專利名稱：自身免疫性和炎性疾病的治療的制作方法
自身免疫性和炎性疾病的治療本發(fā)明提供了多發(fā)性硬化和其他自身免疫性疾病的新治療方法，和用于在這些方法中使用的新分離的結(jié)合蛋白。還提供了治療多發(fā)性硬化的方法，其包含中和IL-7或 IL-7R的生物活性。
背景技術(shù)：
多發(fā)性硬化(MS)是影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性炎性、脫髓鞘疾病。在MS中，認(rèn)為浸潤炎性免疫細(xì)胞與少突膠質(zhì)細(xì)胞的破壞有關(guān)，所述少突膠質(zhì)細(xì)胞是負(fù)責(zé)生成且維持稱為髓鞘的脂肪層的細(xì)胞。MS導(dǎo)致髓鞘質(zhì)變薄或完全喪失。當(dāng)髓鞘質(zhì)喪失時(shí)，神經(jīng)元可以不再有效傳導(dǎo)其電信號(hào)，從而導(dǎo)致眾多神經(jīng)病學(xué)功能障礙。具有MS的個(gè)體產(chǎn)生自身反應(yīng)性T細(xì)胞，其參與沿著神經(jīng)纖維的髓鞘的炎性病變形成。具有活動(dòng)性MS的患者的腦脊液含有激活的T 細(xì)胞，其浸潤腦組織且引起特征性炎性病變，從而破壞髓鞘質(zhì)。盡管多發(fā)性硬化癥狀和疾病過程可以從人到人不同，但存在3種形式的疾病一復(fù)發(fā)緩解型MS、繼發(fā)進(jìn)行型MS和原發(fā)進(jìn)行型MS。在MS早期階段，炎性發(fā)作在疾病活性劇烈提高的短時(shí)間間隔期間發(fā)生。這些發(fā)作隨后為恢復(fù)和緩解期。在緩解期過程中，神經(jīng)系統(tǒng)病變中的局部腫脹消退，免疫細(xì)胞變得更不活躍或無活性，并且髓鞘質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞使軸突重新形成髓鞘(remyelinate)。神經(jīng)發(fā)信號(hào)改善，并且由炎癥引起的失能變得更不嚴(yán)重或完全消失。疾病的這個(gè)病期被稱為復(fù)發(fā)緩解型 MS (RRMS)。然而，病變并未完全痊愈。一些作為“慢性”病變保留，這通常具有缺乏免疫細(xì)胞的脫髓鞘核心區(qū)。隨著時(shí)間過去，此種病變中心中的細(xì)胞大部分死亡，盡管炎癥經(jīng)常在其邊緣處繼續(xù)。腦可以良好適應(yīng)一些神經(jīng)元的喪失，并且永久失能可能很多年不發(fā)生。然而， 超過50%具有MS的患者最終進(jìn)入進(jìn)行性惡化病期，稱為繼發(fā)進(jìn)行型MS (SPMS)。在這個(gè)病期，疾病不再良好響應(yīng)緩解疾病藥物，并且患者的失能穩(wěn)定惡化。來自MS自然過程早期的神經(jīng)元破壞暗示SPMS的進(jìn)行性失能可能是累積神經(jīng)元喪失的結(jié)果，其最終壓倒腦的代償能力。原發(fā)進(jìn)行型MS是一類多發(fā)性硬化，其中不存在復(fù)發(fā)，但在數(shù)年時(shí)間段期間，存在身體和認(rèn)知功能的逐步喪失。具有復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化的患者中的治療目標(biāo)是減少復(fù)發(fā)頻率和嚴(yán)重性(且從而預(yù)防惡化)以及阻止或推遲疾病進(jìn)行性病期的開始。為了達(dá)到這個(gè)目標(biāo)，尤其是在過去， 已使用免疫調(diào)諧或免疫抑制藥物，但由于有限的功效和相當(dāng)大的毒性，它們從未被廣泛接受。例如，已用干擾素β _la、干擾素β-Ib和乙酸格拉太咪爾成功執(zhí)行大型隨機(jī)化對(duì)照試驗(yàn)。改變的自身免疫T細(xì)胞應(yīng)答和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的功能障礙都在人自身免疫病理學(xué)例如MS和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中起重要作用(Kuchroo等人，(2002)Annu. Rev. Immunol. 20:101-123 ;Sospedra禾口Martin(2005)Annu. Rev. Immunol. 23 :683-747 ;Toh禾口Miossec (2007) Curr. Opin. Rheumatol. 19:284-288)。盡管MS的病因?qū)W和發(fā)病機(jī)理仍是未知的，但一般被視為自身免疫病理學(xué)，其中具有致病潛力的自身反應(yīng)性T細(xì)胞例如ThI和Th17細(xì)胞被認(rèn)為起重要作用。存在這些效應(yīng)T 細(xì)胞在疾病過程期間在體內(nèi)激活且可歸因于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎癥的證據(jù)。還存在這些T細(xì)胞在疾病的活動(dòng)期過程中介導(dǎo)EAE和MS病變中的髓鞘質(zhì)表達(dá)細(xì)胞破壞的證據(jù)。另一方面，在檢查中正常維持致病性ThI和Th17細(xì)胞的調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg)在具有MS的患者中缺乏，從而使免疫系統(tǒng)進(jìn)一步朝向促炎狀態(tài)傾斜。3個(gè)分開團(tuán)體最近報(bào)道在具有或不具有MS的總共17’ 947個(gè)供體中的全基因組單核苷酸多態(tài)性(SNPs)掃描結(jié)果。在掃描334，923個(gè)SWs后，他們發(fā)現(xiàn)在人IL-7受體α鏈 (IL-7Ra )中的非同義編碼SNP與MS易感性的高度顯著關(guān)聯(lián)(總體P=2JxlO-7)。SNP與 ⑶127 (也稱為IL-7Ra )外顯子6中從T到C的改變對(duì)應(yīng)。這個(gè)改變增強(qiáng)在RNA剪接過程中外顯子6跳躍的機(jī)會(huì)，從而導(dǎo)致可溶形式的CD127。此外，相對(duì)于具有其他神經(jīng)學(xué)病癥的患者的CSFs，MS患者腦脊液(CSFs)中的⑶127和IL_7 RNAs表達(dá)顯著更高。已知IL-7和IL-7受體(IL-7R)主要在胸腺環(huán)境中在T細(xì)胞和B細(xì)胞發(fā)育和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起重要作用。事實(shí)上，胸腺基質(zhì)細(xì)胞、胎兒胸腺和骨髓是IL-7生產(chǎn)部位。IL-7受體由2個(gè)亞單位CD127和共同鏈(γ鏈或Yc)組成，所述共同鏈由IL-2、IL-4、IL-9、IL-15 和IL-21的受體共享。CD127 也稱為 IL-7 受體 a (IL-7Ra )禾口 p90 IL-7R。人 CD127 (Swiss Prot 登記號(hào)P16871)具有總共459個(gè)氨基酸(20個(gè)信號(hào)序列)。它包括219氨基酸胞外區(qū)、25氨基酸跨膜區(qū)和195氨基酸胞內(nèi)區(qū)。如本文使用的(例如用于描述抗體表位)在CD127內(nèi)的殘基編號(hào)基于全長蛋白質(zhì)，包括信號(hào)序列殘基。CD127可以以4種同種型存在，同種型H20 (Swissprot登記號(hào)P16871-1)具有下述氨基酸序列(包括信號(hào)序列)
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⑶127也在胸腺基質(zhì)衍生的淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)受體中發(fā)現(xiàn)。TSLP受體是⑶127和細(xì)胞因子受體樣因子2 (CRLF2)的異二聚體。IL-7與IL-7R的結(jié)合激活多種發(fā)信號(hào)途徑，包括JAK激酶1和3的激活，從而導(dǎo)致 Stat5的磷酸化和激活。這個(gè)途徑對(duì)于胸腺發(fā)育T細(xì)胞前體存活是關(guān)鍵的，這是因?yàn)镸at5 激活是誘導(dǎo)抗凋亡(anti-apoptotic)蛋白質(zhì)Bcl-2和阻止促凋亡(pro-apoptotic)蛋白質(zhì) Bax進(jìn)入線粒體內(nèi)所需的。另一個(gè)IL-R介導(dǎo)的途徑是PI3激酶的激活，從而導(dǎo)致促凋亡蛋白質(zhì)Bad的磷酸化及其細(xì)胞質(zhì)保留。⑶127在外周靜息和記憶T細(xì)胞中表達(dá)。T細(xì)胞存活和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的IL-7調(diào)節(jié)機(jī)制以及外周中的IL-7來源并未得到完全了解。此外，它在自身免疫性疾病中致病性T細(xì)胞的分化和功能中的潛在作用研究不足且大部分是未知的。存在暗示IL-7可能促成自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)理的少數(shù)報(bào)道。⑶127已在W09015870中得到描述，并且在多發(fā)性硬化治療中的IL-7和⑶127拮抗劑已在W0200605^60和US20060198822中得到描述。TSLP的拮抗劑已在例如US7304144 和W02007096149中得到描述。
發(fā)明概述
本發(fā)明人已顯示IL-7/CD127拮抗作用在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)改善中是有效的。治療導(dǎo)致在處理的小鼠的脾和脊髓中Th17的明顯減少，和程度較少的ThI細(xì)胞減少，這伴隨你即3+ TMg的水平增加。本發(fā)明人也已顯示IL-7對(duì)于TH17細(xì)胞擴(kuò)張和存活是決定性地需要的，但它在前體T細(xì)胞分化成Th17細(xì)胞群體中的需求是最低限度的。用⑶127或IL-7拮抗劑恢復(fù)自身反應(yīng)性炎性TH17和ThI細(xì)胞以及Treg的功能比平衡提供了作為用于多發(fā)性硬化和其他自身免疫性疾病治療的極大潛力。ThI7和ThI細(xì)胞的選擇性易感性可歸因于CD127在激活的致病性T細(xì)胞中的高表達(dá)及其擴(kuò)張和存活對(duì)于IL-7的需求。CD127的阻斷導(dǎo)致改變的發(fā)信號(hào)事件，其特征在于磷酸化的JAK-I和STAT-5和BCL-2的下調(diào)以及BAX的活性增加，從而致使⑶127+ TH17和ThI 細(xì)胞對(duì)凋亡易感。相比之下，F(xiàn)oxp3+ Treg (誘導(dǎo)型TMg)對(duì)⑶127拮抗作用有抵抗力，這是因?yàn)樗鼈儾槐磉_(dá)⑶127，或表達(dá)較低水平的⑶127。IL-7/IL-7R相互作用下游的發(fā)信號(hào)事件， 包括凋亡途徑，在 ^οχρβ+ Treg中不受中和抗⑶127抗體影響。此外，⑶127拮抗作用的相似作用在人Τη17和ThI擴(kuò)張和存活中看到，這不傷害Treg。這些發(fā)現(xiàn)提供了支持IL-7在致病性T細(xì)胞分化和維持中的作用的新證據(jù)，并且在MS和其他人自身免疫性疾病中具有重要治療牽涉。因此，在本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了用于治療人受試者中的自身免疫性疾病或炎性病癥的方法，其包含給受試者施用下述至少一種的拮抗劑IL-7受體介導(dǎo)的Th17擴(kuò)張，和IL-7受體介導(dǎo)的Th17存活。IL-7受體介導(dǎo)的Th17擴(kuò)張和/或存活可以在細(xì)胞水平下觀察到，通過TH17細(xì)胞計(jì)數(shù)的增加或維持，或通過與其他CD4+ T細(xì)胞數(shù)目相比較，Th17細(xì)胞數(shù)目比中的增加，或更具體而言通過 Th17:Th1 比、TH17:Treg 比、(Th17 加上 TH1) :Treg 比和 / 或 TH17: (TH1 加上 Treg) 比中的增加。在分子水平下，ThI7擴(kuò)張和/或存活可以通過經(jīng)由⑶4+ T細(xì)胞群體(或經(jīng)由TH17 細(xì)胞群體)的IL-17生產(chǎn)中的增加觀察到。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，IL-7受體介導(dǎo)的Th17 擴(kuò)張和/或IL-7受體介導(dǎo)的Th17存活的拮抗劑減少通過⑶4+ T細(xì)胞群體的IL-17生產(chǎn)。 IL-7受體介導(dǎo)的Th17擴(kuò)張和存活也可以通過經(jīng)由CD4+ T細(xì)胞群體(或經(jīng)由TH17細(xì)胞群體) 的IFN-Y生產(chǎn)中的增加觀察到。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的拮抗劑抑制通過CD4+ T細(xì)胞群體的IFN-Y生產(chǎn)。在分子水平下，IL-7受體介導(dǎo)的TH17擴(kuò)張和/或存活的拮抗劑可以抑制IL-7受體介導(dǎo)的STAT-5磷酸化。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療自身免疫性疾病或炎性病癥的方法， 其包含給患者施用IL-7或⑶127的拮抗劑，其量足以減少患者中的TH17細(xì)胞計(jì)數(shù)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療人受試者中的自身免疫性疾病的方法，其包含給受試者施用IL-7受體介導(dǎo)的STAT-5磷酸化的拮抗劑。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療患者中的多發(fā)性硬化的方法，其包含給所述患者施用IL-7或⑶127的拮抗劑，其中所述患者患有復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療人受試者中的自身免疫性或炎性疾病的方法， 其包含給受試者施用IL-7或IL-7R的拮抗劑，其量有效減少Th17細(xì)胞相對(duì)于ThI細(xì)胞的比。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療人受試者中的自身免疫性或炎性疾病的方法， 其包含給受試者施用IL-7或IL-7R的拮抗劑，其量有效減少Th細(xì)胞相對(duì)于(F0Xp3+)T,eg細(xì)胞的比。在上述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，拮抗劑選自(a)與⑶127 (SEQ ID NO: 1)特異性結(jié)合的結(jié)合蛋白；(b)與IL-7特異性結(jié)合的結(jié)合蛋白，(c)可溶性CD127多肽；和(d)所述拮抗劑中的2種或更多種的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，特異性結(jié)合CD127或IL-7的結(jié)合蛋白是分離的人、人源化或嵌合抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，與CD127特異性結(jié)合的結(jié)合蛋白(抗CD127結(jié)合蛋白)是抗體或其抗原結(jié)合片段。在一些實(shí)施方案中，抗CD127結(jié)合蛋白抑制IL-7與IL-7R受體復(fù)合物的結(jié)合。在本發(fā)明的方法中有用的特定抗CD127抗體在本文中得到描述，并且包括9B7、 6C5、6A3、R34. 34、GR34和IAl 1，其人源化或嵌合形式，其類似物及其抗原結(jié)合片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，與IL-7特異性結(jié)合的結(jié)合蛋白(抗IL-7結(jié)合蛋白)是抗體或其抗原結(jié)合片段。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了嵌合、人源化或全人抗體或其抗原結(jié)合片段，其與 ⑶127結(jié)合且能夠抑制IL-7介導(dǎo)的Th17擴(kuò)張。本發(fā)明人已確定抗⑶127結(jié)合蛋白在功能性中和IL-7途徑或IL-7R介導(dǎo)的發(fā)信號(hào)方面不是一致有效的。相反，存在看起來在發(fā)信號(hào)途徑中起重要作用的人CD127多肽的特定區(qū)域，從而能夠與人CD127的這些區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合的抗體在中和IL-7途徑或 IL-7R介導(dǎo)的發(fā)信號(hào)中特別有效。這些區(qū)域由SEQ ID NO: 1的下述氨基酸殘基限定
(ν) 202 EfKVRSIPDHYFKGFWSE 219 (SEQ !0N0;121) 假定這些區(qū)域含有在配體IL-7和⑶127受體之間的相互作用中起作用的氨基酸。 下述氨基酸被認(rèn)為在IL-7/CD127相互作用中具有特殊重要性氨基酸結(jié)合這些區(qū)域中的超過一個(gè)可能在IL-7R功能抑制中具有重要性。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合蛋白能夠結(jié)合在如上定義的區(qū)域(i)至(iv)中的至少一個(gè)或多個(gè)內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸，或側(cè)接或結(jié)構(gòu)上鄰近如上定義的區(qū)域(i )至(iv)中的至少一個(gè)或多個(gè)的氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合蛋白能夠結(jié)合在如上定義的區(qū)域(a)至(e)中的至少一個(gè)內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸，或如上定義的區(qū)域(a)至(e)的至少一個(gè)的氨基酸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗原結(jié)合蛋白，其能夠結(jié)合由SEQ ID N0:1的氨基酸殘基202 - 219限定的區(qū)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案的抗原結(jié)合蛋白可能進(jìn)一步能夠結(jié)合由SEQ ID NO: 1的氨基酸殘基(i) 41 - 63、(ii)65 - 80、(iii) 84 - 105和(iv) 148 - 169限定的1、2、3個(gè)或所有4個(gè)區(qū)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合蛋白結(jié)合由SEQ ID NO: 1的氨基酸(O202 - 219限定的區(qū)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸和由SEQ ID N0:1的氨基酸(iv)148 - 169限定的區(qū)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案的抗原結(jié)合蛋白可能進(jìn)一步能夠結(jié)合由SEQ ID N0:1 的氨基酸(ii)65 - 80和/或(iii)84 - 105限定的區(qū)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸。在特定實(shí)施方案中，抗原結(jié)合蛋白結(jié)合SEQ ID N0:1的肽(ii)65 - 80、(iii)84 - 105、(iv)148 -169和(v) 202 - 219的每一個(gè)內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗原結(jié)合蛋白，其能夠結(jié)合由SEQ ID N0:1的氨基酸殘基(e) 212 - 213限定的區(qū)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸，或側(cè)接或結(jié)構(gòu)上鄰近的氨基酸。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案的抗原結(jié)合蛋白可能進(jìn)一步能夠結(jié)合由SEQ ID NO: 1的氨基酸殘基 (a) 51 - 53、(b) 77 - 79、(c) 97 - 103 和(d) 158 - 159 限定的 1、2、3 個(gè)或所有 4 個(gè)區(qū)域內(nèi)的，側(cè)接或結(jié)構(gòu)上鄰近由SEQ ID NO: 1的氨基酸殘基(a)51 - 53、(b)77 - 79、(c)97 -103和(d) 158 - 159限定的1、2、3個(gè)或所有4個(gè)區(qū)域的至少一個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白結(jié)合由SEQ ID NO: 1的氨基酸(￠0212 - 213限定的區(qū)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸，或側(cè)接或結(jié)構(gòu)上鄰近的氨基酸，和由SEQ ID N0:1的氨基酸(d) 158 - 159限定的區(qū)域內(nèi)、側(cè)接或結(jié)構(gòu)上鄰近由SEQ ID NO: 1的氨基酸(d) 158 - 159限定的區(qū)域的至少一個(gè)氨基酸。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案的結(jié)合蛋白可能進(jìn)一步能夠結(jié)合由SEQ ID NO: 1的氨基酸(b) 77 - 79和/或(c) 97 - 103限定的區(qū)域內(nèi)、側(cè)接或結(jié)構(gòu)上鄰近由SEQ ID N0:1的氨基酸(b) 77 - 79和/或(c) 97 - 103限定的區(qū)域的至少一個(gè)氨基酸。在特定實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白結(jié)合SEQ ID N0:1的肽(b)77 - 79、(c)97 - 103、(d)158 - 159 和(e)212 - 213的每一個(gè)內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的這些方面的抗體包括6A3、1A11、6C5和9B7，其抗原結(jié)合片段及其嵌合或人源化變體。本發(fā)明的這些方面的另外抗體是R3434或GR34的嵌合或人源化變體，或 R3434或GR34的抗原結(jié)合片段。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了人、人源化或嵌合抗體或其片段，其中所述抗體或片段與人CD127的表位結(jié)合，所述表位含有在從殘基編號(hào)80開始且以殘基編號(hào)190結(jié)束的區(qū)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗體或其片段，其與人⑶127 (SEQ ID N0:1)的表位結(jié)合，其中所述表位具有存在于SEQ ID N0s:20-28、45-50、67-70、87-89和106-116的 CD127區(qū)域中的至少一個(gè)中的氨基酸殘基。這種結(jié)合尤其可以通過肽ELISA、表面等離振子共振(BIAcore)或噬菌體展示進(jìn)行測量。在特定實(shí)施方案中，抗體或其片段與人⑶127 (SEQ ID NO: 1)的表位結(jié)合，其中所述表位具有存在于下述中的氨基酸殘基SEQ ID N0s:66-70的區(qū)域中的1、2、3或4個(gè)，SEQ ID N0s:87-89 的 CD127 區(qū)域中的 1、2 或 3 個(gè)；或 SEQ ID NOs: 114-116 的 CD127 區(qū)域中的 1、2或3個(gè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與人CD127的表位結(jié)合的抗體或其片段，其中所述表位具有存在于⑶127的下述區(qū)域的至少一個(gè)中的氨基酸殘基35-49 (SEQ ID N0:20)、84-105 (SEQ ID N0:21) 171-180 (SEQ ID NO:22)，或與下述線性肽的至少一個(gè)結(jié)合的抗體或片段；35-49 (SEQ ID NO:20),84-105 (SEQ ID N0:21) 171-180 (SEQ ID N0:22)。這種結(jié)合尤其可以通過肽ELISA、表面等離振子共振(BIAcore)或噬菌體展示進(jìn)行測量。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與人CD127(SEQ ID NO: 1)的表位結(jié)合的抗體或其片段，所述表位具有存在于⑶127 (SEQ ID NO: 1)的下述區(qū)域內(nèi)的氨基酸殘基80-94 (SEQ ID N0:23)、95-109 (SEQ ID NO: 24)、170-184 (SEQ ID NO: 25)，或所述表位存在于 CD127 (SEQ ID N0:1)的下述區(qū)域內(nèi)80-94 (SEQ ID NO:23),95-109 (SEQ ID NO:24)、170-184 (SEQ ID N0:25)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與人⑶127 (SEQ ID N0:1)的表位結(jié)合的抗體或其片段，所述表位具有存在于⑶127 (SEQ ID NO: 1)的下述區(qū)域內(nèi)的氨基酸殘基35-49 (SEQ ID NO:26),84-105 (SEQ ID NO:27)、139-184 (SEQ ID N0:28)，或所述表位存在于 CD127 (SEQ ID N0:1)的下述區(qū)域內(nèi)35-49 (SEQ ID NO:26),84-105 (SEQ ID N0:27)、139-184 (SEQ ID N0:28)。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了與C末端生物素化CD127肽結(jié)合的抗體或其片段， 如通過表面等離振子共振測定的，所述⑶127肽包含⑶127的殘基35-49、84-105、171-180， 所述肽與鏈霉抗生物素蛋白傳感器芯片結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或其片段另外需要相對(duì)于⑶127的35-49、84_105或 171-180區(qū)域中的所述至少一個(gè)殘基的至少一個(gè)側(cè)接殘基或結(jié)構(gòu)上鄰近殘基用于結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地鑒定此種抗體或其片段，例如在ELISA測定中使用丙氨酸置換掃描。在這個(gè)方面，抗體是否需要在CD127的上述區(qū)域中的殘基、或側(cè)接或結(jié)構(gòu)上鄰近殘基用于結(jié)合可以通過下述進(jìn)行測定獨(dú)立地用丙氨酸取代CD127的所述殘基，并且使抗體與丙氨酸取代的CD127肽的結(jié)合親和力和抗體與野生型CD127的結(jié)合親和力比較。⑶127的上述區(qū)域中的殘基是否需要通過與野生型⑶127相比較，抗體與丙氨酸取代的 ⑶127的結(jié)合親和力中的減少進(jìn)行限定，其中如通過Biacore或ELISA親和力測量測定的， 所述減少超過1、2、3、4或5倍。進(jìn)一步地，在這個(gè)背景中的結(jié)構(gòu)上鄰近殘基是在三維空間中與所討論的殘基緊密接近且由抗體結(jié)合的殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到抗原表位可以是線性或非線性肽序列。 在后者、非線性情況下，盡管殘基來自肽鏈的不同區(qū)域，但它們可以在抗原的三維結(jié)構(gòu)中緊密接近。此種結(jié)構(gòu)上鄰近殘基可以通過計(jì)算機(jī)建模程序或經(jīng)由通過本領(lǐng)域已知的方法例如 X射線晶體學(xué)獲得的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及治療用抗體及其抗原結(jié)合片段，其對(duì)于CD127特異，并且在自身免疫性和/或炎性病癥治療中有用。在如本文定義的測定中，抗體和抗原結(jié)合片段可以抑制Th17擴(kuò)張和存活和/或抑制pSTAT-5。這些抗體和抗原結(jié)合片段可以代表在本發(fā)明的方法中有用的拮抗劑。更具體而言，在一個(gè)方面，提供了抗體或其抗原結(jié)合片段和/或衍生物，其與 CD127結(jié)合，并且包含選自下述的至少第三條重鏈CDR (CDRH3):9B7-CDRH3 (SEQ ID N0:6)； 6C5-CDRH3 (SEQ ID NO:33)、6A3_CDRH3 (SEQ ID NO:55)或 1A11-CDRH3 (SEQ ID N0:75)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段和/或衍生物包含下述的CDRH3 抗體 9B7 (SEQ ID N0:6)和 9B7 的 1、2、3、4 個(gè)或所有 5 個(gè)另外 CDRs (SEQ ID NOs4，5，7，8，9);
12抗體 6C5 (SEQ ID N0:33)和 6C5 的 1、2、3、4 個(gè)或所有 5 個(gè)另外 CDRs (SEQ ID NOs 31，32，34，35，36)；抗體 6A3 (SEQ ID NO:55)和 6A3 的 1、2、3、4 個(gè)或所有 5 個(gè)另外 CDRs (SEQ ID NOs :53，54，56，57，58)；或抗體 IAll (SEQ ID N0:75)禾口 IAll 的 1、2、3、4 個(gè)或所有 5 個(gè)另外 CDRs (SEQ ID NOs73，74，76，77，78)。 在另一個(gè)方面，提供了其為抗體或其抗原結(jié)合片段和/或衍生物的治療用抗體， 其與⑶127結(jié)合且包含下述⑶Rs或其類似物
CDRH3; GDGNYWYF (SEQ ID NO: 5) CDRL1: SASSSVTYMHW (SEQ ID NO:76) CDRL2: EfSKLAS (SEQ ID NO: )°
CDRL3 QEWNYPYTF (SEQ ID NO:78) 在另一個(gè)方面，提供了其為人、人源化或嵌合抗體或其抗原結(jié)合片段和/或衍生物的治療用抗體，其與⑶127結(jié)合且包含下述⑶Rs或其類似物
貫穿本說明書自始至終，術(shù)語 〃CDR〃、〃CDRL1〃、"CDRL2"、"CDRL3"、〃CDRH1〃、 "CDRH2〃、〃CDRH3〃 遵循 Kabat 編號(hào)系統(tǒng)，如 Kabat 等 k;Sequences of proteins of Immunological Interest NIH，1987中所述。因此，下述限定了根據(jù)本發(fā)明的CDRs :在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含下述的單克隆抗體
(i)SEQ ID NO:2的重鏈可變區(qū)和/或SEQ ID NO:3的輕鏈可變區(qū)；
(ii)SEQ ID NO:29的重鏈可變區(qū)和/或SEQ ID NO:30的輕鏈可變區(qū)；
(iii)SEQID NO:51的重鏈可變區(qū)和/或SEQ ID N0:52的輕鏈可變區(qū)；或
(iv)SEQ ID NO:71的重鏈可變區(qū)和/或SEQ ID N0:72的輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明還提供的是在SEQ ID NOs :2、3、四、30、51、52、71和72的序列全長上具有至少90%同一性、或至少95%同一性、或至少98%同一性、或至少99%同一性的抗體可變結(jié)構(gòu)域序列。本發(fā)明還提供的是自身免疫性疾病或炎性病癥的治療方法，其包含給患者施用抗 ⑶127抗體，其中所述抗體包含
(i)SEQID NO:2的重鏈可變區(qū)和/或SEQ ID N0:3的輕鏈可變區(qū)；
(ii)SEQ ID N0:29的重鏈可變區(qū)和/或SEQ ID N0:30的輕鏈可變區(qū)；
(iii)SEQID NO:51的重鏈可變區(qū)和/或SEQ ID N0:52的輕鏈可變區(qū)；
(iv)SEQ ID NO:71的重鏈可變區(qū)和/或SEQ ID N0:72的輕鏈可變區(qū)；或
(v)SEQ ID NO:90的重鏈可變區(qū)和/或SEQ ID N0:91的輕鏈可變區(qū)，
或具有這樣的重和輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體，其與這些重和/或輕鏈可變區(qū)具有至少 90%同一性、或至少95%同一性、或至少98%同一性、或至少99%同一性。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了抗體或其抗原結(jié)合片段，其與CD127結(jié)合，并且能夠抑制IL-7介導(dǎo)的Th17擴(kuò)張，其中所述抗體不是R. 34. 34 (Dendritics Inc.，#DDX0700)。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于鑒定適合于用于治療自身免疫性疾病或炎性疾病的抗體或抗體片段的方法，所述方法包含步驟篩選多個(gè)獨(dú)立的抗體或抗體片段群體， 以測定每個(gè)抗體群體關(guān)于下述的能力i.抑制IL-7與IL-7R的結(jié)合，
ii.中和IL-7誘導(dǎo)的STAT-5磷酸化，和/或
iii.抑制通過TH17細(xì)胞的IL-17生產(chǎn)，
并且選擇在體內(nèi)能夠抑制IL-7與IL-7R結(jié)合、抑制IL-7誘導(dǎo)的STAT-5磷酸化、和/ 或抑制通過Th17細(xì)胞的IL-17生產(chǎn)的那些抗體或抗體片段群體。組合物或物質(zhì)(測試試劑)充當(dāng)IL-7受體介導(dǎo)的Th17擴(kuò)張或IL_7受體介導(dǎo)的TH17 存活的拮抗劑、或減少Th17細(xì)胞計(jì)數(shù)的能力，可以通過常規(guī)方法進(jìn)行測定。例如可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適條件(例如TGF-β 1、11^-23、11^-6、抗正^￥和抗IL-4或IL-I β、 IL-6和IL-23)刺激幼稚(na’iVe)CD4+細(xì)胞，以分化成TH17。TH17細(xì)胞群體隨后可以暴露于測試試劑和IL-7，這之后可以測定Th17細(xì)胞計(jì)數(shù)。相對(duì)于對(duì)照，Th17細(xì)胞中的減少將指示測試試劑能夠抑制Th17擴(kuò)張或存活。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了制備用于治療自身免疫性或炎性疾病的藥物的方法，所述方法包含將抗CD127或抗IL-7抗體或其抗原結(jié)合片段和一種或多種賦形劑配制成藥學(xué)上可接受的制劑。這種方法可以包含如上文限定的鑒定抗體和/或重組生產(chǎn)此種抗體的預(yù)備步驟。在由本發(fā)明的結(jié)合蛋白和抗體結(jié)合的CD127表位的定義中，所使用的編號(hào)系統(tǒng)指 CD127的全長序列，其包括信號(hào)序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，人CD127的表位在所引用的SEQ ID NO: 1殘基內(nèi)發(fā)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白與人⑶127結(jié)合，其親和力(KD)小于 20nM、小于15nM、小于ΙΟηΜ、小于5nM、小于InM或小于0. 5nM，如通過表面等離振子共振 (BIAcore)測量的。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白競爭性抑制9B7、6C5、3A6、1A11或R34. 34 (Dendritics Inc. #DDX0700)或其抗原結(jié)合片段與人CD127的結(jié)合。競爭性抑制可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行測定，例如在競爭ELISA測定中，通過 BIAcore 或 Scatchard 分析。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了分離的結(jié)合蛋白，其與下述競爭結(jié)合CD127
i.抗體R34. 34 (Dendritics Inc.，#DDX0700)；
ii.具有如SEQID NO:2中所示可變重鏈區(qū)和SEQ ID NO:3中所示可變輕鏈區(qū)的抗
體；
iii.具有如SEQID NO:29中所示可變重鏈區(qū)和SEQ ID N0:30中所示可變輕鏈區(qū)的抗體；
iv.具有如SEQID N0:51中所示可變重鏈區(qū)和SEQ ID N0:52中所示可變輕鏈區(qū)的抗
體；
v.具有如SEQID N0:71中所示可變重鏈區(qū)和SEQ ID N0:72中所示可變輕鏈區(qū)的抗體；或
vi.具有如SEQID N0:90中所示可變重鏈區(qū)和SEQ ID N0:91中所示可變輕鏈區(qū)的抗
體，
其中所述抗體不是 R. 34. 34 (Dendritics Inc.，#DDX0700)。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的結(jié)合蛋白是抗體或其抗原結(jié)合片段，其與下述競爭結(jié)合⑶127
i.抗體R34. 34 (Dendritics Inc.，#DDX0700)；
ii.具有如SEQID NO: 51中所示可變重鏈區(qū)和SEQ ID NO: 52中所示可變輕鏈區(qū)的抗
體；
iii.具有如SEQID NO:71中所示可變重鏈區(qū)和SEQ ID NO:72中所示可變輕鏈區(qū)的抗體；或
iv.具有如SEQID NO:90中所示可變重鏈區(qū)和SEQ ID N0:91中所示可變輕鏈區(qū)的抗
體，
其中所述抗體不是 R. 34. 34 (Dendritics Inc.，#DDX0700)。本發(fā)明還提供的是用于在多發(fā)性硬化治療中使用的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白與下述競爭結(jié)合人CD127 (SEQ ID N0:1)
i.抗體R34. 34 (Dendritics Inc.，#DDX0700)；
ii.具有如SEQID N0:2中所示可變重鏈區(qū)和SEQ ID N0:3中所示可變輕鏈區(qū)的抗
體；
iii.具有如SEQID N0:29中所示可變重鏈區(qū)和SEQ ID N0:30中所示可變輕鏈區(qū)的抗體；
iv.具有如SEQID N0:51中所示可變重鏈區(qū)和SEQ ID N0:52中所示可變輕鏈區(qū)的抗
體；
v.具有如SEQID N0:71中所示可變重鏈區(qū)和SEQ ID N0:72中所示可變輕鏈區(qū)的抗體；或
vi.具有如SEQID N0:90中所示可變重鏈區(qū)和SEQ ID N0:91中所示可變輕鏈區(qū)的抗
體，
用于與⑶127結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到為了使抗體或片段(抗體或片段A)與抗體R34. 34、GR34、 6A3、1A11、6C5或9B7 (抗體B)競爭特異性結(jié)合位點(diǎn)(人⑶127的)，抗體A必須以足夠量存在，以在所述測定中具有作用。例如，抗體A和抗體B可以以等摩爾量存在。如果抗體A 是競爭抗體，那么抗體A的存在可以使抗體B在ELISA測定中與人CD127的結(jié)合減少超過 10 %、20 %、30 %、40 %或50 %。競爭抗體(抗體A)可以減少抗體B與板結(jié)合的人⑶127的結(jié)合，而非抗⑶127特異性對(duì)照則不這樣。在此種ELISA測定中，人⑶127可以與免疫測定板結(jié)合。在另一種測定系統(tǒng)中，表面等離振子共振可以用于測定抗體之間的競爭。能夠與抗體R34. 34或本發(fā)明的抗體競爭結(jié)合⑶127的分離的結(jié)合蛋白，具有SEQ ID N0:2 的 V1^P SEQ ID N0:3 的 Vl 的分離的結(jié)合蛋白，具有 SEQ ID NOIeWV1^nSEQ ID N0:77的Vl的分離的結(jié)合蛋白，或具有SEQ ID N0:193的Vh和SEQ ID N0:194的VL的分離的結(jié)合蛋白，可以用于治療MS和其他自身免疫性疾病。本發(fā)明的結(jié)合蛋白可以包含R34. 34、GR34、9B7、6A3、IAll或6C5的CDRs，或它們
可以包含其類似物。本發(fā)明還提供的是人源化抗體，其中R34. ;34、GR34、9B7、6A3、1A11或6C5 CDRs(或其類似物)嫁接到重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架內(nèi)。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供的是編碼本發(fā)明的結(jié)合蛋白的多核苷酸序列。特別地，提供了編碼抗體或其片段的多核苷酸序列，所述抗體或其片段包含9B7 (SEQ ID N0s:4-9)、6C5 (SEQ ID NOs31_36)、6A5 (SEQ ID NOs:53-58)、IAll (SEQ ID NOs:73-78) 或GR34 (SEQ ID NOs:92-97)中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或所有⑶Rs。在本發(fā)明的相關(guān)方面，提供的是用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的結(jié)合蛋白、抗體、抗原結(jié)合片段，其人源化、人或嵌合變體，和類似物可以用于多發(fā)性硬化的治療方法中，所述方法包含給有此需要的患者施用安全且有效劑量的本發(fā)明的結(jié)合蛋白。在本發(fā)明的這個(gè)方面，結(jié)合蛋白可以是抗體，其包含9B7 (SEQ ID N0s:4-9)、6C5 (SEQ ID NOs31_36)、6A5 (SEQ ID NOs:53-58)、IAll (SEQ ID NOs:73-78) 或GR34 (SEQ ID NOs:92-97)中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或所有CDRs。本發(fā)明的這個(gè)方面中還提供的是這樣的方法，其中需要治療的患者是復(fù)發(fā)/緩解型MS (RRMS)患者，其大約在復(fù)發(fā)期或在復(fù)發(fā)期內(nèi)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療自身免疫性或炎性疾病的方法，其包含給有此需要的受試者施用治療有效量的IL-7或IL-7R的拮抗劑和另外的治療劑。另外的治療劑可以選自免疫調(diào)諧劑例如干擾素β (IFNβ-Ia或IFN^ _lb)和乙酸格拉太咪爾，免疫抑制劑例如環(huán)磷酰胺、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、克拉屈濱、環(huán)孢菌素和米托蒽醌，其他免疫療法例如靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IVIg)、血漿置換和柳氮磺胺吡啶。另外的治療可以與由醫(yī)生開處方一樣的方式(劑量、時(shí)間控制、機(jī)制)施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，另外的治療劑可以與本發(fā)明的拮抗劑同時(shí)或順次或分開施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，另外的治療劑和拮抗劑這樣施用，從而使得其對(duì)患者的藥理學(xué)作用重疊；換言之，它們可以同時(shí)對(duì)患者發(fā)揮其生物學(xué)作用。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，IL-7/IL-7R拮抗劑是可溶性⑶127多肽?？扇苄?⑶127多肽可以包含與選自⑶127 (SEQ ID NO: 1)的胞外結(jié)構(gòu)域的多肽90%或更多等同的多肽，或包含SEQ IDN0:1的氨基酸21 - 219的多肽。在特定實(shí)施方案中，可溶性⑶127 包含其為SEQ ID NO: 1的氨基酸21-219的多肽。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可溶性⑶127多肽可以與非CD127部分融合。非CD127部分可以是與可溶性CD127多肽融合的異源肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，非CD127部分選自血清清蛋白、靶向蛋白質(zhì)、免疫球蛋白片段、報(bào)道蛋白質(zhì)或促進(jìn)純化的蛋白質(zhì)。在特定實(shí)施方案中，可溶性CD127多肽與免疫球蛋白的Fc區(qū)域融
I=I O附圖簡述


圖1 (A)顯示通過抗小鼠CD127抗體抑制IL-7介導(dǎo)的pSTAT5 ； 圖1 (B)顯示通過抗小鼠CD127抗體抑制TSLP介導(dǎo)的pSTAT5 ； 圖2顯示關(guān)于9B7的⑶127 ELISA結(jié)合曲線；
圖3 (A)顯示MAb 9B7 (實(shí)線)能夠識(shí)別在⑶127轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系表面上表達(dá)的 CD127。不相關(guān)的同種型對(duì)照抗體顯示為虛線；
圖3化)顯示抗體987 (實(shí)線)不能識(shí)別在模擬轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系中的⑶127 -不相關(guān)的同種型對(duì)照抗體顯示為虛線；
圖4展示通過純化的鼠抗⑶127 mAb 9B7抑制IL-7介導(dǎo)的pStat5發(fā)信號(hào)的例子； 圖5 (A)顯示MOG-EAE臨床得分通過大鼠抗鼠⑶127抗體SB/14得到改善； 圖5 (B)顯示通過SB/14抑制MOG肽誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖；
17圖5 (C)顯示通過SB/14抑制通過抗⑶127抗體的細(xì)胞因子生產(chǎn)； 圖5 (D)和5 (E)顯示抗mCD127抗體(SB/14)處理對(duì)輔助T細(xì)胞亞型的選擇性作用； 圖5 (F)顯示MOG-EAE臨床得分通過抗mCD127抗體(SB/14)處理得到改善； 圖6顯示先體外后體內(nèi)衍生自EAE小鼠脾或脊髓的TMg、THl和Th17細(xì)胞中的⑶127表
達(dá)；
圖7 (A)顯示與IL-6的那種相比較，IL-7對(duì)促進(jìn)TH17分化的作用是適度的； 圖7 (B)顯示STAT-3磷酸化的誘導(dǎo)在很大程度上由IL-6驅(qū)動(dòng)，不依賴于IL-7 ； 圖7 (C)顯示與IL-6的那種相比較，IL-7對(duì)RORα表達(dá)的作用也是適度的； 圖7 (D)顯示抗mCD127抗體(SB/14)處理的作用在EAE中的疾病開始過程中是適度
的；
圖8 (A)顯示在CNS中的TH17細(xì)胞、Y-干擾素分泌ThI細(xì)胞和TMg細(xì)胞的百分比； 圖8 (B)顯示在脾細(xì)胞中的Th17細(xì)胞、γ -干擾素分泌ThI細(xì)胞和TMg細(xì)胞的百分比； 圖8 (C)顯示在治療和對(duì)照小鼠中在EAE過程中的Th17、ThI和TMg的百分比； 圖9 (A)顯示當(dāng)在分化開始時(shí)添加⑶127抗體時(shí)，Th17和ThI細(xì)胞計(jì)數(shù)但不是Treg計(jì)數(shù)的抗⑶127抗體(SB/14)的作用被抑制；
圖9 (B)顯示如圖9 (A)的抗mCD127抗體(SB/14)對(duì)分化的TH17而不是ThI或TMg的作用；
圖10顯示當(dāng)培養(yǎng)第9天EAE MOG特異性T細(xì)胞時(shí)，IL-7的添加促進(jìn)TH17擴(kuò)張/存活， 和程度較少的ThI擴(kuò)張/存活，但不是TMg中的R)xp3 ；
圖11 (A)顯示先體外后體內(nèi)衍生自處理的或?qū)φ誆AE小鼠的⑶4+ T細(xì)胞的免疫印跡分析，顯示抗⑶127抗體處理改變與JAK-STAT有關(guān)的發(fā)信號(hào)途徑和凋亡，如通過磷酸化 JAK-I和磷酸化STAT-5的下調(diào)以及關(guān)鍵促凋亡分子BCL-2的水平顯著降低，和抗凋亡分子 BAX的活性增加表征的；
圖11 (B)顯示與衍生自處理的EAE小鼠的⑶4+⑶127- T細(xì)胞的那種相比較，抗⑶127 抗體處理增加在⑶4+⑶127+ T細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白-V+凋亡細(xì)胞的百分比；
圖11 (C)顯示衍生自EAE小鼠的分化的TH17細(xì)胞經(jīng)歷凋亡，這可以用IL-7拯救，但如果細(xì)胞與抗⑶127抗體預(yù)溫育，那么這個(gè)過程減慢；
圖11 (D)顯示IL-7的作用通過JAK/STAT-5途徑介導(dǎo)；
圖12顯示mAb 9B7和R34. 34對(duì)來自人總⑶4+細(xì)胞的TH17分化具有最低限度的抑制作用。 圖13顯示mAb 6C5抑制CD127-ECD與固定化IL-7的結(jié)合； 圖14顯示mAb 6C5與IL-7競爭結(jié)合CD127 ； 圖 15 顯示 mAb 6C5 和 Dendritics 抗體 R. 34. 34 競爭結(jié)合 CD127 ； 圖16 (A)顯示mAb 6A3抑制CD127-ECD與固定化IL-7的結(jié)合； 圖16 (B)是抗體6A3、6C5和R34.34在不同抗體濃度下的抑制比曲線，顯示這些抗體對(duì)CD127-ECD與IL-7結(jié)合的作用；
圖17顯示mAb 6A3與IL-7競爭結(jié)合在CHO細(xì)胞上表達(dá)的⑶127 ； 圖18顯示mAb 6C5和抗體R. 34. 34都抑制通過IL-7刺激的PBMCs的IFN γ生產(chǎn)； 圖19顯示抗體BD、R34. 34、IAll和6C5阻斷由IL-7刺激的PBMCs誘導(dǎo)的Stat5發(fā)信號(hào)的能力；
圖20顯示抗體BD、R34. 34、IAll和6C5阻斷由IL-7刺激的CCF-CEM細(xì)胞誘導(dǎo)的Mat5 發(fā)信號(hào)的能力；
圖21顯示mAb 6A3在Th17擴(kuò)張測定中抑制IL-17和IFN- γ生產(chǎn)的能力； 圖22顯示各種抗⑶127抗體對(duì)在IL-7刺激下通過h⑶4+細(xì)胞的IL-17生產(chǎn)的抑制作
用；
圖23顯示mAb 6A3對(duì)通過Th17細(xì)胞的IFN- γ生產(chǎn)和IL-17生產(chǎn)的抑制作用。發(fā)明詳述
本發(fā)明基于下述發(fā)現(xiàn)IL-7/IL-7R發(fā)信號(hào)對(duì)于小鼠和人系統(tǒng)中的定型ΤΗ17細(xì)胞存活和擴(kuò)張是決定性地需要的，而它在Τη17分化中的作用與IL-6的那種相比較不是必需的。令人驚訝的是，通過IL-7R拮抗作用對(duì)免疫系統(tǒng)的體內(nèi)作用在關(guān)于多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型EAE中是高度選擇性的，影響Τη17細(xì)胞和程度較少的占優(yōu)勢地具有記憶表型的ThI 細(xì)胞，并且不傷害TMg細(xì)胞。這種選擇性看起來在EAE中通過IL-7R拮抗作用重新平衡 (rebalancing)致病性TH17細(xì)胞和TMg細(xì)胞比中起重要作用，并且可歸因于治療功效。如上所述IL-7/IL-7R發(fā)信號(hào)在Th17細(xì)胞存活和擴(kuò)張中的新作用機(jī)制提供了關(guān)于IL-7R拮抗作用在EAE中的治療功效和關(guān)于人自身免疫性疾病例如MS的治療牽涉的有力解釋。IL-7 中和或IL-7R拮抗作用可能具有獨(dú)特的治療優(yōu)點(diǎn)。一方面，治療提供了區(qū)分致病性ThI和 Th17細(xì)胞與TMg和無關(guān)免疫細(xì)胞的選擇性。另一方面，與Th17分化相反，IL-7R拮抗作用的另外治療優(yōu)點(diǎn)涉及其對(duì)分化的Th17存活和擴(kuò)張的選擇性作用?？梢韵胂蠖ㄐ蚑h17與Th17 分化比較的靶向體內(nèi)維持在治療背景中更有效。IL-7受體介導(dǎo)的發(fā)信號(hào)的抑制因此提供了用于治療自身免疫性或炎性疾病的有希望的治療介入。如本文使用的，術(shù)語IL-7R介導(dǎo)的發(fā)信號(hào)意指當(dāng)由其配體IL-7結(jié)合時(shí)，由IL_7 受體復(fù)合物促成的生物學(xué)作用。IL-7R介導(dǎo)的發(fā)信號(hào)因此包括但不一定限于IL-7誘導(dǎo)的 STAT-5磷酸化、IL-7誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞擴(kuò)張和IL-7誘導(dǎo)的TH17細(xì)胞存活中的一種或多種或全部。拮抗劑
如本文使用的，IL-7途徑拮抗劑是可通過測定測量的，功能上阻斷IL-7的生物學(xué)作用的任何實(shí)體。在分子水平下，人們可以通過測定例如IL-7誘導(dǎo)的P-STAT5或Bcl-2觀察且測量阻斷作用。示例性P-STAT5測定在本文中得到描述。在細(xì)胞水平下，人們可以通過測定例如IL-17或IFNy的Thl7分泌觀察且測量阻斷作用。示例性測定也在本文中得到描述。在本發(fā)明中有用的IL-7/IL-7R途徑拮抗劑能夠部分或完全抑制由IL-7誘導(dǎo)的 STAT-5磷酸化。STAT-5磷酸化可以通過本領(lǐng)域中的常規(guī)方法進(jìn)行測定，例如在測定例如本文描述的那種中(實(shí)施例2. 3)。在此種測定中，在測試試劑的存在和不存在下，用IL-7刺激 PBMCs0細(xì)胞隨后就pSTAT-5水平進(jìn)行定量評(píng)估，例如通過就pSTAT_5染色(例如用標(biāo)記的抗pSTAT-5抗體)，隨后為熒光激活細(xì)胞分選術(shù)。磷酸化STAT-5水平也可以通過ELISA進(jìn)行測定。減少磷酸化STAT-5水平的那些試劑可以是用于自身免疫性疾病的潛在治療候選物。
當(dāng)與在不存在拮抗劑的情況下的STAT-5水平相比較時(shí)，或當(dāng)與陰性對(duì)照或未處理的細(xì)胞相比較時(shí)，拮抗劑可能能夠使磷酸化STAT-5水平減少至少20^^50^^75%, 80%、85%、90%、95%或 100%。拮抗劑可以具有 50 μ g/ml、25 μ g/ml 或更少、10μ g/ml 或更少、5μ g/ml或更少或2 μ g/ml或更少的IC5(1。在一個(gè)實(shí)施方案中，拮抗劑具有小于或等于1 μ g/ml、小于或等于0. 75 μ g/ml、小于或等于0. 5 μ g/ml、小于或等于0. 25 μ g/ml或小于或等于0. 1 μ g/ml的IC500本發(fā)明的拮抗劑在抑制Th17細(xì)胞擴(kuò)張中特別有效。Th17細(xì)胞擴(kuò)張可以在TH17擴(kuò)張測定中進(jìn)行測定，其包含刺激幼稚T細(xì)胞群體，以在測試試劑的存在或不存在下擴(kuò)張， 隨后刺激細(xì)胞以生產(chǎn)IL-17，并且評(píng)估在測試試劑的存在和不存在下通過這些細(xì)胞生產(chǎn)的 IL-17水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，與陰性對(duì)照比較，在此種測定中拮抗劑能夠20%或更多抑制 IL-17分泌。更一般地，與對(duì)照比較，拮抗劑能夠50%、75%、85%或90%或更多抑制IL-17 分泌。在一些實(shí)施方案中，在測定中拮抗劑可以顯示小于或等于50μ g/ml的IC5(I。在其他實(shí)施方案中，IC5tl可以小于或等于20μ g/ml、10μ g/ml或5μ g/ml。在這個(gè)測定的實(shí)施方案中，在IL-1、IL-6和IL-23的存在下，通過用T細(xì)胞受體激活刺激，人⑶4+ T細(xì)胞分化成Th17。在分化5天后，CCR6+細(xì)胞進(jìn)行分選，以產(chǎn)生富集的 TH17群體。這個(gè)群體隨后用人11^-7刺激，并且測定上清液中11^17和0^-￥中的增加。 在溫育時(shí)間段中通過功能IL-7/IL-7R途徑拮抗劑(例如抗⑶127抗體)阻斷IL-7和⑶127 之間的相互作用應(yīng)阻止Th17細(xì)胞擴(kuò)張，從而導(dǎo)致IL-17和IFN- γ生產(chǎn)減少。在這個(gè)實(shí)施方案中，使用商業(yè)試劑盒(例如CD4+ T Cell Isolation Kit II, # 130-091-155,Miltenyi Biotec)，可以從人外周血單核細(xì)胞分離CD4+ T細(xì)胞。CD4+ T細(xì)胞隨后一般以1. 5xlOE6/ml的濃度重懸浮于具有10% FCS的RPMI培養(yǎng)基中。細(xì)胞與對(duì)照或抗IL-7RY抗體一起預(yù)溫育，一般30分鐘。細(xì)胞隨后連同或不連同10 ng/ml IL-7—起在 37 C培養(yǎng)72小時(shí)。在溫育結(jié)束時(shí)，細(xì)胞用50ng/ml PMA和lug/ml離子霉素刺激5小時(shí)。 隨后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并且通過ELISA (eBiosciences)測定IL-17濃度。結(jié)合蛋白
本發(fā)明的分離的結(jié)合蛋白可以為抗體或免疫球蛋白的形式，例如完整抗體，人、人源化或嵌合抗體或所述抗體的片段或結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的這些抗體可以包含9B7 (SEQ ID N0s:4-9)、6C5 (SEQ ID NOs31_36)、6A5 (SEQ ID NOs:53-58)、IAll (SEQ ID NOs:73-78) 或GR34 (SEQ ID NOs:92-97)中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)或所有CDRs。在這個(gè)背景中的“結(jié)合”基本上意指結(jié)合蛋白例如抗體經(jīng)由抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與 ⑶127 (的表位)結(jié)合，并且結(jié)合需要抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和⑶127 (的表位)之間的一些互補(bǔ)性。 結(jié)合蛋白因此比其與隨機(jī)無關(guān)多肽或隨機(jī)無關(guān)表位結(jié)合更容易與CD127或CD127的表位結(jié)合。換言之，在結(jié)合蛋白和CD127 (的表位)之間存在特異性。本發(fā)明的結(jié)合蛋白還可以為可溶性⑶127多肽的形式。本發(fā)明的結(jié)合蛋白可以與CD127結(jié)合，例如與CD127特異性結(jié)合的單克隆抗體。結(jié)合蛋白還可以是用于治療多發(fā)性硬化的，減少TSLP與TSLP受體結(jié)合，并且還減少IL-7與 IL-7受體結(jié)合的實(shí)體，例如與IL-7和TSLP配體結(jié)合的雙特異性結(jié)合蛋白，或?qū)a(chǎn)生這種作用的IL-7R和TSLPR元件，或配體和受體的組合。在這點(diǎn)上，TSLP拮抗劑在例如US7304144
20和TO2007096149中得到描述，并且如上所述，TSLP受體包含CD127。本發(fā)明的拮抗劑因此可以用作TSLP的拮抗劑。分離的
如它在本文中使用的，術(shù)語“分離的”意指結(jié)合蛋白從其中它們可能在自然界中發(fā)現(xiàn)的環(huán)境中取出，例如，它們可以純化掉它們在自然界中通常將與之一起存在的物質(zhì)。這些結(jié)合蛋白可以是基本上純的，因?yàn)闃悠分械牡鞍踪|(zhì)塊將由至少50%或至少80%結(jié)合蛋白構(gòu)成。競爭
結(jié)合蛋白被說成競爭性抑制參考結(jié)合蛋白與CD127、與CD127的片段或與在CD127 內(nèi)的表位的結(jié)合，如果它優(yōu)先與那個(gè)表位結(jié)合，從而其在一定程度上阻斷參考結(jié)合蛋白與⑶127、或與⑶127的那個(gè)片段或在⑶127內(nèi)的表位的結(jié)合的話。競爭性抑制可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行測定，例如競爭ELISA測定、表面等離振子共振(BIAcore)或 katchard分析。結(jié)合蛋白可以被說成競爭性抑制參考結(jié)合蛋白與給定表位的結(jié)合，如果參考抗體的結(jié)合減少至少90%、至少80%、至少70%、至少60%或至少50%的話。完整抗體
本發(fā)明的結(jié)合蛋白可以是“完整抗體”。完整抗體通常是包含至少2條重鏈和2條輕鏈的異源多體糖蛋白。除IgM外，完整抗體是約150KDa的異源四聚糖蛋白，由2條等同輕 (L)鏈和2條等同重(H)鏈組成。一般地，每條輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈連接，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間的二硫鍵數(shù)目不同。每條重和輕鏈也具有鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在一個(gè)末端上具有可變結(jié)構(gòu)域(VH)，隨后為許多恒定區(qū)。每條輕鏈具有可變結(jié)構(gòu)域 (Vl)和在其另一個(gè)末端上的恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)匹配，并且輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域與重鏈的可變結(jié)構(gòu)域匹配?；诤愣▍^(qū)的氨基酸序列，來自大多數(shù)脊椎動(dòng)物物種的抗體的輕鏈可以分配到稱為κ和λ的2個(gè)類型之一。依賴于其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，人抗體可以分配到5個(gè)不同類別，IgA, IgD, IgE, IgG和IgM0 IgG和IgA可以進(jìn)一步再分成亞類IgGl、IgG2、IgG3和IgG4 ；以及IgAl和IgA2。對(duì)于小鼠和大鼠存在具有至少IgG2a、IgG2b的物種變體?？贵w的可變結(jié)構(gòu)域?qū)贵w賦予結(jié)合特異性，其中展示特定變異性的特定區(qū)域被稱為互補(bǔ)性決定區(qū)(CDRs)。可變區(qū)的更保守部分被稱為構(gòu)架區(qū)(FR)。完整重和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各自包含由3個(gè)⑶Rs連接的4個(gè)FR。每條鏈中的⑶Rs通過FR 區(qū)緊密接近地保持在一起，并且與來自其他鏈的CDRs —起促成抗體的抗原結(jié)合部位的形成。恒定區(qū)不直接和抗體與抗原的結(jié)合有關(guān)，但顯示出各種效應(yīng)子功能，例如參與依賴抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)、經(jīng)由與Fc γ受體結(jié)合的吞噬作用、經(jīng)由新生Fc受體(FcRn)的半衰期/ 清除率和經(jīng)由補(bǔ)體級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的Clq組分的依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性。已報(bào)道人IgG2恒定區(qū)基本上缺乏通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體，或介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用的能力。已報(bào)道IgG4恒定區(qū)缺乏通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體的能力，并且其僅弱地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用?；旧先狈@些效應(yīng)子功能的抗體可以被稱為‘非裂解’抗體。人抗體
本發(fā)明的結(jié)合蛋白可以是“人抗體”。人抗體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法進(jìn)行生產(chǎn)。人抗體可以通過雜交瘤方法進(jìn)行制備，其中使用人骨髓瘤或小鼠-人異源骨髓瘤(heteromyeloma)細(xì)胞系，參見 Kozbor J. Immunol 133,3001, (1984)禾口 Brodeur， Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp51_63 (MarcelDekker Inc, 1987).可替代方法包括使用噬菌體文庫或轉(zhuǎn)基因小鼠，這兩者都利用人V區(qū) if (repertories) (# JAL Winter G, (1994), Annu. Rev. Immunol 12, 433-455, Green LL (1999)，J. Immunol, methods 231,11-23)。幾個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠品系目前是可獲得的，其中它們的小鼠免疫球蛋白基因座已由人免疫球蛋白基因區(qū)段置換(參見Tomizuka K, (2000) PNAS 97, 722-727 ；Fishwild D. M (1996) Nature Biotechnol. 14, 845-851, Mendez MJ,1997, Nature Genetics, 15，146-156)。在抗原攻擊后，此種小鼠能夠生產(chǎn)人抗體譜，從其中可以選擇目的抗體。噬菌體展示技術(shù)可以用于生產(chǎn)人抗體(及其片段)，參見McCafferty ；Nature, 348, 552-553 (1990)和 Griffiths AD 等人(1994) EMBO 13:3245-3260。嵌合和人源化抗體
本發(fā)明的結(jié)合蛋白可以是“嵌合”或“人源化”抗體。完整非人抗體在治療人疾病或病癥中的使用伴有目前充分確定的潛在免疫原性問題，尤其是在抗體反復(fù)施用后即患者的免疫系統(tǒng)可能將非人完整抗體識(shí)別為非自身的且發(fā)動(dòng)中和應(yīng)答。除開發(fā)全人抗體(參見上文)外，在多年期間已開發(fā)了各種技術(shù)以克服這些問題，且一般涉及減少完整治療用抗體中的非人氨基酸序列組成，同時(shí)保留從免疫接種的動(dòng)物例如小鼠、大鼠或兔中獲得非人抗體的相對(duì)容易性。廣泛而言，2種方法已用于達(dá)到這點(diǎn)。第一種是嵌合抗體，其一般包含與人恒定區(qū)融合的非人(例如嚙齒類動(dòng)物，例如小鼠)可變結(jié)構(gòu)域。因?yàn)榭贵w的抗原結(jié)合部位位于可變區(qū)內(nèi)，所以嵌合抗體保留其對(duì)于抗原的結(jié)合親和力，但獲得人恒定區(qū)的效應(yīng)子功能并且因此能夠執(zhí)行效應(yīng)子功能。嵌合抗體一般使用重組DNA方法進(jìn)行生產(chǎn)。使用常規(guī)程序分離且測序編碼抗體的DNA (例如cDNA)(例如通過使用能夠與編碼本發(fā)明抗體的H和L鏈可變區(qū)的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針，例如上文描述的SEQ ID N0:2和3的DNA)。可以通過用關(guān)于人L和H鏈的編碼序列置換相應(yīng)非人(例如鼠)H和L恒定區(qū)來修飾DNA，參見例如Morrison ；PNAS 81,6851 (1984)。因此，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供的是與人恒定區(qū)(其可以是IgG同種型例如IgGl的)融合的，包含具有序列SEQ ID NO: 2的Vh結(jié)構(gòu)域和具有序列SEQ ID NO:3的八結(jié)構(gòu)域的嵌合抗體。第二種方法涉及人源化抗體的生成，其中通過使可變區(qū)人源化減少抗體的非人含量。用于人源化的2種技術(shù)已獲得普及。第一種是通過⑶R嫁接人源化。⑶Rs構(gòu)建接近于抗體的N末端的環(huán)，在那里它們形成在由構(gòu)架區(qū)提供的支架中固定的表面?？贵w的抗原結(jié)合特異性主要由拓?fù)鋱D及其⑶R表面的化學(xué)特征限定。這些特征又由個(gè)別⑶Rs的構(gòu)象、 CDRs的相對(duì)排列、以及構(gòu)成CDRs的殘基側(cè)鏈的性質(zhì)和排列決定。免疫原性中的大降低可以通過僅將非人(例如鼠)抗體(“供體”抗體)的CDRs嫁接到合適的人構(gòu)架(“受體構(gòu)架”)和恒定區(qū)上來達(dá)到(參見 Jones 等人(1986)Nature 321，522-525 和 Verhoeyen M 等人(1988) Science 239，1534-1536)。然而，⑶R嫁接本身不導(dǎo)致抗原結(jié)合性質(zhì)的完全保留，并且通常發(fā)現(xiàn)供體抗體的一些構(gòu)架殘基需要在人源化分子中保存(有時(shí)被稱為“回復(fù)突變”)，如果待恢復(fù)顯著的抗原結(jié)合親和力的話(參見Queen C等人(1989) PNAS 86，10，029-10，033，Co， M等人(199DNature 351，501-502)。在這種情況下，可以從數(shù)據(jù)庫中選擇與非人供體抗體顯示最大序列同源性(一般60%或更大)的人V區(qū)，以提供人構(gòu)架(FR)。人FRs的選擇可以從人共有序列或個(gè)別人抗體中進(jìn)行。需要時(shí)，將來自供體抗體的關(guān)鍵殘基置換到人受體構(gòu)架內(nèi)，以保存CDR構(gòu)象?？贵w的計(jì)算機(jī)建?？梢杂糜趲椭b定此種結(jié)構(gòu)上重要的殘基，參見CN 102177179 A
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W099/48523?？商娲?，人源化可以通過“鑲面(veneering)”的過程達(dá)到。獨(dú)特人和鼠免疫球蛋白重和輕鏈可變區(qū)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析揭示暴露的殘基的精確模式在人和鼠抗體中是不同的， 并且大多數(shù)個(gè)別表面位置對(duì)于少數(shù)不同殘基具有強(qiáng)偏愛(參見Indian Ε. Α.等人；(1991) Mol. Immunol. 28,489-498 和 Pedersen J. Τ.等 Λ (1994) J. Mol. Biol. 235 ;959_973)。 因此，通過置換在其構(gòu)架區(qū)中不同于人抗體中通常發(fā)現(xiàn)的那些的暴露的殘基，可能減少非人Fv的免疫原性。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)抗原性可以與表面可接近性相關(guān)，所以表面殘基的置換可能足以致使小鼠可變區(qū)對(duì)于人免疫系統(tǒng)“不可見”(還參見Mark G.E.等人(1994) in Handbook of Experimental Pharmacology vol. 113 .-The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag，第105_134頁)。這個(gè)人源化程序被稱為“鑲面”，因?yàn)閮H改變抗體的表面，而支持殘基保持原狀。進(jìn)一步的可替代方法包括W004/006955中所示的那種和Humaneering (Kalobios)程序，其利用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)且產(chǎn)生在序列中接近于人禾中系的抗體(Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics January 2007，San Diego, California)0對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見的是術(shù)語“衍生的”不僅意欲定義在關(guān)于材料的物理起源意義上的來源，還意欲定義在結(jié)構(gòu)上等同于材料但不源于參考來源的材料。因此， “在供體抗體中發(fā)現(xiàn)的殘基”不一定已從供體抗體中純化。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是包含小鼠抗體9B7 (SEQ ID NOs :4_9)中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)或所有CDRs的人源化抗體。多特異性或雙特異性抗體
本發(fā)明的結(jié)合蛋白可以是“多特異性”或“雙特異性”抗體。多特異性或雙特異性抗體是阻止或減少IL-7和TSLP與其受體結(jié)合的抗體衍生物，所述抗體對(duì)于選自IL-7、TSLP, ⑶127、IL7Ry鏈或CRLF2的至少2種蛋白質(zhì)具有結(jié)合特異性，也構(gòu)成本發(fā)明的部分。本發(fā)明的結(jié)合蛋白還可以對(duì)于在Th17細(xì)胞的細(xì)胞表面上表達(dá)的IL-23具有結(jié)合特異性，例如所述結(jié)合蛋白可以對(duì)于IL-23R (或IL-23)和CD127或IL-2R (或IL-23)和IL-7具有特異性。制備此種抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組生產(chǎn)基于2 個(gè)免疫球蛋白H鏈-L鏈對(duì)的共表達(dá)，其中2條H鏈具有不同結(jié)合特異性，參見Millstein 等人，Nature 305 537-539 (1983)， W093/08829 和 Traunecker 等人 ΕΜΒ0，10，1991， 3655-3659。因?yàn)镠和L鏈的隨機(jī)分配，所以生產(chǎn)了 10種不同抗體結(jié)構(gòu)的潛在混合物，其中僅1種具有所需結(jié)合特異性?？商娲椒ㄉ婕笆咕哂兴杞Y(jié)合特異性的可變結(jié)構(gòu)域與包含鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)的至少部分的重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選具有在融合物的至少一個(gè)中存在的含有對(duì)于輕鏈結(jié)合所需位點(diǎn)的CHl區(qū)。將編碼這些融合物的DNA和需要時(shí)的L鏈插入分開的表達(dá)載體內(nèi)，并且隨后共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物內(nèi)。于是可能將關(guān)于2條或所有3條鏈的編碼序列插入1個(gè)表達(dá)載體內(nèi)。在一種優(yōu)選方法中，雙特異性抗體由在一個(gè)臂中具有第一種結(jié)合特異性的H鏈和H-L鏈對(duì)組成，從而在另一個(gè)臂中提供第二種結(jié)合特異性，參見 W094/04690。還參見 Suresh 等人 Methods in Enzymology 121，210，1986。一種潛在方法是產(chǎn)生雙特異性抗體或雙特異性片段，例如上文所述的，其中第一種特異性針對(duì)IL-7的表位，并且第二種特異性針對(duì)TSLP。另一種潛在方法是產(chǎn)生雙特異性
23抗體或雙特異性片段，例如上文所述的，其中第一種特異性針對(duì)IL-7的表位，并且第二種特異性針對(duì)IL-6。抗體片段
本發(fā)明的結(jié)合蛋白可以是“抗體片段”。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，提供的是其為抗原結(jié)合片段的治療用抗體。此種片段可以是完整和/或人源化和/或嵌合抗體的功能性抗原結(jié)合片段，例如上文描述的抗體的Fab、Fd、Fab’、F (ab’)2、FvjCFv片段。片段還可以是人、駱駝科成員(camellid)或鯊魚或其他物種，單可變結(jié)構(gòu)域抗體或包含其的較大構(gòu)建體。 缺乏恒定區(qū)的片段缺乏通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體或介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用的能力。傳統(tǒng)上，此種片段通過完整抗體的蛋白酶解消化產(chǎn)生，通過例如木瓜蛋白酶消化(參見例如，WO 94/29348)，但可以由重組轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞直接生產(chǎn)。關(guān)于kFv的生產(chǎn)，參見Bird等人； (1988)Science, 242,423-426.此外，抗體片段可以使用如下所述的多種工程改造技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。Fv片段看起來具有比Fab片段更低的其2條鏈的相互作用能量。為了穩(wěn)定Vh和 Vl結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，它們已用肽(Bird等人，(1988) Science 242,423-426, Huston等人， PNAS, 85，5879-5883)、二硫鍵(Glockshuber 等人，(1990) Biochemistry, 29，1362-1367) 和“結(jié)進(jìn)孔(knob in hole)” 突變(Zhu 等人(1997)，Protein Sci.，6，781-788)進(jìn)行連接。 ^Fv片段可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法進(jìn)行生產(chǎn)，參見Whitlow等人(1991) Methods companion Methods Enzymol, 2,97-105 禾口 Huston 等人(1993) Int. Rev. Immunol 10,195-217。kFv可以在細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌(五cWi)中進(jìn)行生產(chǎn)，但更一般在真核細(xì)胞中進(jìn)行生產(chǎn)。^Fv的一個(gè)缺點(diǎn)是產(chǎn)物的單價(jià)性，這排除了由于多價(jià)結(jié)合增加的抗體親抗原性(avidity)，及其短半衰期?？朔@些問題的嘗試包括通過化學(xué)偶聯(lián)(Adams等人(1993) Can. Res 53，4026-4034 和 McCartney 等人(1995) Protein Eng. 8，301-314)或通過含有未配對(duì)C末端半胱氨酸殘基的kFv自發(fā)位點(diǎn)特異性二聚化(參見Kipriyanov等人(1995)Cell. Biophys 26，187-204)由含有另外C末端半胱氨酸的&FV產(chǎn)生的二價(jià) (ScFv')2?？商娲?，通過使肽接頭縮短至3 - 12個(gè)殘基，可以迫使kFv形成多聚體， 以形成“雙抗體”，參見Holliger等人PNAS (1993)，90，6444-6448。減少接頭仍可以進(jìn)一步導(dǎo)致&FV三聚體(“三鏈抗體(triabodies)”，參見Kortt等人(1997) Protein Eng, 10,423-433)和四聚體(“四抗體(tetrabodies)”，參見 Le Gall 等人(1999) FEBS Lett, 453,164-168)。二價(jià)&FV分子的構(gòu)建還可以通過基因融合用蛋白質(zhì)二聚化基序達(dá)到，以形成“微型抗體(miniantibodies)”(參見 Pack 等人(1992) Biochemistry 31，1579-1584) 和 “minibodies”(參見 Hu 等人(1996)，Cancer Res. 56，3055-3061 )。ScFv-Sc-Fv φ 聯(lián)(GcFV) 2)還可以通過經(jīng)由三肽接頭使2個(gè)kFv單位連接進(jìn)行生產(chǎn)，參見Kurucz等人 (1995) J. Immol. 154，4576-4582。雙特異性抗體可以通過2個(gè)單鏈融合產(chǎn)物的非共價(jià)結(jié)合進(jìn)行生產(chǎn)，所述單鏈融合產(chǎn)物由通過短接頭與另一種抗體的\結(jié)構(gòu)域連接的來自一種抗體的Vh結(jié)構(gòu)域組成，參見Kipriyanov等人(1998)，Int. J. Can 77，763-772。此種雙特異性抗體的穩(wěn)定性可以通過如上所述引入二硫鍵或“結(jié)進(jìn)孔(knob in hole)”突變或通過形成單鏈雙抗體(ScDb)得到增強(qiáng)，在所述kDb中2個(gè)雜種kFv片段通過肽接頭進(jìn)行連接，參見 Kontermann等人(1999)J. Immunol. Methods 226 179-188。四價(jià)雙特異性分子可通過例如使^Fv片段與IgG分子的CH3結(jié)構(gòu)域或通過鉸鏈區(qū)與Fab片段融合獲得，參見Coloma等人(1997) Nature Biotechnol. 15，159-163?？商娲?，四價(jià)雙特異性分子已通過雙特異性單鏈雙抗體的融合進(jìn)行制備(參見Alt等人，(1999) FEBS Lett 454，90_94。較小的四價(jià)雙特異性分子還可以通過下述形成ScFV-kFV串聯(lián)用含有螺旋-環(huán)-螺旋基序的接頭二聚化(DiBi微型抗體，參見Muller等人(1998) FEBS Lett 432，45-49)，或以阻止分子內(nèi)配對(duì)方向包含4個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域(V1^P 的單鏈分子(串聯(lián)雙抗體，參見Kipriyanov等人，(1999) J. Mol. Biol. 293，41_56)。雙特異性F (ab，)2片段可以通過Fab，片段的化學(xué)偶聯(lián)或經(jīng)由亮氨酸拉鏈的異源二聚化進(jìn)行制備(參見Sialaby等人，(1992)J. Exp. Med. 175,217-225 和 Kostelny 等人(1992)，J. Immunol. 148,1547-1553)。還可獲得的是分離的 Vh 和 Vl 結(jié)構(gòu)域，參見 US 6，248，516 ；US 6，291，158 ；US 6，172，197。其他修飾
本發(fā)明的結(jié)合蛋白可以包含其他修飾，以增強(qiáng)或改變其效應(yīng)子功能?？贵w的Fc區(qū)和各種Fc受體(Fe YR)之間的相互作用被認(rèn)為介導(dǎo)抗體的效應(yīng)子功能，這包括抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)、補(bǔ)體固定、吞噬作用和抗體的半衰期/清除率。依賴于所需效應(yīng)子性質(zhì)， 可以執(zhí)行本發(fā)明抗體的Fc區(qū)的各種修飾。特別地，基本上缺乏a)通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體； 和b)介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用功能的人恒定區(qū)，包括含有特異性突變的IgG4恒定區(qū)、 IgG2恒定區(qū)和IgGl恒定區(qū)，所述特異性突變?nèi)缋缭贓P0307434 (W08807089)、EP 0629 240 (W09317105)和 WO 2004/014953 中公開的在位置 234、235、236、237、297、318、320 和 /或322上的突變。在重鏈恒定區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的殘基235或237上的突變(Kabat編號(hào)；EU Index系統(tǒng))已分別得到描述，以減少與Fc γ RI、Fc γ RII和Fc γ RIII的結(jié)合，并且因此減少抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC) (Duncan等人.Nature 1988,332 ；563-564 ；Lund 等人.J. Immunol. 1991,147 ；2657-2662 ；Chappel 等人.PNAS 1991,88 ；9036-9040 ； Burton 禾口 Woof，Adv. Immunol. 1992,51 ；1-84；Morgan φ A, Immunology 1995,86 ； 319-324 ;Hezareh 等人，J. Virol. 2001,75 (24) ;12161_12168)。進(jìn)一步地，一些報(bào)道還已描述了這些殘基中的一些在召募或介導(dǎo)依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(⑶C)中的牽涉(Morgan等人，1995 ;Xu 等人，Cell. Immunol. 2000 ;200 16-26 ;Hezareh 等人，J. Virol. 2001,75 (24);12161-12168)。殘基2；35和237因此已突變?yōu)楸彼釟埢?Brett等人.Immunology 1997,91 ；346-353 ；Bartholomew 等人.Immunology 1995,85 ；41-48 ；和 W09958679)，以減少補(bǔ)體介導(dǎo)的和FcyR介導(dǎo)的作用。包含這些恒定區(qū)的抗體可以命名為‘非裂解’抗體。人們可以將補(bǔ)救受體結(jié)合表位并入抗體內(nèi)以增加血清半衰期，參見US 5，739，277。人Fcγ 受體包括Fc YR(I)、Fc YRIIa、Fc YRIIb、Fc 丫1 1113和新生？^ 11。511丨61(18 等人，(2001)J. Biol. Chem 276，6591-6604證實(shí)IgGl殘基的共同組與結(jié)合所有Fc γ Rs有關(guān)，而Fc γ RII和Fc γ RIII利用這個(gè)共同組外的不同位點(diǎn)。一組IgGl殘基當(dāng)改變?yōu)楸彼釙r(shí)減少與所有Fc γ Rs的結(jié)合Pro-238、Asp-265、Asp-270、Asn-297和Pro-239。它們?nèi)吭?IgG CH2結(jié)構(gòu)域中，并且群集在連接CHl和CH2的鉸鏈附近。雖然Fc y RI僅利用IgGl殘基的共同組用于結(jié)合，但Fc γ RII和Fc γ RIII與除共同組外的不同殘基相互作用。一些殘基的改變僅減少與Fc γ RII (例如Argj92)或Fc γ RIII (例如Glu493)的結(jié)合。一些變體顯示與Fc y RII或Fc y RIII改善的結(jié)合，但不影響與其他受體的結(jié)合(例如krj67Ala改善與Fc γ RII的結(jié)合，但與Fc γ RIII的結(jié)合不受影響)。其他變體顯示與Fc γ RII或Fc γ RIII改善的結(jié)合，伴隨與其他受體的結(jié)合中的減少(例如krj98Ala改善與Fc γ RIII的結(jié)合， 且減少與Fc γ RII的結(jié)合)。對(duì)于？(^1 111&，最佳結(jié)合1861變體具有在^51-四8、6111-333 和Lys-334上的組合丙氨酸取代。新生Fcfoi受體被認(rèn)為與保護(hù)IgG分子不受降解，并且從而增強(qiáng)血清半衰期和跨組織的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用有關(guān)(參見Jimghans R. P (1997)Immunol. Res 16.四-57 和 Ghetie 等人(2000) Annu. Rev. Immunol. 18，739_766)。測定與人 FcRn 直接相互作用的人 IgGl 殘基包括 Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln31U Asn434 和 His435。本發(fā)明的治療用抗體可以并入上述恒定區(qū)修飾中的任何一種。在特定實(shí)施方案中，治療用抗體基本上缺乏下述功能a)通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體； 和b)介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用。在更特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有上文詳述的任何一種(或多種)殘基改變的治療用抗體，以修飾半衰期/清除率和/或效應(yīng)子功能例如 ADCC和/或依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性和/或補(bǔ)體裂解。在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，治療用抗體具有在位置235 (例如L235A)和237 (例如 G237A)上(編號(hào)根據(jù)Kabat中概述的EU方案)含丙氨酸(或其他破壞)取代的同種型人IgG 的恒定區(qū)。本發(fā)明的其他衍生物包括本發(fā)明抗體的糖基化變體。抗體在其恒定區(qū)中在保守位置上的糖基化已知對(duì)抗體功能特別是效應(yīng)子功能具有深刻作用，例如上文描述的那些，參見例如，Boyd等人(1996)，Mol. Immunol. 32，1311-1318。預(yù)期了本發(fā)明的治療用抗體的糖基化變體，其中添加、取代、缺失或修飾一個(gè)或多個(gè)碳水化合物部分。類似物
在本發(fā)明的背景中，還提供的是所述抗體的類似物。因此，本發(fā)明提供了 R34. 34、GR34、 9B7、6A3、1A11或6C5 CDRs的類似物(R34. 34類似物、GR34類似物、9B7類似物、6A3類似物、IAll類似物或6C5類似物)。親本抗體(例如6A3或9B7)的類似物將分別具有與含有親本抗體CDRs的那些相同或相似的功能性質(zhì)，因?yàn)?B7類似物抗體或6A3類似物抗體以相同或相似結(jié)合親和力與相同靶蛋白或表位結(jié)合。類似物可以包含在其CDRs各自或所有內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，并且在一個(gè)實(shí)施方案中，親本抗體CDRs中的至少75%或80%氨基酸殘基未改變，在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少90%的CDRs未改變，并且在另一個(gè)實(shí)施方案中， ⑶Rs中的至少95%氨基酸殘基未改變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，親本抗體的⑶R H3整體未改變，而其他CDRs可以與相應(yīng)親本抗體CDRs相同或可以是其類似物。生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的結(jié)合蛋白可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行生產(chǎn)。本發(fā)明的抗體可以在轉(zhuǎn)基因生物中進(jìn)行生產(chǎn)，所述轉(zhuǎn)基因生物例如山羊(參見Pollock等人(1999)， J. Immunol. Methods 231:147-157)、雞(參 B Morrow KJJ (2000) Genet. Eng. News 20:1-55)、小鼠(參見 Pollock 等人同上)或植物(參見 Doran PM, (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11，199-204，Ma JK-C (1998)，Nat. Med. 4 ；601-606, Baez J 等人，BioPharm (2000) 13 :50-54, Stoger E 等人；(2000) Plant Mol. Biol. 42:583-590)?？贵w還可以通過化學(xué)合成進(jìn)行生產(chǎn)。然而，本發(fā)明的抗體一般使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的重組細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。分離編碼抗體的多核苷酸且插入可復(fù)制載體例如質(zhì)粒內(nèi)，用于在宿主細(xì)胞中進(jìn)一步繁殖或表達(dá)。一種有用的表達(dá)系統(tǒng)是谷氨酸合成酶系統(tǒng)(例如由Lonza Biologies銷售的)，特別是其中宿主細(xì)胞是CHO或NSO(參見下文)。使用常規(guī)程序(例如寡
26核苷酸探針)容易地分離且測序編碼抗體的多核苷酸?？梢允褂玫妮d體包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、微型染色體，其中質(zhì)粒是一般實(shí)施方案。一般地，此種載體進(jìn)一步包括與輕和 /或重鏈多核苷酸可操作地連接的信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種標(biāo)記基因、增強(qiáng)子元件、 啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列，以促進(jìn)表達(dá)。編碼輕和重鏈的多核苷酸可以插入分開載體內(nèi)，且同時(shí)或順次引入(例如通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔或轉(zhuǎn)導(dǎo))相同宿主細(xì)胞內(nèi)，或若需要?jiǎng)t在此種引入前，重鏈和輕鏈都可以插入相同載體內(nèi)。信號(hào)序列
本發(fā)明的抗體可以作為具有異源信號(hào)序列的融合蛋白進(jìn)行生產(chǎn)，所述融合蛋白具有在成熟蛋白質(zhì)N末端上的特異性切割位點(diǎn)。信號(hào)序列應(yīng)由宿主細(xì)胞識(shí)別且加工。對(duì)于原核宿主細(xì)胞，信號(hào)序列可以是堿性磷酸酶、青霉素酶或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)區(qū)。對(duì)于酵母分泌，信號(hào)序列可以是酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)區(qū)、α因子前導(dǎo)區(qū)或酸性磷酸酶前導(dǎo)區(qū)，參見例如 W090/13646。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中，病毒分泌前導(dǎo)區(qū)例如單純皰疹gD信號(hào)和天然免疫球蛋白信號(hào)序列(例如人Ig重鏈)是可用的。一般地，信號(hào)序列在閱讀框中與編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸連接。選擇標(biāo)記
一般的選擇基因編碼這樣的蛋白質(zhì)，其(a)賦予對(duì)于抗生素或其他毒素的抗性，例如氨芐青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四環(huán)素，或(b)補(bǔ)充營養(yǎng)缺陷或供應(yīng)在復(fù)合培養(yǎng)基中不可得到的營養(yǎng)物，或(c)兩者的組合。選擇方案可以涉及阻止未含有一種或多種載體的宿主細(xì)胞的生長。由于例如由共遞送的選擇標(biāo)記賦予的藥物抗性，已用編碼本發(fā)明治療用抗體的基因成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞存活。一個(gè)例子是DHFR選擇系統(tǒng)，其中轉(zhuǎn)化體在DHFR陰性宿主菌株中生成(例如參見Page和Sydenham 1991 Biotechnology 9:64-68)。在這個(gè)系統(tǒng)中，DHFR基因與本發(fā)明的抗體多核苷酸序列一起共遞送，并且隨后通過核苷撤回選擇DHFR陽性細(xì)胞。若需要，則還采用DHFR抑制劑氨甲蝶呤，以選擇具有DiFR基因擴(kuò)增的轉(zhuǎn)化體。通過使DHFR基因與本發(fā)明的抗體編碼序列或其功能衍生物可操作地連接，DHFR 基因擴(kuò)增導(dǎo)致目的所需抗體序列的伴隨擴(kuò)增。CHO細(xì)胞是用于這種DHFR/氨甲蝶呤選擇的特別有用的細(xì)胞系，并且使用DHFR系統(tǒng)擴(kuò)增且選擇宿主細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域充分確定的，參見 Kaufman R.J.等人 J. Mol. Biol. (1982) 159，601-621，關(guān)于綜述，參見 Werner RG, Noe W, Kopp K, Schluter Μ, ” Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals", Arzneimittel-Forschung. 48 (8) :870—80，1998 $ 8 @。 ii—$ 例子是谷氨酸合成酶表達(dá)系統(tǒng)(Bebbington等人Biotechnology 1992 Vol 10 pl69)。用于在酵母中使用的合適的選擇基因是trpl基因；參見Minchcomb等人Nature 282,38, 1979。啟動(dòng)子
用于表達(dá)本發(fā)明抗體的合適啟動(dòng)子與編碼抗體的DNA/多核苷酸可操作地連接。用于原核宿主的啟動(dòng)子包括PhoA啟動(dòng)子、β -內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)，堿性磷酸酶、色氨酸和雜種啟動(dòng)子例如Tac。適合于在酵母細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶，例如烯醇化酶、甘油醛3磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、果糖磷酸激酶、 葡糖6磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶和葡糖激酶。誘導(dǎo)型酵母啟動(dòng)子包括醇脫氫酶2、 異細(xì)胞色素(isocytochrome) C、酸性磷酸酶、金屬硫蛋白和負(fù)責(zé)氮代謝或麥芽糖/半乳糖利用的酶。用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)的啟動(dòng)子包括RNA聚合酶II啟動(dòng)子，包括病毒啟動(dòng)子例如多瘤、禽痘和腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒 (特別是立即早期基因啟動(dòng)子)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒、肌動(dòng)蛋白、勞斯肉瘤病毒(RSV) 啟動(dòng)子和早期或晚期猿猴病毒40，和非病毒啟動(dòng)子例如EF-I α (Mizushima和Nagata Nucleic Acids Res 1990 18 (17):5322。啟動(dòng)子的選擇可以基于與用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的合適相容性。增強(qiáng)子元件
合適時(shí)，例如對(duì)于在高等真核生物中表達(dá)，可以包括另外的增強(qiáng)子元件代替發(fā)現(xiàn)位于上述啟動(dòng)子中的那些，或加上發(fā)現(xiàn)位于上述啟動(dòng)子中的那些。合適的哺乳動(dòng)物增強(qiáng)子序列包括來自珠蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白、金屬硫蛋白(metallothionine)和胰島素的增強(qiáng)子元件?？商娲兀藗兛梢允褂脕碜哉婧思?xì)胞病毒的增強(qiáng)子元件，例如SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、多瘤增強(qiáng)子、桿狀病毒增強(qiáng)子或鼠IgGh基因座(參見 W004/009823)。盡管此種增強(qiáng)子一般在載體上位于啟動(dòng)子上游的位點(diǎn)處，但它們也可以位于其他地方，例如在非翻譯區(qū)內(nèi)或多腺苷酸化信號(hào)下游。增強(qiáng)子的選擇和定位可以基于與用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的合適相容性。多腺苷酸化/終止
在真核系統(tǒng)中，多腺苷酸化信號(hào)與編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸可操作地連接。此種信號(hào)一般置于可讀框的3’。在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中，非限制性示例信號(hào)包括衍生自生長激素、延伸因子-Ia和病毒(例如SV40)基因或逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)序列的那些。在酵母系統(tǒng)中，多腺苷酸化/終止信號(hào)的非限制性例子包括衍生自磷酸甘油酸激酶(PGK)和醇脫氫酶1 (ADH)基因的那些。在原核系統(tǒng)中，多腺苷酸化信號(hào)一般不是需要的，并且相反通常采用較短且更確定的終止子序列。多腺苷酸化/終止序列的選擇可以基于與用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的合適相容性。用于增強(qiáng)得率的其他方法/元件
除上述外，可以用于增強(qiáng)得率的其他特征包括染色質(zhì)重建元件、內(nèi)含子和宿主細(xì)胞特異性密碼子修飾。本發(fā)明抗體的密碼子選擇可以進(jìn)行修飾，以適應(yīng)宿主細(xì)胞的密碼子偏倚， 以便增加轉(zhuǎn)錄和/或產(chǎn)物得率(例如Hoekema A等人Mol Cell Biol 1987 7(8)2914-24)。 密碼子的選擇可以基于與用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的合適相容性。宿主細(xì)胞
用于克隆或表達(dá)編碼本發(fā)明抗體的載體的合適宿主細(xì)胞是原核、酵母或高等真核細(xì)胞。合適的原核細(xì)胞包括真細(xì)菌，例如腸桿菌科(enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌屬{Escherichia )例如大腸桿菌(例如ATCC 31,446 ；31, 537 ；27, 325)、腸桿菌屬(Mnterobacter)、歐文氏菌屬(Mrwinia、、克雷伯氏菌屬illebsiella、、變形菌屬 {Pro teus )、沙門氏菌屬(Salmonella )例如鼠傷寒沙門氏菌{Salmonella typhimurium)、 沙雷氏菌屬(Serratia)例如粘質(zhì)沙雷氏菌marcescans)和志賀氏菌屬 {Shigella )、以及芽孢桿菌(Bac i 11 i )例如枯草芽孢桿菌U sub tills )和地衣芽孢桿 OB. licheniformis、(參見DD 266 710)、假單胞菌屬(Pseudomonas)例如銅綠假單胞菌(β· aeruginosa )和鏈霉菌屬(Strep tomyces )。在酵母宿主細(xì)胞中，還預(yù)期了啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖糖酵母(schizosaccharomyces pombe)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)(例如 ATCC 16，045 ；12，424 ；24178 ；56，500)、耶氏酵母屬(yarrowia) (EP402，2 )、巴斯德畢赤氏酵母 O0ZcAia Pastoris) (EP183, 070，還參見 Peng 等人 J. Biotechnol. 108 (2004) 185-192)、假絲酵母屬)、里氏木霉 (.Trichoderma reesia ) (EP244, 234人青霉素(Penicillin)、彎頸霉屬(Tb/j^oc/ai/i腫)和曲霉屬(AspergiIlus)宿主例如構(gòu)巢曲霉(A nidulans)和黑色曲霉(A niger)。盡管本發(fā)明特別預(yù)期了原核和酵母宿主細(xì)胞，然而，一般地，本發(fā)明的宿主細(xì)胞是脊椎動(dòng)物細(xì)胞。合適的脊椎動(dòng)物宿主細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如cos-l (ATCC編號(hào)CRL 1650)C0S-7(ATCC CRL 1651)、人胚腎系四3、、PerC6(Crucell)、幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK)(ATCC CRL. 1632)、BHK570 (ATCC 編號(hào)CRL 10314),293 (ATCC 編號(hào) CRL 1573)、中國倉鼠卵巢細(xì)胞 CHO (例如 CHO-K1、ATCC 編號(hào):CCL 6UDHFR minus CHO 細(xì)胞系例如 DG44 (Urlaub 等人、 Somat Cell Mol Genet (1986)第12卷第555-566頁)，特別是適合于懸浮培養(yǎng)的那些CHO 細(xì)胞系、小鼠塞托利(Sertoli)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞(ATCC CRL_1587)、HELA細(xì)胞，犬腎細(xì)胞(ATCC CCL 34)，人肺細(xì)胞(ATCC CCL 75),Hep G2和骨髓瘤或淋巴瘤細(xì)胞例如 NSO (參見 US 5，807，715)、Sp2/0、Y0。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供的是穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含編碼如本文描述的治療用抗體的重鏈和/或輕鏈的載體。一般地，此種宿主細(xì)胞包含編碼輕鏈的第一種載體和編碼所述重鏈的第二種載體。此種宿主細(xì)胞還可以進(jìn)一步工程改造或適應(yīng)，以修飾本發(fā)明抗體的品質(zhì)、功能和/ 或得率。非限制性例子包括特異性修飾(例如糖基化)酶和蛋白質(zhì)折疊蛋白伴侶的表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)方法
用編碼本發(fā)明的治療用抗體的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行培養(yǎng)。宿主細(xì)胞可以在旋轉(zhuǎn)瓶(spinner flask)、搖瓶、滾瓶、wave反應(yīng)器(例如來自wavebiotech. com的System 1000)或中空纖維系統(tǒng)中進(jìn)行培養(yǎng)，但對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)優(yōu)選特別使用攪拌釜反應(yīng)器或袋式反應(yīng)器(例如Wave Biotech, Somerset, New Jersey USA)用于懸浮培養(yǎng)。一般地，攪拌釜(tanker)適合于使用例如噴霧器、擋板或低剪切葉輪進(jìn)行通氣。對(duì)于鼓泡塔和氣升式反應(yīng)器，可以使用用空氣或氧氣泡的直接通氣。當(dāng)宿主細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，這可以補(bǔ)加有細(xì)胞保護(hù)劑例如pluronic F-68，以幫助預(yù)防由于通氣過程的細(xì)胞損傷。依賴于宿主細(xì)胞特征，微載體可以用作用于依賴貼壁細(xì)胞系的生長基質(zhì)，或細(xì)胞可以適合于懸浮培養(yǎng)(這是一般的)。宿主細(xì)胞特別是脊椎動(dòng)物宿主細(xì)胞的培養(yǎng)可以利用多種操作方式，例如分批、分批補(bǔ)料、反復(fù)分批過程(參見Drapeau等人 (1994)cytotechnology 15 103-109)、持續(xù)單批過程或灌注培養(yǎng)。盡管重組轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可以在含血清培養(yǎng)基例如包含胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，但優(yōu)選此種宿主細(xì)胞在例如Keen等人(1995) Cytotechnology 17:153-163中公開的無血清培養(yǎng)基，或商購可得培養(yǎng)基例如ftx)CH0-CDM或UltraCHO (Cambrex NJ, USA)中進(jìn)行培養(yǎng)，需要時(shí)補(bǔ)加有能源例如葡萄糖和合成生長因子例如重組胰島素。宿主細(xì)胞的無血清培養(yǎng)可能要求那些細(xì)胞適合于在無血清條件下生長。一種適應(yīng)方法是在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)此種宿主細(xì)胞，并且用無血清培養(yǎng)基反復(fù)交換80%的培養(yǎng)基，從而使得宿主細(xì)胞學(xué)習(xí)適應(yīng)無血清條件(參見例如 ScharfenbergΓ1995) in Animal Cell technology .-Developments
29towards the 21st century 廣Beuvery Ε. C.等人編輯)，第 619—623 頁，Kluwer Academic 出版商)。使用多種技術(shù)可以從培養(yǎng)基中回收且純化分泌到培養(yǎng)基的本發(fā)明的抗體，以提供適合于預(yù)期用途的純化程度。例如，當(dāng)與包含治療用抗體的培養(yǎng)基相比較時(shí)，本發(fā)明治療用抗體用于治療人患者的用途一般要求如通過還原SDS-PAGE測定的至少95%純度、更一般地98%或99%純度。在第一種情況下，一般使用離心去除來自培養(yǎng)基的細(xì)胞碎片，隨后為上清液的澄清步驟，其中使用例如微量過濾、超濾和/或深度過濾(cbpth filtration). 可替代地，抗體可以通過微量過濾、超濾和/或深度過濾進(jìn)行收集，無需先前離心。多種其他技術(shù)例如透析和凝膠電泳和層析技術(shù)，例如羥磷灰石(HA)，親和層析(任選地涉及親和力標(biāo)記系統(tǒng)例如聚組氨酸)和/或疏水作用層析(HIC，參見US 5，429，746)是可用的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在各種澄清步驟后，使用A或G蛋白親和層析進(jìn)行捕獲，隨后為進(jìn)一步的層析步驟例如離子交換和/或HA層析、陰離子或陽離子交換、尺寸排阻層析和硫酸銨沉淀。一般地，還采用各種病毒去除步驟(例如使用例如DV-20濾器的納米過濾 (nanofiltration))。在這些各種步驟后，提供了包含至少10mg/ml或更多、例如100mg/ml 或更多的本發(fā)明抗體的純化的(一般是單克隆)制劑，并且因此構(gòu)成本發(fā)明的實(shí)施方案。通過超速離心可以生成至100mg/ml或更多的濃縮。適當(dāng)?shù)卮朔N制劑基本上不含聚集形式的本發(fā)明抗體。細(xì)菌系統(tǒng)特別適合于表達(dá)抗體片段。此種片段在細(xì)胞內(nèi)或在周質(zhì)(PeriPlasma)R 定位。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以提取且重折疊不溶性周質(zhì)蛋白質(zhì)，以形成活性蛋白質(zhì)，參見 Sanchez 等人(1999) J. Biotechnol. 72，13-20 和 Cupit PM 等人(1999)Lett Appl Microbiol，29，273-277。藥物組合物
如上所述的本發(fā)明抗體的純化的制劑(特別是單克隆制劑)可以并入藥物組合物內(nèi)， 用于在治療人疾病和病癥例如上述那些中使用。一般地，此種組合物進(jìn)一步包含如由可接受的藥學(xué)實(shí)踐已知且要求的藥學(xué)上可接受的(即惰性)載體，參見例如Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th ed, (1980),Mack Publishing Co。此種載體的例子包括滅菌載體例如鹽水、林格液(Ringers solution)或葡萄糖溶液，用合適緩沖劑例如三水乙酸鈉緩沖至藥學(xué)上可接受的PH，例如在5 - 8范圍內(nèi)的pH。用于注射(例如通過靜脈內(nèi)、 腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或門脈內(nèi)(intraportal))或連續(xù)輸注的藥物組合物適當(dāng)?shù)夭缓梢婎w粒物質(zhì)，并且可以包含Img - IOg治療用抗體，一般5mg - lg，更一般5mg - 25mg 或50mg抗體。用于制備此種藥物組合物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含單位劑型的Img - IOg本發(fā)明的治療用抗體，任選地連同使用說明書。本發(fā)明的藥物組合物可以是凍干的(冷凍干燥)，用于在根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知或顯而易見的方法施用前重構(gòu)。當(dāng)本發(fā)明的實(shí)施方案包含具有IgGl同種型的本發(fā)明抗體時(shí)，金屬離子包括銅的螯合劑，例如檸檬酸鹽(例如檸檬酸鈉)或EDTA或組氨酸，可以加入藥物組合物中，以減少金屬介導(dǎo)的這種同種型抗體的降解程度，參見EP0612251。藥物組合物還可以包含加溶劑例如精氨酸堿、去污劑/抗聚集試劑例如聚山梨醇酯80、和惰性氣體例如氮，以替換小瓶頂空氧。關(guān)于施用本發(fā)明抗體的有效劑量和治療方案一般憑經(jīng)驗(yàn)確定，并且依賴于因素例如患者年齡、重量和健康狀況和待治療的疾病或病癥。此種因素在主治醫(yī)師的權(quán)限內(nèi)。選擇合適劑量的指導(dǎo)可以在例如Smith等人(1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New York 中發(fā)現(xiàn)。臨床用途
本發(fā)明的拮抗劑可以用于治療多發(fā)性硬化和其他自身免疫性和炎性疾病，特別是其中牽涉致病性TH17細(xì)胞的那些。此種疾病與高水平的IL-17表達(dá)相關(guān)。升高水平的IL-17 已在 MS 患者的血清和 CSF (Matusevicius，D.等人· ；Mult. Scler. 5，101-104 ； 1999) 以及得自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑液中得到報(bào)道。IL-17還已和牛皮癬(Homey等人.；J. Immunol. 164 (12) :6621-32 ；2000)有牽連，而 Hamzaoui 等人報(bào)道在 Behcet 氏病中高水平的 IL-17 (Scand. J. Rhuematol. ；31 4，205-210 ;2002)。升高的 IL-17 水平也已在全身性紅斑狼瘡(SLE)中觀察到(Wong等人.；Lupus 9 (8) 589-93 ;2000)。IL-7受體介導(dǎo)的發(fā)信號(hào)的抑制還可以用于治療其中已牽涉升高的IL-17的炎性 (非自身免疫性)疾病，例如哮喘。因此，本發(fā)明的炎性和/或自身免疫性疾病包括炎性皮膚疾病包括牛皮癬和特應(yīng)性皮炎；系統(tǒng)性硬皮病和硬化；炎性腸病(IBD) ；Crohn氏?。粷冃越Y(jié)腸炎；缺血性再灌注病癥包括外科手術(shù)組織再灌注損傷，心肌缺血狀況例如心肌梗死、心跳停止、在心臟外科后的再灌注和在經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)后的收縮、中風(fēng)和腹主動(dòng)脈瘤；中風(fēng)繼發(fā)的腦水腫； 顱創(chuàng)傷，低血容量性休克；窒息；成人呼吸窘迫綜合征；急性肺損傷；Behcet氏病；皮肌炎； 多肌炎；多發(fā)性硬化(MS)；皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；骨關(guān)節(jié)炎；狼瘡腎炎；自身免疫性疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，Sjorgen氏綜合征，脈管炎；涉及白細(xì)胞血細(xì)胞滲出的疾??；中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性病癥，敗血病或創(chuàng)傷繼發(fā)的多器官損傷綜合征；酒精性肝炎； 細(xì)菌性肺炎；抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病包括腎小球腎炎；膿毒癥；肉樣瘤??；針對(duì)組織 /器官移植的免疫病理學(xué)應(yīng)答；肺炎癥包括胸膜炎、肺泡炎、脈管炎、肺炎、慢性支氣管炎、 支氣管擴(kuò)張、彌漫性泛細(xì)支氣管炎(diffuse panbronchiolitis)、過敏性肺炎、特發(fā)性肺纖維化(IPF)和囊性纖維化；牛皮癬性關(guān)節(jié)炎；視神經(jīng)脊髓炎、Guillain-Barre綜合征(GBS)、 COPDU型糖尿病等。特別地，本發(fā)明的拮抗劑可以用于治療以其所有形式的多發(fā)性硬化，包括視神經(jīng)脊髓炎。當(dāng)在活動(dòng)性炎性疾病的背景中施用時(shí)，即當(dāng)用于治療臨床上分離的綜合征或復(fù)發(fā)形式的MS時(shí)，用本發(fā)明的拮抗劑治療預(yù)期是最有效的。這些疾病病期可以在臨床上和/或通過成像標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行限定，例如釓增強(qiáng)或其他更敏感的技術(shù)，和/或其他迄今未限定的活動(dòng)性疾病生物標(biāo)記。特別地，當(dāng)患者進(jìn)入復(fù)發(fā)或在復(fù)發(fā)中時(shí)，本發(fā)明的拮抗劑可以用于治療 RRMS (經(jīng)由靜脈內(nèi)、皮下、經(jīng)口或肌內(nèi)遞送)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的拮抗劑在復(fù)發(fā)開始時(shí)施用于患者，或在復(fù)發(fā)開始1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、2天、3天、 4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天內(nèi)施用于患者。生物標(biāo)記的使用例如⑶127表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(例如IL-17染色)提供了關(guān)于應(yīng)用治療用抗⑶127結(jié)合蛋白的標(biāo)準(zhǔn)。在其⑶4+ T細(xì)胞中具有增加的Th17的MS患者亞組是用于治療的主要候選者。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療方法是本發(fā)明的方法，是治療在其T細(xì)胞上表達(dá)高水平⑶127的那些患者，使得其對(duì)抗⑶127治療易感的方法。用抗⑶127 治療可能可以縮短復(fù)發(fā)時(shí)間，并且加快可通過EDSS或MRI測量的臨床活動(dòng)的減弱。一旦患者進(jìn)入減輕，治療就可以停止，以避免并發(fā)癥例如正常T細(xì)胞發(fā)育和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的抑制?？?⑶127抗體的使用還可以延長在復(fù)發(fā)之間的時(shí)間段且改善患者的生活質(zhì)量。除非另有說明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常使用且理解相同的含義。本文使用的例子和材料僅用于舉例說明目的并且不意欲是限制性的。
權(quán)利要求
1.一種人受試者中的自身免疫性疾病或炎性病癥的治療方法，其包含給所述受試者施用IL-7受體介導(dǎo)的Th17擴(kuò)張和IL-7受體介導(dǎo)的TH17存活中的至少一種的拮抗劑。
2.如權(quán)利要求1中要求的治療方法，其中所述拮抗劑抑制IL-7誘導(dǎo)的通過Th17細(xì)胞的IL-17生產(chǎn)。
3.如權(quán)利要求1或2中要求的治療方法，其中所述拮抗劑抑制IL-7誘導(dǎo)的通過Th17 細(xì)胞的IFN-Y生產(chǎn)。
4.如權(quán)利要求1、2或3中要求的治療方法，其中所述拮抗劑抑制IL-7受體介導(dǎo)的 STAT-5磷酸化。
5.如權(quán)利要求1、2、3或4中任一項(xiàng)中要求的治療方法，其中所述拮抗劑是與IL-7或 CD127特異性結(jié)合的結(jié)合蛋白。
6.如權(quán)利要求5中要求的方法，其中所述結(jié)合蛋白與⑶127(SEQ ID N0:1)特異性結(jié)合。
7.如權(quán)利要求6中要求的方法，其中所述結(jié)合蛋白抑制IL-7與IL-7R的結(jié)合。
8.如權(quán)利要求5、6或7中要求的方法，其中所述結(jié)合蛋白與由選自下述的氨基酸殘基組成的至少一種肽內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸結(jié)合SEQ ID NO:1 的 a) 41 - 63 (SEQ ID NO:117)，b)65- 80 (SEQ ID NO:118)，c)84 - 105 (SEQ ID NO:119)，d)148 - 169 (SEQ ID NO:120)，和e)202 - 219 (SEQ ID NO:121)。
9.如權(quán)利要求8中要求的方法，其中所述結(jié)合蛋白與SEQID N0:1的肽65 - 80 (SEQ ID NO:118),84 - 105 (SEQ ID N0:119)、148 - 169 (SEQ ID NO:120)和 202 - 219 (SEQ ID NO: 121)各自內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸結(jié)合。
10.如權(quán)利要求1中要求的治療方法，其中所述結(jié)合蛋白在ELISA測定中競爭性抑制下述中的至少一種與人⑶127的結(jié)合(i)R34. 34 (Dendritics Inc. #DDX0700)，(ii)具有6A3的重和輕可變區(qū)(分別為SEQID N0:51和SEQ ID N0:52)的抗體，和(iii)具有IAll的重和輕鏈可變區(qū)(分別為SEQID N0:71和SEQ ID N0:72)的抗體。
11.如權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)中要求的方法，其中如通過表面等離振子共振測量的， 所述結(jié)合蛋白以15nM或更小的親和力(KD)與⑶127結(jié)合。
12.如任何前述權(quán)利要求中要求的治療方法，其中所述拮抗劑是抗體或其片段。
13.如權(quán)利要求12中要求的方法，其中所述抗體包含SEQID N0:55的重鏈互補(bǔ)性決定區(qū)3 (CDRH3)或其類似物，或SEQ ID N0:75的重鏈互補(bǔ)性決定區(qū)3 (CDRH3)。
14.如任何前述權(quán)利要求中要求的治療方法，其中所述自身免疫性或炎性疾病與升高水平的IL-17有關(guān)。
15.如任何前述權(quán)利要求中要求的治療方法，其中與健康人個(gè)體相比較，所述人受試者已測定為表達(dá)升高水平的IL-17。
16.如權(quán)利要求14或15中要求的方法，其中所述拮抗劑以有效減少所述患者中的 IL-17水平的量施用。
17.如權(quán)利要求14、15或16中要求的方法，其中所述IL-17水平在所述患者的血清中進(jìn)行測量。
18.如任何前述權(quán)利要求中要求的治療方法，其中所述自身免疫性疾病是多發(fā)性硬化。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述患者在其CD4+T細(xì)胞群體內(nèi)具有提高的TH17計(jì) 數(shù)。
20.一種用于治療患者中的多發(fā)性硬化的方法，其包含給所述患者施用IL-7或CD127 的拮抗劑，其中所述患者患有復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化。
21.一種治療人受試者中的自身免疫性疾病的方法，其包含給所述受試者施用IL-7或 IL-7R的拮抗劑，其量有效減少Th17細(xì)胞相對(duì)于ThI細(xì)胞的比。
22.—種治療人受試者中的自身免疫性疾病的方法，其包含給所述受試者施用IL-7或 IL-7R的拮抗劑，其量有效減少Th細(xì)胞與Treg細(xì)胞的比。
23.一種用于治療人受試者中的自身免疫性疾病的方法，其包含給所述受試者施用 IL-7受體介導(dǎo)的STAT-5磷酸化的拮抗劑。
24.如權(quán)利要求20、21、22或23中要求的治療方法，其中所述IL-7或IL-7R的拮抗劑是與⑶127或IL-7特異性結(jié)合的結(jié)合蛋白。
25.如權(quán)利要求M中任一項(xiàng)中要求的治療方法，其中所述結(jié)合蛋白是抗體或其抗原結(jié)合片段，其與由下述氨基酸殘基組成的至少一種肽內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸結(jié)合SEQ ID NO:1 的 a) 41 - 63 (SEQ ID NO:117)，b)65- 80 (SEQ ID NO:118)，c)84 - 105 (SEQ ID NO:119)，d)148 - 169 (SEQ ID NO:120)，和e)202 - 219 (SEQ ID NO:121)。
26.一種分離的人、人源化或嵌合抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或其片段與人 CD127的表位結(jié)合，所述表位含有在從殘基編號(hào)80開始且以殘基編號(hào)190結(jié)束的區(qū)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基。
27.如權(quán)利要求沈中要求的分離的抗體或抗體片段，其中所述抗體或其片段與由下述氨基酸殘基組成的至少一種肽內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸結(jié)合SEQ ID NO:1 的 a) 41 - 63 (SEQ ID NO:117)，b)65- 80 (SEQ ID NO:118)，c)84 - 105 (SEQ ID NO:119)，d)148 - 169 (SEQ ID NO:120)，和e)202 - 219 (SEQ ID NO:121)。
28.如權(quán)利要求沈或27中要求的分離的抗體或抗體片段，其中如通過表面等離振子共振測量的，所述抗體或其抗原結(jié)合片段以低于15nM的親和力(KD)與人CD127結(jié)合。
29.一種分離的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白與⑶127結(jié)合，并且包含選自SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:33,SEQ ID N0:55 禾口 SEQ ID NO:75 的重鏈互補(bǔ)性決定區(qū) 3 (CDRH3)，及其類似物。
30.如權(quán)利要求四中要求的分離的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白包含 A 包含下述CDRs或其類似物的重鏈
31.如權(quán)利要求四或30中要求的分離的結(jié)合蛋白，其為分離的人源化或嵌合抗體。
32.—種與CD127特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或抗體的片段與選自下述的一種或多種抗體競爭結(jié)合人CD127 a.具有下述重鏈可變區(qū)的抗體；b.具有下述重鏈可變區(qū)和下述輕鏈可變區(qū)的抗體；的抗體；和d.具有下述重鏈可變區(qū)和下述輕鏈可變區(qū)的抗體；其中所述抗體不是 R34. ；34 (Dendritics Inc. #DDX0700)。
33. 一種人、人源化或嵌合抗體或其抗原結(jié)合片段和/或衍生物，其與CD127結(jié)合，并且包含包含下述CDRs或其類似物的重鏈
34.一種用于治療自身免疫性疾病或炎性狀況的方法，其包含給患有自身免疫性疾病或炎性狀況的患者施用根據(jù)權(quán)利要求26-33中任一項(xiàng)的結(jié)合蛋白、抗體或其片段。
35.一種IL-7受體介導(dǎo)的TH17擴(kuò)張和/或存活的拮抗劑，其用于治療人受試者中的自身免疫性疾病或炎性病癥。
36.根據(jù)權(quán)利要求沈-33中任一項(xiàng)的分離的結(jié)合蛋白、抗體或其片段，其用于治療自身免疫性或炎性狀況。
37.一種用于鑒定適合于用于治療自身免疫性疾病或炎性疾病的抗體的方法，所述方法包含步驟篩選多個(gè)獨(dú)立的抗體群體，以測定每個(gè)抗體群體關(guān)于下述的能力i.抑制IL-7與IL-7R的結(jié)合，ii.中和IL-7誘導(dǎo)的STAT-5磷酸化，和/或iii.抑制通過TH17細(xì)胞的IL-17生產(chǎn)，并且選擇能夠抑制IL-7與IL-7R的結(jié)合、抑制IL-7誘導(dǎo)的STAT-5磷酸化、和/或抑制通過Th17細(xì)胞的IL-17生產(chǎn)的那些抗體群體。
全文摘要
本發(fā)明提供了多發(fā)性硬化和其他自身免疫性疾病或炎性病癥的新治療方法，和用于在新方法中使用的拮抗劑，包括分離的結(jié)合蛋白。還提供了治療多發(fā)性硬化的方法，其包含通過與CD127或IL-7結(jié)合來中和IL-7的生物活性。分離的結(jié)合蛋白還可以中和TSLP的生物活性。
文檔編號(hào)A61P25/00GK102177179SQ200980139759
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2009年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月8日
發(fā)明者盧 H., 張 J., 李 L., 徐 P., 梁 S., 劉學(xué)彬 申請(qǐng)人:葛蘭素集團(tuán)有限公司