)合，這可藉由免疫組織化學法進行檢測。另外地，如在實施例8中進一步說明，本發(fā)明的某些抗LAG-3抗體如藉由免疫組織化學法所測量使垂體組織染色(例如，被保留在垂體中)， 而本發(fā)明的其它抗LAG-3抗體如藉由免疫組織化學法所測量不使垂體組織染色(例如，不被保留在垂體中)。因此，在一實施方案中，本發(fā)明提供了藉由免疫組織化學法使垂體組織染色的人類抗LAG-3抗體，而在另一實施方案中，本發(fā)明提供了藉由免疫組織化學法不使垂體組織染色的人類抗LAG-3抗體。本發(fā)明較佳之抗體系人類單克隆抗體。另外地或可替代地，該抗體可以是(例如) 嵌合或人源化單克隆抗體。單克隆抗體25F7、26H10、25E3、8B7、11F2 以及 17E5較佳的本發(fā)明之抗體系如在實施例1和2中所說明進行分離以及結(jié)構(gòu)表征的人類單克隆抗體 25F7J6H10、25E3、8B7、11F2 以及 17E5。25F7J6H10、25E3、8B7、11F2 以及 17E5 的VH氨基酸序列分別示于SEQ ID N0:37至42中。25F7J6H10、25E3、8B7、11F2以及17E5 的VK氨基酸序列分別示于SEQ ID NO 43至48中。考慮到該等抗體中的每一種均可結(jié)合人類LAG-3，可將V1^P \序列進行“混合并匹配”以產(chǎn)生本發(fā)明的其它抗LAG-3結(jié)合分子。較佳的是，當V1^n八鏈被混合并匹配時，來自特定VH/VL對的Vh序列被結(jié)構(gòu)相似的Vh序列代替。同樣地，較佳的是來自特定對的 Vl序列被結(jié)構(gòu)相似的\序列代替。因此，一方面，本披露提供了分離的單克隆抗體、或其抗原結(jié)合部分，包括(a)重鏈可變區(qū)，包括一條氨基酸序列，該氨基酸序列選自下組，其構(gòu)成為SEQ ID
18NO :37至42 ；以及(b)輕鏈可變區(qū)，包括一條氨基酸序列，該氨基酸序列選自下組，其構(gòu)成為SEQ ID NO 43 至 48 ；其中該抗體特異性結(jié)合人類LAG-3。較佳的重鏈及輕鏈組合包括(a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO 列 SEQ ID NO 43 ；(b)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO 列 SEQ ID NO 44 ；(c)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO 列 SEQ ID NO 45 ；(d)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO 列 SEQ ID NO 46 ；(e)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO 列 SEQ ID NO 47 ；或者(f)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO 列 SEQ ID NO :48ο在另一方面，本披露提供了多種抗體，該等抗體包括25F7、26H10、25E3、8B7、11F2 或17Ε5的重鏈及輕鏈的CDRl、CDR2及CDR3，或它們的組合。25F7、^HlO、25Ε3、8Β7、11F2以及 17E5&Vh CDRl 的氨基酸序列分別示于 SEQ ID N0:37 至 42 中。25F7、26H10、25E3、8B7、 11F2以及17E5的Vh CDR2的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO 43至48中。25F7J6H10、 25E3、8B7、11F2以及17E5的Vh CDR3的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO 13至14、GGY以及16至18中。25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5的Vk CDRl的氨基酸序列分別示于 SEQ ID N0:19 至 24 中。25F7、26H10、25E3、8B7、11F2 以及 17E5&VK CDR2 的氨基酸序列示于 SEQ ID NO 25 至 30 中。25F7J6H10、25E3、8B7、11F2 以及 17E5 的 Vk CDR3 的氨基酸序列分別示于SEQ ID N0:31至36中。CDR區(qū)系用Kabat系統(tǒng)繪出的(Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。在該等抗體中每一種均能結(jié)合人類LAG-3、并且抗原結(jié)合特異性主要由⑶Rl、 CDR2、及CDR3區(qū)提供的條件下，Vh CDRl、CDR2、以及CDR3序列與\ CDRl、CDR2、以及CDR3 序列可以被“混合并匹配”(即，來自不同抗體的CDR可以被混合并匹配，盡管每種抗體均必須包含Vh⑶R1、⑶R2、以及⑶R3以及八⑶R1、⑶R2，以及⑶R3)，以產(chǎn)生本發(fā)明的其它抗 LAG-3結(jié)合分子。使用以上所說明及實例中的結(jié)合測定(例如，ELISA、Biaeore 分析)可以測試此類“混合并匹配”之抗體的LAG-3結(jié)合。較佳的是，當Vh CDR序列被混合并匹配時，來自特定Vh序列的CDRl、CDR2和/或CDR3序列被結(jié)構(gòu)上相似的一或多種CDR序列代替。類似地，當\⑶R序列被混合并匹配時，來自特定\序列的⑶R1、⑶R2和/或⑶R3序列較佳的是被結(jié)構(gòu)上相似的一或多種CDR序列代替。對于普通技術(shù)人員非常清楚的是，藉由用來自在此披露的單克隆抗體25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5的CDR序列的結(jié)構(gòu)類似序列代替一或多個Vh和/或\ CDR區(qū)序列可以產(chǎn)生新穎的Vh以及\序列。
:37，以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序 :38，以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序 :39，以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序 :40，以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序 :41，以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序 :42，以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序
19
至6 ； 至12 ； 至14、 至24 ； 至30 ； 至36 ；

因此，在另一方面，本披露提供了分離的單克隆抗體、或其抗原結(jié)合部分，包括
(a)重鏈可變區(qū)⑶R1，包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為SEQID NO=I
(b)重鏈可變區(qū)⑶R2，包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為SEQID NO 7
(c)重鏈可變區(qū)⑶R3，包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為SEQID NO 13 GGY以及16至18 ；
(d)輕鏈可變區(qū)⑶R1，包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為SEQID NO 19
(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為以及
(f)輕鏈可變區(qū)CDR3，包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為
其中該抗體特異性結(jié)合人類LAG-3。 在一較佳的實施方案中，該抗體包括
(a)重鏈可變區(qū)CDRl，包括SEQID NO 1 ；
(b)重鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQID NO 7 ；
(c)重鏈可變區(qū)CDR3，包括SEQID NO 13
(d)輕鏈可變區(qū)CDRl，包括SEQID NO 19
(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQID NO :25 ；以及
(f)輕鏈可變區(qū)CDR3，包括SEQID NO :31。 在另一較佳的實施方案中，該抗體包括
(a)重鏈可變區(qū)CDRl，包括SEQID NO 2 ；
(b)重鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQID NO 8 ；
(c)重鏈可變區(qū)⑶R3，包括SEQID NO 14
(d)輕鏈可變區(qū)CDRl，包括SEQID NO 20
(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQID NO :26 ；以及
(f)輕鏈可變區(qū)CDR3，包括SEQID NO :32。 在另一較佳的實施方案中，該抗體包括
(a)重鏈可變區(qū)CDRl，包括SEQID NO 3 ；
(b)重鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQID NO 9 ；
(c)重鏈可變區(qū)⑶R3，包括GGY；
(d)輕鏈可變區(qū)CDRl，包括SEQID NO 21 ；
(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQID NO :27 ；以及
(f)輕鏈可變區(qū)CDR3，包括SEQID NO :33。 在另一較佳的實施方案中，該抗體包括
(a)重鏈可變區(qū)CDRl，包括SEQID NO 4 ；
(b)重鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQID NO 10 ；
(c)重鏈可變區(qū)CDR3，包括SEQID NO 16 ；
:SEQ ID NO 25 :SEQ ID NO 31
(d)輕鏈可變區(qū) CDRl，包括 SEQ ID NO 22 ；(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQ ID NO :28 ；以及(f)輕鏈可變區(qū) CDR3，包括 SEQ ID NO 340在另一較佳的實施方案中，該抗體包括(a)重鏈可變區(qū) CDRl，包括 SEQ ID NO 5 ；(b)重鏈可變區(qū) CDR2，包括 SEQ ID NO 11 ；(c)重鏈可變區(qū) CDR3，包括 SEQ ID NO 17 ；(d)輕鏈可變區(qū) CDRl，包括 SEQ ID NO 23 ；(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQ ID NO :29 ；以及(f)輕鏈可變區(qū) CDR3，包括 SEQ ID NO :35。在另一較佳的實施方案中，該抗體包括(a)重鏈可變區(qū) CDRl，包括 SEQ ID NO 6 ；(b)重鏈可變區(qū) CDR2，包括 SEQ ID NO 12 ；(c)重鏈可變區(qū) CDR3，包括 SEQ ID NO 18 ；(d)輕鏈可變區(qū) CDRl，包括 SEQ ID NO 24 ；(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQ ID NO :30 ；以及(f)輕鏈可變區(qū) CDR3，包括 SEQ ID NO :36。在本領域中熟知的是，⑶R3結(jié)構(gòu)域，獨立于⑶Rl和/或⑶R2域，可以單獨確定抗體對關(guān)聯(lián)抗原的結(jié)合特異性，并且可預測地產(chǎn)生多種抗體，該等抗體具有基于共同的CDR3序列的相同的結(jié)合特異性。參見，例如Klimka et al.，British J. of Cancer 83(2) :252-260(2000) ；Beiboer et al. , J. Mol. Biol. 296 :833-849 (2000) ；Rader et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95 :8910-8915 (1998) ；Barbas et al.，J. Am. Chem. Soc. 116 2161-2162(1994) ；Barbas et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92 :2529-2533 (1995)； Ditzel et al. , J.Immunol. 157 :739-749(1996) ；Berezov et al. , BIAjournal 8 Scientific Review 8(2001) ；Igarashi et al.，J. Biochem(Tokyo) 117 :452-7(1995) Bourgeois et al. , J. Virol 72 :807-10 (1998) ；Levi et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 :4374-8(1993) ；Polymenis and Stoller, J. Immunol. 152 :5218-5329(1994)及 Xu and Davis, Immunity 1^:37-45 0000)。還參見美國專利號 6，951，646 ;6, 914，1 ; 6，090，382 ；6，818，216 ；6，156，313 ；6，827，925 ；5，833，943 ；5，762，905 以及 5，760，185。該等參考文獻中每一篇的全文均藉由引用由此結(jié)合。因此，本披露提供的單克隆抗體包括來自如下抗體的一或多個重鏈和/或輕鏈 CDR3域，該抗體衍生自人類或非人類動物，其中該單克隆抗體能夠特異性結(jié)合人類LAG-3。 在某些方面，本披露提供的單克隆抗體包括來自非人類抗體(如小鼠或大鼠抗體)的一或多個重鏈和/或輕鏈CDR3域，其中該單克隆抗體能夠特異性結(jié)合LAG-3。在一些實施方案中，此類創(chuàng)造性之抗體包括來自非人類抗體的一或多個重鏈和/或輕鏈CDR3域，與相應的親本的非人類抗體比較，(a)能與其競爭而進行結(jié)合；(b)保留功能特性；(c)結(jié)合到相同的表位；和/或(d)具有相似的結(jié)合親和力。在其它方面，本披露提供的單克隆抗體包括來自人類抗體(例如，獲自非人類動物的人類抗體)的一或多個重鏈和/或輕鏈CDR3域，其中該人類抗體能夠特異性結(jié)合人類LAG-3。在其它方面，本披露提供的單克隆抗體包括來自第一人類抗體(例如獲自非人類動物的人類抗體)的一或多個重鏈和/或輕鏈CDR3域，其中該第一人類抗體能夠特異性結(jié)合人類LAG-3，并且其中來自該第一人類抗體的CDR3域替換在缺乏針對LAG-3的結(jié)合特異性的人類抗體中的CDR3域，以產(chǎn)生能特異性結(jié)合人類LAG-3的第二人類抗體。在一些實施方案中，此類創(chuàng)造性之抗體包括來自該第一人類抗體的一或多個重鏈和/或輕鏈CDR3域，與相應的親本的第一人類抗體相比較，(a)能與其競爭而進行結(jié)合；(b)保留功能特性；(c)結(jié)合到相同的表位；和/或(d)具有相似的結(jié)合親和力。具有特定種系序列之抗體在某些實施方案中，本發(fā)明之抗體包括來自特定種系重鏈免疫球蛋白基因的重鏈可變區(qū)和/或來自特定種系輕鏈免疫球蛋白基因的輕鏈可變區(qū)。例如，在一較佳的實施方案中，本披露提供分離的單克隆抗體、或其抗原結(jié)合部位，包括重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類Vh 3-20基因、人類Vh 4-34基因、人類Vh 3-33 基因或人類Vh 1-24基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，其中該抗體特異性結(jié)合人類LAG-3。在另一較佳的實施方案中，本披露提供了分離的單克隆抗體、或其抗原結(jié)合部分，包括輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類Vk L18基因、人類Vk L6基因或人類Vk A27基因的產(chǎn)物或是衍生于該基因，其中該抗體特異性結(jié)合人類LAG-3。在又一較佳的實施方案中，本披露提供了分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體包括重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類 Vh 3-20基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，并包括輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類Vk L18基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，其中該抗體特異性結(jié)合人類LAG-3。在又一較佳的實施方案中， 本披露提供了分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體包括重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類Vh 4-34基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，并包括輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類乂￡ L6基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，其中該抗體特異性結(jié)合人類LAG-3。在又一較佳的實施方案中，本披露提供了分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體包括重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類VH3-33基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，并包括輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類Vk A27基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，其中該抗體特異性結(jié)合人類LAG-3。在又一較佳的實施方案中，本披露提供了分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體包括重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類Vh 1-24基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，并包括輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類Vk L6基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，其中該抗體特異性結(jié)合人類 LAG-3。在又一較佳的實施方案中，本披露提供了分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體包括重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類Vh 3-33基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，并包括輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類\ L6基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，其中該抗體特異性結(jié)合人類LAG-3。此類抗體還可以擁有一或多項以上詳細說明的功能特征，例如高親和力與人類 LAG-3結(jié)合、與猴類LAG-3結(jié)合、缺乏與小鼠LAG-3的結(jié)合、抑制LAG-3與MHC II類分子結(jié)合的能力、和/或刺激抗原特異性T細胞應答的能力。分別具有Vh 3-20及Vk L18的Vh及\之抗體的實例系25E3抗體。分別具有Vh 4-34及Vk L6的Vh及\之抗體的實例系25F7抗體以及8B7抗體。分別具有Vh 3-33及Vk A27的Vh及Vl之抗體的實例系26H10抗體。分別具有Vh 1-24及Vk L6的Vh及\之抗體的實例系11F2抗體。分別具有Vh 3-33及Vk L6的Vh及\之抗體的實例系17E5抗體。
如在此所用，如果人類抗體的可變區(qū)從使用特定人類種系免疫球蛋白基因的系統(tǒng)中獲得，則該抗體包含如下重鏈或輕鏈可變區(qū)，該等可變區(qū)系該種系序列的“產(chǎn)物”或者“衍生于”該種系序列。此類系統(tǒng)包括用所感興趣的抗原對攜帶人類免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠進行免疫，或者用所感興趣的抗原對在噬菌體上進行展示的人類免疫球蛋白基因文庫進行篩選。人類抗體系人類種系免疫球蛋白序列的“產(chǎn)物”或“衍生于”該序列，藉由將該人類抗體的氨基酸序列與人類種系免疫球蛋白的氨基酸序列進行比較，并選擇在序列上最接近(即最大％同一性)該人類抗體的序列的人類種系免疫球蛋白序列，就可以將該人類抗體鑒定為是此類抗體。人類抗體系特定的人類種系免疫球蛋白序列的“產(chǎn)物”或“衍生于” 該序列，與該種系序列相比，該人類抗體可含有氨基酸差異，由于例如自然發(fā)生的體細胞突變或故意引入的定點突變。然而，經(jīng)定的人類抗體典型地與由人類種系免疫球蛋白基因進行編碼的氨基酸序列在氨基酸序列上具有至少90%的同一性，并且當與其它物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠類種系序列)進行比較時，該選定的人類抗體包含將該人類抗體鑒定為人類的氨基酸殘基。在某些情況中，人類抗體與由該種系免疫球蛋白基因進行編碼的氨基酸序列在氨基酸序列上可具有至少95 %、或甚至至少96 %、97 %、98 %，或99 % 的同一性。典型地，與由特定的人類種系免疫球蛋白基因進行編碼的氨基酸序列相比，衍生于該人類種系序列的人類抗體會展示不超過10處氨基酸差異。在某些情況中，與由該種系免疫球蛋白基因進行編碼的氨基酸序列相比，該人類抗體可以展示出不超過5處，或甚至不超過4處、3處、2處，或1處氨基酸差異。同源抗體在又另一實施方案中，本發(fā)明之抗體包括含有與此處說明的較佳抗體的氨基酸序列同源的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)以及輕鏈可變區(qū)，并且其中該抗體保留本發(fā)明的抗 LAG-3抗體的所希望的功能特性。例如，本披露提供了分離的單克隆抗體、或其抗原結(jié)合部分，包括重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)，其中(a)該重鏈可變區(qū)包括氨基酸序列，該氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的同源性，該組的構(gòu)成為SEQ ID NO 37至42 ；(b)該輕鏈可變區(qū)包括氨基酸序列，該氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的同源性，該組的構(gòu)成系SEQ ID NO :43至48 ；以及(c)該抗體特異性地結(jié)合人類LAG-3。另外地或可替代地，該抗體還可以擁有一或多項以上所討論的以下功能特性，例如高親和力與人類LAG-3結(jié)合、與猴類LAG-3結(jié)合、缺乏與小鼠LAG-3的結(jié)合、抑制LAG-3 與MHC II類分子結(jié)合的能力、和/或刺激抗原特異性T細胞應答的能力。在不同的實施方案中，該抗體可以是(例如)人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體。在其它實施方案中，V1^P/或八氨基酸序列可與以上給出的序列具有85%、90%、 95%、96%、97%、98%或99%的同源性。與以上給出的序列的Vh與Vl區(qū)具有高(S卩，80% 或更大)同源性的Vh與\區(qū)之抗體，可以藉由以下方式獲得對編碼SEQ ID而49至討或55至60的核酸分子進行誘變(例如，定點誘變或PCR介導的誘變)，接著使用在此說明的功能測定針對保留的功能(即，以上所給出的功能)測試所編碼的經(jīng)改變之抗體。如在此所使用，兩條氨基酸序列之間的百分比同源性等同于兩條序列之間的百分比同一性。在這兩條序列之間的百分比同一性系該等序列共享的相同位置的數(shù)目的函數(shù)
23(即，％同源性=相同位置的數(shù)目/位置的總數(shù)目X100)，考慮到缺口(gap)的數(shù)目、以及每個缺口的長度，需要將它們引入用于這兩條序列的最佳比對。正如在以下的非限制性實例中說明，使用數(shù)學算法可以完成兩條序列之間的序列比較以及百分比同一性的確定。使用已經(jīng)被整合至ALIGN程序(2. 0版本)中的E. Meyers和W. Miller (Comput. Appl.Biosci. ,4 11-17(1988))的算法，使用PAM120權(quán)重殘基表，缺口長度罰分為12以及缺口罰分為4，可以確定兩個氨基酸序列之間的百分比同一性。此外，使用已經(jīng)被整合至 GCG軟件包(可在www. gcg. com上獲得)中的GAP程序里的Needleman和Wunsch (J. Mol. Biol. 48 444-453 (1970))的算法，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，以及缺口權(quán)重16、 14、12、10、8、6、或4以及長度權(quán)重1、2、3、4、5、或6，可以確定兩條氨基酸序列之間的百分比同一性。另外地或者可替代地，本披露的蛋白質(zhì)序列可以作為“查詢序列”進一步被使用，對公共數(shù)據(jù)庫進行檢索，例如來鑒定相關(guān)序列。使用Altschul，et al. (1990) J. Mol. Biol. @ =403-10的XBLAST程序(版本2. 0)可以進行此類檢索。BLAST蛋白質(zhì)檢索可采用XBLAST程序，記分=50，字長=3而進行，以獲得與本發(fā)明之抗體分子同源的氨基酸序列。為獲得用于比較目的的缺口比對，可如在Altschul et al.，(1997)Nucleic Acids Res. 25(17) =3389-3402中所說明地使用帶缺口的BLAST。當使用BLAST及帶缺口的BLAST 程序時，對應的程序(例如XBLAST及NBLAST)的默認參數(shù)系有用的。見www. ncbi. nlm. nih. gov ο具有保守件修飾之抗體在某些實施方案中，本發(fā)明之抗體包括含有⑶R1、⑶R2及⑶R3序列的重鏈可變區(qū)以及含有⑶R1、⑶R2及⑶R3序列的輕鏈可變區(qū)，其中該等⑶R序列中的一或多個包括基于在此所說明的較佳抗體(例如，25F7、26H10、25E3、8B7、11F2、17E5)的限定的氨基酸序列、或它們的保守性修飾，并且其中所述抗體保留了本發(fā)明的抗LAG-3抗體的所希望的功能特性。在本領域中所理解的是，可以進行某些保守性序列修飾，該等保守性序列修飾并不去除抗原結(jié)合。參見，例如Brummell et al. (1993)Biochem 32 1180-8 ；de Wildt et al. (1997)Prot. Eng. 10 835-41 ；Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272 26864-26870 ；Hall et al. (1992)J. Immunol. 149 1605-12 ；Kelley and 0'Connell(1993) Biochem. 32 6862-35 ；Adib-Conquy et al. (1998) Iht. Immunol. 10 341-6 \)XR Beers et al. (2000)Clin.Can.Res4:2835-43。因此，本披露提供了分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，包括含有⑶R1、⑶R2、以及⑶R3序列的重鏈可變區(qū)以及含有⑶R1、⑶R2、以及⑶R3 序列的輕鏈可變區(qū)，其中(a)該重鏈可變區(qū)CDR3序列包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為氨基酸序列SEQ ID NO :13至14、GGY、以及16至18，以及它們的保守性修飾；(b)該輕鏈可變區(qū)CDR3序列包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為氨基酸序列SEQ ID NO 31至36，以及它們的保守性修飾；以及(c)該抗體特異性地結(jié)合人類LAG-3。另外地或可替代地，該抗體還可以擁有以上所說明的以下功能特性中的一或多項，例如高親和力與人類LAG-3結(jié)合、與猴類LAG-3結(jié)合、缺乏與小鼠LAG-3的結(jié)合、抑制 LAG-3與MHC II類分子結(jié)合的能力和/或刺激抗原特異性T細胞應答的能力。
在一較佳的實施方案中，該重鏈可變區(qū)⑶R2序列包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為氨基酸序列SEQ ID No :7至12，以及它們的保守性修飾；并且該輕鏈可變區(qū) ⑶R2序列包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為氨基酸序列SEQ ID No 25至30，以及它們的保守性修飾。在另一較佳的實施方案中，該重鏈可變區(qū)CDRl序列包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為氨基酸序列SEQ ID No :1至6，以及它們的保守性修飾；并且該輕鏈可變區(qū)CDRl序列包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為氨基酸序列SEQ ID No 19至24，以及它們的保守性修飾。在不同的實施方案中，該抗體可以是例如人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體。如此處所使用，術(shù)語“保守性修飾”旨在表示氨基酸修飾，該等修飾不顯著影響或改變包含該氨基酸序列之抗體的結(jié)合特征。此類保守性修飾包括氨基酸的替代、插入、以及刪除。修飾可藉由本領域已知的標準技術(shù)(如，定點誘變以及PCR介導的誘變)被引入本發(fā)明之抗體中。保守性氨基酸替代系以下該等替代，其中氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換。本領域中已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。該等家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、 絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)，以及具有芳香側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，在本發(fā)明之抗體的CDR區(qū)中的一或多個氨基酸殘基可以被來自相同側(cè)鏈家族的其它氨基酸殘基所替換，并且使用在此說明的功能測定可以針對保留的功能(即，以上給出的功能)測試被改變之抗體。與抗LAG-3抗體結(jié)合到相同的表位上之抗體在另一實施方案中，本披露提供了如下抗體，它們在LAG-3上所結(jié)合的表位與本發(fā)明的抗LAG-3單克隆抗體中的任何抗體在LAG-3上所結(jié)合的表位相同(即，該等抗體有能力與本發(fā)明的該等單克隆抗體中的任何抗體進行交叉競爭而與人類LAG-3相結(jié)合)。在較佳的實施方案中，用于交叉競爭研究的參考抗體可以是單克隆抗體25F7、26H10、25E3、 8B7、11F2 或 17E5。此類交叉競爭之抗體可基于它們在標準LAG-3結(jié)合測定中與25F7、26H10、25E3、 8B7、11F2和/或17E5交叉競爭的能力被鑒定。例如，可使用標準ELISA測定，其中將重組的人類LAG-3蛋白固定在板上，該等抗體之一用熒光進行了標記，并且評價了未被標記之抗體進行競爭使被標記之抗體脫離結(jié)合(off the binding)的能力。另外地或可替代地，也可以使用BIAcore分析來評價抗體的交叉競爭的能力。測試抗體抑制(例如)25F7、26H10、 25E3、8B7、11F2和/或17E5與人類LAG-3相結(jié)合的能力證明該測試抗體能與25F7、26H10、 25E3、8B7、11F2 和 / 或 17E5 競爭而結(jié)合人類 LAG-3，并因此與 25F7、26H10、25E3、8B7、11F2 和/或17E —樣結(jié)合人類LAG-3上的相同表位。在一較佳的實施方案中，與25F7J6H10、 25E3、8B7、11F2和/或17E5 —樣結(jié)合人類LAG-3上的相同表位之抗體系一人類單克隆抗體。如在實施例中所說明，可以對此類人類單克隆抗體進行制備并分離。如在實施例3C中進一步所討論，已經(jīng)將25E3、25F7以及8E7與人類LAG-3的結(jié)合定位(map)于人類LAG-3的第一個細胞外結(jié)構(gòu)域內(nèi)的“額外(extra)環(huán)”區(qū)。該額外環(huán)區(qū)的序列在SEQ ID N0:79中給出。使用肽掃描實驗將25E3與額外環(huán)區(qū)的結(jié)合定位于以下氨基酸序列PGHPLAPG(SEQ ID NO :76)，而將25F7與額外環(huán)區(qū)的結(jié)合定位于以下氨基酸序列HPAAPSSW(SEQID NO 77)，并且8B7與額外環(huán)區(qū)的結(jié)合定位于以下氨基酸序列 PAAPSSffG(SEQ ID NO :78)。因此，在一較佳的實施方案中，本發(fā)明提供了抗LAG-3抗體，該抗體結(jié)合人類LAG-3的如下表位，該表位包括氨基酸序列PGHPLAPG(SEQ ID NO :76)。在另一較佳的實施方案中，本發(fā)明提供了抗LAG-3抗體，該抗體結(jié)合人類LAG-3的如下表位，該表位包括氨基酸序列 HPAPPSSW(SEQ ID NO 77)或 PAAPSSWG (SEQ ID NO :78)。經(jīng)工稈處理及經(jīng)修飾之抗體可以進一步藉由下述方式制備本發(fā)明之抗體使用具有在此披露的V1^P/或八序列中的一或多個之抗體作為起始材料，對經(jīng)修飾之抗體進行工程處理，這種經(jīng)修飾之抗體可具有與起始抗體不同的特性。藉由在一或兩個可變區(qū)(即V1^n/或VJ中，例如在一或多個CDR區(qū)內(nèi)和/或在一或多個框架區(qū)內(nèi)中修飾一或多個殘基，可以對抗體進行工程處理。另外地或可替代地，藉由在一或多個恒定區(qū)中修飾殘基，例如改變該抗體的一或多項效應器功能，可以對抗體進行工程處理。在某些實施方案中，可以使用CDR移植對抗體的可變區(qū)進行工程處理。抗體與靶抗原主要藉由位于六個重鏈及輕鏈互補決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基進行相互作用。由于這一原因，CDR中的氨基酸序列在各個抗體之間比在CDR之外的序列更具有多樣性。因為 CDR序列負責大多數(shù)抗體-抗原相互作用，所以藉由構(gòu)建包括被移植至框架序列(來自具有不同特性的不同抗體)上的來自特異的自然發(fā)生之抗體的CDR序列的表達載體，表達模擬特異的自然發(fā)生之抗體的特性的重組抗體系可能的(參見，例如Riechmarm et al. (1998) Nature 332 323-327 Jones et al. (1986)Nature 321522-525 ；Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U. S. Α. 86 10029-10033 ；美國專利號 5，225，539 ;5，530，101 ； 5，585，089 ；5，693，762 以及 6，180，370)。因此，本發(fā)明的另一實施方案涉及分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，包括包含⑶R1、⑶R2、以及⑶R3序列的重鏈可變區(qū)，該⑶R1、⑶R2以及⑶R3序列包含選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成分別為=SEQID NO :1至6，SEQ ID NO 7至12，以及SEQ ID NO 13 至14、GGY、以及16-18，以及包含CDRU CDR2、以及CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，該CDRU CDR2 以及⑶R3序列包含選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成分別為SEQID N0:19至24、SEQ ID NO :25 至 30，以及 SEQ ID N0:31 至 36。因此，包含單克隆抗體 25F7、26H10、25E3、8B7、11F2 或17E5的Vh以及\ CDR序列的此類抗體可包含不同于該等抗體的框架序列。此類框架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫或已公開的參考文獻中獲得。例如，針對人類重鏈及輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在“Vbase”人類種系序列數(shù)據(jù)庫中找到(在互聯(lián)網(wǎng)在http://www. mrc-cpe. cam. ac. uk/vbase上獲得)，連同在以下獻中找到如上所引述的Kabat et al. (1991) ；Tomlinson et al. (1992) " The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of Vh Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227 776~798 以及 Cox et al. (1994)" A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. M :827_836 ；該等文獻中每一篇的內(nèi)容均明確地藉由引用結(jié)合在此。作為另一實例，針對人類重鏈及輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在Genbank數(shù)據(jù)庫中找到。例如，在HCo7 HuMAb小鼠中發(fā)現(xiàn)的以下重鏈種系序列在所附的 Genbank 登錄號中可獲得1_69 (NG_0010109、NT_024637 以及 BC070333) ,3-33 (NG_0010109 & NT_024637)、以及 3-7(NG_0010109 & NT_024637)。作為另一實例，在 HCol2 HuMAb 小鼠中發(fā)現(xiàn)的以下重鏈種系序列在所附的Genbank登錄號中可獲得1_69 (NG_0010109、 NT_024637 以及 BC070333)，5-51 (NG_0010109 &NT_024637)，4-34(NG_0010109 & NT_024637)，3-30. 3 (CAJ556644)，以及 3-23 (AJ406678)。使用被稱為帶缺口的BLAST (Altschul et al. (1997)，如上所述)的序列相似性檢索方法之一將抗體蛋白序列與已編制的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進行比較，這對本領域技術(shù)人員而言系熟知的。在本發(fā)明之抗體中使用的較佳框架序列系那些結(jié)構(gòu)上與由本發(fā)明的選定之抗體所使用的框架序列相似的框架序列，例如類似于由本發(fā)明較佳的單克隆抗體所使用的Vh 3-20 (SEQ ID N0:69)、Vh 4-34 (SEQ ID NO :61)、Vh 3-33 (SEQ ID NO :65)、或 Vh 1-24 (SEQ ID NO 73)框架序列和 / 或 VKL18(SEQ ID NO :71)、Vk L6 (SEQ ID NO :63)或 Vk A27 (SEQ ID NO 67)框架序列。Vh CDRl、CDR2、以及CDR3序列，以及Vk CDRl、CDR2、以及CDR3序列可以被移植至如下框架區(qū)上，該等框架區(qū)具有與在從中衍生出該框架序列的種系免疫球蛋白基因中所發(fā)現(xiàn)的序列相同的序列，或者該等CDR序列可以被移植至如下框架區(qū)上，該等框架區(qū)與該等種系序列相比含有一或多處突變。例如，已發(fā)現(xiàn)在某些情況下在框架區(qū)內(nèi)對殘基進行突變可能是有益的，以保持或增強該抗體的抗原結(jié)合能力(參見，例如美國專利號 5，530，101 ；5，585，089 ；5，693，762 以及 6，180，370)。另一類型的可變區(qū)修飾系在V1^P/或\⑶R1、⑶R2和/或⑶R3區(qū)中對氨基酸殘基進行突變，由此改善所感興趣之抗體的一或多項結(jié)合特性(例如親和力)。可以進行定點誘變或PCR介導的誘變來引入一或多處突變，并且對抗體的結(jié)合、或其它所感興趣的功能特性的作用可以如在此說明的以及在實施例中提供的體內(nèi)或體外測定中進行評估。引入較佳的是保守性修飾(如以上所討論)。該等突變可以是氨基酸替代、插入、或刪除，但較佳地是替代。此外，典型地在⑶R區(qū)中改變不超過一個、兩個、三個、四個或五個殘基。因此，在另一實施方案中，本披露提供了分離的抗LAG-3單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，包括重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包括(a)Vh CDRl區(qū)，包括選自下組的氨基酸序列， 該組的構(gòu)成為SEQ ID NO :1至6，或與SEQID NO 1至6相比具有一處、兩處、三處、四處或五處氨基酸替代、缺失或刪除的氨基酸序列；(b)Vh CDR2區(qū)，包括選自下組的氨基酸序列， 該組的構(gòu)成為SEQ ID NO :7至12，或與SEQ ID NO :7至12相比具有一處、兩處、三處、四處或五處氨基酸替代、缺失或刪除的氨基酸序列；(C)VH CDR3區(qū)，包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為SEQ ID NO :13至14、GGY以及16至18，或與SEQ ID NO :13至14、GGY以及16至18相比具有一處、兩處、三處、四處或五處氨基酸替代、缺失或刪除的氨基酸序列；
(d)VlCDRI區(qū)，包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為SEQ ID NO 19至M，或與SEQ ID NO :19至對相比具有一處、兩處、三處、四處或五處氨基酸替代、缺失或刪除的氨基酸序列；
(e)VL⑶R2區(qū)，包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為SEQID NO :25至30，或與SEQ ID NO :25至30相比具有一處、兩處、三處、四處或五處氨基酸替代、缺失或刪除的氨基酸序列；以及⑴八⑶R3區(qū)，包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為SEQ ID NO :31至36， 或與SEQ ID NO :31至36相比具有一處、兩處、三處、四處或五處氨基酸替代、缺失或刪除的氨基酸序列。本發(fā)明的工程化之抗體包括以下抗體其中在Vh和/或\內(nèi)已經(jīng)對框架殘基進行了修飾，例如改善了抗體的特性。典型地進行了此類框架修飾，以降低抗體的免疫原性。例如，一種方法系使一或多個框架殘基進行“回復突變”為對應的種系序列。更具體地說，已經(jīng)經(jīng)歷了體細胞突變之抗體可以包含與從中衍生出抗體的種系序列不同的框架殘基。此類殘基可以藉由將該抗體框架序列與從中衍生出抗體的種系序列進行比較而被鑒定。例如，表A示出了不同于種系的框架區(qū)氨基酸位置(使用Kabat編號系統(tǒng))的區(qū)
域，并示出這個位置如何藉由所指示的替代而回復突變?yōu)樵摲N系
表A-示例性回復突變區(qū)框架氨基酸位置(Kabat編號)回復突變25E3 Vh72G72R25E3 Vh95Y95H25E3 Vh97T97A25E3 Vh98T98R25F7 Vh69L69I25F7 Vh71L71V25F7 Vh83R83S25F7 Vh97F97R8B7 Vh76K76N8B7 Vh79A79S8B7 Yh83N83S8B7 Vh112P112Q11F2 Vh3D3A17E5 Vh3H3Q8B7 Vh59C59Y8B7 Vh59C59S另一類型的框架修飾涉及在框架區(qū)內(nèi)，或甚至在一或多個CDR區(qū)內(nèi)，對一或多個殘基進行突變，以去除T細胞表位，由此降低該抗體的潛在的免疫原性。這一方法也被稱為 “去免疫化”，并且美國專利公開號20030153043中進一步詳細地說明了該方法。除了在框架區(qū)或⑶R區(qū)內(nèi)進行的修飾之外，或可替代地，還可以對本發(fā)明之抗體進行工程處理，以在Fc區(qū)內(nèi)包含修飾，以便典型地改變該抗體的一或多項功能特性，如血清半衰期、補體結(jié)合、Fc受體結(jié)合、和/或抗原依賴的細胞的細胞毒性作用。此外，本發(fā)明之抗體可以進行化學修飾(例如，一或多個化學物模塊可以被附聯(lián)至抗體上)，或被修飾以改變其糖基化作用，再次改變該抗體的一或多項功能特性。以下對該等實施方案中的每一
28個均進行更詳細的說明。Fc區(qū)中的殘基的編號系Kabat的EU索引號的編號。在一較佳的實施方案中，抗體系IgG4同種型抗體，該抗體包括在重鏈恒定區(qū)的鉸鏈區(qū)中對應于位置228(S2^P;EU索引)的位置上的絲氨酸到脯氨酸的突變。已經(jīng)報導這個突變消除了鉸鏈區(qū)中重鏈之間二硫橋的異質(zhì)性(Angal et al.如上所述；位置241系基于Kabat編號系統(tǒng)的)。例如，在各種實施方案中，本發(fā)明的抗LAG-3抗體可包括連接至一人類IgG4恒定區(qū)的25F7(SEQ ID NO :37)或 H10(SEQ ID NO :38)的重鏈可變區(qū)，在人類 IgG4恒定區(qū)中在對應于位置Ml的位置上的絲氨酸如在以上所述之Angal et al.中所說明已經(jīng)被突變成脯氨酸。因此，對于連接至人類IgG4恒定區(qū)的25F7或^HlO重鏈可變區(qū)而言，這種突變對應于EU索引的S228P突變。在一實施方案中，對CHl的鉸鏈區(qū)進行修飾，這樣鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基的數(shù)目發(fā)生了變化，例如，增加或減少。這個方法進一步說明于美國專利號5，677，425中。CHl 的鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基的數(shù)目發(fā)生變化，以(例如)便于組裝輕鏈以及重鏈或者增大或減小抗體的穩(wěn)定性。在另一實施方案中，對抗體的Fc鉸鏈區(qū)進行突變以減小該抗體的生物半衰期。更具體地說，將一或多處氨基酸突變引入Fc鉸鏈片段的CH2-CH3結(jié)構(gòu)域的界面區(qū)，這樣相對于天然Fc鉸鏈結(jié)構(gòu)域的葡萄球菌蛋白A(SpA)結(jié)合而言，該抗體具有削弱的SpA結(jié)合。這一方法更詳細地說明于美國專利號6，165，745中。在另一實施方案中，對該抗體進行修飾以增大其生物半衰期。多種不同的方法系可能的。例如，如在美國專利號6，277，375中所說明，可引入以下突變中的一或多處突變T252L、T2MS、以及T256F?？商娲兀瑸榱嗽龃笊锇胨テ?，該抗體可以在CHl或CL 區(qū)內(nèi)進行改變以包含從IgG的Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域的兩個環(huán)中得到的補救受體(salvage receptor)結(jié)合表位，如在美國專利號5，869，046以及6，121,022中所說明。在仍又其它的實施方案中，藉由用不同的氨基酸殘基替換至少一個氨基酸殘基來改變Fc區(qū)，以改變該抗體的效應器功能。例如，選自氨基酸殘基234、235、236、237、四7、 318、320及322的一或多個氨基酸可以被不同的氨基酸殘基所替換，這樣該抗體對于效應器配體而言具有已改變的親和力，但仍保留親本抗體的抗原結(jié)合能力。例如，親和力被改變的效應器配體可以是例如Fc受體或補體Cl成分。這一方法更詳細地說明于美國專利號 5，624，821 以及 5，648，260 中。在另一實例中，選自氨基酸殘基329、331及322的一或多個氨基酸可以被不同的氨基酸殘基所替換，這樣該抗體具有已改變的Clq結(jié)合和/或降低或已消除的補體依賴的細胞毒性作用(⑶C)。這一方法更詳細地說明于美國專利號6，194，551中。在另一實例中，改變氨基酸位置231及239中的一或多個氨基酸殘基，由此改變抗體的固定補體的能力。這個方法進一步說明于PCT公開文件W094/29351中。在又另一實例中，藉由在以下位置修飾一或多個氨基酸對Fc區(qū)進行修飾以提高該抗體介導抗體依賴的細胞的細胞毒性(ADCC)的能力和/或增加該抗體對Fc γ受體的親和力238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、 283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、 322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、 389、398、414、416、419、430、434、435、437、438 或 439。這一方法進一步說明于 PCT 公開文件
29WO 00/42072中。而且，已經(jīng)定位出針對Fc yR1、Fc yRII、Fc YRIII以及FcRn在人類IgGl 上的結(jié)合位點，并且已經(jīng)說明了具有結(jié)合已被改善的變體(參見Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 6591-6604)。已表明在位置 256、290、298、333、334 及 339 上特定的突變改善了對Fc γ RIII的結(jié)合。額外地，已表明以下組合突變體改善了 Fc γ RIII結(jié)合T256A/ S298A、S298A/E333A、S298A/K224A、以及 S298A/E333A/K334A。在又另一實施方案中，對抗體的糖基化進行了修飾。例如，可以制做去糖基化之抗體(即，該抗體缺乏糖基化)?？梢愿淖兲腔?，以(例如)增加該抗體對抗原的親和力。 例如，藉由在抗體序列中改變一或多個糖基化的位點可以實現(xiàn)此類碳水化合物修飾。例如， 可以進行一或多處氨基酸替代，這導致了一或多個可變區(qū)框架糖基化位點的消除，由此在該位點處消除糖基化作用。這種去糖基化作用可增加該抗體對抗原的親和力。參見例如美國專利號 5，714，350 以及 6，350，861。另外地或可替代地，可以制做具有被改變類型的糖基化作用的抗體，如具有減少量的巖藻糖基殘基的低巖藻糖基化之抗體或具有增加的二等分GlcNac結(jié)構(gòu)的抗體。已經(jīng)證明此類已改變的糖基化類型增加抗體的ADCC能力。例如，藉由在具有已改變的糖基化機制的宿主細胞中表達該抗體可以實現(xiàn)此類碳水化合物修飾。具有已改變的糖基化機制的細胞在本領域中系已有記載的，并可被用作表達本發(fā)明的重組抗體的宿主細胞，由此產(chǎn)生具有已改變的糖基化之抗體。例如，細胞系Ms704、Ms705以及Ms709缺乏巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因，F(xiàn)UT8 (α (1,6)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)，這樣在Ms704、Ms705、以及Ms709細胞系中表達之抗體中缺乏在它們的碳水化合物上的巖藻糖。Ms704、Ms705、以及Ms709 FUT8+細胞系系藉由使用兩種替換載體對CH0/DG44細胞中的FUT8基因的靶向破壞而產(chǎn)生(參見美國專利公開號 20040110704 以及 Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 位614_22)。作為另一實例，EP 1，176，195說明了帶有在功能上被破壞的FUT8基因的細胞系(該基因?qū)r藻糖基轉(zhuǎn)移酶進行編碼)，這樣藉由減少或消除α -1，6鍵相關(guān)的酶，在這種細胞系中表達之抗體表現(xiàn)出低巖藻糖基化作用。EP 1，176，195還說明了這樣的細胞系它們具有低的用于將巖藻糖加至與抗體的Fc區(qū)相結(jié)合的N-乙?；咸前返拿富钚裕蛘卟痪哂性撁富钚?，例如大鼠骨髓瘤細胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。PCT公開文件WO 03/035835說明了變種的CHO細胞系Lecl3細胞，它具有降低的將巖藻糖附聯(lián)于與Asn (297)相連的碳水化合物的能力，這也導致在該宿主細胞中表達之抗體的低巖藻糖基化作用(還可參見Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277 =26733-26740)。具有經(jīng)修飾的糖基化特性之抗體還可在雞蛋中產(chǎn)生，如在PCT公開文件W006/089231所說明?？商娲?，具有經(jīng)修飾的糖基化特性之抗體可在植物細胞(如浮萍(Lemna))中產(chǎn)生。在植物系統(tǒng)中用于生產(chǎn)抗體的方法披露于美國專利申請中，該專利申請對應于2006年8月11日提交的Alston & Bird LLP代理參考號040989/314911。PCT公開文件WO 99/54342中說明了經(jīng)工程處理而表達糖蛋白修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，β (1,4)-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶III (GnTIII))的細胞系，這樣在經(jīng)工程處理的細胞系中表達之抗體展示出增多的二等分GlcNac結(jié)構(gòu)，這導致抗體的ADCC活性提高(還可參見Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17 176-180) 可替代地，抗體的巖藻糖殘基可以使用巖藻糖苷酶切掉；例如，巖藻糖苷酶(α-L-巖藻糖苷酶)從抗體中除去巖藻糖基殘基(Tarentino et al. (1975) Biochem. :5516_23)。由本披露在此所考慮之抗體的另一修飾系聚乙二醇化作用(pegylation)?？蓪贵w進行聚乙二醇化以例如增加該抗體的生物(例如血清)半衰期。為了對抗體進行聚乙二醇化，典型地在一或多個聚乙二醇(PEG)基團附聯(lián)于該抗體或其片段的條件下，將抗體或抗體片段與PEG(如PEG的反應性酯或醛類衍生物)進行反應。較佳的是，藉由酰化反應或烷化反應使用反應性的PEG分子(或類似的反應性的水溶性聚合物)進行聚乙二醇化。 在此使用之術(shù)語“聚乙二醇”旨在涵蓋已用于衍生其它蛋白質(zhì)的PEG的形式中的任何形式 (如單(Cl-ClO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來酰亞胺)。在某些實施方案中，有待聚乙二醇化之抗體系去糖基化之抗體。對蛋白質(zhì)進行聚乙二醇化的方法在本領域中系已知的，并可應用至本發(fā)明之抗體。參見例如EP 0 154,316以及EP 0 401,384?？贵w之物理特件本披露之抗體可藉由其多種的物理特性進行表征，以檢測和/或區(qū)分它們的不同類別。本披露之抗體可在輕鏈或重鏈可變區(qū)中含有一或多個糖基化位點。此類糖基化位點可導致抗體的免疫原性提高或抗體的PK發(fā)生變化，這系因為抗原結(jié)合發(fā)生改 ^ (Marshall et al(1972)Annu Rev Biochem 41:673-702 ；Gala and Morrison(2004) J Immunol 172 :5489-94 ；Wallick et al(1988)J Exp Med 168 1099~109 ；Spiro (2002) Glycobiology 12 :43R-56R ；Parekh et al (1985)Nature 316 :452-7 ；Mimura et al. (2000)Mol Immunol 37 =697-706) 已知糖基化作用發(fā)生在包含N-X-S/T序列的基序中。在某些情況下，較佳地是具有不包含可變區(qū)糖基化的抗LAG-3抗體。這可以藉由選擇在可變區(qū)中不包含糖基化基序之抗體，或者藉由在糖基化區(qū)域內(nèi)突變殘基來實現(xiàn)。在一較佳的實施方案中，本披露之抗體不含有天冬酰胺同分異構(gòu)位點。在N-G序列或D-G序列上有可能發(fā)生天冬酰胺的脫酰胺作用，并導致生成一異天冬氨酸殘基，這將一纏繞結(jié)構(gòu)引入多肽鏈中并且降低它的穩(wěn)定性(異天冬氨酸效應)。每種抗體均具有一獨特的等電點(pi)，等電點通常落在6至9. 5的pH范圍內(nèi)。 IgGl抗體的pi典型地落在7至9. 5的pH范圍內(nèi)，并且IgG4抗體的pi典型地落在6至8 的PH范圍內(nèi)。推測pi在正常范圍之外之抗體在體內(nèi)條件下可能會有一些解折疊以及不穩(wěn)定性。因此，較佳的是具有包含落入正常范圍內(nèi)的Pl值的抗LAG-3抗體。這可以藉由選擇 Pl在正常范圍內(nèi)之抗體或者藉由對帶電荷的表面殘基進行突變來實現(xiàn)。每種抗體均具有特征性的解鏈溫度，解鏈溫度越高表明在體內(nèi)的總體穩(wěn)定性越好 (Krishnamurthy R and Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol 2:361—71)。 il胃，罾佳的是Tmi (開始解折疊的溫度)大于60°C，較佳的是大于65°C，甚至更佳的是大于70°C。 使用差示掃描熱量法(Chen et al (2003) Pharm Res 20 :1952-60 ；Ghirlando et al (1999) Immunol Lett M :47-52)或者圓二色性法(Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40 343-9)可以測量抗體的解鏈溫度。在一較佳的實施方案中，選擇不會快速降解之抗體。使用毛細管電泳法(CE)以及 MALDI-MS 可以測量抗體的降解(Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67 3626-32)。在另一較佳的實施方案中，選擇具有最低限度的聚集作用之抗體，聚集作用可能導致觸發(fā)不想要的免疫反應和/或經(jīng)改變的或不良的藥物動力學特性?？傮w上，可接受之抗體的聚集度系25 %或更低，較佳地是20 %或更低，甚至更佳地是15 %或更低，甚至更佳地是10 %或更低，并甚至更佳的是5 %或更低?？梢允褂脦追N技術(shù)來測量聚集，所述技術(shù)包括大小排阻柱(SEC)、高效液相層析(HPLC)、以及光散射法。工稈化抗體的方法如以上所討論，藉由修飾V1^P/或\序列，或其附聯(lián)的一或多個恒定區(qū)，可以使用具有在此披露的Vh和\序列的抗LAG-3抗體以產(chǎn)生新的抗LAG-3抗體。因此，在本發(fā)明的另一方面，使用本發(fā)明的抗LAG-3抗體(如25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5)的結(jié)構(gòu)特征來產(chǎn)生在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗LAG-3抗體，該抗體保留了本發(fā)明之抗體的至少一功能特性， 例如結(jié)合人類LAG-3。例如，如以上所討論，可以將25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5的一或多個⑶R區(qū)，或它們的突變與已知的框架區(qū)和/或其它⑶R重組地組合，以產(chǎn)生另外的重組工程化的本發(fā)明的抗LAG-3抗體。其它類型的修飾包括上節(jié)中說明的那些修飾。用于工程化方法的起始材料系在此提供的V1^P /或\序列中的一或多個序列，或它們的一或多個⑶R區(qū)。為了產(chǎn)生工程化之抗體，不必實際地制出一抗體(即，表達成一蛋白)，該抗體具有在此提供的Vh和/或\序列中的一或多個序列、或它們的一或多個CDR區(qū)。相反，在一或多個序列中所包含的信息被用作起始材料來創(chuàng)造從一或多個原始序列所衍生的一或多個“第二代”序列，并接著制備該一或多個“第二代”序列并將其表達為蛋白質(zhì)。因此，在另一實施方案中，本披露提供了用于制備抗LAG-3抗體的一種方法，包括(a)提供(i) 一重鏈可變區(qū)抗體序列，包括選自下組的一 CDRl序列，該組的構(gòu)成為SEQ ID NO :1至6，選自下組的一 CDR2序列，該組的構(gòu)成為SEQ ID N0:7至12，和/或選自下組的一 CDR3序列，該組的構(gòu)成為SEQ ID NO 13至14、GGY、16至18 ；和/或(ii) 一輕鏈可變區(qū)抗體序列，包括選自下組的一⑶Rl序列，該組的構(gòu)成為SEQ ID N0:19至24， 選自下組的一⑶R2序列，該組的構(gòu)成為SEQ ID N0:25至30，和/或選自下組的一⑶R3序列，該組的構(gòu)成為=SEQ ID NO 31至36 ；(b)改變在重鏈可變區(qū)抗體序列和/或輕鏈可變區(qū)抗體序列中的至少一個氨基酸殘基，以產(chǎn)生至少一種被改變之抗體序列；并且(c)將被改變之抗體序列表達成一蛋白?？梢允褂脴藴实姆肿由飳W技術(shù)來制備并表達被改變之抗體序列。較佳的是，由一或一些經(jīng)改變之抗體序列所編碼之抗體系以下抗體，它(們)保留了在此說明的抗LAG-3抗體中的一種、一些或全部功能特性，該等功能特性包括但不限于(i)與人類LAG-3的高親和力結(jié)合；(ii)結(jié)合猴類 LAG-3;(iii)缺乏與小鼠LAG-3結(jié)合；(iv)抑制LAG-3與MHC II類分子相結(jié)合的能力；和/或(ν)刺激一免疫反應(例如，抗原特異性T細胞應答)的能力。使用本領域可獲得的和/或在此所說明的標準測定(例如實施例中所給出那些測定)評定被改變之抗體的功能特性。在本發(fā)明的工程化抗體的方法的某些實施方案中，可以沿抗LAG-3抗體編碼序列的全長或一部分隨機地或選擇性地引入突變，并針對結(jié)合活性和/或在此說明的其它功能特性可對得到的經(jīng)修飾的抗LAG-3抗體進行篩選。已在本領域中說明了突變的方法(參見，
32例如 PCT 公開文件 WO 02/092780 以及 WO 03/074679)。編碼本發(fā)明抗體之核酸分子本發(fā)明的另一方面涉及對本發(fā)明之抗體進行編碼的核酸分子。該等核酸可存在于整個細胞中、細胞裂解物中、或者以部分純化或基本上純的形式存在。藉由標準的技術(shù)，包括用堿/SDS處理、CsCl成帶(CsCl banding)、柱層析法、瓊脂糖凝膠電泳、以及其它的本領域熟知的技術(shù)，當將核酸從其它的細胞成分或其它污染物，如其它細胞核酸或蛋白中純化出來，核酸系“分離的”或“使之基本上是純的”。參見Ausubel，et al. ,ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York。本發(fā)明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以包含或可以不包含內(nèi)含子序列。在一較佳的實施方案中，該核酸為cDNA分子。使用標準的分子生物學技術(shù)可以獲得本發(fā)明的核酸。對于藉由雜交瘤表達之抗體 (例如，如以下進一步說明從攜帶人類免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠中制備的雜交瘤)而言，藉由標準的PCR擴增或cDNA克隆技術(shù)可以獲得對由雜交瘤制作的抗體的輕鏈以及重鏈進行編碼的cDNA。對于從免疫球蛋白基因文庫中獲得之抗體(例如，使用噬菌體展示技術(shù)) 而言，可以從該基因文庫中回收編碼此類抗體的核酸。本發(fā)明的較佳的核酸分子系對25E3、25F7、8B7J6H10、11F2以及17E5單克隆抗體的Vh以及Vl序列進行編碼的核酸分子。對25E3、25F7、8B7、26H10、11F2以及17E5的Vh序列進行編碼的DNA序列分別示于SEQID NO :49至54。對25E3、25F7、8B7J6H10、11F2以及 17E5的\序列進行編碼的DNA序列分別示于SEQ ID NO 55至60?！┇@得了編碼Vh和\區(qū)段的DNA片段，則藉由標準的重組DNA技術(shù)(例如將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)變成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因)可以對該等DNA片段進行進一步操作。在該等操作中，編碼^或乂^勺DNA片段被可操作地連接至編碼另一蛋白(如一抗體恒定區(qū)或一柔性接頭)的另一條DNA片段上。在本文中使用之術(shù)語“可操作地連接”旨在說明將這兩個DNA片段連接，這樣由這兩條DNA片段編碼的氨基酸序列仍在閱讀框內(nèi)。藉由將編碼Vh的DNA可操作地連接至另一編碼重鏈恒定區(qū)(CHI、CH2及CH3)的 DNA分子，可以將編碼Vh區(qū)的分離的DNA轉(zhuǎn)化成全長重鏈基因。人類重鏈恒定區(qū)基因的序列在本領域中系已知的(參見例如Kabat et al. (1991)，如上所述)，并且包括該等區(qū)域的DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。該重鏈恒定區(qū)可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、 IgE、IgM或IgD恒定區(qū)，但最佳地是IgGl或IgG4恒定區(qū)。對于Fab片段重鏈基因而言，可以將編碼Vh的DNA可操作地連接至另一僅對重鏈CHl恒定區(qū)進行編碼的DNA分子。藉由將編碼\的DNA可操作地連接至編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另一 DNA分子上，可以將編碼\區(qū)的分離的DNA轉(zhuǎn)化成全長輕鏈基因(連同F(xiàn)ab輕鏈基因)。人類輕鏈恒定區(qū)基因的序列在本領域系已知的(參見，例如Kabat et al.，如上所述)，并且涵蓋該等區(qū)域的DNA片段可藉由標準的PCR擴增獲得。在較佳的實施方案中，該輕鏈恒定區(qū)可以為κ或 λ恒定區(qū)。為了產(chǎn)生scFv基因，將編碼Vh和\的DNA片段可操作地連接至另一條編碼柔性接頭，例如編碼氨基酸序列(Gly4-Ser)3的片段，這樣V1^nt序列可被表達為連續(xù)的單鏈蛋白，其中區(qū)域藉由柔性接頭進行連接(參見，例如Bird et al. (1988) Science塑: 423-426 ；Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883 ；McCafferty etal. ， (1990)Nature 348 552~554)。本發(fā)明之單克降抗體的牛產(chǎn)使用熟知的Kohler and Milstein(1975)Nature 256 495 的體細胞雜交(雜交瘤)技術(shù)可以產(chǎn)生本披露的單克隆抗體(單抗)。產(chǎn)生單克隆抗體的其它實施方案包括B淋巴細胞的病毒性或致癌性轉(zhuǎn)化以及噬菌體展示技術(shù)。嵌合抗體或人源化抗體在本領域也是熟知的。參見，例如美國專利號 4，816，567 ；5，225，539 ；5，530，101 ；5，585，089 ；5，693，762 以及6，180，370，它們的全文內(nèi)容藉由引用特定地結(jié)合在此。在一較佳的實施方案中，本發(fā)明之抗體系人類單克隆抗體。使用攜帶部分的人類免疫體系而不是小鼠體系的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠，可以產(chǎn)生針對人類LAG-3的此類人類單克隆抗體。該等轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)染色體小鼠包括在此分別稱作HuMAb Mouse 及 KM Mouse 的小鼠，并在此共同稱作“人類Ig小鼠”。HuMAb Mouse ( Medarex , Inc.)含有對非重排的人類重鏈(μ以及γ)以及κ輕鏈免疫球蛋白序列進行編碼的人類免疫球蛋白基因微型基因座，并含有使內(nèi)源性 μ和Y鏈基因座失活的靶向突變(見，例如Lonberg et al. (1994)Nature 368(6474) 856-859)。因此，該等小鼠表現(xiàn)出小鼠IgM或κ的表達減少；并且響應于免疫，所引入的人類重鏈以及輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷了類別轉(zhuǎn)換以及體細胞突變以產(chǎn)生高親和力的人類 IgGK 單克隆抗體(Lonberg et al. (1994)，如上所述；在 Lonberg(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113 49~101 進行綜述LonberR, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13 :65_93 以及Harding and Lonberg (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764 536-546)。HuMAb Mouse 的制備及用途，以及由這種小鼠攜帶的基因組修飾，進一步說明于 Taylor et al. (1992)Nucleic Acids Research 20 6287-6295 ；Chen et al. (1993) International Immunology 5 647-656 ；Tuaillon et al. (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 3720-3724 ；Choi et al. (1993)Nature Genetics 4117-123 ；Chen et al. (1993) EMBO J. 12 821-830 ；Tuaillon et al. (1994)J. Immunol. 152 2912-2920 ；Taylor et al. (1994) International Immunology 互579_591 ；以及 Fishwild et al. (1996)Nature Biotechnology 14 845-851中，所有該等文獻的全文內(nèi)容均藉由引用特定地結(jié)合在此。進一步參見美國專利號 5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；5，789，650 ； 5，877，397 ；5，661，016 ；5，814，318 ；5，874，299 ；5，770，429 ；以及 5，545，807 ；PCT
發(fā)明者凱拉·D·曾斯, 海迪·勒布蘭克, 肯特·B·蘇迪厄姆, 艾倫·J·科曼, 馬克·亞馬納卡, 馬克·塞爾比 申請人:梅達雷克斯股份有限公司