專利名稱：：外膜囊引發(fā)-蛋白質(zhì)增強(qiáng)疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于促進(jìn)針對(duì)腦膜炎球菌病原體的免疫應(yīng)答的方法的領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及用于使受試者針對(duì)由腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)造成的疾病免疫的方法，以及用于針對(duì)疾病如細(xì)菌性腦膜炎的引發(fā)-增強(qiáng)疫苗接種的組合。
背景技術(shù)：
：腦膜炎奈瑟氏菌(也稱為腦膜炎球菌(meningococcus))是非能動(dòng)性(non-motile)、革蘭氏陰性莢膜細(xì)菌，其為細(xì)菌性腦膜炎和敗血病最常見的原因。其在咽部建群，造成腦膜炎，并有時(shí)造成在不存在腦膜炎的情況下的敗血病。在美國，發(fā)作率為0.6-1次每100，000人每年，且在爆發(fā)時(shí)可遠(yuǎn)較此為高(參見Lieberman等(1996)JAMA275(19)1499-1503；Schuchat^(1997)NEnglJMed337(14):970-976)。在歐洲，發(fā)作率在不同國家之間有顯著不同，范圍為0.3-9例每100，000人。在發(fā)展中國家，地方病比率要高得多，且在流行期間發(fā)病率可達(dá)到500例每100，000人每年。死亡率極高，在歐洲各地為5-10%，在美國為10-20%，而在發(fā)展中國家要高得多。腦膜炎奈瑟氏菌還與其他嚴(yán)重的感染包括腦膜炎球菌關(guān)節(jié)炎(meningococcalarthritis)以及(罕見地)腦膜炎球菌肺炎相關(guān)。風(fēng)險(xiǎn)組(riskgroup)包括嬰兒和幼兒，難民，患者家庭接觸者(householdcontactofpatient)，募集的兵員(militaryrecruit)，大學(xué)生和研究活的分離株的微生物學(xué)家。除了高致死率之外，幸存者可具有嚴(yán)重的長期影響如腦損傷，聽力損失，學(xué)習(xí)障礙和截肢。已經(jīng)鑒定了十二個(gè)血清組(seragroup)的腦膜炎奈瑟氏菌，且四種(A、B、C和W-135)為主要病原體。血清組是通過腦膜炎球菌莢膜多糖的免疫化學(xué)來確定的。B和C組為在歐洲和美洲造成腦膜炎最常見的類型。Y組與肺炎相關(guān)，且其發(fā)病率目前在美國正在上升。在引入了針對(duì)流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)的結(jié)合疫苗(conjugatevaccine)之后，腦膜炎奈瑟氏菌為美國所有年齡中造成細(xì)菌性腦膜炎的主要原因。得到許可的腦膜炎球菌疫苗基于莢膜多糖。四價(jià)多糖制備物針對(duì)A、C、Y和W135組提供保護(hù)，但對(duì)最易感腦膜炎球菌疾病的年齡組，即幼兒并不有效。結(jié)合疫苗，其中所述多糖化學(xué)連接于載體蛋白，對(duì)兒童更加有效，并具有在經(jīng)免疫的人群中提供群體免疫的潛力。僅靶向C組疾病的結(jié)合疫苗廣泛用于歐洲，而一種四價(jià)結(jié)合物(A、C、W135和Y)在美國得到許可。B組腦膜炎球菌莢膜多糖并未用作疫苗抗原。腦膜炎奈瑟氏菌的血清組B目前導(dǎo)致美國、歐洲和南美全部腦膜炎的大約50%。無法使用多糖方法，因?yàn)閙enB莢膜多糖是α(2-8)連接N-乙酰神經(jīng)氨酸的聚合物，其也存在于哺乳動(dòng)物組織中。這導(dǎo)致對(duì)該抗原的耐受；事實(shí)上，如果引發(fā)了應(yīng)答，會(huì)擔(dān)心其可為抗自身的，因此不理想。多種針對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌(腦膜炎球菌)感染進(jìn)行免疫的方法之一是使用外膜囊(OMV)。有效的針對(duì)血清組B的外膜囊(OMV)疫苗已由NorwegianNationalInstituteofPublicHealth產(chǎn)生[參見Bjune等(1991)Lancet338(8775):1093-96]。盡管該疫苗是安全的，并阻止B組腦膜炎球菌(NmB)疾病，其效力限于用于制備該疫苗的株。該受限的效力可通過免疫顯性的PorA抗原的抗原變異性來解釋，該抗原歷史上也稱作1類外膜蛋白(OMP)。也有其他基于外膜制備物的疫苗的報(bào)道?！癛IVM”或稱NetherlandsVaccineInstitute(NVI)疫苗基于含有六種不同PorA亞型的0MV。已在II期臨床試驗(yàn)中顯示其對(duì)兒童有免疫原性(deKleijn等(2001)Vaccine20:352-358)。美國專利5，597，572&5，747，653號(hào)公開了針對(duì)血清組B腦膜炎球菌不同免疫原性血清型的疫苗，其基于保留65-kDa蛋白質(zhì)復(fù)合物的OMV。W090/06696公開了包含來自遺傳工程改造的腦膜炎球菌菌株的OMV的疫苗，其中所述OMV包含至少一個(gè)1類0ΜΡ，但不包含2/3類OMP。W094/08021公開了包含在其表面環(huán)中具有突變的OMP的OMV和包含腦膜炎球菌脂多糖(LPS)衍生物的OMV。W001/91788公開了用于制備針對(duì)血清組A腦膜炎球菌的基于OMV的疫苗的方法。有多種為促進(jìn)OMV效力的建議。W000/25811公開了包含補(bǔ)充了運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白(例如iTbpA和TbpB)和/或Cu，Zn-超氧化物歧化酶的OMV的組合物。W001/5^85公開了包含補(bǔ)充了多種蛋白質(zhì)的OMV的組合物。腦膜炎球菌OMV無法引發(fā)針對(duì)非同源血清亞型的交叉保護(hù)使其作為一般疫苗的用途受限，但其可能在流行病的情況中非常有用，在此情況下疾病的特征為病原株基本上屬于同一克隆(clonal)。因此FinlayInstitute疫苗(VA-MENGOC-BC(TM))在拉丁美洲是有用的，該處血清組B疾病由Pl.19，15血清型主宰，但該疫苗在其他地方并不有效(Mcchi等(1998)RevInstMedTropSaoPaulo40:65_70)。類似地，ChironMeNZB(TM)疫苗靶向1991年以來在新西蘭盛行的流行株(PI.7b，4根據(jù)最近的命名法稱作Pl.7-2，4)。盡管此類疫苗的成功，一些個(gè)體顯示對(duì)免疫有缺陷的應(yīng)答，使得無法誘導(dǎo)有效水平的免疫性。這在嬰兒中特別常見，嬰兒趨于對(duì)用OMV的免疫應(yīng)答不良。由于非常年幼者罹患腦膜炎球菌疾病的風(fēng)險(xiǎn)最大，這對(duì)于基于OMV的疫苗的使用而言是主要的問題。因此，存在對(duì)于新穎的和改良的疫苗接種策略的需要以供針對(duì)腦膜炎球菌疾病進(jìn)行免疫，例如供增強(qiáng)針對(duì)OMV及相關(guān)蛋白質(zhì)抗原的免疫應(yīng)答。
發(fā)明內(nèi)容在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在受試者中促進(jìn)針對(duì)腦膜炎球菌細(xì)菌的免疫應(yīng)答的方法，包括向所述受試者施用包含腦膜炎球菌OMV制備物的引發(fā)組合物(primercomposition)，和包含腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原制備物的增強(qiáng)組合物(boostercomposition)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了使受試者針對(duì)由腦膜炎奈瑟氏菌造成的疾病免疫的方法，包括向所述受試者施用包含OMV制備物的引發(fā)組合物，和包含蛋白質(zhì)抗原制備物的增強(qiáng)組合物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含包含腦膜炎球菌OMV制備物的引發(fā)組合物，和包含腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原制備物的增強(qiáng)組合物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了組合疫苗，其包含包含腦膜炎球菌外膜囊制備物的引發(fā)組合物，和包含腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原制備物的增強(qiáng)組合物，用于分別或順序施用以供預(yù)防腦膜炎球菌感染。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含腦膜炎球菌外膜囊制備物的引發(fā)組合物，和包含腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原制備物的增強(qiáng)組合物，在制備用于預(yù)防或治療腦膜炎球菌感染的組合疫苗中的用途。本方法可包括促進(jìn)(包括誘導(dǎo)或增強(qiáng))針對(duì)腦膜炎球菌細(xì)菌或由其衍生的抗原的免疫應(yīng)答。例如，本方法可涉及使受試者針對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌免疫或?qū)ζ溥M(jìn)行針對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌的免疫接種，例如以供預(yù)防或治療腦膜炎球菌疾病。待預(yù)防或治療的疾病可為例如，細(xì)菌性(腦膜炎球菌)腦膜炎、敗血病、腦膜炎球菌關(guān)節(jié)炎或肺炎。優(yōu)選所述疾病是腦膜炎或敗血病。待預(yù)防或治療的腦膜炎球菌血清組或株，例如免疫提供的保護(hù)所針對(duì)的那些，可為任何病原性血清型，特別是A、B、C、Y或W135。外膜囊(OMV)和外膜蛋白(OMP)可相應(yīng)地來源于此種血清型，例如，來自血清型A、B、C、Y或W135。優(yōu)選本方法涉及針對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌血清組B進(jìn)行免疫或促進(jìn)針對(duì)其的免疫應(yīng)答。優(yōu)選所述腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原制備物包含腦膜炎球菌外膜蛋白制備物。所述蛋白質(zhì)抗原或外膜蛋白制備物優(yōu)選為純化的蛋白制備物。OMP可為例如下述蛋白質(zhì)或其免疫原性片段中的一種或多種PorA、PorB,FetA,NadA、運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白(例如TbpA和TbpB)、乳鐵蛋白結(jié)合蛋白、血紅素和觸珠蛋白受體、補(bǔ)體因子H結(jié)合蛋白、Opa蛋白、NspA、0mp85、PilQ和Cu，Zn-超氧化物歧化酶。優(yōu)選所述OMP是PorA。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述引發(fā)組合物和/或所述增強(qiáng)組合物包含佐劑。優(yōu)選所述佐劑包含單磷酰脂質(zhì)A或氫氧化鋁。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述OMV制備物不包含純化的腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原或0ΜΡ，例如，所述OMV制備物可基本上由外膜囊組成。類似地，在具體實(shí)施方案中，所述引發(fā)組合物不包含純化的腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原或0ΜΡ，例如所述引發(fā)組合物可基本上由OMV和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體和/或佐劑組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原(例如0ΜΡ)制備物不包含外膜囊，例如所述腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原或OMP制備物基本上由一種或多種純化的腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原(例如0ΜΡ)組成。類似地，在具體實(shí)施方案中，所述增強(qiáng)組合物不包含0MV，例如，所述增強(qiáng)組合物可基本上由一種或多種純化的腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原(例如0ΜΡ)和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體和/或佐劑組成?？蓪⑺鲈鰪?qiáng)組合物在施用了弓丨發(fā)組合物之后在不同時(shí)間向受試者施用。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述增強(qiáng)組合物在引發(fā)組合物之后2至10周，優(yōu)選3至6周施用。本發(fā)明的實(shí)施方案可有利地促進(jìn)針對(duì)腦膜炎球菌抗原的免疫應(yīng)答，由此增強(qiáng)針對(duì)疾病如腦膜炎的疫苗的有效性。圖1顯示了對(duì)于經(jīng)引發(fā)然后用不同排列的(differentpermutationsof)0MV和純化的PorA蛋白增強(qiáng)的小鼠組的血清細(xì)菌抗體效價(jià)。實(shí)驗(yàn)使用Al(OH)3和MPL作為佐劑加以重復(fù)。1組0MV引發(fā)，OMV增強(qiáng)。2組0MV引發(fā)，PorA蛋白增強(qiáng)。3組PorA蛋白引發(fā)，OMV增強(qiáng)。4組=PorA蛋白引發(fā)，PorA蛋白增強(qiáng)。發(fā)明詳述外膜囊(OMV)在本發(fā)明的實(shí)施方案中，引發(fā)組合物包含來源于腦膜炎奈瑟氏菌的外膜囊(OMV)制備物。所述OMV制備物可為任何形式的包含腦膜炎球菌OMV的組合物。因此“0MV”包括任何通過破壞細(xì)菌外膜以形成包含外膜蛋白質(zhì)組分的外膜囊而獲得的脂蛋白體囊。OMV可從細(xì)菌例如通過去污劑處理，或通過非去污劑手段例如W02004/019977中所述的手段從細(xì)菌人工制備。該術(shù)語還涵蓋小泡(bleb)、微囊(例如W002/09643中所述的MV)和“天然0MV”(例如，Katial等Q002)Infect.Immun.70:702-707中所述的“N0MV，，)，其為天然存在的膜囊，在細(xì)菌生長過程中自發(fā)形成并釋放至培養(yǎng)基中。MV可通過將奈瑟氏菌(Neisseria)在液體培養(yǎng)基(brothculturemedium)中培養(yǎng)，在所述液體培養(yǎng)基中將全細(xì)胞從較小的MV分離(例如通過過濾或通過低速離心以僅沉淀細(xì)胞而不沉淀較小的囊)，并然后從除盡細(xì)胞的培養(yǎng)基收集MV(例如通過過濾，通過MV的示差沉淀或聚集，通過高速離心以沉淀MV)來獲得。用于產(chǎn)生MV的染料(stain)可通常基于培養(yǎng)基中產(chǎn)生的MV的量來選取，例如，美國專利6，180，111和W001/34642描述了具有高M(jìn)V產(chǎn)量的奈瑟氏菌?？梢砸远喾N方式制備0MV。用于獲得合適制備物的方法公開于例如本文中引用的參考文獻(xiàn)。用于形成OMV的技術(shù)包括用膽汁酸鹽去污劑例如石膽酸、鵝脫氧膽酸、熊脫氧膽酸、脫氧膽酸、膽酸、熊膽酸等的鹽處理細(xì)菌，其中優(yōu)選脫氧膽酸鈉用于在足夠高的PH處理奈瑟氏菌以免沉淀去污劑(參見EP0011243和W001/91788)。其他的技術(shù)可基本上在不存在去污劑的條件下實(shí)施，使用技術(shù)如聲處理、勻漿、微流化、空腔形成(cavitation)、滲透壓休克(osmoticshock)、研磨、弗氏壓碎(Frenchpress)、摻和(blending)等(參見W02004/019977)。一種用于OMV制備的優(yōu)選方法涉及用對(duì)粗OMV進(jìn)行超濾替代進(jìn)行高速離心(參見W02005/004908)。這使得量大得多的含OMV上清能夠在短得多的時(shí)間內(nèi)得到加工(通常>15升時(shí)4小時(shí)，相比<1.5升時(shí)10小時(shí))，并避免在離心之后重新分散(redisperse)OMV的需要。超離心使得大量的OMV能夠更加方便地制備，并使得能夠從所選的染料迅速產(chǎn)生OMV以用于疫苗制備。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述引發(fā)組合物可為包含OMV的針對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌的已知疫苗,例如RIVM、VA-MENG0C-BC、MeNZB或MenBvac。MenBvac(TM)產(chǎn)品含從挪威株H44/76制備的0MV。從新西蘭株NZ98/2M制備的OMV構(gòu)成MeNZB(TM)產(chǎn)品的基礎(chǔ)。其安全性和效力已經(jīng)經(jīng)證實(shí)。MeNZB(TM)和MenBvac(TM)兩者均在0.5ml劑量中包含50μg/ml濃度(以蛋白質(zhì)的量測量)的0MV。用于疫苗制備的腦膜炎球菌菌株鑒定目標(biāo)腦膜炎球菌菌株的血清亞型可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)基于1類孔蛋白OMP(PorA)達(dá)成。根據(jù)本發(fā)明所用的腦膜炎球菌菌株包括表達(dá)多重血清亞型即多重PorA等位基因的株。在其他實(shí)施方案中，腦膜炎球菌菌株表達(dá)單一PorA序列即為單一血清亞型的。根據(jù)本發(fā)明所用的腦膜炎球菌菌株通常會(huì)為，但不限于下述血清組之一A、B、C、W135或Y。在其他的實(shí)施方案中，來自任何其他腦膜炎球菌血清組的株可用于本發(fā)明，包括例如血清組乂。根據(jù)本發(fā)明所用的腦膜炎球菌可為任何血清型例如1、加、213、4、14、15、16等和/或任何免疫型例如Ll；L3,3,7;L10等。腦膜炎球菌可為來自任何合適的種系，包括超侵襲性(hyperinvasive)和超毒力(hypervirulent)種系例如下述七個(gè)超毒力種系之一亞組I；亞組III；亞組IV-I；ET-5復(fù)合物；ET-37復(fù)合物；A4簇；種系3。這些種系通過多位點(diǎn)酶電泳(MLEE)進(jìn)行了定義，但也使用多位點(diǎn)序列分型(multilocussequencetyping,MLST)對(duì)腦膜炎球菌進(jìn)行分類(參見Maiden等(1998)PNASUSA95:3140-3145)，例如用MLST分類ET-37復(fù)合物為ST-Il復(fù)合物，ET-5復(fù)合物是ST-32(ET-5)，種系3是ST-41/44寸。腦膜炎球菌可具有一個(gè)或多個(gè)基因的一個(gè)或多個(gè)敲除突變。為了減少致熱原活性，例如，細(xì)菌應(yīng)具有低的內(nèi)毒素(LPQ水平，且這可通過敲除涉及LPS生物合成的酶來達(dá)成。合適的突變體細(xì)菌為已知的，例如突變體奈瑟氏菌(參見W099/10497)。用于從革蘭氏陰性細(xì)菌制備LPS除盡外膜的方法公開于EP06M376。正如下調(diào)特定蛋白的表達(dá)，細(xì)菌可過表達(dá)(相對(duì)于相應(yīng)的野生型株)免疫原如NspA、蛋白觀7、蛋白741、TbpA,TbpB、超氧化物歧化酶等。細(xì)菌還可表達(dá)一種或多種并非內(nèi)源的基因。例如，本發(fā)明可使用相對(duì)于相應(yīng)的野生型株表達(dá)新基因的重組株。以此形式的非內(nèi)源基因的表達(dá)可通過多種技術(shù)例如染色體插入(如用于如vanderLey等(1995)Vaccine13:401-7所述引入多重PorA基因)、敲入(knockin)突變、從染色體外載體例如從質(zhì)粒表達(dá)等來達(dá)成。腦膜炎球菌優(yōu)選為血清組B。在具體實(shí)施方案中，OMV可從具有下述血清亞型之一的腦膜炎球菌制備:P1.2；Pl.2,5；Pl.4；Pl.5；Pl.5,2；Pl.5，c；PL5c,10；Pl.7-2.4、Pl.7，16；Pl.7，16b；PI.7h，4；Pl.9；Pl.15；Pl.9，15；Pl.12，13；Pl.13；Pl.14；Pl.21，16；Pl.22，14。然而，任何合適的腦膜炎球菌血清亞型可用于本發(fā)明，包括例如任何在中http//neisseria,org/提及的，例如參見http//neisseria,org/perl/agdbnet/agdbnet.pi？file=poravr.xml。OMV給藥現(xiàn)存的腦膜炎球菌OMV疫苗為制備實(shí)施本發(fā)明的引發(fā)組合物提供了藥學(xué)、計(jì)量學(xué)和制劑方面的指導(dǎo)。例如，VA-MENGOC-BC(TM)為0.5ml的可注射的懸液，包含50μg來自Cu-385-83株的OMV和50μg血清組C莢膜多糖，吸收于2mg的氫氧化鋁凝膠，以及0.01%硫柳汞和磷酸鹽緩沖液。MeNZB(TM)亦為0.5ml懸液，并包含25μg來自NZ98/2M株的OMV吸附在1.65mg氫氧化鋁佐劑上，以及組氨酸緩沖液和氯化鈉。MenBvac類似于MeNZB(TM)，但是從44/76株制備的。可選取用于引發(fā)組合物的OMV的濃度從而使其在將增強(qiáng)組合物向受試者施用之后提供保護(hù)性免疫。在本發(fā)明引發(fā)組合物中OMV的濃度通常會(huì)為10至500μg/ml，優(yōu)選25至200μg/ml，且更優(yōu)選約50μg/ml或約100μg/ml(例如以O(shè)MV中的總蛋白表示)。在某些實(shí)施方案中，所述引發(fā)組合物可包含來自超過一種腦膜炎球菌血清亞型的0MV。在此情況下可減少用于單個(gè)血清亞型的劑量而不喪失效力。腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原(例如0ΜΡ)制備物依照本發(fā)明，增強(qiáng)組合物可包含一種或多種特定腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原(優(yōu)選來自血清組B)，或其免疫原性片段。提及“腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原”旨在涵蓋任何來源于腦膜炎奈瑟氏菌，并當(dāng)引入受試者(例如人)時(shí)能夠產(chǎn)生免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)、多肽或其片段。優(yōu)選所述腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌具有特異性。優(yōu)選所述腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原是外膜蛋白。提及“外膜蛋白”旨在涵蓋任何存在于腦膜炎奈瑟氏菌外表面的蛋白質(zhì)，例如任何可檢測為位于腦膜炎球菌外膜或與其相關(guān)的蛋白質(zhì)。例如，可使用外膜蛋白質(zhì)抗原如W02004/048404、TO99/24578、TO99/36544、W099/57280、W000/22430、W096/29412、W001/64920、W003/020756或W02004/032958中公開的。合適的OM蛋白包括但不限于PorA、PorB、!^etA、NadA、運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白(例如TbpA和TbpB)、乳鐵蛋白結(jié)合蛋白、血紅素和觸珠蛋白受體、補(bǔ)體因子H結(jié)合蛋白、Opa蛋白、NspA、0mp85、PilQ和Cu，Zn超氧化物歧化酶，包括其免疫原性片段。增強(qiáng)組合物或OMP制備物可包含單一蛋白質(zhì)抗原，或可添加少數(shù)限定的抗原(10或更少(例如9、8、7、6、5、4、3、2)個(gè)純化抗原的混合物)。免疫原性片段可包含至少η個(gè)來自所述序列的連續(xù)氨基酸，其中η是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。優(yōu)選的片段包括來自相關(guān)序列的表位，可包括超過一個(gè)(例如2、3、4、5、6個(gè))這些多肽。腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原制備物優(yōu)選為純化的蛋白質(zhì)制備物。用于本發(fā)明的合適的腦膜炎球菌蛋白，包括外膜蛋白可從適當(dāng)?shù)哪X膜炎球菌菌株純化或例如在重組細(xì)胞中產(chǎn)生，例如如上述公開文獻(xiàn)中所述。許多OMP的多肽和DNA序列是已知的，并可從公眾可訪問的數(shù)據(jù)庫得到。含有OMV或_莫奶求ifgsji!抗jc(仿_OMP)ammn^本發(fā)明的引發(fā)和/或增強(qiáng)組合物可為包含藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。此類組合物可使用包括將OMV或腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原(例如0ΜΡ)與藥學(xué)上可接受的載體混合的步驟的方法來制備。典型的“藥學(xué)上可接受的載體”包括任何自身不誘導(dǎo)對(duì)接受該組合物的個(gè)體有害的抗體產(chǎn)生的載體。合適的載體通常為大的、代謝緩慢的大分子如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和脂質(zhì)聚集體(如油小滴或脂質(zhì)體)。此類載體對(duì)于本領(lǐng)域一般技術(shù)人員而言是公知的。疫苗還可包含稀釋劑如水、鹽水、甘油等。此外，可存在輔助性物質(zhì)如潤濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)、蔗糖等。無菌的無熱原磷酸鹽緩沖生理鹽水是一種典型的載體，例如基于注射用水(basedonwaterforinjection)。對(duì)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的詳盡討論可從Gennaro(2000)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy.20thedition,ISBN:0683306472獲得。本發(fā)明的引發(fā)和/或增強(qiáng)組合物通常會(huì)為水性形式(例如溶液或懸液)而非干燥形式(例如凍干的)。水性組合物也適用于將疫苗從凍干形式重構(gòu)。當(dāng)本發(fā)明組合物是用于此種臨時(shí)重構(gòu)(extemporaneousreconstitution)時(shí)，本發(fā)明提供了試劑盒，其可包含兩個(gè)或更多個(gè)小瓶，或可包含一個(gè)或多個(gè)預(yù)填充的注射器和一個(gè)或多個(gè)小瓶，其中所述注射器的水性內(nèi)容物用于在注射之前重新激活小瓶中的干燥內(nèi)容物。本發(fā)明的引發(fā)和/或增強(qiáng)組合物可置于小瓶中，或其可置于預(yù)填充的注射器中。所述注射器可配有或不配有針頭來提供。組合物可以以單位劑量形式或多重劑量形式(multipledoseform)包裝。注射器通常會(huì)包含單一劑量的組合物，而小瓶可包含單一劑量或多重劑量。因此，對(duì)于多重劑量形式，小瓶比預(yù)填充注射器優(yōu)選。可常規(guī)地確定有效的劑量體積，但本組合物的典型人用劑量具有約0.5ml的體積，例如用于肌肉內(nèi)注射?；赗IVMOMV的疫苗以0.5ml體積通過肌肉內(nèi)注射于大腿或上臂來施用。MeNZB(TM)以0.5ml通過肌肉內(nèi)注射于股前外側(cè)(anterolateralthigh)或手臂三角肌區(qū)域來施用。類似的劑量可用于其他遞送途徑例如用于噴霧的基于OMV的鼻內(nèi)疫苗可具有每噴約100μ1或約130μ1的體積，而施用四噴給予約0.5ml的總劑量。組合物的pH優(yōu)選為6至8，且更優(yōu)選6.5至7.5(例如約7)。基于RIVM0MV的疫苗的PH為7.4，而對(duì)于本發(fā)明的組合物優(yōu)選pH<7.5?？赏ㄟ^使用緩沖液例如Tris緩沖液、磷酸鹽緩沖液或組氨酸緩沖液維持穩(wěn)定的PH。本發(fā)明的組合物通常會(huì)包含緩沖液。如果組合物包含氫氧化鋁鹽，其優(yōu)選使用組氨酸緩沖液例如Ι-lOmM，優(yōu)選約5mM?；赗IVMOMV的疫苗通過使用IOmMTris/HCl緩沖液維持pH。組合物可為無菌的和/或無熱原的。本發(fā)明的組合物對(duì)于人類可為等張的。本發(fā)明的引發(fā)和/或增強(qiáng)組合物是免疫原性的，可更優(yōu)選為疫苗組合物。依照本發(fā)明的疫苗可為預(yù)防性的(即用于預(yù)防感染)或治療性的(即用于治療感染)，但通常會(huì)為預(yù)防性的。用作疫苗的免疫原性組合物包含免疫學(xué)有效量的抗原，以及任何其他所需的成分。提及“免疫學(xué)有效量”意指將該量作為本文中所述的組合引發(fā)物/增強(qiáng)物給藥方案的一部分向個(gè)體施用對(duì)于治療或預(yù)防是有效的。該量取決于待治療個(gè)體的健康和身體情況、年齡、待治療個(gè)體的分類學(xué)分組(例如，非人靈長類，靈長類等)、個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需保護(hù)的程度、疫苗的配制、主治醫(yī)師對(duì)醫(yī)療狀況的評(píng)價(jià)和其他相關(guān)因素而變化。預(yù)計(jì)該量會(huì)落在較寬的范圍內(nèi)，其可通過常規(guī)試驗(yàn)確定。本發(fā)明組合物的抗原成分通常會(huì)表示為每劑蛋白量的形式。約0.9mg蛋白質(zhì)每ml的劑量對(duì)于基于OMV的鼻內(nèi)疫苗是常見的。腦膜炎球菌影響身體的多個(gè)區(qū)域，并因此本發(fā)明組合物可以以多種形式制備。例如，所述組合物可作為注射劑(injectable)，或者作為液體溶液或者作為懸液來制備。所述組合物可制備用于肺部施用，例如作為吸入劑，使用細(xì)粉劑(finepowder)或噴霧劑。所述組合物可制為為栓劑或陰道栓劑(pessary)。所述組合物可制備用于鼻部、耳部或眼部施用，例如作為噴霧劑、滴劑、凝膠劑或粉劑(參見例如Almeida&Alpar(1996)J.DrugTargeting3:455-467)。用于肌肉內(nèi)施用的注射劑是典型的。本發(fā)明的引發(fā)和/或增強(qiáng)組合物可包含抗微生物劑，特別是當(dāng)包裝為多重劑量形式時(shí)。抗微生物劑如硫柳汞和2-苯氧乙醇常常見于疫苗，但優(yōu)選使用不含汞的防腐劑或根本不使用防腐劑。本發(fā)明的組合物可包含去污劑例如Tween(聚山梨酯)^Tween80。去污劑通常以低水平例如<0.01%存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原制備物包含去污劑。去污劑可協(xié)助確保腦膜炎球菌蛋白質(zhì)(例如0ΜΡ)采用適當(dāng)?shù)臉?gòu)象以供引起免疫應(yīng)答。本發(fā)明的引發(fā)和/或增強(qiáng)組合物可包含來自O(shè)MV制備的殘余去污劑(例如脫氧膽酸鹽)。殘余去污劑的量優(yōu)選對(duì)于每Pg蛋白質(zhì)少于0.4yg(更優(yōu)選少于0.2yg)。本發(fā)明的組合物可包含來自腦膜炎球菌的LPS。LPS的量優(yōu)選對(duì)于每yg蛋白質(zhì)少于0.12yg(更優(yōu)選少于0.05yg)。本發(fā)明的組合物可包含鈉鹽(例如氯化鈉)以給予張度。10mg/mlNaCl的濃度是典型的。氯化鈉的濃度優(yōu)選為約9mg/ml。本發(fā)明的引發(fā)和/或增強(qiáng)組合物通常會(huì)與其他免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)合施用。具體而言，組合物通常會(huì)包含一種或多種佐劑，且本發(fā)明提供了用于制備本發(fā)明組合物的方法，包括分別將OMV和/或OMP與佐劑例如在藥學(xué)上可接受的載體中混合的步驟。合適的佐劑在VaccineDesign(1995)eds.Powell&Newman.ISBN:030644867X,Plenum中于了i寸ife，i包括但不限于A.含有無機(jī)物的組合物在本發(fā)明中適用作佐劑的含有無機(jī)物的組合物包括無機(jī)鹽如鋁鹽和鈣鹽。本發(fā)明包括無機(jī)鹽如氫氧化物(例如羥基氧化物)、磷酸鹽(例如羥基磷酸鹽、正磷酸鹽)、硫酸鹽等，或不同無機(jī)化合物的混合物，其中所述化合物為任何合適的形式(例如凝膠、晶狀物、無定形等)，并優(yōu)選具有吸附。含有無機(jī)物的組合物還可配制為金屬鹽的顆粒。例如，RIVM疫苗可吸收于磷酸鋁或氫氧化鋁佐劑。MeNZB(TM)、MenBvac(TM)和VA-MENINGOC-BC(TM)產(chǎn)品均包含氫氧化鋁佐劑。鋁佐劑的典型劑量為約3.3mg/ml(表示為鋁離子的濃度)。B.油乳劑在本發(fā)明中適用作佐劑的油乳劑包括鯊烯-水乳劑，如MF59(5%鯊烯，0.5%Tween80和0.5%Span85，使用微流化器(microfluidizer)配制為亞微米顆粒)。當(dāng)免疫一些動(dòng)物物種時(shí)，還可使用弗氏完全佐劑(CFA)和弗氏不完全佐劑(IFA)。C.皂苷配制物皂苷配制物也可在本發(fā)明中用作佐劑。皂苷為異源的留醇糖苷和三萜糖苷的組，其見于廣泛范圍植物物種的樹皮/莖皮(bark)、葉、莖、根和甚至花。來自QuillaiasaponariaMolina樹樹皮的皂苷作為佐劑受到了廣泛研究。皂苷還可從Smilaxornata(墨西哥菝葜(sarsaprilla))、圓錐石頭花(Gypsophi1Iapaniculata)(bridesveil)禾口月巴阜草(Saponariaofficianalis)(soaproot)獲得。阜昔佐劑配制物包括純化配制物如QS21，以及脂質(zhì)配制物，如ISC0M。QS21作為Stimulon(TM)商業(yè)推廣。使用HPLC和RP-HPLC純化了皂苷組合物。鑒定了使用這些技術(shù)純化的特定級(jí)分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。優(yōu)選地，所述皂苷是QS21。皂苷配制物還可包含留醇，如膽固醇。皂苷和膽固醇的組合可用于形成稱為免疫刺激復(fù)合物的獨(dú)特顆粒(ISCOM)。ISCOM通常還包含磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。任何已知的皂苷可用于ISC0M。優(yōu)選地，所述ISCOM包含QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。任選地，所述ISCOM可不含其他去污劑?；谠碥盏淖魟┰诶鏐arr等(1998)AdvancedDrugDeliveryReviews32:247-271中有進(jìn)一步討論。D.病毒體和病毒樣顆粒在本發(fā)明中病毒體和病毒樣顆粒(VLP)也可用作佐劑。這些結(jié)構(gòu)通常含有一種或多種來自病毒的蛋白質(zhì)任選地與磷脂組合或一起配制。其通常為非病原性、非復(fù)制的并通常并不含有任何天然病毒基因組。病毒蛋白可重組產(chǎn)生或從全病毒分離。這些適用于病毒體和VLP的病毒蛋白包括來源于流感病毒如(HA或NA)、乙型肝炎病毒(如核心或殼體蛋白)、戊型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、諾瓦克病毒、人乳頭狀瘤病毒、HIV、RNA噬菌體、Qβ噬菌體(如外殼病毒)、GA-噬菌體、fr-噬菌體、AP205噬菌體和Ty(如反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白pi)的蛋白質(zhì)。VLP和病毒體在例如W003/024481和Gluck等Q002)Vaccine20:B10_B16中有進(jìn)一步討論。E.細(xì)菌或微生物衍生物適用于本發(fā)明的佐劑包括細(xì)菌或微生物衍生物如腸細(xì)菌脂多糖(LPQ的非毒性衍生物、脂質(zhì)A衍生物、免疫刺激寡核苷酸和ADP核糖基化毒素及其解毒衍生物。LPS的非毒性衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A(MPL)和3_0_脫乙酰MPL(3dMPL)。3dMPL是3-脫-0-乙?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A具有4、5或6乙?；湹幕旌衔铩?-脫-0-乙酰化單磷酰脂質(zhì)A的優(yōu)選的“小顆?！毙问焦_于EP0689454。此類3dMPL的“小顆?！毙≈磷阋酝ㄟ^0.22μm膜的滅菌過濾。其他非毒性LPS衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A模擬物，如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物例如RC-5^(Evans等000；3)ExpertRevVaccines2:219-229)脂質(zhì)A衍生物包括來自大腸桿菌的脂質(zhì)A衍生物如0M-174。0M-174描述于例如Meraldi等(2003)Vaccine21:2485-2491。適于作為佐劑用于本發(fā)明的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含有未甲基化的胞嘧啶通過磷酸鍵連接于鳥苷的二核苷酸序列)的核苷酸序列。也顯示了含有回文或聚(dG)序列的雙鏈RNA和寡核苷酸為免疫刺激性的。CpG可包括核苷酸修飾/類似物如硫代磷酸酯修飾，且可為雙鏈的或單鏈的。CpG寡核苷酸的佐劑作用在Krieg(2003)NatureMedicine9:831-835中有進(jìn)一步討論。細(xì)菌ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物可用作本發(fā)明中的佐劑。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)來源于大腸桿菌(大腸桿菌不耐熱腸毒素“LT”)、霍亂(“CT”)或百日咳(“PT”)。使用解毒的ADP-核糖基化毒素作為粘膜佐劑和作為腸胃外佐劑描述于W095/17211和W098/42375。F.人免疫調(diào)節(jié)劑適于作為佐劑用于本發(fā)明的人免疫調(diào)節(jié)劑包括細(xì)胞因子，如白介素例如IL-I、IL-2、IL-4、IL-5、IL_6、IL_7、IL-12等，干擾素，巨噬細(xì)胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子。G.生物粘著劑和粘膜粘著劑還可在本發(fā)明中使用生物粘著劑和粘膜粘著劑作為佐劑。合適的生物粘著劑包括酯化的透明質(zhì)酸微球或粘膜粘著劑如聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、多糖和羧甲基纖維素的交聯(lián)衍生物。殼聚糖及其衍生物也可在本發(fā)明中用作佐劑。H.微粒微粒也可在本發(fā)明中用作佐劑。優(yōu)選從生物可降解的和非毒性的材料(例如，聚(a_羥酸)、聚羥丁酸、聚正酯、聚酐、聚己酸內(nèi)酯等)與丙交酯-乙交酯共聚物(polydactide-co-glycotide))形成的微粒(即，直徑為IOOnm至150μm,更優(yōu)選直徑為200nm至30μm，且最優(yōu)選直徑為500nm至10μm的顆粒)，任選地經(jīng)處理具有荷負(fù)電的表面(例如，用SDS)或荷正電的表面(例如，用陽離子型去污劑如CTAB)。I.脂質(zhì)體適于作為佐劑使用的脂質(zhì)體配制物的實(shí)例描述于US6，090，406、US5,916，588和EP0626169。J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯配制物適用于本發(fā)明的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯。此類配制物還包括聚氧乙烯山梨糖醇酐酯表面活性劑與辛苯聚醇的組合以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑與至少一種其他非離子型表面活性劑如辛苯聚醇的組合。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自下組聚氧乙烯-9-月桂醚(Laureth9)、聚氧乙烯~9~硬脂醚(polyoxyethylene-9-steorylether)、聚氧乙烯-8-硬脂醚(polyoxyethylene-9-steorylether)、聚氧乙烯_4_月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。K.聚磷腈(PCPP)PCPP配制物描述于例如Andrianov等(1998)Biomaterials19109-115。L.胞壁酰肽適于在本發(fā)明中用作佐劑的胞壁酰肽的實(shí)例包括N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨M-D-^#MM月安(N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamine)(thr-MDP)，N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamine)(nor-MPD)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(r_2‘-二棕櫚酰-5n-甘油-3-羥基磷酰氧)-乙醇胺(N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2-(r~2‘-dipalmitoyl-5n-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamine)(MTP-PE)。Μ.咪唑并喹諾酮(imidazoquinolone)化合物適于在本發(fā)明中用作佐劑的咪唑并喹諾酮化合物的實(shí)例包括Imiquamod及其同源物(例如"Resiquimod3M，，)，進(jìn)一步描述于ManleyQ002)ClinExpDermatol27:571-577。本發(fā)明還包含一種或多種方面上述確定的佐劑的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑是鋁鹽，例如氫氧化鋁。處理方法本發(fā)明還提供了用于在哺乳動(dòng)物中引起免疫應(yīng)答的方法，包括向所述哺乳動(dòng)物施用本發(fā)明的引發(fā)組合物和增強(qiáng)組合物。免疫應(yīng)答優(yōu)選為保護(hù)性的，且優(yōu)選涉及抗體。所述方法可在已經(jīng)通過施用引發(fā)組合物針對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌引發(fā)的受試者中引起增強(qiáng)應(yīng)答。對(duì)于OMV的皮下和鼻內(nèi)引發(fā)/增強(qiáng)給藥方案公開于Bakke等(2001)Infect.Immun.69:5010_5015。本發(fā)明可使用類似的引發(fā)-增強(qiáng)給藥方案實(shí)施，但是所述引發(fā)物包含OMV而所述增強(qiáng)物包含腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原(例如，0ΜΡ)。哺乳動(dòng)物(例如，在本文中定義的任何方法中所稱的受試者)優(yōu)選為人。當(dāng)疫苗是用于預(yù)防用途時(shí)，人優(yōu)選為兒童(例如蹣跚學(xué)步的兒童或嬰兒)或青少年；當(dāng)疫苗是用于治療用途時(shí)，人優(yōu)選為成人。旨在用于兒童的疫苗也可施用于成人例如以評(píng)價(jià)安全性、劑量、免疫原性等。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的OMV和腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原(例如0ΜΡ)組合物和混合物用作藥物。所述藥物優(yōu)選能夠在哺乳動(dòng)物中(即其為免疫原性組合物)作為如本文中所述的引發(fā)-增強(qiáng)給藥方案的一部分引起免疫應(yīng)答，并更優(yōu)選為疫苗。本發(fā)明還提供了OMV和腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原(例如0ΜΡ)組合物在制備用于在哺乳動(dòng)物中引起免疫應(yīng)答的組合疫苗中的用途，其中將所述OMV組合物作為引發(fā)物施用，而所述腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原(例如0ΜΡ)組合物作為增強(qiáng)物施用。這些用途和方法優(yōu)選用于預(yù)防和/或治療由腦膜炎奈瑟氏菌造成的疾病例如細(xì)菌性(或更具體而言，腦膜炎球菌)腦膜炎，或敗血病。一種檢查治療性處理效力的方式涉及在施用本發(fā)明的組合物之后監(jiān)視奈瑟氏菌感染。一種檢查預(yù)防性處理效力的方式涉及在施用所述組合物之后監(jiān)視針對(duì)OMV抗原的免疫應(yīng)答。本發(fā)明組合物的免疫原性可通過將其向測試受試者(例如12-16月齡的兒童或動(dòng)物模型)施用并然后確定標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)包括血清殺細(xì)菌抗體(SBA)和ELISA效價(jià)(GMT)來確定。這些免疫應(yīng)答通常會(huì)在施用組合物之后大約4周確定，并與在施用組合物之前確定的值比較。優(yōu)選SBA至少增加至4倍或8倍。當(dāng)施用多于一個(gè)劑量的組合物時(shí)，可進(jìn)行超過一次施用后測定。本發(fā)明的優(yōu)選組合物可對(duì)于可接受百分比的人類受試者賦予受試者超過血清保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)的抗體效價(jià)。具有下述相關(guān)抗體效價(jià)的抗原是公知的，在所述相關(guān)抗體效價(jià)之上就將宿主視為針對(duì)所述抗原為血清轉(zhuǎn)化的，且此類效價(jià)由組織如WHO公開。優(yōu)選超過80%，更優(yōu)選超過90%，仍更優(yōu)選超過93%且最優(yōu)選96-100%的統(tǒng)計(jì)上顯著的受試者樣品為血清轉(zhuǎn)化的。本發(fā)明的組合物通常會(huì)直接向受試者施用。直接遞送可通過腸胃外注射(例如皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或向組織的間質(zhì)間隙中)，或通過直腸、經(jīng)口、陰道、局部、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、眼部、耳部、肺部或其他粘膜施用來達(dá)成。優(yōu)選肌肉內(nèi)施用于大腿或上臂。注射可為通過針頭(例如皮下注射針頭)，但或者可使用無針頭的注射。典型肌肉內(nèi)劑量為0.5ml。劑量處理可為單一劑量方案或多重劑量方案。多重劑量可用于初級(jí)免疫方案和/或用于增強(qiáng)免疫方案。初級(jí)劑量方案在增強(qiáng)劑量方案之前。多個(gè)引發(fā)劑量之間的合適時(shí)機(jī)(例如，4-16周)和引發(fā)及增強(qiáng)之間的合適時(shí)機(jī)可常規(guī)地確定。對(duì)基于OMV的RIVM疫苗使用3或4個(gè)劑量的初級(jí)方案進(jìn)行測試，在0、2和8或者0、1、2和8個(gè)月時(shí)進(jìn)行疫苗接種。將MeNZB(TM)作為三個(gè)劑量以六周間隔施用。類似的引發(fā)給藥方案可依照本發(fā)明使用，只要初級(jí)劑量方案(使用OMV制備物)之后為增強(qiáng)劑量方案(使用OMP制備物)。如上所述，本發(fā)明的初級(jí)劑量方案可涉及分別或混合施用來自腦膜炎奈瑟氏菌超過一種血清亞型的囊。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法涉及將腦膜炎球菌OMV制備物作為引發(fā)劑量向受試者施用，并隨后將腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原(例如0ΜΡ)制備物作為增強(qiáng)給藥向受試者施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述引發(fā)劑量在時(shí)點(diǎn)零給予，而增強(qiáng)劑量在所述引發(fā)劑量之后2周和12個(gè)月之間給予，例如4至12周之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將一個(gè)或多個(gè)額外的引發(fā)劑量(例如1或2個(gè)額外的引發(fā)劑量)在第一引發(fā)劑量之后0至6周給予，并將一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)劑量(例如1至3個(gè)增強(qiáng)劑量)在第一引發(fā)劑量之后6周至12個(gè)月給予。所述受試者于每個(gè)劑量可接受相同或不同量的引發(fā)和/或增強(qiáng)組合物。本發(fā)明可用于引起系統(tǒng)和/或粘膜免疫。一般而言，本發(fā)明的組合物在向受試者施用之后能夠誘導(dǎo)血清殺細(xì)菌抗體應(yīng)答。這些應(yīng)答可方便地在小鼠中測量，并為疫苗效力的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)(參見例如Pizza等O000)Science287:1816-1820)。血清殺細(xì)菌活性(SBA)測量由補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)菌殺滅，并可使用人或幼兔補(bǔ)體來測定。涉及基于多糖的疫苗的WHO標(biāo)準(zhǔn)(但并不特別針對(duì)基于OMV或蛋白的疫苗)要求疫苗在超過90%的受體中誘導(dǎo)SBA至少4倍的增加。MeNZB(TM)在施用第三劑量之后4_6周疫苗引起SBA4倍的升高。依照本發(fā)明，優(yōu)選在施用增強(qiáng)組合物之后4-6周在多于90%的受體中誘導(dǎo)SBA的至少4倍的升高。本發(fā)明的組合疫苗(即引發(fā)加上增強(qiáng)組合物)可另外誘導(dǎo)針對(duì)一種或多種超毒力種系和針對(duì)其他種系例如超侵襲性種系的殺細(xì)菌抗體應(yīng)答。優(yōu)選的株組可包括在至少四個(gè)下述國家中分離的株GB、AU、CA、N0、IT、US、NZ、NL、BR和CU。所述血清優(yōu)選具有至少256或更高的殺細(xì)菌效價(jià)，更優(yōu)選512、10M、2048、4096或更高的效價(jià)，例如，當(dāng)1/10稀釋時(shí)，血清能夠殺滅至少50%的特定株的測試細(xì)菌，如Pizza等(2000)Science287:1816-1820中所述。優(yōu)選的組合物可誘導(dǎo)針對(duì)多種腦膜炎球菌菌株的殺細(xì)菌應(yīng)答，包括例如來自簇A4(例如株961-5945(B:2b:Ρ1·21，16)和/或株G2136)、來自ΕΤ_5復(fù)合物(例如株MC58(B15:P1.7，16b)和/或株44/76(B15:P1.7,16))或來自種系3(例如株394/98(B4=Pl.4)和/或株BZ198)的血清組B腦膜炎球菌菌株。株961-5945和G2136均為奈瑟氏菌MLST參照株(參見iTettelin等(2000)Science287:1809-1815,Pettersson等(1994)MicrobPathog17(6):395-408和http//neisseria,org/nm/typing/mlst/)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述腦膜炎球菌菌株是NZ98/2M。其他的抗原件組分正如包含0MV，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的弓丨發(fā)組合物可包含其他非囊抗原，如來自腦膜炎奈瑟氏菌例如來自血清組A、C、W135和/或Y的糖抗原。當(dāng)使用糖(saccharide)或糖(carbohydrate)抗原時(shí)，其優(yōu)選結(jié)合于載體以增強(qiáng)免疫原性。腦膜炎球菌糖抗原的結(jié)合是公知的。所述引發(fā)組合物還可包含一種或多種來自不同的病原體的抗原例如破傷風(fēng)或白喉抗原。優(yōu)選引發(fā)組合物不包含純化的腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原。在組合物中的抗原通常會(huì)以至少各1μg/ml的濃度存在。一般而言，任何給定抗原的濃度應(yīng)足以弓I起針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。作為在本發(fā)明組合物中使用蛋白質(zhì)抗原的替代手段，可使用編碼該抗原的核酸。本發(fā)明組合物的蛋白質(zhì)組分可因此由編碼該蛋白質(zhì)的核酸(優(yōu)選為DNA，例如以質(zhì)粒的形式)替代。如本文中使用的術(shù)語“包含/包括”涵蓋了“含有”以及“由...組成”，例如“包含”X的組合物可基本上或排他地由X組成或可含有其他組分。應(yīng)理解的是以上僅通過舉例對(duì)本發(fā)明加以描述，且可進(jìn)行修飾而仍舊包含于本發(fā)明的保護(hù)范圍和精神。實(shí)施例用于優(yōu)化針對(duì)腦膜炎球菌外膜抗原的免疫應(yīng)答的引發(fā)增強(qiáng)策略在臨床試驗(yàn)中，用外膜囊(OMV)進(jìn)行的免疫顯示提供了針對(duì)由腦膜炎奈瑟氏菌造成的疾病的保護(hù)(Bjune等，1991；Sierra等，1991)。在去污劑的存在下將OMV從生物提取，且其含有與完整細(xì)菌的外膜相同的蛋白質(zhì)抗原的補(bǔ)體(Poolman等，2006)。由OMV疫苗提供的保護(hù)趨于為株特異性的，特別是在最易受到感染的幼體中，因?yàn)橹鲗?dǎo)性殺細(xì)菌抗體應(yīng)答是針對(duì)可變的PorA抗原的(Tappero等，1999)。疫苗開發(fā)者對(duì)此問題采用了截然相反的應(yīng)對(duì)方法，或者搜索基因組中的保守蛋白質(zhì)抗原(Rappuoli，2001)或開發(fā)基于可變的蛋白質(zhì)抗原如PorA的組合的配制物(vandenDobbelsteen等，2006；Urwin等，2004)。該實(shí)施例闡明了用于優(yōu)化針對(duì)在腦膜炎球菌表面上表達(dá)的保護(hù)性表位的免疫應(yīng)答的新免疫策略。在本實(shí)施例中，將PorA用作外膜蛋白，但在其他實(shí)施方案中，可使用其他保守或其他可變的蛋白質(zhì)抗原。方法如圖1所示，將雌性NIH小鼠(10只/組)在皮下用1μg0MV(NZ98/254株)或IOyg純化的PorA蛋白(P1.7-2,4)引發(fā)和增強(qiáng)來進(jìn)行免疫。將增強(qiáng)劑量在引發(fā)之后3周施用。使用氫氧化鋁(Alum)或MPL佐劑(單磷酰脂質(zhì)A+TDM，Sigma)。在增強(qiáng)劑量之后2周對(duì)小鼠取血。在小鼠模型中針對(duì)PorA蛋白誘導(dǎo)的疫苗保護(hù)是通過血清殺細(xì)菌測定法(SBA)使用幼兔補(bǔ)體和腦膜炎奈瑟氏菌株Z6426/9140來確定的。將SBA效價(jià)報(bào)道為與活菌數(shù)對(duì)照相比導(dǎo)致>50%細(xì)菌殺滅的血清稀釋度倒數(shù)的幾何平均值。將數(shù)據(jù)通過GeneralLinearModels分析使用Minitab15進(jìn)行協(xié)方差分析。結(jié)果和討論結(jié)果示于圖1。在該研究中，在用不同組合的OMV和純化PorA蛋白質(zhì)組分的組合引發(fā)和增強(qiáng)之后比較了針對(duì)PorA抗原的殺細(xì)菌應(yīng)答。結(jié)果闡明了用于引發(fā)免疫系統(tǒng)的抗原(即，作為純化蛋白或在OMV中)的呈遞對(duì)殺細(xì)菌應(yīng)答比用作增強(qiáng)物的抗原的呈遞具有更大的作用。無論使用的佐劑為何，殺細(xì)菌抗體效價(jià)在用OMV疫苗引發(fā)并用純化的PorA蛋白增強(qiáng)的小鼠組中是最高的，闡明了有可能通過用增強(qiáng)劑量特異性靶向PorA(或其他候選抗原)來促進(jìn)由OMV引起的殺細(xì)菌應(yīng)答。不愿拘于理論，對(duì)這些結(jié)果的可能解釋是用OMV的引發(fā)將保護(hù)性PorA表位以對(duì)于良好的殺細(xì)菌應(yīng)答正確的構(gòu)象呈遞。后續(xù)用純化的蛋白質(zhì)的增強(qiáng)確保該應(yīng)答特異性靶向所選抗原，在此情況下為PorA。此外，用OMV引發(fā)免疫應(yīng)答確保了強(qiáng)Thl應(yīng)答，其中對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)殺細(xì)菌殺滅最有效的IgG亞型占據(jù)主導(dǎo)地位。這與使用MPL，一種已知引起良好Thl型應(yīng)答的佐劑所觀察到的增強(qiáng)的殺細(xì)菌應(yīng)答相一致。盡管PorA在OMV制備物中是免疫顯性的，目前疫苗開發(fā)者正在衡量許多其他外膜蛋白質(zhì)抗原，包括PorB、FetA、運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白、乳鐵蛋白結(jié)合蛋白、血紅素和觸珠蛋白受體、補(bǔ)體因子H結(jié)合蛋白、NadA、0pa蛋白、NspA、0mp85、PilQ和許多其他從基因組序列數(shù)據(jù)鑒定、具有未確證功能的蛋白質(zhì)。用OMV引發(fā)并用純化的蛋白質(zhì)增強(qiáng)的原理對(duì)于這些其他抗原是同樣適用的。例如，在另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用I^etA抗原實(shí)施本文針對(duì)PorA所述的引發(fā)-增強(qiáng)策略。與其針對(duì)蛋白質(zhì)抗原的應(yīng)答相對(duì)，嬰兒趨于對(duì)用OMV的免疫應(yīng)答不良。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，使用結(jié)合了用OMV引發(fā)和用純化的外膜蛋白增強(qiáng)的引發(fā)-增強(qiáng)策略可確保在腦膜炎球菌疾病風(fēng)險(xiǎn)最大的非常年幼的個(gè)體中強(qiáng)力的保護(hù)性應(yīng)答。參考文獻(xiàn)Bjune,G.,Hoiby,E.A.,Gronnesby,J.K.,Arnesen,0.,Fredriksen,J.H.,Halstensen,A.等(1991)EffectofoutermembranevesiclevaccineagainstgroupBmeningococcaldiseaseinNorway.Lancet338:1093-1096.PooIman,J.T.，Denoel,P.，F(xiàn)eron,C.，Goraj,K.禾口Weynants，V.(2006)OutermembraneVesicle-basedMeningococcalVaccines.InHandbookofMeningococcalDisease.Frosch,M.，andMaiden，M.(eds).WILEY-VCH,pp.371-390.Rappuoli,R.(2001)Reversevaccinology,agenome-basedapproachtovaccinedevelopment.Vaccine19:2688-2691.Sierra，V.G.G.，Campa,C.H.，Garcia，LI.，Sotolongo，F(xiàn).P.，Izquierdo，LP.，Valcarcel,Μ.N.等(1991)EfficacyevaluationoftheCubanvaccineVA-MENG0C-BCagainstdiseasecausedbyserogroupBNeisseriameningitidis.InNiesseria1990.Achtman,M.e.a.(ed).Berlin:WalterdeGruyter,pp.129-134.Tappero,J.W.，Lagos,R.，Ballesteros，A.M.，Plikaytis，B.，Williams,D.，Dykes,J.等(1999)Immunogenicityof2serogroupBouter-membraneproteinmeningococcalvaccines:arandomizedcontrolledtrialinChile.JAMA2811520-1527.Urwin,R.，Russell，J.E.，Thompson,E.A.，Holmes，E.C.，F(xiàn)eavers，I.M.禾口Maiden,M.C.(2004)DistributionofSurfaceProteinVariantsamongHyperinvasiveMeningococci!ImplicationsforVaccineDesign.InfectImmun72:5955-5962.vandenDobbelsteen，G.P.，vanDijken，H.H.，Pillai，S.禾口van，A.L.(2006)ImmunogenicityofacombinationvaccinecontainingpneumococcalconjugatesandmeningococcalPorAOMVs.Vaccine.在此文件中提及的每個(gè)申請(qǐng)和專利，以及每個(gè)在上述申請(qǐng)和專利中引用或參照的文件，以及任何在每個(gè)申請(qǐng)和專利中和在任何申請(qǐng)引用的文件中引用或提及的生產(chǎn)商的指示或產(chǎn)品目錄，通過提述并入本文。此外，所有在此文件中引用的文件，以及所有在此文件中引用的文件中引用或參照的文件，以及在該文件中引用或提及的任何生產(chǎn)商的指示或任何產(chǎn)品的目錄，通過提述并入本文。本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)的多種修飾和變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見不乖離本發(fā)明的范圍和精神。盡管本發(fā)明是就具體優(yōu)選實(shí)施方案來進(jìn)行描述的，應(yīng)理解的是要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)不恰當(dāng)?shù)叵抻诖祟惥唧w實(shí)施方案，且可在本發(fā)明范圍內(nèi)對(duì)其的進(jìn)行許多修飾和添加。事實(shí)上，所述用于實(shí)施本發(fā)明的模式的多種修飾對(duì)于免疫學(xué)、分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的，并旨在處于權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。此外，在獨(dú)立權(quán)利要求的特征之內(nèi)，上述從屬權(quán)利要求的特征可進(jìn)行多種組合，而不乖離本發(fā)明的范圍。權(quán)利要求1.一種使受試者針對(duì)由腦膜炎奈瑟氏菌造成的疾病免疫的方法，包括向所述受試者施用包含腦膜炎球菌外膜囊制備物的引發(fā)組合物和包含腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原制備物的增強(qiáng)組合物。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是腦膜炎、敗血病、腦膜炎球菌關(guān)節(jié)炎或肺炎。3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中所述疾病由腦膜炎奈瑟氏菌血清型A、B、C、Y或W135造成。4.任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述外膜囊制備物和/或所述腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原制備物來源于腦膜炎奈瑟氏菌血清型B。5.任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原制備物來源于腦膜炎奈瑟氏菌菌株NZ98/254或H44/76。6.任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述引發(fā)組合物包括RIVM、VA-MENGOC-BC、MeNZB或MenBvac疫苗組合物。7.任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原制備物包含腦膜炎球菌外膜蛋白制備物。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述外膜蛋白制備物包含一種或多種選自下組的純化的蛋白質(zhì)PorA、PorB、i^etA、NadA、運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白、乳鐵蛋白結(jié)合蛋白、血紅素和觸珠蛋白受體、補(bǔ)體因子!1結(jié)合蛋白、0￡1蛋白、臨六、011185、？110、01，211-超氧化物歧化酶及其免疫原性片段。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述外膜蛋白制備物包含純化的PorA或其免疫原性片段。10.任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述外膜蛋白制備物來源于腦膜炎奈瑟氏菌血清型Pl.7-2.4。11.任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述引發(fā)組合物和/或所述增強(qiáng)組合物包含佐劑。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述佐劑包含單磷酰脂質(zhì)A或氫氧化鋁。13.任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述增強(qiáng)組合物在引發(fā)組合物施用于受試者之后2周至12個(gè)月施用。14.一種在受試者中促進(jìn)針對(duì)腦膜炎球菌細(xì)菌的免疫應(yīng)答的方法，包括向所述受試者施用包含腦膜炎球菌外膜囊制備物的引發(fā)組合物和包含腦膜炎球菌外膜蛋白制備物的增強(qiáng)組合物。15.一種藥物組合，其包含包含腦膜炎球菌外膜囊制備物的引發(fā)組合物和包含腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原制備物的增強(qiáng)組合物。16.一種組合疫苗，其包含包含腦膜炎球菌外膜囊制備物的引發(fā)組合物和包含腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原制備物的增強(qiáng)組合物，用于分別或順序施用以供預(yù)防腦膜炎球菌感染。17.包含腦膜炎球菌外膜囊制備物的引發(fā)組合物和包含腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原制備物的增強(qiáng)組合物在制備用于預(yù)防或治療腦膜炎球菌感染的組合疫苗中的用途。全文摘要本發(fā)明提供了一種使受試者針對(duì)由腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)造成的疾病免疫的方法，包括向所述受試者施用包含腦膜炎球菌外膜囊制備物的引發(fā)組合物和包含腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原制備物的增強(qiáng)組合物。還提供了包含引發(fā)和增強(qiáng)組合物的疫苗組合以及相關(guān)用途。文檔編號(hào)A61P31/04GK102202686SQ200980144006公開日2011年9月28日申請(qǐng)日期2009年9月4日優(yōu)先權(quán)日2008年9月5日發(fā)明者伊安.菲弗斯申請(qǐng)人:健康保護(hù)機(jī)構(gòu)