專利名稱：截短型eif-5a1多核苷酸誘導(dǎo)癌細胞凋亡的用途的制作方法
截短型EIF-5A1多核苷酸誘導(dǎo)癌細胞凋亡的用途相關(guān)申請本申請要求2008年9月3日提交的美國臨時申請?zhí)?1/093，749和2009年3月 19日申請的美國申請?zhí)?2/400，742的優(yōu)先權(quán)，它們都通過引用整體結(jié)合到本文中。
背景技術(shù)：
最近，研究人員觀測到雙鏈RNA(“dsRNA”)可用于抑制蛋白質(zhì)表達，雙鏈RNA這種沉默基因的能力具有治療人類疾病的廣泛潛力，現(xiàn)在，許多研究人員和商業(yè)實體大量投資開發(fā)以這種技術(shù)為基礎(chǔ)的治療法。雙鏈RNA誘導(dǎo)基因沉默可出現(xiàn)至少3種不同的水平⑴轉(zhuǎn)錄失活，即RNA引導(dǎo)的 DNA或組蛋白甲基化；(ii) siRNA誘導(dǎo)的mRNA降解；和(iii)mRNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄弱化。一般認為，在哺乳動物細胞中RNA誘導(dǎo)沉默(RNA干擾或RNAi)的主要機制是mRNA 降解。最初在哺乳動物細胞中嘗試使用RNAi主要是使用長鏈dsRNA。然而，這些誘導(dǎo)RNAi 的嘗試所取得的成效有限，部分原因在于誘導(dǎo)了干擾素反應(yīng)，干擾素反應(yīng)與靶特異性相反， 其導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成普遍抑制。因此，長鏈dsRNA對于哺乳動物系統(tǒng)的RNAi不是可行的選擇。近來，有證據(jù)表明，當(dāng)將短(18_30bp)RNA雙鏈體引入培養(yǎng)的哺乳動物細胞時， 可以實現(xiàn)靶mRNA的序列特異性抑制而不誘導(dǎo)干擾素反應(yīng)。某些短dsRNA，被稱為小抑制型RNA( “siRNA”)，可在亞摩爾濃度進行催化性作用，以切割細胞中95%以上的靶mRNA。 siRNA作用機制的描述及其某些應(yīng)用參見Provost et al. (2002) Ribonuclease Activity and RNA Binding of Recombinant Human Dicer, EMBO J.21(21) :5864-5874 ；Tabara et al. (2002)The dsRNA Binding Protein RDE-4 Interacts with RDE-I, DCR-I and a DexH-box Helicase to Direct RNAi in C. elegans, Cell 109(7) :861-71 ；Ketting et al. (2002)Dicer Functions in RNA Interference and in Synthesis of Small RNA Involved in Developmental Timing in C. elegans ；Martinez et al. , Single-Stranded Antisense siRNAs Guide Target RNA Cleavage in RNAi,Cell 110(5) 563 ；Hutvagner & Zamore(2002)A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex,Science 297 2056。從機械觀來看，引入植物和無脊柱動物細胞的長雙鏈RNA被稱為Dicer的III 型核酸內(nèi)切酶分解為 siRNA。Sharp，RNA interference-2001, Genes Dev. 2001，15 485。Dicer是一種核糖核酸酶-III-樣酶，其將dsRNA加工為19-23個堿基對的短干擾 RNAs，具有特征性的 2 個堿基的 3，突出端。Bernstein, Caudy, Hammond, & Hannon (2001) Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference, Nature 409:363。然后siRNAs摻入RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)中，其中一種或多種解旋酶解旋siRNA雙鏈，使互補的反義鏈指導(dǎo)靶識別。Nykanen，Haley, & Zamore (2001)， ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway, Cell 107 :309。在結(jié)合到適宜的靶mRNA時，RISC中的一種或多種核酸內(nèi)切酶切割靴 mRNA 以誘導(dǎo)沉默。Elbashir，Lendeckel，& Tuschl Q001) RNA interference is mediated by 21-and 22-nucleotide RNAs, Genes Dev. 15 :188, 1。
所述干擾效應(yīng)可長期持續(xù)，并且在許多次細胞分裂后仍然可檢測到。而且，RNAi具有序列特異性。Kisielow，M. et al. (2002)，Isoform-specific knockdown and expression of adaptor protein ShcA using small interfering RNA, J. Biochem. 363 :1-5。因此， RNAi機制可特異性抑制一種類型的轉(zhuǎn)錄物，同時不會影響與之密切相關(guān)的mRNA。這些特性使siRNA可能成為抑制基因表達、研究基因功能以及確認藥物靶的有用工具。而且，siRNA 可能用作以下疾病的治療劑(1)由基因的過表達或錯誤表達引起的疾??；和( 由包含突變的基因表達引起的疾病。成功的SiRNA-依賴性基因沉默取決于許多因素。關(guān)于RNAi最有爭議的問題之一是siRNA設(shè)計必要性的問題，即考慮所用的siRNA的序列。早期用秀麗隱桿線蟲 (C. elegans)和植物進行的工作因為引入長dsRNA而繞過了該siRNA序列設(shè)計的問題(參見，例如，F(xiàn)ire，A. et al. (1998)Nature 391:806-811)。在這種原始生物中，長 dsRNA 分子被Dicer切割成siRNA，從而產(chǎn)生各種雙鏈體，其可能覆蓋完整轉(zhuǎn)錄物。盡管這些分子中的某些部分是非功能性的(即，誘導(dǎo)極少或不沉默)，但是一種或多種分子可能具有高功能性，因此能夠沉默目標(biāo)基因，而不太需要設(shè)計siRNA。不幸的是，由于干擾素反應(yīng)，同樣的方法不適用哺乳動物系統(tǒng)。然而，避開Dicer切割步驟，直接引入siRNA可避免這種影響，實施這種策略的風(fēng)險是選取的siRNA序列可能是非功能性的或半功能性的。許多研究已經(jīng)表明了 siRNA設(shè)計不是RNAi的關(guān)鍵性因素的觀點。另一方面，該領(lǐng)域的其它研究人員已著手研究注重siRNA設(shè)計而使RNAi更加有效的可能性。為了治療各種疾病或障礙，需要上調(diào)某些蛋白質(zhì)，但這可能不是需要的全部。例如，可能需要組合使用siRNA抑制或敲除內(nèi)源蛋白質(zhì)或不同蛋白質(zhì)的表達。本發(fā)明滿足這種需要并提供治療癌癥、尤其是多發(fā)性骨髓瘤的方法。癌癥，包括多發(fā)性骨髓瘤，是可從誘導(dǎo)細胞凋亡中獲益的疾病。多發(fā)性骨髓瘤的傳統(tǒng)療法包括化療、干細胞移植、高劑量化療聯(lián)合干細胞移植以及輔助性療法?；煱ㄓ孟铝兴幬镏委烼halomid (沙利度胺)、硼替佐米、Aredia (帕米膦酸)、類固醇和 hmeta (唑來膦酸)。然而許多化療藥物對分裂活躍的非癌細胞例如骨髓細胞、胃腸粘膜以及毛囊都是毒性的。所以，化療可能導(dǎo)致血細胞數(shù)減少、惡心、嘔吐、腹瀉和脫發(fā)。常規(guī)化療或標(biāo)準劑量化療是多發(fā)性骨髓瘤患者典型的初級治療或初始治療?；颊哌€可接受高劑量化療制劑的化療和干細胞移植。誘導(dǎo)療法(干細胞移植前的常規(guī)化療) 可用于移植前降低腫瘤負荷。與其它療法相比，某些化療藥物更適合誘導(dǎo)療法，因為它們對骨髓細胞毒性較少并且使骨髓產(chǎn)生更多干細胞。適于誘導(dǎo)療法的化療藥物實例包括地塞米松、沙利度胺/地塞米松、VAD (長春新堿、Adriamycin (多柔比星)和地塞米松組合) 和DVd(聚乙二醇化脂質(zhì)體多柔比星(Doxil ，Caelyx )、長春新堿和縮短療程(reduced schedule)的地塞米松組合)。多發(fā)性骨髓瘤的標(biāo)準治療是美法侖結(jié)合強的松(一種皮質(zhì)類固醇類藥物)，反應(yīng)率達50%。不幸的是，美法侖是烷化劑從而不大適于誘導(dǎo)療法。皮質(zhì)類固醇類(尤其是地塞米松)有時單獨用于多發(fā)性骨髓瘤療法，尤其是老年患者和那些不能忍受化療的患者。 地塞米松同樣單獨或者與其它藥物聯(lián)合用于誘導(dǎo)療法。VAD是最常用的誘導(dǎo)療法，而最近證明DVd在誘導(dǎo)療法中是有效的。最近，硼替佐米被批準用于治療多發(fā)性骨髓瘤，但其毒性很大。然而，現(xiàn)有療法中沒有一種表現(xiàn)出治愈的明顯可能性。因此，仍有必要尋求治療癌癥和多發(fā)性骨髓瘤的適宜療法。本發(fā)明滿足這種需要。 發(fā)明概要本發(fā)明提供編碼截短型eIF_5Al的分離多核苷酸以及截短型eIF_Al多肽。截短型eIF-5Al多核苷酸可用于誘導(dǎo)患者的癌細胞凋亡和殺死癌細胞?？稍诒磉_載體中使用截短型多核苷酸，然后將其給予患者。截短型eIF-5A形式可在哺乳動物體內(nèi)表達并殺死癌細胞。截短型eIF-5Al蛋白質(zhì)約16kDA，而全長eIf-5Al蛋白質(zhì)約17kDa。編碼截短型eIF5Al 蛋白質(zhì)的多核苷酸可用來制備用于誘導(dǎo)患者癌細胞或腫瘤凋亡的藥物。編碼截短型eIF5Al 蛋白質(zhì)的多核苷酸可聯(lián)合本文所述其它實施方案使用(例如聯(lián)合編碼全長eIF5Al的多核苷酸、聯(lián)合編碼全長突變eIF5Al的多核苷酸和/或聯(lián)合靶向eIF5A的3’ UTR的siRNA使用)。本發(fā)明還涉及聯(lián)合使用靶向內(nèi)源基因以敲除或抑制內(nèi)源基因在宿主中表達的 siRNA和以遞送介質(zhì)(a delivery vechicle)/表達載體遞送編碼所述基因的多核苷酸至宿主以提供所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)在宿主中表達。將編碼正常(非缺陷)蛋白質(zhì)的多核苷酸(或蛋白質(zhì)本身)給予宿主并表達(在多核苷酸情況下)，使得正常蛋白質(zhì)可履行其必要的功能。優(yōu)選將siRNA設(shè)計成靶向所述基因區(qū)域，這樣它在抑制或敲除缺陷蛋白質(zhì)內(nèi)源表達的同時，不會影響所給予的編碼正常蛋白質(zhì)的多核苷酸的外源表達。本發(fā)明提供一種組合物，其包含靶向eIF5Al的3’末端的eIF5AlsiRNA、包含編碼突變eIF5Al的多核苷酸的表達載體的復(fù)合物，其中所述突變eIF5Al不能被羥丁賴氨酸化， 并且其中所述siRNA和表達載體與聚氮丙啶(polyethylenimine)復(fù)合形成復(fù)合物。本發(fā)明提供一種組合物，其包含靶向目標(biāo)基因以抑制患者該目標(biāo)基因內(nèi)源表達的 siRNA和編碼能夠在患者中表達的目標(biāo)蛋白的多核苷酸。在某些實施方案中，所述多核苷酸存在于RNAi抗性質(zhì)粒中(不會被siRNA抑制)。所述siRNA和質(zhì)粒優(yōu)選與聚氮丙啶復(fù)合形成復(fù)合物。在某些實施方案中，siRNA具有圖25所示序列，其中編碼突變eIF5Al的多核苷酸是eIF5AlK5°R。表達載體包含編碼突變eIF5Al的多核苷酸和有效連接的啟動子以提供多核苷酸在患者中表達。啟動子優(yōu)選是組織特異性的或系統(tǒng)性的。例如，如果組合物用于治療癌癥，那么優(yōu)選啟動子對該癌癥所處的組織是組織特異性的。例如，對于治療多發(fā)性骨髓瘤， 優(yōu)選使用B細胞特異性啟動子，例如B29。在某些實施方案中，表達載體包含pCpG質(zhì)粒。在某些實施方案中，eIF5Al siRNA和包含突變eIF5Al多核苷酸的表達載體獨立與聚氮丙啶復(fù)合，例如化Vivo JetPEI 。在其它實施方案中，eIF5Al siRNA和包含突變 eIF5Al多核苷酸的表達載體與聚氮丙啶復(fù)合在一起。本發(fā)明還提供一種組合物，其包含靶向eIF5Al的3’末端的eIF5Al siRNA和包含編碼突變eIF5Al的多核苷酸的表達載體，其中所述突變eIF5Al不能被羥丁賴氨酸化，而其中所述siRNA和表達載體被遞送至患者以治療癌癥。所述癌癥可以是任何癌癥，包括多發(fā)性骨髓瘤。本發(fā)明還提供一種治療癌癥的方法，其包括給予患者(包括但不限于哺乳動物和人)本發(fā)明的組合物。本發(fā)明組合物通過任何可接受的途徑給予，例如但不限于靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或腫瘤內(nèi)。SiRNA和表達載體可于不同時間經(jīng)不同途徑給予，或者可于同一時間經(jīng)同一途徑一起給予。例如但不限于，可將siRNA直接、或者與載體復(fù)合(例如h vivo jetPEI)經(jīng)IV 遞送，并且所述表達載體可腫瘤內(nèi)給予，或者可將所述siRNA和表達載體這兩者經(jīng)IV或腫瘤內(nèi)等給予。本發(fā)明提供一種抑制癌細胞生長和/或殺死癌細胞的方法。本發(fā)明還提供一種抑制或減緩癌細胞轉(zhuǎn)移能力的方法。抑制癌癥生長包括減小腫瘤大小、延緩腫瘤生長，還可包括徹底消除腫瘤。所述癌癥可以是任何癌癥或腫瘤，包括但不限于結(jié)腸癌、結(jié)直腸腺癌、膀胱癌、宮頸腺癌以及肺癌。優(yōu)選癌癥是多發(fā)性骨髓瘤。在優(yōu)選的實施方案中，所述eIF_5A是一種不能被羥丁賴氨酸化的突變體。本文描述了典型的突變體。除了提供eIF_5A或編碼eIF_5A的多核苷酸至患者(以提供表達eIF_5A)外，還提供siRNA以敲除或抑制eIF-5A的內(nèi)源表達。本發(fā)明還提供eIF5A、編碼eIF5Al的多核苷酸以及針對eIF5Al的siRNA用于制備治療癌癥、殺死多發(fā)性骨髓瘤患者的多發(fā)性骨髓瘤細胞的藥物的用途。優(yōu)選編碼突變 eIF-5A的多核苷酸不被羥丁賴氨酸化。本發(fā)明還提供一種治療鐮狀細胞性貧血的方法。將編碼健康血紅蛋白基因(例如 HBB)的多核苷酸給予罹患鐮狀細胞性貧血的患者。還聯(lián)合給予患者siRNA，所述siRNA靶向編碼缺陷血紅蛋白基因(例如編碼突變HbS的基因)以抑制或敲除所述缺陷蛋白質(zhì)表達。 所述治療還可包括給予其它在治療鐮狀細胞性貧血中通常使用的已知藥物或者治療。
附圖簡介

圖1提供人eIF_5Al的氨基酸序列并圖示不同的重要位點。圖2圖示eIF_5Al于K50和K67的突變增加轉(zhuǎn)染蛋白的累積。參見實施例1。圖3圖示eIF5Al于K47、K50和Κ67的突變增加轉(zhuǎn)染蛋白的累積。參見實施例2。圖4圖示Κ50和Κ67突變的eIF5Al轉(zhuǎn)染到KAS細胞中時誘導(dǎo)細胞凋亡。參見實施例3。圖5圖示K50和K67突變的eIF5Al轉(zhuǎn)染到KAS細胞中時誘導(dǎo)細胞凋亡。參見實施例4。圖6圖示K50和K67突變的eIF5Al轉(zhuǎn)染到KAS細胞中時誘導(dǎo)細胞凋亡。參見實施例5。圖7A圖示用siRNA轉(zhuǎn)染和用經(jīng)過修飾表達eIF_5Al的腺病毒處理導(dǎo)致KAS細胞凋亡。參見實施例6A。圖 7B 圖示 eIF5Al siRNA 的預(yù)處理(針對靶 #1 (SEQ ID NO 1))(圖 25 所示 siRNA 構(gòu)建體序列)降低了內(nèi)源eIF5Al表達，但使腺病毒表達的RNAi-抗性eIF5Alk5°A累積。參見實施例6B。圖7C圖示用針對靶#1的eIF5Al siRNA預(yù)處理然后進行腺病毒感染降低人多發(fā)性骨髓瘤細胞的磷酸化NF- κ B表達。參見實施例6C。圖7D圖示用針對靶#1的eIF5Al siRNA預(yù)處理然后進行腺病毒感染降低人多發(fā)性骨髓瘤細胞的磷酸化NF-kB和ICAM-I表達。參見實施例6D。
圖7E圖示在人多發(fā)性骨髓瘤細胞中SiRNA-介導(dǎo)的eIF5A抑制抑制LPS-介導(dǎo)的 NFkB DNA-結(jié)合活性的誘導(dǎo)。eIF5A siRNA對NFkB活性的抑制能夠解釋與過表達eIF5AK5°K 結(jié)合時因為NF-kB調(diào)節(jié)眾多促存活的和抗細胞凋亡的途徑，所以其增強細胞凋亡誘導(dǎo)的能力。圖7F圖示在IL-6存在下，siRNA預(yù)處理KAS細胞增加eIF5Alk5°K基因遞送引起的細胞凋亡。參見實施例6E。圖8圖示同時給予eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA延緩多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的生長。所示數(shù)據(jù)是每組所有小鼠的腫瘤體積。參見實施例7。圖9圖示同時給予eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA延緩多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的生長。所示數(shù)據(jù)是每組平均腫瘤體積+/_標(biāo)準誤差。參見實施例7。圖10圖示同時給予eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA減輕多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤重量。參見實施例7。圖11圖示同時給予eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA延緩多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤生長并導(dǎo)致腫瘤皺縮(減小/縮小)(shringkage)。參見實施例8。圖12 圖示靜脈內(nèi)給予(i. v. )eIF5Al siRNA 和腫瘤內(nèi)(i. t.)給予 PEI/eIF5AlK5°K 質(zhì)粒復(fù)合物導(dǎo)致多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤皺縮。參見實施例9。圖13A圖示用eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA治療延緩多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤生長和導(dǎo)致腫瘤減小。圖13B圖示同時給予eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA導(dǎo)致腫瘤皺縮。圖 13C圖示靜脈內(nèi)給予(i. v. )eIF5AlsiRNA和腫瘤內(nèi)(i. t.)給予PEI/eIF5AlK5°K質(zhì)粒復(fù)合物導(dǎo)致多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤皺縮。圖14圖示靜脈內(nèi)同時給予eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA延緩多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤生長。參見實施例10。圖15圖示靜脈內(nèi)給予(i. v.)eIF5Al siRNA和靜脈內(nèi)(i. v.)或腹膜內(nèi)(i. p.)給予PEI/eIF5AlK5°K質(zhì)粒復(fù)合物延緩多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤生長。參見實施例11。圖16圖示用eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA治療延緩多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤生長。圖17圖示同時給予eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA延緩多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤生長和導(dǎo)致腫瘤減小。參見實施例12。圖18 圖示靜脈內(nèi)給予(i. v. )eIF5Al siRNA 和腫瘤內(nèi)(i. t.)給予 PEI/eIF5AlK5°K 質(zhì)粒復(fù)合物導(dǎo)致多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤皺縮。參見實施例13。圖19圖示同時給予EFl或B^啟動子驅(qū)動的eIF5AlK5°K質(zhì)粒和eIF5Al siRNA延緩多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤生長和導(dǎo)致腫瘤減小(KAS-SQ-5)。參見實施例14。圖20圖示同時給予eIF5Al siRNA增強eIF5AlK5°K質(zhì)粒(EFl或B^啟動子驅(qū)動) 對多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的抗腫瘤作用，并且導(dǎo)致腫瘤負荷下降(KAS-SQ-5)。參見實施例 15。圖21圖示eIF5Al siRNA協(xié)作增強Ad_eIF5A感染肺腺癌細胞引起的細胞凋亡。參見實施例16。圖22圖示pExp5A的圖譜，其結(jié)構(gòu)描述參見實施例17。圖23圖示pExp5A的預(yù)期序列(3371bp)。參見實施例17。圖M圖示eIF5AlK5°K在不同細胞系的表達。參見實施例18。
圖25圖示靶序列和優(yōu)選的eIF5Al siRNA序列。圖沈提供多發(fā)性骨髓瘤的功效研究結(jié)果。參見實施例21。圖27提供多發(fā)性骨髓瘤的功效研究結(jié)果。參見實施例21。圖28 提供 eIF_5Alk5°KcDNA 的序列。圖四提供人eIF_5Al與人eIF5Alk5°K之間的比對。圖30圖示DNA siRNA之比對HA-eIF5AK5°K表達的影響。參見實施例23。圖31圖示DNA siRNA之比對納米微粒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)的細胞凋亡的影響。參見實施例24。圖 32 圖示給予包含 eIF5AlK5°K 質(zhì)粒和 eIF5Al siRNA (siSTABLE 或非 siSTABLE)的 PEI復(fù)合物(N/P = 6或8)抑制多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤生長和導(dǎo)致腫瘤減小。參見實施例 25。圖33圖示JET PEI 納米微粒被腫瘤組織有效吸收，且納米微粒遞送質(zhì)粒和siRNA 至相同的細胞。參見實施例沈。圖34圖示KAS細胞由放線菌素D引起的細胞凋亡。KAS細胞未處理或者用0. 5 μ g/ ml放線菌素D處理。在初始處理后對小時，收獲細胞、洗滌，用Annexin/PI(BD Bioscience) 標(biāo)記凋亡細胞，然后通過流式細胞術(shù)分析。圖35圖示放線菌素D處理引起的截短型eIF_5Al累積。將KAS細胞用0. 5 μ g/ ml放線菌素D處理0-30小時。收獲細胞裂解物，然后使用針對eIF5Al的抗體通過蛋白質(zhì)印跡分析。在放線菌素D處理后大約8小時，開始觀察到小分子量形式(切割型/裂解型) 的eIF5Al的累積，而這種累積貫穿余下的處理。使用針對肌動蛋白的抗體通過相同膜的蛋白質(zhì)印跡證明加載是相等的。圖36圖示截短型eIF_5Al的等電點比全長eIf_5Al的高。KAS細胞未處理或者用0. 5 μ g/ml放線菌素D處理。在開始處理后17小時，收獲細胞裂解物，通過2-D凝膠電泳分離后使用針對eIF5Al的抗體進行蛋白質(zhì)印跡分析。在未處理樣品中觀察到大量全長 eIF5Al，在放線菌素D處理樣品中觀察到較高PI值的切割型eIF5Al的累積。圖37提供截短型eIF-5Al 2-D凝膠的照片。KAS細胞經(jīng)0. 5 μ g/ml放線菌素D處理。在開始處理后17小時，收獲細胞裂解物，進行2-D凝膠電泳分離后，進行考馬斯藍染色。 收集切割型eIF5Al，質(zhì)譜分析指示其位置。圖38提供了截短型eIF_5Al質(zhì)譜測序的結(jié)果。(A)eIF5Al的全長氨基酸序列以黑色顯示。與eIF5Al全長序列比對，將質(zhì)譜鑒定的測序的肽(B)以下劃線顯示(A)。要注意的是，在測序肽中沒有eIF5Al的前6個氨基酸。圖39圖示半胱天冬酶(caspase) 3、8和9抑制劑抑制截短型eIF_5Al形成。將人多發(fā)性骨髓瘤KAS細胞與不同的半胱天冬酶抑制劑溫育8小時，然后再用0. 5 μ g/ml放線菌素D(ActD)共處理16小時。收集細胞裂解物。蛋白質(zhì)通過2D-PAGE分離，使用針對 eIF5A的抗體進行蛋白質(zhì)印跡分析。使用的半胱天冬酶抑制劑是Z-VAD-FMK (普通半胱天冬酶抑制劑)、Z-LEHD-FMK (半胱天冬酶9抑制劑)、Z-DEVD-FMK (半胱天冬酶3/7抑制劑)、 Z-IETD-FMK(半胱天冬酶6/8抑制劑)和Z-YVAD-FMK(半胱天冬酶1抑制劑)。數(shù)據(jù)表明普通半胱天冬酶抑制劑和半胱天冬酶3、8和9抑制劑全都能有力阻止切割型eIF5A形成， 切割型eIF5A在KAS細胞的ActD誘導(dǎo)的細胞凋亡中累積。半胱天冬酶1抑制劑還降低但不完全阻斷切割產(chǎn)物的形成。這些結(jié)果表明在基因毒性壓力(通過放線菌素D誘導(dǎo))后， eIF5Al被半胱天冬酶裂解；eIF5Al的切割可改變其活性，即增加促凋亡活性。圖40圖示脫乙酰酶抑制劑(煙酰胺)促進截短型eIF_5Al形成?？稍谫嚢彼?7 上乙?；膃IF5A是Sir2相關(guān)的脫乙酰酶Hst2的底物(Shiraiet al.，2008)。人宮頸癌 HelaS3細胞經(jīng)0. 5 μ g/ml放線菌素D(ActD)和/或20 μ M煙酰胺(Sir2的有效抑制劑) 持續(xù)處理指定時間。收集細胞裂解物。蛋白質(zhì)通過2D-PAGE分離后使用針對eIF5A的抗體進行蛋白質(zhì)印跡分析。用ActD或煙酰胺單獨處理HelaS3細胞不誘導(dǎo)切割型eIF5A的累積。然而，用放線菌素D和煙酰胺兩者處理HeLa細胞，在暴露于ActD后至少4小時，切割型eIF5A上調(diào)，表示乙酰化可促進細胞凋亡期間的eIF5A切割。圖41提供截短型人eIF5Al的DNA序列。圖42提供全長eIF5Al的蛋白質(zhì)序列、截短型eIF5A和切割位點。圖43 用腺病毒構(gòu)建體感染Hela細胞導(dǎo)致eIF5A轉(zhuǎn)基因累積。用不同腺病毒構(gòu)建體以500個感染單位/細胞感染HelaS3細胞。于感染后48和72小時收集細胞裂解物， 進行SDS-PAGE，使用針對eIF5A和肌動蛋白的抗體進行蛋白質(zhì)印跡分析。可觀察到截短型 eIF5A的累積。圖44:用放線菌素D、硝普鈉處理或者IL-6消除誘導(dǎo)細胞凋亡導(dǎo)致截短型 eIF5Al(eIF5AlAl-6)在人骨髓瘤細胞中累積。KAS-6/1細胞如所示處理，然后進行 2D-PAGE和使用針對eIF5A的抗體進行蛋白質(zhì)印跡分析。在KAS-6/1細胞中經(jīng)放線菌素D、N0供體硝普鈉或IL-6饑餓的細胞凋亡誘導(dǎo)全都誘導(dǎo)截短型eIF5Al累積。使用 Ad-Al Δ (2-6)或Ad-Al Δ (2_6)/K50R過表達截短型eIF5Al誘導(dǎo)累積的eIF5Al蛋白質(zhì)pi 值比細胞凋亡時產(chǎn)生的截短型eIF5Al (eIF5Al Δ 1-6)pi值低，表明在eIF5Al Δ 1-6上存在其它翻譯后修飾。圖45 :eIF5AlD6E和eIF5AlD6E/K50R對細胞凋亡期間的放線菌素D-誘導(dǎo)的切割有抗性。人多發(fā)性骨髓瘤KAS-6/1細胞如所示處理，然后進行2D-PAGE和使用針對eIF5A 的抗體進行蛋白質(zhì)印跡分析。過表達的eIF5Al (Ad-Al)在放線菌素D處理期間經(jīng)歷切割。 然而，eIF5AlD6E或eIF5AlD6E/K50R對用放線菌素D處理后的切割有抗性。這些結(jié)果符合 eIF5Al的氨基酸3-6構(gòu)成半胱天冬酶切割位點的假設(shè)。圖46 重組型半胱天冬酶對eIF5Al進行的體外切割。將人eIF5Al (Al)以及突變體 eIF5AlD6E(D6E)和 eIF5AlD6E/K50R(D6E/K50R)亞克隆入 pHM6 載體(Roche)，其導(dǎo)致 HA 標(biāo)記蛋白質(zhì)表達。pHM6-HA-Al、pHM6-HA-Al(D6E)和 pHM6-HA_Al (D6E/K50R)在體外轉(zhuǎn)錄和番羽譯(TNT T7 Quick Coupled Transcription/Translation Systems ；Promega),并根據(jù)廠商說明書用 Transcend Non-Radioactive Translation Detection Systems (Promega)標(biāo)記。將3微升每種體外翻譯產(chǎn)物與1微升重組型半胱天冬酶(半胱天冬酶1、2、3、6、7、8、9 或10 ；Calbiochem)在半胱天冬酶反應(yīng)緩沖液(50mM H印es、0. 1% CHAPS、10%蔗糖、IOOmM NaClUOmM DTTUmM EDTA)中于37°C溫育2小時。最終產(chǎn)物經(jīng)過SDS-PAGE，與鏈霉抗生物素蛋白-HRP溫育顯現(xiàn)生物素化蛋白質(zhì)，然后進行化學(xué)發(fā)光檢測。野生型eIF5Al被半胱天冬酶2、3、6、7、8、9和10切割而不被半胱天冬酶1切割。HA-標(biāo)記的eIF5AlD6E和eIF5AlD6E/ K50R被半胱天冬酶3、7和8體外有效切割，但不能被半胱天冬酶9和10有效切割。然而， 這種切割可能是由于體外系統(tǒng)中高豐度半胱天冬酶活性以及谷氨酸和天冬氨酸之間的結(jié)構(gòu)高度相似性，因此允許切割eIF5AlD6E，但是切割效率較低(尤其是因為eIF5AlD6E和 eIF5AlD6E/K50R在體內(nèi)測定對切割有抗性(圖45))。圖47 用 Ad_eIF5Al Δ (2-6)或Ad_eIF5AlK5°K Δ (2-6)感染Hela 細胞導(dǎo)致細胞凋亡比用野生型Ad-eIF5Al或Ad-eIF5AlK5°K感染的細胞凋亡增加。將人宮頸癌Hela S3細胞用不同的腺病毒構(gòu)建體以500個感染單位/細胞感染。于感染后48或72小時收集細胞，進行 Annexin V/PI染色。然后通過流式細胞術(shù)對細胞進行分揀。顯示了凋亡早期(Armexin V+/ PI-)以及晚期(Annexin V+/PI+)的細胞百分率。截除氨基酸2-6增強eIF5Al或eIF5AlK5°K 的細胞凋亡活性。相反，預(yù)期的切割位點的突變降低但不消除eIF5Al或eIF5AlK5°K的細胞凋亡活性。這些結(jié)果表明，半胱天冬酶介導(dǎo)的eIF5Al切割導(dǎo)致具有細胞凋亡活性增加的截短型 eIF5Al。圖48提供了半胱天冬酶介導(dǎo)的截短eIF_5Al在細胞凋亡中的作用模型。圖49圖示放線菌素D處理KAS人骨髓瘤細胞后切割型eIF5A在細胞核中的累積。圖50圖示放線菌素D處理KAS人骨髓瘤細胞后切割型eIF5A在核中的累積。關(guān)鍵詞UN =未處理；actD =用放線菌素D處理；C =胞質(zhì)部分；N =核部分，α -微管蛋白 (tubilin)和α-PCNA是對照。該圖還顯示截短型eIF5A主要在細胞核中累積，而全長 eIF5A均勻分布在胞質(zhì)和核之間。圖51圖示截短型eIF5A在多種細胞系和細胞類型中應(yīng)答不同的細胞凋亡刺激的累積，表明半胱天冬酶-介導(dǎo)的eIF5A切割在細胞凋亡中是普通現(xiàn)象。該圖還顯示截短形式主要在核中累積，而全長eIF5A均勻分布在胞質(zhì)和核之間。圖52提供的研究結(jié)果表明，截短eIF5A在不同細胞系應(yīng)答不同的細胞凋亡刺激的產(chǎn)生一KAS人多發(fā)性骨髓瘤細胞用IL-6饑餓、或IL-6和FBS饑餓處理；UACC1598 (人卵巢癌細胞系)用放線菌素D處理。圖53提供人eIF5Al和eIF5A2的核苷酸序列。發(fā)明詳述本發(fā)明提供編碼截短型eIF_5Al的分離多核苷酸以及截短型elF-Al多肽。截短型 eIF-5Al多核苷酸用于誘導(dǎo)細胞凋亡和殺死癌細胞。所述截短型多核苷酸可用于表達載體中，然后將表達載體給予哺乳動物。截短型eIF-5A形式在哺乳動物中表達并殺死癌細胞。 截短型eIF-5Al蛋白約16kDA，而全長eIf_5Al蛋白約17kDa。較小分子量形式的eIF5A(約16kDa)的形成已在經(jīng)歷凋亡的細胞中觀察到。這種現(xiàn)象也在用細胞因子混合物處理的β胰島細胞和用細胞毒性藥物放線菌素D處理的人骨髓瘤細胞(KAS細胞)中觀察到。參見圖35。還發(fā)現(xiàn)較小分子量形式的eIF5A在HeLa宮頸癌細胞感染Ad-eIF5Al后經(jīng)歷凋亡的細胞中累積，表明較小分子量形式的eIF5A由于蛋白酶裂解產(chǎn)生而不是可變剪接的結(jié)果。較小分子量形式的eIF5A累積伴隨著全長羥丁賴氨酸化(hypUSinated)eIF5A的數(shù)量急劇降低，這一觀察結(jié)果進一步支持較小分子量形式的 eIF5A是由于裂解而不是可變剪接形成的觀點。參見圖36。本發(fā)明提供一種組合物，其包含編碼截短型eIF5Al蛋白質(zhì)的eIF5Al多核苷酸。這種組合物可用于制備誘導(dǎo)患者癌細胞或腫瘤細胞凋亡的藥物。所述eIF5Al多核苷酸編碼的截短型eIF5Al蛋白質(zhì)優(yōu)選包含圖38所示SEQ ID NO :37的氨基酸序列。在某些實施方案中，所述eIF5Al多核苷酸編碼的截短型eIF5Al蛋白質(zhì)約16kDA。
可將組合物和/或藥物給予哺乳動物，包括人。本文使用的“患者”包括哺乳動物和人。誘導(dǎo)細胞凋亡可在癌細胞或腫瘤中產(chǎn)生下列作用延緩癌細胞或腫瘤生長，阻止癌細胞或腫瘤細胞生長，或者殺死癌細胞或降低腫瘤大小以及上述任何作用組合。可治療任何癌癥，在某些實施方案中，癌癥為多發(fā)性骨髓瘤。在某些實施方案中，eIF5Al多核苷酸包含SEQ ID NO 38所示的序列(如圖41所示)。在某些實施方案中，eIF5Al多核苷酸包含在質(zhì)粒或表達載體中。質(zhì)粒和表達載體在下文進一步詳述。在某些實施方案中，表達載體是腺病毒表達載體或PHM6。在某些實施方案中，當(dāng)組合物或藥物用于治療多發(fā)性骨髓瘤時，表達載體包含組織特異性啟動子，例如B 細胞特異性啟動子(即B29)。表達載體可包含pCpG質(zhì)粒。如下文進一步詳述，表達載體可與聚氮丙啶復(fù)合。所述組合物或藥物優(yōu)選腫瘤內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下給予。本發(fā)明還提供編碼截短型eIF5Al蛋白質(zhì)的分離多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO 38所示的序列(如圖41所示)。本發(fā)明還提供一種編碼截短型eIF5Al蛋白質(zhì)的分離多核苷酸，其中所述截短型蛋白質(zhì)包含SEQ ID NO :37所示的氨基酸序列。如下文所述，所述eIF5Al通過半胱天冬酶介導(dǎo)的裂解/切割形成。因此，本發(fā)明還提供通過半胱天冬酶介導(dǎo)的eIF5Al裂解形成的分離的截短型eIF5Al多肽。本發(fā)明進一步提供一種組合物或該組合物制備藥物的用途，所述組合物包含編碼截短型eIF5Al蛋白質(zhì)的eIF5Al多核苷酸和全長eIF5Al多核苷酸。這種組合物用于制備誘導(dǎo)患者癌細胞或腫瘤凋亡的藥物。編碼截短型eIF5A蛋白質(zhì)的eIF5Al多核苷酸如上所述。 全長eIF5Al多核苷酸編碼包含SEQ ID NO :35所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。全長eIF5Al 多核苷酸在下文進一步詳述。在某些實施方案中，所述eIF5Al多核苷酸包含SEQ ID NO 38 所示的序列，所述全長eIF5Al多核苷酸包含SEQ ID NO 43所示的序列(如圖53所示)。所述全長和截短型多核苷酸可存在于本文所述的表達載體中。另外，載體可包含本文所述的啟動子以及任何其它有益的啟動子。在某些實施方案中，全長eIF5A多核苷酸編碼突變eIF5Al，其中所述突變防止或抑制脫氧羥丁賴氨酸合酶(deoxyhypusine synthase)的羥丁賴氨酸化作用 (hypusination)和/或其中所述突變存在于遍在蛋白化位點和/或乙酰化位點上。突變體 /突變在下文進一步詳述。在某些實施方案中，突變體選自K50A、K50R、K67A、K47R、K67R、 K50A/K67A、K50A/K47R、K50A/K67R、K50R/K67A、K50R/K47R、K50R/K67R 和 K47A/K67A。本發(fā)明還提供一種組合物，其包含編碼截短型eIF5A的多核苷酸、編碼突變eIF5A 的核苷酸和靶向eIF5A的3’UTR的siRNA。下文詳述組合/ 二元使用編碼突變eIF5A的核苷酸和靶向eIF5A的3’ UTR的siRNA。所述組合物可用于制備藥物，將其給予患者以誘導(dǎo)癌細胞或腫瘤凋亡。在某些優(yōu)選的實施方案中，siRNA靶向eIF5Al的5，-GCT GGA CTC CTC CTA CAC A-3，序列。siRNA 是 dsRNA 且 dsRNA 的一條鏈包含序列 5，-GCU GGA CUC CUC CUA CAC A-3’。在某些實施方案中，siRNA被穩(wěn)定以防止在血清中降解。全長eIF5Al多核苷酸和/或編碼截短型eIF5Al蛋白質(zhì)的eIF5A多核苷酸可以存在于表達載體中。在某些實施方案中，全長eIF5Al多核苷酸和/或編碼截短型eIF5Al蛋白質(zhì)的eIF5A多核苷酸和/或siRNA與聚氮丙啶復(fù)合。全長eIF5Al多核苷酸和/或編碼截短型eIF5Al蛋白質(zhì)的eIF5A多核苷酸和/或所述siRNA獨立與聚氮丙啶復(fù)合。本發(fā)明還提供一種誘導(dǎo)哺乳動物癌細胞或哺乳動物腫瘤凋亡的方法，其向哺乳動物提供本文所述的組合物或藥物，例如包含編碼截短型eIF5Al的核苷酸、任選包含編碼全長eIF5A的核苷酸或編碼全長突變eIF5A的核苷酸和任選包含靶向eIF5A的3，UTR的 SiRNA0在某些實施方案中，癌癥是多發(fā)性骨髓瘤，將組合物/藥物靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或腫瘤內(nèi)給予。本發(fā)明還涉及聯(lián)合使用靶向內(nèi)源基因以敲除或抑制患者內(nèi)源基因表達的siRNA 和以遞送介質(zhì)/表達載體提供給患者的編碼所述基因的多核苷酸，以提供所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)在宿主中表達。這種組合可用于治療患者由于存在缺陷蛋白或突變蛋白引起的疾病或病癥，即， 其中患者所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)不能實施其必需功能，或者由于其結(jié)構(gòu)缺陷從而擾亂(fowls up) 代謝途徑或生物分子相互作用。將SiRNA設(shè)計成靶向編碼缺陷蛋白質(zhì)的基因，且抑制或敲除缺陷蛋白質(zhì)的表達。將編碼正常(非缺陷)蛋白質(zhì)的多核苷酸給予患者并在患者中表達， 以便正常蛋白質(zhì)可實施其必需功能。在又一實施方案中，將蛋白質(zhì)給予患者，而不是給予編碼所需蛋白質(zhì)的多核苷酸。 術(shù)語蛋白質(zhì)、肽和多肽在本文中可互換使用。優(yōu)選將SiRNA設(shè)計成靶向所述基因的某一區(qū)域，使得其抑制或敲除缺陷蛋白質(zhì)的內(nèi)源表達，但同時不會影響給予的編碼正常蛋白質(zhì)的多核苷酸的外源表達。例如，siRNA可靶向3’UTR使得其不會影響給予的有義構(gòu)建體(編碼該蛋白質(zhì)的多核苷酸)外源表達。通過抑制或敲除缺陷基因的內(nèi)源表達，較少或沒有缺陷蛋白質(zhì)與外源多核苷酸表達的正常蛋白質(zhì)競爭。本發(fā)明有益應(yīng)用涉及的一種疾病實例是鐮狀細胞性貧血。鐮狀細胞性貧血是影響血紅蛋白的一種血液障礙，紅細胞(RBC)中的血紅蛋白幫助運輸氧到全身各處。當(dāng)一個人遺傳到兩個異常基因(從父母各遺傳一個)，其導(dǎo)致表達突變血紅蛋白 (HbS)，就會發(fā)生鐮狀細胞性貧血。突變的血紅蛋白引起RBC形狀改變。具有正常血紅蛋白 (血紅蛋白A或HbA)的紅細胞容易通過血流移動，將氧運輸?shù)饺硭屑毎?。它們能夠容易地“擠”過非常細小的血管。鐮狀細胞性貧的發(fā)生是因為異常血紅蛋白(HbQ往往聚集在一起，使得紅細胞呈粘性、僵硬且更易破碎，使它們形成彎曲鐮刀狀。盡管已知幾百種HBB基因變體，但鐮狀細胞性貧血最通常由血紅蛋白變體HbS引起。在這種變體中，疏水性氨基酸纈氨酸取代在HBB多肽鏈的第6個氨基酸位置的親水性谷氨酸。這種取代在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的外面產(chǎn)生疏水斑點，其粘住相鄰血紅蛋白分子β鏈的疏水區(qū)。這使得HbS分子聚集在一起(聚合)形成僵硬的纖維，產(chǎn)生“鐮刀”狀紅細胞。聚合僅在紅細胞釋放氧分子后發(fā)生，氧分子被送到全身的各種組織。一旦紅細胞回到其中血紅蛋白可結(jié)合氧的肺部，HbS分子的長纖維就會解聚或裂解為單一分子。聚合和解聚合之間的循環(huán)使紅細胞膜僵化。在不攜帶氧時這些紅細胞的僵化及形狀扭曲可導(dǎo)致小血管堵塞。這種堵塞可引起疼痛發(fā)作并且可損害器官。鐮狀細胞性貧血是常染色體隱性遺傳疾病。顯現(xiàn)這種疾病的人必須遺傳到兩拷貝的HbS變體或者遺傳到一拷貝HbS及一拷貝的另一變體。具有一拷貝正常HBB基因(HbA) 和一拷貝HbS的攜帶者具有鐮狀細胞特征而不會表現(xiàn)出疾病癥狀。因此，本發(fā)明的一個實施方案提供一種治療患者鐮狀細胞性貧血的方法。給予患者靶向HBB基因的siRNA。設(shè)計SiRNA以抑制、優(yōu)選敲除血紅蛋白Hbs變體的表達。將編碼正常血紅蛋白的多核苷酸提供給患者使得所述患者表達正常的血紅蛋白。還設(shè)計SiRNA以便其不會干擾編碼正常血紅蛋白的外源多核苷酸的表達。因此，所述患者不再產(chǎn)生變體血紅蛋白(或者極少產(chǎn)生)，代之以產(chǎn)生正常健康的血紅蛋白，以產(chǎn)生更多功能正常的正常紅細胞。本發(fā)明還可用于發(fā)生蛋白質(zhì)翻譯后修飾導(dǎo)致或引起的疾病的情況。siRNA用于抑制內(nèi)源蛋白質(zhì)表達，使得沒有或很少可用于翻譯后修飾。然后，提供編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸給患者用于外源表達。修飾蛋白質(zhì)以便其不能被翻譯后修飾。然后這種蛋白質(zhì)可被機體適當(dāng)使用，但由于其不能被翻譯后修飾，所以不會導(dǎo)致疾病。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白不同的翻譯后修飾。例如，在翻譯后，氨基酸的翻譯后修飾通過以下方法擴展蛋白質(zhì)的功能范圍 連接其它生化功能團例如乙酸基、磷酸基、各種脂質(zhì)和碳水化合物；改變氨基酸的化學(xué)性質(zhì) (例如瓜氨酸化(citrullination))或進行結(jié)構(gòu)變化，如形成二硫鍵。另外，酶可從蛋白質(zhì)的氨基末端除去氨基酸，或者從中間切割肽鏈。例如，將肽激素胰島素在二硫鍵形成后切割兩次，將前肽從鏈的中間除去；所得的蛋白質(zhì)由二硫鍵連接的兩個多肽鏈組成。同樣，大多數(shù)新生成的多肽以氨基酸甲硫氨酸開始，因為在mRNA上的“啟始”密碼子也編碼這種氨基酸。在翻譯后修飾時通常除去該氨基酸。其它修飾如磷酸化是控制蛋白質(zhì)行為常見機制的一部分，例如激活或滅活酶。另外的翻譯后修飾包括通過脫氧羥丁賴氨酸合酶(DiB)對真核細胞翻譯起始因子5A(eIF5A)的羥丁賴氨酸化作用。因此，本發(fā)明提供一種改變患者基因表達的方法，其中將編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸提供給患者并在患者中表達。蛋白質(zhì)可以是正常/野生型蛋白質(zhì)或突變蛋白質(zhì)。相應(yīng)內(nèi)源基因的表達被給予患者的siRNA抑制。該方法還包括提供包含編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的多核苷酸的構(gòu)建體，其中所述多核苷酸在患者中表達以產(chǎn)生目標(biāo)蛋白質(zhì)。在其中內(nèi)源基因表達缺陷蛋白質(zhì)的某些實施方案中，設(shè)計多核苷酸以編碼正常/健康蛋白質(zhì)。給予SiRNA抑制缺陷內(nèi)源蛋白質(zhì)表達。在其中內(nèi)源基因表達正常/健康蛋白質(zhì)的某些實施方案中，設(shè)計多核苷酸以編碼突變蛋白質(zhì)，其與正常/健康蛋白質(zhì)或非突變蛋白質(zhì)發(fā)生的一樣不能被翻譯后修飾。給予SiRNA抑制內(nèi)源蛋白質(zhì)表達，使得這種蛋白質(zhì)很少可用于翻譯后修飾。在某些實施方案中，選取或設(shè)計siRNA以靶向基因的區(qū)域，以便不影響外源多核苷酸表達。例如，siRNA可靶向3’ UTR或3’末端?？蓪iRNA作為裸siRNA或?qū)τ谘宸€(wěn)定的裸siRNA遞送至患者。SiRNA可通過系統(tǒng)注射，即IP或IV。或者，SiRNA可局部注射或遞送至機體所需部位。在某些實施方案中，siRNA可以遞送介質(zhì)給予，例如但不限于樹狀聚體、脂質(zhì)體或聚合物。編碼所需蛋白質(zhì)的多核苷酸可通過提供或允許核苷酸表達的任何遞送方式給予。 術(shù)語多核苷酸和核苷酸本文可互換使用。遞送可通過任何病毒或非病毒機制，例如但不限于質(zhì)粒、表達載體、病毒構(gòu)建體、腺病毒構(gòu)建體、樹狀聚體、脂質(zhì)體或聚合物。在某些實施方案中，將具有減少的CpG 二核苷酸的表達質(zhì)粒用于表達多核苷酸?？墒褂萌魏文軌虼龠M多核苷酸表達的啟動子，啟動子的選擇取決于該療法應(yīng)用的需要。例如，殺死多發(fā)性骨髓瘤，可能需要對B細胞特異性的啟動子，例如人似9啟動子/增強子。在其它實施方案中，啟動子可以是其它組織特異性啟動子，或者可以是系統(tǒng)啟動子。編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的多核苷酸可通過IV或皮下注射或任何其它生物學(xué)上可接受的遞送機制遞送?；蛘?，多核苷酸可用脂質(zhì)體或其它任何提供遞送DNA (或質(zhì)?；虮磉_載體)至目標(biāo)腫瘤或癌細胞的適宜“載體”或“介質(zhì)”中遞送。參見例如，Luo, Danet al.，Nature Biotechnology, Vol. 18, January 2000，pp. 33-37，合成DNA遞送系統(tǒng)綜述。因此，優(yōu)選經(jīng)納米大小介質(zhì)(例如脂質(zhì)體、樹狀聚體或類似的無毒納米微粒)遞送核苷酸/質(zhì)粒/表達載體。優(yōu)選介質(zhì)保護核苷酸/質(zhì)粒/表達載體不被過早清除，或者當(dāng)遞送有效量的核苷酸/質(zhì)粒/表達載體至患者腫瘤或癌細胞，不產(chǎn)生免疫應(yīng)答。示例性介質(zhì)包括簡單的與核苷酸/質(zhì)粒/表達載體結(jié)合的納米微粒至更復(fù)雜的聚乙二醇化介質(zhì)，例如具有連接在其表面上的配體以靶向特異性細胞受體的聚乙二醇化脂質(zhì)體。本領(lǐng)域已知脂質(zhì)體和聚乙二醇化脂質(zhì)體。在傳統(tǒng)脂質(zhì)體中，要遞送的分子(即小藥物、蛋白質(zhì)、核苷酸或質(zhì)粒)包含在脂質(zhì)體的中央腔中。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，也有可用于分子遞送的“隱形”、靶向、陽離子脂質(zhì)體。參見例如，Hortobagyi, Gabriel N. et al. ， J. Clinical Oncology, Vol. 19, Issue 14 (July)2001 :3422-3433 ；Yu, Weiet al.， Nucleic Acids Research. 2004,32(5) ；e48?？伸o脈內(nèi)注射脂質(zhì)體，可修飾脂質(zhì)體使它們的表面對雙分子層更具親水性(通過加入聚乙二醇(“聚乙二醇化”))，增加它們在血液中的循環(huán)時間。這些被稱為“隱形”脂質(zhì)體，尤其是可用作親水性(水溶性)抗癌藥物例如多柔比星和米托蒽醌的載體。為加強攜帶藥物的脂質(zhì)體與靶細胞例如腫瘤細胞的特異性結(jié)合特性，可將特異性分子(例如抗體、蛋白質(zhì)、肽等)連接在脂質(zhì)體表面上。例如，抗癌細胞上的受體的抗體可用于將脂質(zhì)體靶向癌細胞。在靶向多發(fā)性骨髓瘤的情況下，例如葉酸、II-6或轉(zhuǎn)鐵蛋白可用于將脂質(zhì)體靶向多發(fā)性骨髓瘤細胞。本領(lǐng)域同樣已知樹狀聚體和提供優(yōu)選的遞送介質(zhì)。參見例如下列文獻關(guān)于樹狀
:Marjoros, Istvan, J. et al.， 〃 PAMAM Dendrimer-Based Multifunctional Conjugate for Cancer Therapy :Synthesis,Characterization,and Functionality, " B iomacromo1ecu1es, Vol. 7, No. 2,2006 ；572-579 ；Majoros,Istvan J. et al. , J. Med. Chem, 2005.48,5892-5899 ο在優(yōu)選的實施方案中，遞送介質(zhì)包括聚氮丙啶納米微粒。示例性聚氮丙啶納米微粒是 h vivo-jetPEI ,目前由 Polyplus Transfection, Inc.生產(chǎn)。h vivo-jetPEI 是陽離子聚合物轉(zhuǎn)染劑，可用作DNA和siRNA遞送劑。Polyplus Transfection生產(chǎn)的 In vivo-jetPEI 是線性聚氮丙啶試劑，其在動物中提供可靠的核酸遞送。其用于基因療法(Ohana et al,2004. Gene Ther Mol Bio 8 :181-192 ；Vernejoul et al. ,2002. Cancer Research 62 :6124-31)> RNA ^ Jft (Urbain-Kleinet al. ,2004. Gene therapy 23 1-6 ； Grezelinskiet al. , 2006. Human Gene Therapy 17 :751-66)禾口遺傳疫苗(Garzon et al., 2005. Vaccine 23:1384-92)。In vivo jet-PEI目前在人臨床試驗中用作癌基因療法的遞送載體(Lemkineet al. , 2002. Mol. Cell. Neurosci. 19 :165-174)。In vivo-jetPEI 將核酸縮合成大約50nm納米微粒，能穩(wěn)定若干小時。由于這種獨特的保護機制，注射后血細胞聚集較其它試劑低，因此阻止組織擴散受限、紅細胞聚集和微栓塞。這些納米微粒非常小，可以擴散至組織中并通過內(nèi)吞進入細胞。h vivo-jetPEI 幫助核酸自核內(nèi)體釋放并轉(zhuǎn)運穿過核膜。在優(yōu)選的實施方案中，將SiRNA和包含多核苷酸的載體/質(zhì)粒這二者經(jīng)h vivo-jetPEI 復(fù)合物給予患者?？蓪iRNA和包含多核苷酸的載體/質(zhì)粒經(jīng)聚合復(fù)合物例如聚氮丙啶或者h vivo jetPEI 復(fù)合物復(fù)合在一起，或者可分開與聚合物復(fù)合。例如， 當(dāng)需要將siRNA和包含多核苷酸的載體/質(zhì)粒分開給予患者(在時間和/或遞送位點上的分開)時，優(yōu)選將siRNA和多核苷酸與不同載體復(fù)合。當(dāng)所述給予同時進行和給予位點相同，優(yōu)選siRNA與多核苷酸復(fù)合在一起。在又一實施方案中，將蛋白質(zhì)本身遞送至患者，而不是給予質(zhì)?；蜉d體以遞送在患者中表達的多核苷酸。所述蛋白質(zhì)可以是分離蛋白質(zhì)或者是合成蛋白質(zhì)。本發(fā)明的一個實施方案提供一種治療患者癌癥的方法，患者包括哺乳動物和人。 治療癌癥包括但不限于誘導(dǎo)癌細胞凋亡、殺死癌細胞、降低癌細胞數(shù)量和降低腫瘤體積/ 重量。該方法包括給予一種組合物，其包含eIF5Al siRNA和編碼突變eIF5Al的多核苷酸。 組合物、eIF5AlsiRNA和編碼突變eIF5Al的多核苷酸在下文詳細論述。所有細胞都產(chǎn)生真核起始因子5A( “eIF_5A”)(本文也稱為“因子5A”)。哺乳動物細胞產(chǎn)生兩種同種型eIF-5A(eIF-5Al和eIF_5A2)。eIF_5Al被稱為細胞凋亡特異性 eIF-5A，因為其在遭遇凋亡的細胞中上調(diào)。人eIF-5Al的登錄號為NM001970，示于圖1。人們認為，eIF-5Al負責(zé)將編碼細胞凋亡必需的蛋白質(zhì)的mRNA群運出細胞核。eIF_5A2被稱為增殖eIF-5A，因為人們認為其負責(zé)將編碼細胞增殖必需的蛋白質(zhì)的mRNA群運出細胞核° 參見 Liu & Tartakoff (1997) Supplement to Molecular Biology of the Cell, 8, 426a. Abstract No. 2476,37th American Society for Cell Biology Annual Meeting 禾口 Rosorius et al. (1999)J. Cell Science,112，2369—2380。兩種因子5A都通過脫氧羥丁賴氨酸合酶(“DHS”)進行翻譯后修飾。DHS使 eIF-5A羥丁賴氨酸化。羥丁賴氨酸(Hypusine)是一種獨特的氨基酸，見于所有所檢查的真核細胞和古細菌，但是在真細菌中沒有發(fā)現(xiàn)，eIF-5A是唯一已知的包含羥丁賴氨酸的蛋白質(zhì)。Park(1988)J. Biol. Chem.，洸3，7447-7449 ;Schumann & Klink (1989) System. Appl. Microbiol,11,103-107 ；Bartig et al. (1990)System. Appl. Microbiol,13,112-116 ； Gordon et al. (1987a) J. Biol. Chem.，262，16585-16589。羥丁賴氨酸化 eIF_5A 在兩個翻譯后步驟中形成第一步是脫氧羥丁賴氨酸殘基的形成，脫氧羥丁賴氨酸合酶催化將亞精胺的4-氨基丁基部分轉(zhuǎn)移至前體eIF_5A的特定賴氨酸的α _氨基上；第二步涉及通過脫氧羥丁賴氨酸羥化酶羥基化4-氨基丁基部分形成羥丁賴氨酸。eIF_5A的氨基酸序列在物種中十分保守，并且嚴格保守的氨基酸序列圍繞著 eIF-5A的羥丁賴氨酸殘基，其表明這種修飾對于存活可能是重要的。Parket al. (1993) Biofactors, 4,95-104.這種設(shè)想還得到以下觀察結(jié)果的進一步支持迄今為止只在酵母中發(fā)現(xiàn)兩種同種型eIF-5A的失活或DHS基因的失活，DHS催化活化的第一步，從而阻止細胞分裂。Schnier et al. (1991)Mol Cell. Biol, 11,3105-3114 ；Sasakiet al. (1996)FEBS Lett.，384，151-154 ；Parket al. (1998) J. Biol. Chem.，273，1677-1683。然而，酵母中的 eIF-5A蛋白質(zhì)的缺乏僅僅使總蛋白質(zhì)合成略微減少，表明eIF-5A只是特定部分mRNA的翻譯必需的，而不是蛋白質(zhì)總合成所必需的。Kanget al. (1993)，‘‘ Effect of initiationfactor eIF_5A depletion on cell proliferation and protein synthesis," in Tuite, M. (ed.) ,Protein Synthesis and Targeting in Yeast,NATO Series H.。最近發(fā)現(xiàn)，配體結(jié)合的eIF-5A具有高度保守的基序，也證明eIF-5A的重要性。Xu & Chen (2001) J. Biol. Chem.，276，2555-2561。另外，發(fā)現(xiàn)修飾的eIF_5A的羥丁賴氨酸殘基對于序列-特異性結(jié)合RNA是必需的，而結(jié)合不提供對核糖核酸酶的保護。本發(fā)明人已經(jīng)表明，將編碼eIF_5A的多核苷酸給予細胞時，會增加那些細胞的凋亡。他們還表明，他們能夠通過給予eIF-5Al多核苷酸，然后使其在癌細胞中表達從而推動癌細胞凋亡。參見共同未決申請10/200, 148 ； 11/287, 460 ；11/293，391和11/637，835，它們?nèi)客ㄟ^引用整體結(jié)合到本文中。本發(fā)明人另外確定當(dāng)細胞具有增強羥丁賴氨酸化形式因子5A時，細胞進入生存模式，而不會經(jīng)歷它們通常隨著時間發(fā)生的細胞凋亡。值得注意的是，癌細胞中有顯著量的羥丁賴氨酸化因子5A，因此，細胞不進行凋亡(和不會死亡)。因此，通過殺死癌細胞治療癌癥(推動癌細胞進入細胞凋亡途徑)，將編碼eIF-5Al的多核苷酸給予患者或者癌細胞或腫瘤以增加表達eIF-5Al，其再導(dǎo)致癌細胞凋亡，最終細胞死亡和腫瘤皺縮。然而，如果只提供編碼eIF-5Al蛋白質(zhì)的多核苷酸上調(diào)eIF-5Al基因表達而不另外使用siRNA抑制eIF_5Al 內(nèi)源表達，就會出現(xiàn)競爭引導(dǎo)細胞進入細胞凋亡途徑的eIF-5Al表達與存在的引導(dǎo)細胞進入細胞存活途徑的羥丁賴氨酸化因子5A競爭。本發(fā)明消除了這種競爭，并且表現(xiàn)的改善不只是增加了 eIF-5Al表達。使給予患者或細胞的多核苷酸突變，使得產(chǎn)生的表達蛋白不能被羥丁賴氨酸化。另外，因子5A的內(nèi)源表達用靶向eIF-5A的siRNA敲除/抑制，使得周圍沒有/較少內(nèi)源eIF-5Al被羥丁賴氨酸化。因此，由于細胞中沒有(或基本沒有)羥丁賴氨酸化eIF-5A，所以它們不會推動存活模式。編碼突變eIF_5Al的多核苷酸優(yōu)選被突變，以便其不能被羥丁賴氨酸化，因此不能驅(qū)動細胞進入存活模式。例如，在一個實施方案中，編碼eIF-5A的多核苷酸突變使得50 位的賴氨酸(K)(其通常被DHS羥丁賴氨酸化)變化為丙氨酸(A)(其不能被羥丁賴氨酸化)。這種突變表示為K50A。在另一實施方案中，67位賴氨酸變化為精氨酸(R)。這種突變體表示為(K67R)。 在又一實施方案中，67位賴氨酸(K)變化為丙氨酸(A)，表示為(K67A)。在又一實施方案中，50位賴氨酸(K)變化為精氨酸(K50R)；又一實施方案提供突變體，其中47位賴氨酸(K) 變化為精氨酸(K47R)。在其它實施方案中，使用雙突變體。一種雙突變體是其中50位賴氨酸(K)變化為精氨酸(R)，而67位賴氨酸(K)變化為精氨酸(R)。這種雙突變體被稱為K50R/K67R。這種雙突變體同樣不能被羥丁賴氨酸化，但是所述氨基酸的變化不改變eIF-5Al的3-D結(jié)構(gòu)，與單個突變(K50A)差不多。這種雙突變因此提供十分類似3-D形狀且如野生型折疊的蛋白質(zhì)，因此比單突變體更穩(wěn)定。由于更穩(wěn)定，其在機體中存在較長時間以提供較持久的治療作用。因此，機體具有的因子5A能滿足正常細胞功能但其不能羥丁賴氨酸化，那么細胞不會進入細胞存活模式從而避免細胞凋亡。另一種雙突變體是其中47位賴氨酸(K)變化為精氨酸(R)和在50位上的賴氨酸變化為精氨酸(R)，這種突變體表示為(K47R/K50R)。本發(fā)明提供另一種雙突變體，其中在 50位上的賴氨酸(L)變化為丙氨酸(A)，而在67位上的賴氨酸變化為丙氨酸(A)，這種突變體表示為(K50A/K67A)。由于機體需要因子5A以便維持正常細胞存活和健康細胞增殖，所以，如果SiRNA 被系統(tǒng)遞送，則優(yōu)選siRNA不完全阻斷患者的表達。eIF-5A表達控制可這樣實現(xiàn)使用不完全關(guān)閉表達的siRNA (即關(guān)閉或降低表達但不完全關(guān)閉表達)或者利用劑量形式和/或治療方案以平衡表達水平，從而既維持健康細胞的生長及功能正常，又推動癌細胞凋亡?；蛘?，可局部遞送siRNA。如果局部遞送siRNA至癌細胞或腫瘤，那么表達優(yōu)選敲除。通過敲除表達，周圍就沒有化因子5A被羥丁賴氨酸，因而沒有羥丁賴氨酸化eIF-5A封鎖細胞進入存活模式。由于局部遞送siRNA至癌癥或腫瘤，所以不需要提供eIF-5A用于正常細胞生長。在某些實施方案中，內(nèi)源基因為eIF5Al。將靶向eIF5Al的siRNA給予患者以抑制內(nèi)源eIF-5Al表達。在某些實施方案中，siRNA包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2或者是任何靶向eIF5Al的siRNA，其將抑制內(nèi)源eIF_5Al表達。在某些實施方案中，eIF5Al是人 eIF-5Al (圖1所示)且所述患者是人。已知其它靶向人eIF-5Al的siRNA并且公開于共同未決的申請 11/134，445 ； 11/287，460 ； 11/184，982 ； 11/293，391 ； 11/725，520 ； 11/725，470 ； 11/637，835。在其它實施方案中，患者是哺乳動物且eIF5Al是哺乳動物特異性的。例如，患者為狗且eIF5Al是狗eIF5Al。在某些實施方案中，siRNA基本上由圖25所示的siRNA構(gòu)建體組成。例如，siRNA包含靶向eIF5Al的核酸但同樣包含突出端例如U或T核酸，或者還包含標(biāo)簽，例如his標(biāo)簽(通常稱為HA標(biāo)簽-其通常用于體外研究)。可包括于5’或3’ 末端連接的分子或其它核酸(例如甚至包含在圖25所示核酸的連續(xù)鏈中)，這些分子或核酸屬于“基本上組成”的部分，條件是siRNA構(gòu)建體能夠降低目標(biāo)基因的表達。優(yōu)選siRNA 靶向eIF5Al基因的區(qū)域，使得不影響外源多核苷酸表達。例如eIF5Al siRNA靶向3’ UTR 或3，末端。圖25所示的SiRNA是示例性的eIF5Al siRNA。多核苷酸編碼eIF5Al，其中所述多核苷酸突變以編碼eIF5Al變體。設(shè)計突變 eIF5Al使得突變體eIF5Al不能被翻譯后修飾(不能被羥丁賴氨酸化)。示例性突變體如上所述。涉及實體腫瘤的癌癥時，可能需要直接遞送siRNA至腫瘤。就時間和遞送位點而言，siRNA可與多核苷酸分開給予，或者可于同時和/或相同的遞送位點一起給予。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，給予siRNA的恰當(dāng)時間可能是當(dāng)內(nèi)源蛋白質(zhì)正在翻譯時而不是在翻譯后。盡管本發(fā)明人早就表明eIF5Al對正常組織是無毒的(參見2005年11月觀日申請的未決申請系列號11Λ93，391，其通過引用整體結(jié)合到本文中)，相比于直接給予eIF5A 多核苷酸/質(zhì)粒/表達載體，還是可優(yōu)選遞送復(fù)合物。優(yōu)選的遞送系統(tǒng)提供有效量的eIF5Al 至患者腫瘤或癌細胞群，還優(yōu)選提供靶向遞送至腫瘤或癌細胞群。因此，在某些實施方案中，優(yōu)選遞送eIF5Al核苷酸/質(zhì)粒/表達載體通過納米大小介質(zhì)例如脂質(zhì)體、樹狀聚體或類似無毒納米微粒例如聚氮丙啶聚合物(例如h vivo JetPEI復(fù)合物)遞送。eIF5Al蛋白質(zhì)同樣可直接遞送至腫瘤位點。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定遞送 eIF5Al蛋白質(zhì)的治療方案的劑量和時間長短。通過eIF5Al誘導(dǎo)細胞凋亡的分子基礎(chǔ)在下文論述。死亡受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)
用Ad_eIF5Al (野生型eIF5Al的腺病毒)或Ad_eIF5Al (K50A)處理癌細胞誘導(dǎo)半胱天冬酶8 (其通過死亡受體-配體結(jié)合啟動)和半胱天冬酶3 (執(zhí)行者半胱天冬酶)激活。這些可能是eIF5Al的間接影響，事實上用不能被羥丁賴氨酸化的eIF5Al(K50A)處理或治療后，半胱天冬酶8和半胱天冬酶3同樣被激活，表明這種作用是由賴氨酸5(leIF5Al引起的。用Ad-eIF5Al處理還顯示導(dǎo)致死亡受體上調(diào)，與先前的TNFRl上調(diào)一樣。線粒體路徑細胞凋亡的線粒體路徑直接或間接涉及賴氨酸5(leIF5Al，這得到大量觀察結(jié)果的支持，包括發(fā)現(xiàn)用eIF5Al或eIF5Al (K50A)處理癌細胞激活半胱天冬酶9。同樣，在激活線粒體凋亡路徑中起作用的p53顯示被eIF5Al調(diào)節(jié)。例如，用放線菌素D處理癌細胞上調(diào) p53，而p53的這種上調(diào)被eIF5Al siRNA抑制。與此一致的是，用Ad_eIF5Al處理癌細胞上調(diào)p53mRNA。用eIF5Al處理癌細胞同樣誘導(dǎo)Bax從胞液遷移至線粒體，接著線粒體膜電位損失和細胞色素C從線粒體膜內(nèi)空間釋放入胞液中。另外，這種處理導(dǎo)致切割型Bcl2、Bim 和剪接型Bim上調(diào)，它們都是促進細胞凋亡的。MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)另外，本發(fā)明人已獲得eIF5Al參與細胞凋亡相關(guān)性的MAHi信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的證據(jù)。例如，用Ad-eIF5Al處理癌細胞上調(diào)P-JNK，其又抑制抗凋亡的Bcl2。另外，Ad_eIF5Al和 Ad-eIF5Al (K50A)兩者都誘導(dǎo)P_p38形成，其又通過影響各種促凋亡劑啟動細胞凋亡，促凋亡劑包括TNFRl & TNF ；FAS & FASL ；半胱天冬酶8 ；Bid ；細胞色素C和半胱天冬酶3。NF- κ B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有證據(jù)表明TNF-K B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)支持骨髓瘤牛長。例如，骨髓瘤細胞粘附至骨髓基質(zhì)細胞誘導(dǎo)NF-K B-依賴性轉(zhuǎn)錄上調(diào)IL-6，其既是多發(fā)性骨髓瘤的生長因子又是抗凋亡因子[Chauhanet al. (1996)Blood 87，1104]。另外，骨髓瘤細胞分泌的TNF-α激活骨髓基質(zhì)細胞中的NF- κ B,從而上調(diào)IL-6轉(zhuǎn)錄和分泌。TNF- α還激活骨髓瘤細胞中的NF- κ B,其導(dǎo)致骨髓瘤細胞和骨髓基質(zhì)細胞兩者上的細胞內(nèi)粘附分子-KICAM-I ；CD54)和血管細胞粘附分子-1 (VCAM-1 ;CD106)上調(diào)[Hideshimaet al. (2001) Oncogene 20,4519]。這又增強了骨髓瘤細胞與骨髓基質(zhì)細胞的締合[Hideshimaet al. (2001) Oncogene 20，4519]。相反， 這些作用通過阻止TNF α誘導(dǎo)的NF-κ B活化而被抑制[Hideshimaet al. (2001) Oncogene 20,4519]。事實上，有可能NF-κ B介導(dǎo)骨髓瘤細胞中針對TNF α誘導(dǎo)的細胞凋亡的保護 [Hideshimaet al. (2002) JBC277,16639] 0這些和其它觀察結(jié)果表明，NF_kB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是多發(fā)性骨髓瘤療法中引人注目的靶點。本發(fā)明人已經(jīng)表明，eIF5Al siRNA在人骨髓瘤細胞中抑制NF-κ B激活和ICAM-I 形成這二者。這些觀察結(jié)果表明，eIF5Al在NF-kB激活中起作用，并且因為NF-KB激活后的作用實際上都是促存活的，所以我們預(yù)測這種激活直接或間接由羥丁賴氨酸化eIF5Al 介導(dǎo)。IL-I骨髓瘤細胞過量產(chǎn)生促炎細胞因子IL-I是多發(fā)性骨髓瘤的特征，其導(dǎo)致骨組織退化。eIF5Al siRNA已顯示急劇降低小鼠中LPS攻擊誘導(dǎo)的IL-I過量產(chǎn)生。本發(fā)明的一個實施方案提供一種治療多發(fā)性骨髓瘤的方法。多發(fā)性骨髓瘤(“MM”) 是一種漸進性致死性疾病，其特征在于惡性血漿細胞在骨髓中增殖并存在溶骨性病變。多發(fā)性骨髓瘤是一種不能治愈但是可治療的漿細胞癌。漿細胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其生產(chǎn)幫助抵抗感染和疾病的免疫球蛋白(抗體)。多發(fā)性骨髓瘤的特征在于骨髓中過量的異常漿細胞和完整的單克隆免疫球蛋白(IgG、IgA、IgD或IgE ;“M-蛋白質(zhì)”)或 Bence-Jones蛋白質(zhì)(無單克隆輕鏈)過量產(chǎn)生。低鈣血癥、貧血、腎損害、細菌感染易感性增加和正常免疫球蛋白產(chǎn)生受損都是多發(fā)性骨髓瘤的常見臨床表現(xiàn)。多發(fā)性骨髓瘤還常常以彌散性骨質(zhì)疏松為特點，通常見于骨盆、脊柱、肋骨和頭蓋骨。本發(fā)明看來十分適于治療多發(fā)性骨髓瘤，因為在多發(fā)性骨髓瘤中發(fā)現(xiàn)了刺激反饋回路。例如，多發(fā)性骨髓瘤在骨髓中以低濃度產(chǎn)生11-1。Il-I又刺激基質(zhì)細胞產(chǎn)生IL-6， 然后其刺激多發(fā)性骨髓瘤生長。本發(fā)明人先前已經(jīng)表明(參見未決申請11/725，539和 11/184，982)，直接針對eIF-5Al的siRNA能夠抑制促炎細胞因子表達，例如Il-I ；TNF-α 和11-8)。因此，siRNA不僅抑制eIF-5A表達(這樣較少發(fā)生羥丁賴氨酸化作用)，而且切斷或降低I1-1/I1-6反饋回路。靶向人eIF5A的siRNA用于抑制腫瘤中內(nèi)源羥丁賴氨酸化eIF5A的水平，而表達 eIF5A突變體(eIF5AK5°K)(其不能被羥丁賴氨酸化)的RNAi-抗性質(zhì)粒，用于提高體內(nèi)未修飾的eIF5A水平。腫瘤內(nèi)注射包含eIF5A siRNA的PEI納米復(fù)合物抑制MM腫瘤生長超過 80% (***p = 0. 0003,與包含對照siRNA的復(fù)合物相比)，表明抑制羥丁賴氨酸化eIF5A的水平具有抗腫瘤效果。包含eIF5AK5°K表達質(zhì)粒的PEI復(fù)合物具有類似的效果并且抑制腫瘤生長超過70% Cp = 0.001，與包含對照質(zhì)粒的復(fù)合物相比)。因此，通過抑制促生長的羥丁賴氨酸化eIF5A或者通過增加促凋亡的未羥丁賴氨酸化形式eIF5A的水平可抑制MM 腫瘤生長。腫瘤內(nèi)遞送包含eIF5A siRNA和RNAi-抗性eIF5AK5°K質(zhì)粒的復(fù)合物對腫瘤生長具有協(xié)作效應(yīng)并且使腫瘤明顯縮小，抑制腫瘤生長達94% (_ = 0.000幻。靜脈內(nèi)遞送 eIF5AsiRNA/eIF5AK50E PEI復(fù)合物同樣有效降低腫瘤生長達95%廣ρ = 0. 002)，表明系統(tǒng)遞送所述治療劑是切實可行的。局部遞送和系統(tǒng)遞送eIF5A siRNA/eIF5AK50E pDNA PEI復(fù)合物都導(dǎo)致多發(fā)性骨髓瘤明顯抗腫瘤效應(yīng)。本發(fā)明還提供一種可用于治療癌癥(包括多發(fā)性骨髓瘤)的組合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述組合物是質(zhì)粒DNA和eIF5AlsiRNA的復(fù)合物，所述質(zhì)粒DNA編碼不能被羥丁賴氨酸化的點突變eIF5Al，所述eIF5Al siRNA選擇性抑制內(nèi)源人eIF5Al但是對所述質(zhì)粒編碼的點突變eIF5Al沒有影響。eIF5Al siRNA和編碼突變eIF5Al的多核苷酸如上所述。質(zhì)粒DNA和siRNA兩者優(yōu)選與PEI (聚氮丙啶)納米微粒復(fù)合。它們可分開復(fù)合并且分開給予或一起給予，或者它們可復(fù)合在一起。DNA和RNA與PEI上的正電荷氨基結(jié)合并且在納米微粒吸收入細胞時釋放出來。已經(jīng)證明PEI-核酸復(fù)合物有效吸收入分裂細胞和未分裂細胞中。質(zhì)粒DNA優(yōu)選編碼eIF5Al (K50R)，其如eIF5Al (K50A) 一樣不能被羥丁賴氨酸化， 因而是強有力地促細胞凋亡。eIF5Al(K50R)表達優(yōu)選通過B細胞特異性啟動子調(diào)節(jié)。eIF5Al siRNA優(yōu)選是內(nèi)源人eIF5Al的3’ -末端特異性的而不影響反式 eIF5Al (K50R)的表達。示例性的優(yōu)選eIF5Al siRNA包含圖25所示的siRNA/基本上由圖25所示的siRNA組成或者就是由圖25所示的siRNA組成。納入eIF5Al siRNA的根本原因在于(1)消除內(nèi)源eIF5Al，其幾乎全部被羥丁賴氨酸化因而為促存活形式；( 抑制NF-kB的激活，由此降低IL-6的產(chǎn)生和細胞內(nèi)粘附分子形成；和(3)抑制IL-I形成。所述eIF5Al siRNA與eIF5Al (K50R)協(xié)同作用誘導(dǎo)骨髓瘤細胞凋亡。由于以上(2)和(3)都是促存活事件，所以它們很可能通過羥丁賴氨酸化eIF5Al介導(dǎo)，因而不受不能被羥丁賴氨酸化的eIF5Al(K50R)影響。這種方法產(chǎn)生大量未羥丁賴氨酸化的eIF5A，其引起癌細胞包括多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡，但對健康細胞幾乎沒有影響。優(yōu)選的組合物在本文指SNS01。SNSOl是一種包含RNAi-抗性質(zhì)粒DNA和siRNA 兩者的復(fù)合物，所述RNAi-抗性質(zhì)粒DNA編碼由啟動子驅(qū)動的eIF5AK5°K，所述啟動子限制表達于B-細胞源的細胞(包括骨髓瘤細胞)以增強安全性，而siRNA靶向具有dTdT 3’突出端的人eIF5A以提高核酸酶抗性，且該siRNA和質(zhì)粒與h vivo JetPEI 復(fù)合。
實施例實施例1 用野生型eIF_5Al和變體eIF_5Al轉(zhuǎn)染HeLaS3細胞將HeLaS3細胞用Lipofectamine 2000和表達HA-標(biāo)記的eIF5Al變體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，所述變體包括野生型 eIF5Al (WT)、eIF5AlK50R(K50R)、eIF5AlK67R(K67R)、 eIF5AlK67A(K67A)、eIF5AlK47R/K50R (K4750R)，eIF5A1K50R/K67R (K5067R)或 eIF5AlK50A/K67A(K5067A)。表達LacZ的質(zhì)粒用作對照。于轉(zhuǎn)染后M和48小時(A)或觀和52小時(B)，收獲細胞裂解物，通過SDS-PAGE分離。轉(zhuǎn)染eIF5Al的表達水平使用針對 HA的抗體檢測。結(jié)果eIF5Al在推定的遍在蛋白化位點的賴氨酸突變(K67R)增加eIF5Al 轉(zhuǎn)基因的累積超過野生型(A)。eIF5Al在羥丁賴氨酸化作用必需的賴氨酸突變(K50R)同樣增加eIF5Al轉(zhuǎn)基因的累積超過野生型eIF5Al (B)。與未突變野生型eIF5Al轉(zhuǎn)基因相比， 雙突變形式的eIF5Al (K50A/K67A)表達尤其充分(A+B)。參見圖2。實施例2 用野生型eIF_5Al和變體eIF_5Al轉(zhuǎn)染KAS細胞將KAS細胞用具有表達HA-標(biāo)記的eIF5Al變體的質(zhì)粒的PAMAM樹狀聚體(FMD44) 轉(zhuǎn)染，變體包括野生型 eIF5Al (5A1)、eIF5AlK67A (K67A)、eIF5AlK50A/K67A (K50A K67A)、 eIF5AlK50R(K50R)、eIF5AlK47R(K47R)、eIF5AlK67R(K67R)、eIF5AlK47R/K50R(K47R K50R) 或eIF5AlK50R/K67R(K50R K67R)。表達LacZ的質(zhì)粒用作對照。轉(zhuǎn)染后48小時，收獲細胞裂解物，通過SDS-PAGE分離。轉(zhuǎn)染eIF5Al的表達水平使用針對HA的抗體檢測。使用針對肌動蛋白的抗體證實相等加載。結(jié)果eIF5Al在推定的遍在蛋白化位點的賴氨酸上的突變 (K67A或K67R)增加eIF5Al轉(zhuǎn)基因的累積超過野生型。羥丁賴氨酸化作用需要的賴氨酸上的eIF5Al突變(K50R)或在乙?；稽c上的eIF5Al突變(K47R)同樣增加eIF5Al轉(zhuǎn)基因的累積超過野生型eIF5A。與未突變野生型eIF5Al轉(zhuǎn)基因相比，雙突變形式的eIF5Al (K50A/ K67A)同樣以較高水平表達。參見圖3。實施例3 使用PAMAM樹狀聚體轉(zhuǎn)染KAS細胞將KAS細胞用載有表達HA-標(biāo)記的eIF5Al變體的質(zhì)粒的PAMAM樹狀聚體(FMD45-2)轉(zhuǎn)染，變體包括 eIF5AlK50R(K50R)、eIF5AlK50A/K67A(K50A/K67A)或 eIF5AlK50R/K67R(K50R K67R)。表達LacZ的質(zhì)粒用作對照。轉(zhuǎn)染后72小時，將細胞用 Annexin/PI染色后進行FACS分析。Armexin V染色陽性而PI (碘化丙啶)染色陰性的細胞被認為處于細胞凋亡早期(Arm+/PI-)，而Armexin V和PI均染色陽性的細胞則被認為是處于細胞凋亡晚期(Arm+/PI+)。結(jié)果eIF5Al在羥丁賴氨酸化位點的賴氨酸上的突變(K50R)或在推定的遍在蛋白化位點的突變(K67R)以及雙突變(K50A/K67A)，導(dǎo)致KAS細胞凋亡顯著超過LacZ對照水平。參見圖4。實施例4 用表達eIF_5Al和eIF_5Al變體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染KAS細胞將KAS細胞用Lipofectamine 2000和表達HA-標(biāo)記的eIF5Al變體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，變體包括 eIF5AlK50A(K50A)、eIF5AlK50R(K50R)、eIF5AlK67R(K67R)、eIF5AlK50A/ K67A(K50A/K67A)或 eIF5AlK50R/K67R(K50R K67R)。表達 LacZ 的質(zhì)粒用作對照。轉(zhuǎn)染后 72小時，用Annexin/PI染色細胞后通過FACS分析。Annexin V染色陽性而PI (碘化丙啶) 染色陰性的細胞被認為處于細胞凋亡早期(Arm+/PI-)，而Armexin V和PI均染色陽性的細胞則被認為是處于細胞凋亡晚期(Arm+/PI+)。結(jié)果eIF5Al在羥丁賴氨酸化作用位點上的賴氨酸突變(K50R)或推定的遍在蛋白化位點的突變(K67R)以及雙突變體(K50A/K67A)均導(dǎo)致KAS細胞凋亡顯著超過LacZ對照水平。參見圖5。實施例5 使用突變的eIF_5Al處理KAS細胞導(dǎo)致細胞凋亡將KAS細胞用Lipofectamine 2000和表達HA-標(biāo)記的eIF5Al變體 eIF5AlK50R(K50R)或 eIF5AlK50A/K67A(K50A/K67A)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。表達 LacZ 的質(zhì)粒用作對照。轉(zhuǎn)染后72小時，用Armexin/PI染色細胞后通過FACS分析。Armexin V染色陽性而 PI (碘化丙啶)染色陰性的細胞被認為處于細胞凋亡早期(Arm+/PI-)，而Armexin V和PI 均染色陽性的細胞則被認為是處于細胞凋亡晚期(Arm+/PI+)。結(jié)果在羥丁賴氨酸化作用位點的賴氨酸上的eIF5Al突變(K50R)、或在羥丁賴氨酸化作用位點和推定的遍在蛋白化位點兩者上的eIF5Al突變(K50A/K67A)，導(dǎo)致KAS細胞凋亡顯著超過LacZ對照水平。參見圖6。實施例6A =SiRNA/腺病毒介導(dǎo)殺死多發(fā)性骨髓瘤細胞將KAS (人多發(fā)性骨髓瘤)細胞保持在SlO培養(yǎng)基[RPMI 1640，包含^g/ml IL_6、 10%胎牛血清(FBS)和青霉素 / 鏈霉素(P/S)]中。使用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 將KAS細胞用58. 7pmole siRNA轉(zhuǎn)染。用Lipofectamine 2000但沒有siRNA處理模擬轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染在沒有抗生素的SlO培養(yǎng)基中進行。a)革巴向人 eIF5Al 的 siRNA eIF5Al siRNA 靶 #1 (siRNA 靶向人 eIF5Al 區(qū)域5，-AAG CTG GAC TCC TCC TAC ACA-3’ (SEQ ID NO:—)。SiRNA序列示于圖25，本文通常稱為h5Al。eIF5Al siRNA 靶 #2 eIF5Al (siRNA 靶向人 eIF5Al 區(qū)域5，_AAAGGA ATG ACT TCC AGC TGA-3，(SEQ ID NO:—)。(該 siRNA 序列本文通常稱為 h5Al_ALT)b)對照 siRNA 對照 siRNA 具有下列序列正義鏈，5’-ACA CAU CCU CCU CAG GUC GdTdT-3’ ；和反義鏈，3，-dTd TUG UGU AGG AGG AGU CCA GC-5，”。已使用的其它對照包括得自Dharmacon的非靶標(biāo)確認的siRNA，因為它們已被微陣列檢驗以限制不需要的脫靶效應(yīng)。例如，對于體外進行研究NFkB，使用的對照是 Dharmacon的非靶siRNA (序列D-001700-01)，而體內(nèi)進行研究使用的對照是Dharmacon的 siRNA (序列 D-001810-01)。轉(zhuǎn)染后4小時，細胞沉淀后再懸浮于Iml的SlO培養(yǎng)基中。在初始siRNA轉(zhuǎn)染72 小時后，計數(shù)轉(zhuǎn)染的KAS細胞，以300，000個細胞/孔接種在對孔板上，然后用相同的siRNA 進行第二次轉(zhuǎn)染。
轉(zhuǎn)染后4小時，細胞沉淀后再懸浮于Iml的SlO培養(yǎng)基(沒有IL_6)中，其包含 3000ifu的Ad-LacZ (表達半乳糖苷酶的腺病毒)或Ad_5AlM (表達人eIF5AlK5°A的腺病毒)。72小時后，收獲細胞并進行細胞凋亡分析用Annexin V-FITC和PI (BD Bioscience)染色隨后進行FACS分析。a)早期細胞凋亡定義為Armexin-FITC染色陽性而PI染色呈陰性的細胞(Arm+/ PI-)b)細胞凋亡總數(shù)定義為早期細胞凋亡(Arm+/PI-)或晚期細胞凋亡/壞死(Arm+/ PI+)的細胞總數(shù)5A1 siRNA靶#1靶向人eIF5Al的3，UTR，因而不會影響腺病毒表達eIF5Al。 5AlsiRNA靶#2靶向人eIF5Al的開放可讀框中，因此它可能潛在干擾腺病毒表達eIF5Al。結(jié)果用siRNA處理和用表達eIF_5AlK50A變體的腺病毒感染的細胞經(jīng)歷細胞凋亡的數(shù)目大于未處理細胞以及只用siRNA處理的細胞的細胞凋亡數(shù)目。參見圖7。實施例6B 用針對eIF5Al靶#1的eIF5Al siRNA預(yù)處理(圖25所示)，降低內(nèi)源 eIF5Al表達但是使得腺病毒表達的RNAi-抗性eIF5Alk5°A累積。將KAS細胞使用Lipofectamine 2000與對照siRNA(C)或靶向eIF5Al的兩種 siRNA(#1和#2)之一轉(zhuǎn)染。eIF5Al siRNA#l靶向eIF5Al的3，UTR,因而不會干擾腺病毒表達eIF5Al，因為其僅僅包含eIF5Al的開放讀框。siRNA的序列示于圖25。eIF5Al#2 siRNA靶向eIF5Al的開放讀框，因而會影響內(nèi)源和外源兩者表達eIF5Al。在初始轉(zhuǎn)染后72 小時，將細胞用相同的siRNA進行第二次轉(zhuǎn)染。4小時后，從細胞除去轉(zhuǎn)染復(fù)合物，以包含 Ad-LacZ(L)或Ad-eIF5AlK5°A(5M)的生長培養(yǎng)基(_)IL6代替。72小時后，收獲細胞裂解物并使用針對eIF5A和肌動蛋白的抗體通過蛋白質(zhì)印跡分析。參見圖7B?？捎^察到病毒表達的eIF5Al的累積(1道/2道)，顯然通過eIF5Al siRNA靶#1和#2表達的eIF5A的降低 (5道和7道/3道)。如同預(yù)期一樣，eIF5Al siRNA#l不影響病毒表達的eIF5AlK5°A(6道/4 道)的累積，同時eIF5Al siRNA#2僅適度影響病毒表達的轉(zhuǎn)基因的表達(8道/4道)。實施例6C 用針對靶#1的eIF5Al siRNA預(yù)處理然后腺病毒感染，降低磷酸化 NF- κ B在人多發(fā)性骨髓瘤細胞中的表達。將KAS 細胞使用 Lipofectamine 2000 與對照 siRNA (hC)或靴向 eIF5Al 的 siRNA(#1)轉(zhuǎn)染。eIF5Al siRNA#l靶向eIF5Al的3，UTR，因此不會干擾腺病毒表達eIF5Al， 因為其僅僅包含eIF5Al的開放讀框。在初始轉(zhuǎn)染72小時后，將細胞用相同的siRNA進行第二次轉(zhuǎn)染。4小時后，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物從細胞除去，以包含Ad-LacZ (L)或Ad-eIF5AlK5°A(5M) 的生長培養(yǎng)基(+)IL6代替。M小時后，收獲細胞裂解物，使用針對磷酸-NF-kB p65(Ser 536)和eIF5A的抗體進行蛋白印跡分析。正如預(yù)期，eIF5Al siRNA#l不影響病毒表達的 eIF5A1K5oA的累積。在絲氨酸536磷酸化的NF-kB p65上調(diào)節(jié)激活、核定位、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用以及轉(zhuǎn)錄活性。參見圖7C。實施例6D 用eIF5Al siRNA#l預(yù)處理然后腺病毒感染，降低磷酸化NF_kB和 ICAM-I在人多發(fā)性骨髓瘤細胞中的表達。將KAS細胞使用Lipofectamine 2000和對照siRNA(C)或靶向eIF5Al的兩種 siRNA(#1和#2)之一轉(zhuǎn)染。在初始轉(zhuǎn)染后72小時，將細胞用相同的siRNA進行第二次轉(zhuǎn)染。4小時后，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物從細胞除去，以生長培養(yǎng)基(+)IL6代替。第二次轉(zhuǎn)染后對小時，用40ng/mlTNF-a刺激細胞，于0小時、4小時或M小時收獲細胞裂解物，使用針對磷酸-NF-kB p65(Ser 536)、ICAM-I和肌動蛋白的抗體進行蛋白印跡分析。觀察到用兩種 eIF5Al-特異性siRNA轉(zhuǎn)染后，在TNF- α誘導(dǎo)的NF_kB p65磷酸化(ser 536)和ICAM-I表達降低。NF-kB p65在絲氨酸536上的磷酸化調(diào)節(jié)激活、核定位、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和轉(zhuǎn)錄活性。ICAM-I是細胞間粘附表面糖蛋白，人們認為其參與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機理。 參見圖7D。實施例6E 在IL-6存在下，用siRNA預(yù)處理KAS細胞增強eIF5Alk5°K基因遞送的細胞凋亡。將KAS 細胞使用 Lipofectamine 2000 與對照 siRNA (hcon)或人 eIF5Al siRNA(h5Al)轉(zhuǎn)染。72小時后，用siRNA再轉(zhuǎn)染細胞。將空載體(mcs)或eIF5Alk5°K(K50R) 質(zhì)粒的PEI復(fù)合物加至細胞，4小時后，除去siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基。整個研究使用的生長培養(yǎng)基包含IL-6。72小時后檢測細胞凋亡用Armexin/PI染色細胞后進行FACS分析。參見圖 7F。實施例7 同時給予eIF_5Al質(zhì)粒和eIF_5AlsiRNA延緩多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤生長(圖 8-10)。對SCID小鼠皮下注射KAS細胞。當(dāng)觀察到可觸及的腫瘤時開始治療。在6只3_5 周齡SCID/CB17小鼠的右肋脅注射在200 μ L PBS中的1 X IO7個KAS-6/1骨髓瘤細胞，當(dāng)腫瘤達到最小體積4mm3大小時開始治療。對照小鼠每周2次腫瘤內(nèi)注射包含pCpG-mcs (空載體)和對照siRNA (對照組為 3只小鼠C-1、C-2和C-3)的PEI復(fù)合物。治療小鼠每周2次腫瘤內(nèi)注射包含RNAi-抗性質(zhì)粒pCpG-eIF5Alk50R和eIF5Al siRNA的PEI復(fù)合物(治療組為3只小鼠5A_1、5A_2和 5A-3)。在腫瘤內(nèi)多個位點進行注射防止回流，減慢注射速度以提高吸收。圖8數(shù)據(jù)顯示組中所有小鼠的腫瘤體積。圖9所示數(shù)據(jù)是每組平均腫瘤體積+/-標(biāo)準誤差。星號表示統(tǒng)計顯著性(* = ρ < 0. 025 ；η = 3)。圖10顯示同時給予eIF_5Al質(zhì)粒和eIF_5AlsiRNA減輕多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的重量。顯示的數(shù)據(jù)是每組平均腫瘤重量+/-標(biāo)準誤差。星號表示統(tǒng)計顯著性r = ρ < 0. 05 ； η = 3) οJET-PEI (PolyPlus)以 2X0. Iml 用于體內(nèi)測試。Ν/Ρ 之比為 8。PEI/DNA/siRNA 復(fù)合物在總體積0. Iml的5%葡萄糖中形成。形成復(fù)合物的方案如下。1.使組分溫至室溫。保持無菌。2.將 20 μ g 質(zhì)粒 DNA (約 10 μ 1，2mg/ml)禾口 10 μ g siRNA (10 μ 1，lmg/ml)稀釋成總體積25 μ 1。使用無菌水彌補不足部分。3.加入25 μ 1的10%葡萄糖調(diào)節(jié)DNA溶液的體積至50 μ 1 5%葡萄糖。輕輕渦旋
后短暫離心。4.將4. 8 μ 1的In vivo JETPEI稀釋為總體積25 μ 1的10%葡萄糖。用無菌水調(diào)節(jié)至體積50 μ 1，最終濃度為5%葡萄糖。輕輕渦旋后短暫離心。5.立即加入50 μ 1稀釋的PEI至50 μ 1稀釋的DNA (順序不能顛倒)。短暫渦旋后旋轉(zhuǎn)立即減慢。6.溫育15分鐘后注射。復(fù)合物穩(wěn)定6小時。
無CpG克隆載體和pCpG質(zhì)粒得自hvivoGen。這些質(zhì)粒完全沒有CpG 二核苷酸， 稱為pCpG。這些質(zhì)粒體外和體內(nèi)都產(chǎn)生高水平的轉(zhuǎn)基因表達，并且與CMV型質(zhì)粒相反，其使得體內(nèi)持續(xù)表達。PCpG質(zhì)粒包含的元件天然沒有CpG 二核苷酸；其被修飾以除去所有CpG ； 或者是全部合成的，例如編碼選擇標(biāo)記或報告蛋白的基因。這些新等位基因能夠合成的事實在于在形成遺傳密碼的16個二核苷酸中，CG是僅有的非必需的可替代二核苷酸。8種密碼子包含編碼5種不同氨基酸的CG。8種密碼子都可被編碼同一氨基酸的兩種密碼子至少一種取代以產(chǎn)生新等位基因(其編碼與野生型相同氨基酸序列的蛋白質(zhì))，因而其作為野生型對應(yīng)物同樣具有活性。這些新等位基因可獨立存在于稱為pMOD的質(zhì)粒(它們可容易地從中切離)中。pCpG質(zhì)粒能在體內(nèi)長期持續(xù)表達，并是有用工具，其可用于體內(nèi)和體外研究CpG 對基因表達的影響(使用表達TLR9的細胞系)以及它們對先天和后天免疫系統(tǒng)的影響?？蛰d體pCpG-mcs (Invivogen)是沒有表達基因產(chǎn)物、僅一個多克隆位點的載體，并且用作對照載體。將HA-標(biāo)記的eIF5Alk5°KcDNA亞克隆入pCpG_LacZ載體的NcoI和NheI 位點(Invivogen), LacZ基因已經(jīng)從其除去，以產(chǎn)生治療載體pCpG_eIF5Al (K50R)。使用 Endo-Free Qiagen試劑盒制備DNA。測量內(nèi)毒素水平< 0. 03EU/ug ；水中DNA是ang/ml。實驗使用的對照SiRNA是微陣列驗證的非靶對照siRNA (Dharmacon， D-001810-01)。獲得具有修飾(siSTABLE)的siRNA以防止在血清中降解。將實驗使用的eIF5Al siRNA設(shè)計成針對人eIF5Al的3，UTR。eIF5Al siRNA與小鼠eIF5Al之間沒有相似性，因此，siRNA僅僅抑制人(非小鼠)eIF5Al。siRNA與eIF5A2 (人或小鼠)同樣沒有相似性。獲得具有修飾(siSTABLE)的siRNA以防止在血清中降解。 eIF5AlsiRNA具有下列靶序列5，GCU GGA CUC CUC CUA CAC A (UU)3將siSTABLE siRNA 以 lmg/ml 溶于水(于-20C 等分貯存)。使用數(shù)字卡尺2-3次/周測量腫瘤長(1)和寬(w)的尺寸。根據(jù)以下公式計算腫瘤體積1=長度；最小尺寸W=寬度；最大尺寸腫瘤體積(mm3) = l2*w*0. 5統(tǒng)計分析使用Student的t_檢驗進行統(tǒng)計分析。置信水平大于95%彼視為具有顯著性(ρ < 0. 05)。實施例8 同時給予eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA延緩多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤生長和導(dǎo)致腫瘤減小。在另一研究中，對SCID小鼠皮下注射KAS細胞。當(dāng)觀察到可觸及的腫瘤時開始治療。對照小鼠每周2次腫瘤內(nèi)注射包含pCpG-mcs(空載體)和對照siRNA(對照組G-l、G-2和G-3)的PEI復(fù)合物。治療小鼠每周2次腫瘤內(nèi)注射包含RNAi-抗性質(zhì)粒 pCpG-eIF5Alk50R(20y g 質(zhì)粒 DNA)和 eIF5Al siRNA (10 μ g siRNA)的 PEI 復(fù)合物(治療組 G-4、G-5和G-6)。圖11所示數(shù)據(jù)是每組平均腫瘤體積+/_標(biāo)準誤差。星號表示統(tǒng)計顯著性Γ = ρ < 0. 025 ；η = 3)。在21天內(nèi)進行6次注射(紅色箭頭)。
實施例9 靜脈內(nèi)給予(i. v. )eIF5Al siRNA和腫瘤內(nèi)給予(i. t.) PEI/eIF5AlK50R 質(zhì)粒復(fù)合物導(dǎo)致多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的腫瘤減小(2B組)。對SCID小鼠皮下注射KAS細胞。當(dāng)觀察到可觸及的腫瘤時，以50 μ g對照 siRNA(對照組)或人eIF5Al siRNA(治療組)尾部初始注射開始治療。隨后對對照小鼠通過每周2次腫瘤內(nèi)注射包含pCpG-mcs的PEI復(fù)合物進行治療(空載體；對照組；G-l、G-2和G-3)。隨后對治療小鼠通過每周2次腫瘤內(nèi)注射包含RNAi-抗性質(zhì)粒 pCpG-eIF5Alk50R(20 μ g質(zhì)粒DNA)的PEI復(fù)合物進行治療(治療組；G_4、G_5和G-6)。對照小鼠繼續(xù)接受每周1次i. v.注射對照siRNA(對照組R-l、R-2和R-3)。治療小鼠繼續(xù)接受每周1次i. v.注射人eIF5AlsiRNA(20 μ g)(治療組R-4、R-5和R-6)。圖12所示數(shù)據(jù)是每組所有小鼠的腫瘤體積。在21天內(nèi)給予6次腫瘤內(nèi)注射PEI/DNA(紅箭頭)和4次 i.v.注射siRNA (藍箭頭)。圖13提供實施例8和9結(jié)果的疊加圖。對SCID小鼠皮下注射KAS細胞。圖13 所示數(shù)據(jù)是每組小鼠的平均腫瘤體積+/_標(biāo)準誤差。星號表示治療組和對照組之間的統(tǒng)計顯著性(** = ρ < 0. 01 ；*** = ρ < 0. 001 ；η = 3)。形成PEI復(fù)合物的方法1.使組分溫至室溫。保持無菌。2.將質(zhì)粒DNA或質(zhì)粒DNA+siRNA稀釋成總體積25 μ 1。使用無菌水調(diào)節(jié)體積。a)僅質(zhì)粒DNA的復(fù)合物將20 μ g質(zhì)粒DNA(10 μ l,2mg/ml)稀釋成總體積25 μ 1。使用無菌水彌補不足部分。b)質(zhì)粒 DNA+siRNA 復(fù)合物將20 μ g 質(zhì)粒 DNA (約 10 μ 1，2mg/ml)禾口 10 μ g siRNA (10 μ 1，lmg/ml)稀釋成總體積25 μ 1。使用無菌水彌補不足部分。3.加入25 μ 1的10%葡萄糖(PEI kit提供)調(diào)節(jié)DNA溶液的體積至50 μ 1 5%
葡萄糖。輕輕渦旋后短暫離心。4.將In vivo JETPEI稀釋為總體積25 μ 1的10%葡萄糖。a)僅質(zhì)粒DNA的復(fù)合物將3. 2 μ 1 In vivo JETPEI稀釋為總體積25 μ 1的10%葡萄糖。用無菌水調(diào)節(jié)至體積50 μ 1，最終濃度為5%的葡萄糖。輕輕渦旋后短暫離心。b)質(zhì)粒 DNA+siRNA 復(fù)合物將4. 8 μ 1 In vivo JETPEI稀釋為總體積25 μ 1的10%葡萄糖。用無菌水調(diào)節(jié)至體積50 μ 1，最終濃度為5%的葡萄糖。輕輕渦旋后短暫離心。5.立即將50 μ 1稀釋的PEI加至50 μ 1稀釋DNA (不能顛倒順序！)中。短暫渦
旋后立即減慢。6.溫育15分鐘后注射。復(fù)合物穩(wěn)定6小時。就尾部靜脈注射siRNA而言，siRNA初始注射是50 μ g。將siRNA稀釋至0. 4mg/ ml的PBS。以125 μ 1/小鼠(50 μ g)注射入尾部靜脈。隨后以20 μ g/小鼠每周2次注射血清穩(wěn)定型siRNA。將siRNA稀釋至0. 4mg/ml的PBS。以50 μ 1/小鼠(20 μ g)注射入尾部靜脈。
圖1 顯示同時給予eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA導(dǎo)致腫瘤減小。對SCID小鼠皮下注射KAS細胞。當(dāng)觀察到可觸及的腫瘤時開始治療。小鼠每周2次腫瘤內(nèi)注射包含 RNAi-抗性質(zhì)粒 pCpG-eIF5Alk50R 和 eIF5Al siRNA 的 PEI 復(fù)合物(治療組；G_4、G-5 和 G-6)。在21天內(nèi)注射6次。在開始治療后42天，處死小鼠，切開腫瘤位置皮膚檢查腫瘤生長情況。在治療小鼠2A組中沒有觀察到任何腫瘤生長。圖13C顯示靜脈內(nèi)給予(i. v. )eIF5Al siRNA和腫瘤內(nèi)給予(i. t. )PEI/ eIF5AlK50R質(zhì)粒復(fù)合物導(dǎo)致多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤減小。對SCID小鼠皮下注射KAS細胞。 當(dāng)觀察到可觸及的腫瘤時以50 μ g人eIF5Al siRNA(治療組)初始注射開始治療。隨后對小鼠每周2次腫瘤內(nèi)注射包含RNAi-抗性質(zhì)粒pCpG-eIF5Alk50R的PEI復(fù)合物(治療組； R-4、R-5和R-6)。小鼠每周1次繼續(xù)接受i. v.注射人eIF5Al siRNA。在開始治療后21天結(jié)束治療。在初始治療后42天處死小鼠，切開腫瘤位置皮膚檢查腫瘤生長情況。在治療組 (2B組)中有一只小鼠沒有腫瘤生長。實施例10 靜脈內(nèi)同時給予eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA延緩多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤生長。對SCID小鼠皮下注射KAS細胞。當(dāng)觀察到可觸及的腫瘤時以50 μ g對照siRNA (對照組)或人eIF5Al siRNA(治療組)初始注射開始治療。隨后對小鼠通過每周約2次靜脈內(nèi)(紅箭頭)或腹膜內(nèi)(綠箭頭)注射包含pCpG-mcs的PEI復(fù)合物(空載體；對照組Al、 A2和A3)或包含RNAi-抗性質(zhì)粒pCpG_eIF5Alk50R的PEI復(fù)合物(治療組；A4、A5和A6)。 小鼠繼續(xù)接受每周1次i. v.注射(藍箭頭)對照siRNA (對照組Al、A2和A3)或人eIF5Al siRNA(治療組A4、A5和A6)。所示數(shù)據(jù)是每組所有小鼠的腫瘤體積。圖14所示數(shù)據(jù)是每組所有小鼠的腫瘤體積。實施例11 靜脈內(nèi)給予(i. v.)eIF5Al siRNA和靜脈內(nèi)(i. v.)或腹膜內(nèi)(i. p.)給予PEI/eIF5AlK50R質(zhì)粒復(fù)合物延緩多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤生長。對SCID小鼠皮下注射KAS細胞。當(dāng)觀察到可觸及的腫瘤時以50 μ g對照siRNA (對照組)或人eIF5Al siRNA(治療組)初始注射開始治療。隨后對照小鼠每周約1次靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射包含pCpG-mcs的PEI復(fù)合物進行治療(空載體；對照組3只小鼠B1、B2和 B3)。隨后對治療小鼠每周約1次靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射包含RNAi-抗性質(zhì)粒pCpG-eIF5AlK5°K 的PEI復(fù)合物進行治療(治療組；B4、B5和B6)。小鼠繼續(xù)接受對照siRNA(對照組Bi、B2 和B3)或人eIF5Al siRNA (治療組3只小鼠小鼠B4，B5和B6) i. v.注射每周1次。實驗以50 μ g siRNA初始注射開始(圖15曲線上的第2天)。隨后每周1次注射20 μ g siRNA。 直接給予SiRNA，即無遞送介質(zhì)。PEI復(fù)合物包含20 μ g質(zhì)粒DNA。初始PEI注射為i. p.注射而隨后的注射為i. v.注射。圖15所示數(shù)據(jù)是每組所有小鼠的腫瘤體積。圖16提供實施例10和11的結(jié)果疊加圖。對SCID小鼠皮下注射KAS細胞。當(dāng)觀察到可觸及的腫瘤時開始治療。一組小鼠接受每周1次i. v.注射對照siRNA(對照；A組) 或eIF5Al siRNA (治療；A組)和i. v.或i. p.注射包含pCpG-mcs的PEI復(fù)合物(對照； A組)或包含RNAi-抗性質(zhì)粒pCpG-eIF5AlK5°K的PEI復(fù)合物(治療；A組)。第二組小鼠接受每周約2次i. v.或i. p.注射包含pCpG-mcs (空載體)和對照siRNA的PEI復(fù)合物(對照；B組)，或包含RNAi-抗性質(zhì)粒pCpG-eIF5Alk50R和eIF5AlsiRNA的PEI復(fù)合物(治療； B組)。顯示的數(shù)據(jù)是每組小鼠的平均腫瘤體積+/_標(biāo)準誤差。星號表示治療組和對照組之間的統(tǒng)計顯著性(* = ρ < 0. 05廣* = p <0. 001 ；η = 3)。制備PEI復(fù)合物和SiRNA的方案如前面的實施例所述。實施例12 同時給予eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA延緩多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤生長和導(dǎo)致腫瘤減小。對SCID小鼠皮下注射KAS細胞。當(dāng)觀察到可觸及的腫瘤時開始治療。對照小鼠每周2次腫瘤內(nèi)注射包含pCpG-mcS(空載體)和對照siRNA的PEI復(fù)合物(對照組有 3只小鼠對照1、對照2和對照3)。治療小鼠每周2次腫瘤內(nèi)注射包含RNAi-抗性質(zhì)粒 pCpG-eIF5AlK50E 和 eIF5Al siRNA 的 PEI 復(fù)合物(治療組有 4 只小鼠:5A-1、5A-2、5A_3 和 5A-4)。腫瘤內(nèi)注射的PEI復(fù)合物包括20 μ g質(zhì)粒DNA和10 μ g的siRNA。圖17所示數(shù)據(jù)是每組所有小鼠的腫瘤體積。實施例13 靜脈內(nèi)給予(i. v. )eIF5Al siRNA 和腫瘤內(nèi)給予(i. t. ) PEI/eIF5AlK50R 質(zhì)粒復(fù)合物導(dǎo)致多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤減小。對SCID小鼠皮下注射KAS細胞。當(dāng)觀察到可觸及的腫瘤時以50 μ g對照siRNA (對照組有3只小鼠對照1、對照2和對照3)或人eIF5Al siRNA(治療組有3只小鼠5A_1、 5A-2和5A-3)初始注射開始治療。隨后每周2次腫瘤內(nèi)注射包含pCpG-mcs (20 μ g)的 PEI復(fù)合物治療對照小鼠(對照組1-3)。隨后每周2次腫瘤內(nèi)注射包含RNAi-抗性質(zhì)粒 pCpG-eIF5Alk50E(20yg)的PEI復(fù)合物治療治療小鼠(5A-1、A_2、5A_3)。對照小鼠繼續(xù)接受每周2次尾部靜脈i. v.注射任何一種對照siRNA (20 μ g)。治療小鼠繼續(xù)接受每周2次尾部靜脈i. v.注射人eIF5AlsiRNA(20 μ g)。所述注射給予48小時后給予腫瘤內(nèi)注射。SiRNA 作為裸SiRNA給予，即沒有遞送介質(zhì)。圖18所示數(shù)據(jù)是每組所有小鼠的腫瘤體積。實施例14 同時給予eIF5AlK5°K質(zhì)粒(通過EFl或B29啟動子驅(qū)動)和eIF5Al siRNA延緩多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤生長和導(dǎo)致腫瘤減小。對SCID小鼠皮下注射KAS細胞。當(dāng)觀察到可觸及的腫瘤時開始治療。小鼠每周 2次腫瘤內(nèi)注射PEI復(fù)合物，所述PEI復(fù)合物包含對照載體(Gl和G》或通過似9啟動子 (G3和G4)或EFl啟動子(G5和G6)驅(qū)動的eIF5Al質(zhì)粒，以及對照siRNA (Gl、G3、G5)或 h5AlsiRNA(G2、G4、G6)。顯示數(shù)據(jù)是每組平均腫瘤體積+/_標(biāo)準誤差。注意啟動子為B-細胞-特異性啟動子。然而，盡管發(fā)現(xiàn)本研究使用的B^啟動子/mCMV增強子能驅(qū)動 KAS細胞體外高表達HA-eIF5AlK5°K，但其似乎不是B-細胞-特異性的(可能是因為CMV增強子)。參見圖19。實施例15 同時給予eIF5Al siRNA增強EFl或B^啟動子驅(qū)動的eIF5AlK5°K質(zhì)粒對多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的抗腫瘤作用并導(dǎo)致腫瘤負荷降低。對SCID小鼠皮下注射KAS細胞。當(dāng)觀察到可觸及的腫瘤時開始治療。小鼠每周 2次腫瘤內(nèi)注射PEI復(fù)合物，所述PEI復(fù)合物包含對照載體(Gl和⑵)或似9啟動子(G3 和G4)或EFl啟動子(G5和G6)驅(qū)動的eIF5Al質(zhì)粒，以及對照siRNA(GU G3、G5)或h5Al siRNA (G2、G4、G6)。在開始治療后M天處死小鼠，切下皮下腫瘤稱重。顯示數(shù)據(jù)是各組的平均腫瘤重量+/_標(biāo)準誤差。參見圖20。實施例16 :eIF5Al siRNA協(xié)同提高Ad_eIF5A感染肺腺癌細胞所產(chǎn)生的細胞凋亡誘導(dǎo)。用Ad-LacZ 或 Ad_eIF5A 感染 A549 細胞。用對照 siRNA 或靶向人 eIF5Al (h5Al)的siRNA轉(zhuǎn)染細胞將轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基加至細胞，緊接著加入病毒。在用siRNA轉(zhuǎn)染和用病毒感染后4小時，更換上新鮮培養(yǎng)基，并溫育細胞72小時，然后用Armexin/PI標(biāo)記以檢測凋亡細胞。注意這種細胞系中的eIF5A過表達導(dǎo)致未羥丁賴氨酸化eIF5A的累積，由于DHS和 DOHH的量有限，因而與eIF5AK5°K的過表達一樣，導(dǎo)致相同的促凋亡作用。這些數(shù)據(jù)表明，在非骨髓瘤的腫瘤型中同樣觀察到同時抑制羥丁賴氨酸化eIF5A和未羥丁賴氨酸化eIF5A的過表達引起的對細胞凋亡的協(xié)同作用。參見圖21。實施例17 構(gòu)建質(zhì)粒pExp5A。ρΕχρδΑ是設(shè)計的具有減少的CpG 二核苷酸的表達質(zhì)粒，主要驅(qū)動B細胞系細胞中人eIF5AlK5°K表達。載體源自pCpG-LacZ，一種根本沒有CpG 二核苷酸的質(zhì)粒(Invivogen)。 在大腸桿菌中復(fù)制和選擇需要的全部元件都沒有CpG 二核苷酸。CpG-LacZ載體中的原 CMV增強子/啟動子和LacZ基因已經(jīng)分別被人最小B細胞特異性啟動子(B29/⑶79b ； Invivogen)和人eIF5AlK5°K置換，以便驅(qū)動B-細胞特異性表達eIF5AlK5°K。已將B29DHS4. 4 3’增強子引入eIF5Al表達盒的質(zhì)粒下游，以便增強B^啟動子活性和降低非B細胞表達 (Malone et al. 2006. B29 gene silencing in pituitary cells is regulated by its 3' enhancer. J. Mol. Biol. 362 :173-183)。摻入似9最小啟動子、eIF5AlK5°K*B^DHS4. 43， 增強子已經(jīng)將32CpG 二核苷酸引入了載體中。大腸桿菌(E. coli)表汰元件復(fù)制起點大腸桿菌R6K γ起點(ori.)*由于存在R6K γ復(fù)制起點，pCpG質(zhì)粒只可在表達pir突變基因的大腸桿菌突變體菌株中擴增。它們不會在標(biāo)準大腸桿菌菌株中復(fù)制。因此，PCpG質(zhì)粒提供給大腸桿菌 GT115菌株，Dcm甲基化也缺陷的pir突變體Qnvivogen)。細菌性啟動子EMI，一種無CpG形式的細菌性EM7啟動子。選擇標(biāo)記Zeocin 抗性基因，一種無CpG的合成等位基因。哺乳動物細胞中表達元件哺乳動物啟動子對于B細胞組織-特異性表達的人_167bp最小B^ (⑶79b)啟動子。一種合成內(nèi)含子(I 140)也存在于5’ UTR中。聚腺苷酸化信號無CpG 二核苷酸形式的晚期SV40聚腺苷酸化信號。3’增強子人似9 DHS4. 43’增強子。MAR :2個無CpG Matrix連接區(qū)(MAR)存在于細菌性轉(zhuǎn)錄單位和哺乳動物轉(zhuǎn)錄單位之間。一個MAR源自人IFN-β基因5’區(qū)，另一個源自β-球蛋白基因5’區(qū)。pExp5A(3371bp)的預(yù)期序列見圖 23。eIF5AlK50E的氨基酸序列*K50R突變下劃線示出MADDLDFETGDAGASATFPMQCSALRKNGFVVLKGRPCKIVEMSTSKTGRHGHAKVHLVGIDIFTGKKYEDICPSTHNMDVPNIKRNDFQLIGIQDGYLSLLQDSGEVREDLRLPEGDLGKEIEQKYDCGEEILITVLSAMTEEAAVAIKAMAK構(gòu)建ρΕχρ5Α—構(gòu)建要點步驟1:克隆B29 DHS4. 4 3，增強子并亞克隆入pGEM Teasy (!Iomega)—建立 pGEM-4. 4enh#80
步驟2 將最小B^啟動子亞克隆入pCpG-LacZanvivogen)—建立B^_5#3。
步驟 3 將 HA-eIF5AlK5°K 亞克隆入載體一建立 B29-5#3_eIF5AlK5°K。步驟4 在pCpG-mcs (Invivogen)中建立新型多克隆位點一建立pCpG_Linker4。步驟5 將 B29 DS4. 4 3，增強子亞克隆入 pCpG_Linker4—建立 pCpG_DHS4. 4。步驟6 將 B^ 啟動子 +HA-eIF5AlK5°K+SV40pA 表達盒亞克隆入 pCpG_DHS4. 4—建立 pExp-50步驟7 將pExp-5中的HA-eIF5AlK5°K用非-HA eIF5AlK50E置換一建立最終載體 pExp5A。構(gòu)津詳沭步驟1:克隆B29 DHS4. 4 3，增強子并亞克隆入pGEM T easy (!Iomega)—建立 pGEM-4. 4enh#80將從KAS細胞(人多發(fā)性骨髓瘤細胞系)分離的基因組DNA通過PCR克隆 B29DHS4. 4 3，增強子，使用以下引物正向引物5，-CAG CAA GGG AGC ACC TAT G-3，和反向引物 5，-GTT GCA GTG AGC GGA GAT G-3，。使用人CD79B/GH-1基因間區(qū)(Accession AB062674)的序列設(shè)計引物。將所得的608bp PCR片段亞克隆入pGEM T easy克隆載體(Promega)并測序。Komatsuet al. 2002. Novel regulatory regions found downstream of the rat B29/Ig-b gene. Eur. J. Biochem. 269 :1227—1236。在dGEM-4. 4enh#8 中的 B29DHS4. 43’ 增強子 PCR 片段(297bp)的序列ACCACCCTGGGCCAGGCTGGGCCAAGCCAGGCGGCCCCTGTGTTTTCCCCAGTCTCTGGGCTGCTGGAGGGAACCAGGTTGTTTTGG CATCAGC CTCTACTGAGCCGGAGCCCTTCCTTTCCT GCTGCTTTGCATAG TGGCACTAATTCCGTCCTCCTACCTCCACCAGGGACCTAGGCAGCCGGGTAGATGGTGGGAGGAGGCTTCACTTCTCCCCCAAGCAGGGTCTCCACCTGCTT GAGGCTGCCC TGGGTTGGGGGAGGCCTTGGCTTTACCTAAAGACTTTTTAACACCTCT0+4. 4區(qū)域包含若干轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點■ SRY GTTGTTT■ GATA CATCAGC■ OCT-X GCTGCTTTGCATAG■ NF-KB GAGGCTGCCC將在pGEM-4. 4enh#8 中的 B29 DHS4. 4 3’ 增強子 PCR 片段(297bp)與人 CD79B/ GH-I基因間區(qū)的序列(Accession AB062674)進行比對。
權(quán)利要求
1.一種編碼截短型eIF5Al蛋白質(zhì)的eIF5Al多核苷酸在制備用于誘導(dǎo)患者癌細胞或腫瘤的細胞凋亡的藥物中的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述eIF5Al多核苷酸編碼截短型eIF5Al蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包含SEQ ID NO 37所示的氨基酸序列，如圖38所示。
3.權(quán)利要求1的用途，其中所述eIF5Al多核苷酸編碼約16kDA的截短eIF5Al蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求1的用途，其中所述患者是哺乳動物。
5.權(quán)利要求4的用途，其中所述哺乳動物是人。
6.權(quán)利要求1的用途，其中所述誘導(dǎo)癌細胞或腫瘤凋亡延緩癌細胞或腫瘤生長、阻止癌細胞或腫瘤細胞生長，或者殺死癌細胞或減小腫瘤體積。
7.權(quán)利要求1的用途，其中所述癌癥為多發(fā)性骨髓瘤。
8.權(quán)利要求1的用途，其中所述eIF5Al多核苷酸包含SEQID NO 38所示的序列，如圖41所示。
9.權(quán)利要求1的用途，其中所述eIF5Al多核苷酸包含在質(zhì)?；虮磉_載體中。
10.權(quán)利要求1的用途，其中所述表達載體是腺病毒表達載體或PHM6。
11.權(quán)利要求10的用途，其中所述表達載體包含組織特異性啟動子。
12.權(quán)利要求11的用途，其中所述組織特異性啟動子是B細胞特異性啟動子。
13.權(quán)利要求12的用途，其中所述B細胞特異性啟動子是B29。
14.權(quán)利要求10的用途，其中所述表達載體包括pCpG質(zhì)粒。
15.權(quán)利要求10的用途，其中所述表達載體與聚氮丙啶復(fù)合。
16.權(quán)利要求10的用途，其中所述表達載體具有減少的CpG二核苷酸。
17.權(quán)利要求1的用途，其中所述藥物經(jīng)腫瘤內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下給予。
18.一種分離的多核苷酸，其編碼截短型eIF5Al蛋白質(zhì)，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO 38所示的序列，如圖41所示。
19.一種分離的多核苷酸，其編碼截短型eIF5Al蛋白質(zhì)，其中所述截短型蛋白質(zhì)包含 SEQ ID NO :37所示的氨基酸序列，如圖38所示。
20.一種分離的截短型eIF5Al多肽，其通過半胱天冬酶介導(dǎo)的eIF5Al切割形成。
21.編碼截短型eIF5Al蛋白質(zhì)的eIF5Al多核苷酸和全長eIF5Al多核苷酸組合用于制備誘導(dǎo)患者癌細胞或腫瘤細胞凋亡的藥物中的用途。
22.權(quán)利要求21的用途，其中所述eIF5Al多核苷酸編碼包含SEQIDNO 37所示的氨基酸序列的截短eIF5A蛋白質(zhì)，而其中全長eIF5Al多核苷酸編碼包含SEQ ID NO 35所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
23.權(quán)利要求21的用途，其中所述eIF5Al多核苷酸編碼約16kDA的截短eIF5A蛋白質(zhì)。
24.權(quán)利要求21的用途，其中所述患者是哺乳動物。
25.權(quán)利要求M的用途，其中所述哺乳動物是人。
26.權(quán)利要求21的用途，其中所述細胞凋亡誘導(dǎo)延緩癌細胞或腫瘤生長、阻止癌細胞或腫瘤細胞生長、或者殺死癌細胞或減小腫瘤體積。
27.權(quán)利要求21的用途，其中所述癌癥是多發(fā)性骨髓瘤。
28.權(quán)利要求21的用途，其中所述eIF5Al多核苷酸包含SEQID N0:38所示的序列，而其中全長eIF5Al多核苷酸包含SEQ ID NO 43所示的序列，如圖53所示。
29.權(quán)利要求23的用途，其中所述全長eIF5As多核苷酸編碼突變eIF5Al，其中所述突變防止或抑制脫氧羥丁賴氨酸合酶的羥丁賴氨酸化作用和/或其中所述突變存在于遍在蛋白化位點和/或乙?；稽c。
30.權(quán)利要求23的用途，其中所述突變選自K50A、K50R、K67A、K47R、K67R、K50A/K67A、 K50A/K47R、K50A/K67R、K50R/K67A、K50R/K47R、K50R/K67R 和 K47A/K67A。
31.權(quán)利要求四的用途，其還包括靶向eIF5A的3，UTR的siRNA。
32.權(quán)利要求31的用途，其中所述siRNA靶向eIF5Al的5，-GCTGGA CTC CTC CTA CAC A-3’序列。
33.權(quán)利要求32的用途，其中所述siRNA是dsRNA，并且dsRNA的一條鏈包含序列 5， -GCU GGA CUC CUC CUA CAC A-3，。
34.權(quán)利要求32的用途，其中所述siRNA穩(wěn)定化以防止在血清中降解。
35.權(quán)利要求31的用途，其中所述全長eIF5Al多核苷酸和/或編碼截短型eIF5Al蛋白質(zhì)的eIF5A多核苷酸存在于表達載體中。
36.權(quán)利要求35的用途，其中所述全長eIF5Al多核苷酸和/或編碼截短型eIF5Al蛋白質(zhì)的eIF5A多核苷酸和/或siRNA與聚氮丙啶復(fù)合。
37.權(quán)利要求36的用途，其中所述全長eIF5Al多核苷酸和/或編碼截短型eIF5Al蛋白質(zhì)的eIF5A多核苷酸和/或siRNA獨立與聚氮丙啶復(fù)合。
38.一種通過提供給哺乳動物權(quán)利要求1-38中任何一項的組合物從而誘導(dǎo)哺乳動物癌細胞或腫瘤的細胞凋亡的方法。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述組合物經(jīng)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或腫瘤內(nèi)給予。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述癌癥是多發(fā)性骨髓瘤。
41.一種組合物，其包含靶向eIF5Al的3’末端的eIF5Al siRNA、包含編碼突變eIF5Al 的多核苷酸的表達載體的復(fù)合物，其中所述突變eIF5Al不能被羥丁賴氨酸化，且其中所述 siRNA和表達載體與聚氮丙啶復(fù)合形成復(fù)合物。
42.一種組合物，其包含靶向目標(biāo)基因以抑制患者目標(biāo)基因的內(nèi)源表達的siRNA;和以 RNAI抗性質(zhì)粒編碼能夠在患者體內(nèi)表達的目標(biāo)蛋白質(zhì)的多核苷酸，其中所述siRNA和質(zhì)粒與聚氮丙啶復(fù)合形成復(fù)合物。
43.權(quán)利要求41的組合物，其中所述siRNA具有圖25所示的序列，且其中編碼突變 eIF5Al的多核苷酸是eIF5AlK5°K。
44.權(quán)利要求43的組合物，其包含組織特異性啟動子。
45.權(quán)利要求44的組合物，其包含B細胞特異性啟動子。
46.權(quán)利要求45的組合物，其中所述B細胞啟動子是B29。
47.權(quán)利要求43的組合物，其中所述表達載體包含pCpG質(zhì)粒。
48.權(quán)利要求41的組合物，其中所述eIF5AlsiRNA和包含突變eIF5Al多核苷酸的表達載體獨立與聚氮丙啶復(fù)合。
49.權(quán)利要求41的組合物，其中所述eIF5AlsiRNA和包含突變eIF5Al多核苷酸的表達載體與聚氮丙啶復(fù)合在一起。
50.一種組合物，其包含靶向eIF5Al的3’末端的eIF5Al siRNA和包含編碼突變eIF5Al的多核苷酸的表達載體，其中所述突變eIF5Al不能被羥丁賴氨酸化，且其中所述 siRNA和表達載體被遞送給患者以治療癌癥。
51.權(quán)利要求50的組合物，其中所述癌癥是多發(fā)性骨髓瘤。
52.一種治療癌癥的方法，其包括給予患者權(quán)利要求50的組合物。
53.一種治療癌癥的方法，其包括給予患者權(quán)利要求41的組合物。
54.權(quán)利要求52的方法，其中所述組合物經(jīng)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或腫瘤內(nèi)給予。
55.權(quán)利要求53的方法，其中所述靶向eIF5Al的3’末端的siRNA和包含編碼突變 eIF5Al的多核苷酸的表達載體經(jīng)不同途徑遞送。
56.權(quán)利要求52的方法，其中所述組合物每周2次以約0.15mg/kg-約1. 5mg/kg的劑量注射給予。
57.權(quán)利要求52的方法，其中所述所述組合物每周2次以約0.75mg/kg-約1. 5mg/kg 的劑量注射給予。
全文摘要
本發(fā)明涉及靶向內(nèi)源基因以敲除或抑制內(nèi)源基因在宿主中表達的siRNA和以遞送介質(zhì)/表達載體遞送編碼所述基因的多核苷酸至宿主以提供所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)在宿主中表達的聯(lián)合用途。本發(fā)明還涉及截短型eIF-5A1，其用于誘導(dǎo)細胞凋亡和殺死細胞，尤其是哺乳動物的癌細胞。
文檔編號A61K48/00GK102202693SQ200980143782
公開日2011年9月28日 申請日期2009年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月3日
發(fā)明者C·泰勒, J·E·湯普遜, R·東德羅, Z·孫, Z·陳 申請人:森尼斯科技術(shù)公司