專利名稱：調(diào)節(jié)皮膚色素沉著的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)研究或調(diào)節(jié)黑色素在皮膚中的色素沉著有用的組合物和方法。具體但是不獨(dú)占地說(shuō)，本發(fā)明涉及能夠?qū)谏貜暮谒丶?xì)胞到角化細(xì)胞以及潛在地從角化細(xì)胞到角化細(xì)胞的轉(zhuǎn)移進(jìn)行調(diào)節(jié)的組合物，鑒定這種組合物的試驗(yàn)，以及調(diào)節(jié)皮膚色素沉著的方法。
背景技術(shù)：
黑素細(xì)胞是沿著表皮和毛球的基底層分布的神經(jīng)嵴源性細(xì)胞。這些細(xì)胞在稱為黑素體的黑素細(xì)胞特異性細(xì)胞器內(nèi)部合成黑色素。對(duì)于色素沉著的皮膚和頭發(fā)，這種黑素素必須從黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)移到相鄰的角化細(xì)胞。在涉及大量步驟被一系列分子和化合物在多個(gè)控制點(diǎn)上控制的過(guò)程中，黑色素的數(shù)量和質(zhì)量(棕/黑真色素或紅/黃褐黑素)決定哺乳動(dòng)物的皮膚和頭發(fā)/羊毛/毛皮的顏色。在過(guò)去的二十年里，人類在理解黑色素合成和黑素體生源/成熟的分子控制方面取得了很多進(jìn)步。然而，人類知識(shí)的顯著空白集中在黑色素轉(zhuǎn)移是怎樣被控制的一主要的臨床/化妝品興趣點(diǎn)，因?yàn)檫@個(gè)過(guò)程最終控制在皮膚表面和沿著毛發(fā)纖維所察覺(jué)到的色素沉著水平。在本申請(qǐng)中描述了一種控制黑色素從人體皮膚黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)移到人體皮膚角化細(xì)胞的新機(jī)制。該機(jī)制涉及BMP6的行為，其以劑量依賴的方式激發(fā)該過(guò)程。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)是屬于TGF-β超家族的分泌的信號(hào)分子。它們?cè)诩?xì)胞增殖，細(xì)胞分化，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞黏著和細(xì)胞死亡方面發(fā)揮重要作用(Hogan 1996)。迄今為止， 已經(jīng)描述了 20個(gè)以上不同的BMP家族成員，而且每個(gè)都通過(guò)與特異性BMP受體的相互作用發(fā)揮其生物活性(Wozney等，1988)。BMP信號(hào)在多個(gè)水平上運(yùn)行取決于BMP類型，拮抗劑的存在，靶組織的發(fā)展階段，以及靶細(xì)胞受體類型(Botchkarev 2003)。BMI^s結(jié)合兩個(gè)跨膜受體家族，多重BMP受體(BMPR) I和單個(gè)BMPRII (Hogan 1996)。有趣地是，為了啟動(dòng)信號(hào)， BMP必須結(jié)合兩個(gè)受體，通過(guò)BMP-R II誘導(dǎo)BMPR I中細(xì)胞內(nèi)域的磷酸化并且活化細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。BMPs是皮膚發(fā)展的有力監(jiān)管者，而且它們也在調(diào)控表皮動(dòng)態(tài)平衡，毛囊生長(zhǎng)，和正常產(chǎn)后皮膚中黑素生成方面發(fā)揮重要作用(Botchkarev 2003)。黑素細(xì)胞是在胚胎形成過(guò)程中遷移至表皮和毛囊的而且隨后合成黑色素和將黑色素分配給周圍角化細(xì)胞的神經(jīng)嵴源性細(xì)胞(Halaban等2003)。有趣地是，有許多BMPR I受體，BMPR I A(ALK3 ；Seq ID 4)， BMPR I B(ALK6 ；Seq ID 2)，禾口 ActR-I (ALK2) (Kawabata 等，1998)而且通過(guò) ALK3 誘導(dǎo)它們的增殖同時(shí)通過(guò)ALK6誘導(dǎo)它們的分化在神經(jīng)前體細(xì)胞中發(fā)信號(hào)(Panchision等，2001)，這表明受體表達(dá)決定BMP對(duì)細(xì)胞的作用。Gilchrest小組首先在研究中示出BMP4在黑素細(xì)胞生物學(xué)中的作用，該研究表明特定的BMP家族成員通過(guò)抑制黑素細(xì)胞中的限速酶(酪氨酸酶)的表達(dá)和活性而扮演正常人體黑素細(xì)胞中的黑素生成自分泌抑制劑的角色Waar等，2006)。然而，至今還沒(méi)有報(bào)道其他BMP蛋白質(zhì)與黑素細(xì)胞生物學(xué)(例如黑素生成和/或黑色素轉(zhuǎn)移)有關(guān)。雖然已經(jīng)對(duì)黑素細(xì)胞中黑素生成(即黑色素合成)的調(diào)控了解很多， 但是我們關(guān)于黑素體怎樣從黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)移到角化細(xì)胞的知識(shí)還很有限。除了細(xì)胞質(zhì)-吞噬作用，越來(lái)越多的證據(jù)支持黑素體通過(guò)可以與角化細(xì)胞質(zhì)膜相互作用的絲狀偽足轉(zhuǎn)移的觀點(diǎn)(Scott等，2002，Singh等，2008)。重要地是，與由黑素細(xì)胞樹(shù)突的側(cè)面和末梢引起的并且在其內(nèi)腔中包含黑素體的絲狀偽足一致的結(jié)構(gòu)已經(jīng)在human skin in situ as well as in vitro (Scott 等，2002)中進(jìn)行了報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種對(duì)受體的皮膚和/或頭發(fā)的黑色素色素沉著進(jìn)行調(diào)節(jié)的方法，方法包括給受體服用組合物，該組合物包括可以對(duì)ALK6(SEQ ID 2)或 Cdc42的活性或表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)的物質(zhì)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，物質(zhì)通過(guò)調(diào)節(jié)ALK6的活性調(diào)節(jié)Cdc42的表達(dá)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，方法包括將組合物涂在受體的皮膚和/或頭發(fā)的外表面上。為了調(diào)節(jié)皮膚的色素沉著，有兩個(gè)方法調(diào)節(jié)黑素生成和調(diào)節(jié)黑色素的轉(zhuǎn)移。本發(fā)明可以包括這些方法的一個(gè)，另一個(gè)或兩個(gè)方法都包括。然而，本發(fā)明的發(fā)明人尤其對(duì)調(diào)節(jié)黑色素轉(zhuǎn)移的方法感興趣，因?yàn)榘l(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以有效地以黑色素轉(zhuǎn)移為目標(biāo)。假設(shè)黑色素轉(zhuǎn)移是比黑素生成更“下游”的過(guò)程，那么在避免副作用方面，黑色素轉(zhuǎn)移是更有吸引力的目標(biāo)。合適地是，該方法是化妝品的方法，其在用化妝品調(diào)節(jié)皮膚和/或頭發(fā)的黑色素色素沉著水平使皮膚和/或頭發(fā)顏色變淡或變深方面有用?？蛇x地，該方法可以用于為受體提供一定程度的光保護(hù)。眾所周知黑色素保護(hù)皮膚免受紫外線照射的許多有害作用。因此，增加受體的皮膚中的黑色素量可以顯著地降低陽(yáng)光誘發(fā)的損傷，例如細(xì)胞的突變潛在地導(dǎo)致癌癥或早熟衰老癥。在另一個(gè)可替換實(shí)施例中，該方法可以用于治療與皮膚的非正常色素沉著相關(guān)的疾病。這種治療可以是治愈的，或可能是用于緩解癥狀。與皮膚的變異色素沉著相關(guān)的可以治療的疾病或醫(yī)療疾病包括色素沉著過(guò)度(例如黑斑病，黃褐病，衰老性著色斑，日光性著色斑，雀斑，炎癥后色素沉著過(guò)度)和色素減退(例如，白癜風(fēng)，和炎癥后色素減退)和皮膚損傷帶來(lái)的色素沉著減少。在一個(gè)實(shí)施例中，物質(zhì)可以增加與正常生理水平相比的ALK6的活性或表達(dá)，即 ALK6激動(dòng)劑。在特定的實(shí)施例中，物質(zhì)可以以增加黑色素轉(zhuǎn)移的方式增加ALK6的活性或表達(dá)。ALK6的活性的增加將使皮膚和/或頭發(fā)中的黑色素增加。在另一個(gè)實(shí)施例中，物質(zhì)可以降低與正常生理水平相比的ALK6的活性或表達(dá)，即 ALK6拮抗劑。在特定的實(shí)施例中，物質(zhì)可以以降低黑色素轉(zhuǎn)移的方式降低ALK6的活性或表達(dá)。ALK6的活性的降低將使皮膚和/或頭發(fā)中的黑色素降低。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法涉及包含BMP6多肽(編號(hào)NM_001718 ；Seq ID 1) 或片段或其變體的組合物的應(yīng)用，其中所述片段或變體是功能活性的。以野生型BMP6至少50%的活性活化ALK6的片段或變體可以稱為是功能活性的， 盡管較低的活性水平可能也是有用的。更優(yōu)選的這種片段或變體的活性應(yīng)該是野生型BMP6的活性的至少75%，尤其優(yōu)選是野生型BMP6的活性的90%。具體地說(shuō)，本文中的“活性”可以在以下描述的試驗(yàn)中表示激發(fā)黑色素從黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)移到角化細(xì)胞的能力。正如使用以下將要描述的實(shí)驗(yàn)所確定的，“功能活性的”BMP6片段或變體表現(xiàn)出增加黑素生成或黑色素轉(zhuǎn)移的能力。BMP6蛋白質(zhì)，變體，和片段的功能活性可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法進(jìn)行檢驗(yàn)(Current Protocols in Protein Science (1998) Coligan 等，eds. , John Wiley&Son, Inc. , Somerset, New Jersey)而且在以下進(jìn)一步描述。為了本文的目的，功能活性的片段可以包括那些包含BMP6的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域的片段，例如結(jié)合域，因?yàn)樗鲇蚓哂兴璧幕钚?。可以使用PFAM程序鑒別蛋白質(zhì)域 (Bateman A.，等，Nucleic Acids Res，1999，27 :260-2)。在一些實(shí)施例中，優(yōu)選的片段是功能活性的，域包含片段包括至少25個(gè)連續(xù)的氨基酸，優(yōu)選至少50，更優(yōu)選75，而且最優(yōu)選 BMP6有效域的至少100個(gè)連續(xù)的氨基酸。在更優(yōu)選的實(shí)施例中，片段包括整個(gè)功能性的有效域。功能性的活性片段或變體包括重組BMP6多肽及其功能活性片段或變體，包括被 BMP6-編碼核酸編碼的那些。功能性的活性BMP6多肽可以理論上包括BMP6前體蛋白質(zhì)(編號(hào)P22004)(序列號(hào)1)。據(jù)相信，成熟的BMP6多肽包括相同的氨基酸374-513。功能性的活性片段可以包括多肽，該多肽包括BMP6前體(序列號(hào)1)的氨基酸 382-513,388-513 和 412-513。術(shù)語(yǔ)“BMP6-編碼核酸”是指編碼BMP6多肽的DNA或RNA分子。優(yōu)選地是，BMP6多肽或核酸或變體或其片段來(lái)自人體，但是也可以是其同源物或衍生物。優(yōu)選所述變體或其片段具有與人類BMP6或序列編碼BMP6 (NM001718)至少70%的序列一致性，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選85%，進(jìn)一步優(yōu)選90%，和最優(yōu)選至少95%的序列一致性。如本文中所使用的，關(guān)于目標(biāo)序列或目標(biāo)序列的特定部分的“百分比(％ )序列一致性”被定義成候選衍生序列中的核苷酸或氨基酸與目標(biāo)序列(或其特定部分)中的核苷酸或氨基酸的百分比，在對(duì)齊序列和引入間隙之后，如果需要獲得最大的百分比序列一致性，如通過(guò)所有檢索參數(shù)設(shè)定在缺省值的程序WU-BLAST-2. 0al9 (Altschul等，J. Mol. Biol. (1997)215 =403-410)所產(chǎn)生的。HSP S和HSP S2參數(shù)是動(dòng)態(tài)值并且通過(guò)程序建立， 程序本身取決于具體序列的組成和搜索所需序列的特定數(shù)據(jù)庫(kù)的組成?！滦灾涤善ヅ涞南嗤塑账峄虬被岬臄?shù)量決定，核苷酸或氨基酸是由被報(bào)告百分比一致性的序列長(zhǎng)度所分割的。確定“百分比(％)氨基酸序列相似性“的計(jì)算與確定％氨基酸序列一致性的計(jì)算相同，但是在計(jì)算中除了相同氨基酸以外還包括保守氨基酸取代物。保守氨基酸取代物是指其中的氨基酸被具有相似性質(zhì)的另一個(gè)氨基酸取代使得蛋白質(zhì)的折疊或活性不受到顯著的影響?？梢曰ハ嗳〈姆枷阕灏被崾潜奖彼幔彼?，和酪氨酸；可以互換的疏水氨基酸是亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，和纈氨酸；可以互換的極性氨基酸是谷氨酰胺，賴氨酸和組氨酸；可以互換的酸性氨基酸是天冬氨酸和谷氨酸； 和可以互換的小氨基酸是丙胺酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸和甘氨酸?？蛇x地，Smith和Waterman的局部同源性算法提供了核酸序列的對(duì)齊方式(Smith 禾口 Waterman，1981，Advance in Applied Mathematics 2:482—489;數(shù)據(jù)庫(kù) European Bioinformatics Institute ；Smith 禾口 Waterman,1981, J. of Molec. Biol., 147 :195-197 ；Nicholas 1998,"A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods，，(www. psc. edu)禾口其中弓I用的參考文獻(xiàn)；W. R. Pearson, 1991， Genomics 11 :635-650)。通過(guò)使用 Dayhoff(Dayhoff :Atlas of Protein Sequences and Structure, M. 0. Dayhoff ed. ,5suppl. 3 :353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C.，USA)開(kāi)發(fā)的和 Gribskov (Gribskov 1986 Nucl. Acids Res. 14(6) :6745-6763)標(biāo)準(zhǔn)化的計(jì)分矩陣可以將算法應(yīng)用到氨基酸序列上?？梢允褂?Smith-Waterman算法，其中使用缺省參數(shù)計(jì)數(shù)(例如，12的比較結(jié)果中一個(gè)空隙的罰分，2 的比較結(jié)果中一個(gè)空隙每延長(zhǎng)一堿基的罰分)。從產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，“匹配”值反映“序列一致性”。目標(biāo)核酸分子的衍生核酸分子包括與編碼BMP6的核酸序列雜交的序列。在雜交和清洗過(guò)程中，溫度，離子強(qiáng)度，PH，和變性劑例如甲酰胺的存在可以控制雜交的嚴(yán)格。 用容易獲得的過(guò)程文本闡述通常使用的條件(例如Current Protocol in Molecular Biology,Vol. 1,Chap. 2. 10, John ffiley&Sons,Publishers(1994) ；Sambrook等，Molecular Cloning, Cold Spring Harbor(1989))。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸分子可以與包含BMP6的核苷酸序列的核酸分子在高嚴(yán)格雜化條件下雜化在包含6X單強(qiáng)度檸檬酸(SSC) (IX SSC是0. 15M NaCl,0.015M 檸檬酸鈉；PH7. 0)，5XDenhardt，s溶液，0. 05%焦磷酸鈉和100g/ml鯡魚(yú)精DNA的溶液中， 含有核酸的過(guò)濾器在65°C下預(yù)雜化8小時(shí)到過(guò)夜；在含有6XSSC，lXDenhardt’ s溶液， 100 μ g/ml酵母tRNA和0. 05%焦磷酸鈉的溶液中，在65 °C下雜化18-20小時(shí)；在65°C下然后在含有0. IX SSC和0. 1% SDS (十二烷基硫酸鈉)的溶液中清洗過(guò)濾器1小時(shí)。在其他實(shí)施例中，使用的中等嚴(yán)格的水解條件是在包含35 %甲酰胺，5 X SSC, 50mM Tris-HCl (pH7. 5), 5mM EDTA，0. 1 % PVP,0. 1 % Ficoll, 1 % BSA，和 500 μ g/ml 變性的鮭精DNA的溶液中，含有核酸的過(guò)濾器在40°C下預(yù)處理6小時(shí)；在含有35%甲酰胺， 5XSSC,50mM Tris-HCl (pH7. 5), 5mM EDTA，0. 02% PVP,0. 02% Ficoll, 0. 2% BSA, 100 μ g/ ml變性的鮭精DNA，和10% (wt/vol)右旋糖酐硫酸酯的溶液中，在40°C下雜化18-20小時(shí)； 然后在55°C下在含有2 X SSC和0. SDS的溶液中分兩次清洗1小時(shí)?？蛇x地，可以使用的低嚴(yán)格條件是在含有20%甲酰胺，5XSSC，50mM磷酸鈉 (pH7. 6) ,5XDenhardt's溶液，10%右旋糖酐硫酸酯，和20 μ g/ml變性的被修飾的鮭精DNA 的溶液中在37°C下孵化8小時(shí)；在相同的緩沖液中雜化18到20小時(shí)；然后在約37°C條件下在IXSSC中清洗濾器1小時(shí)。在另一個(gè)實(shí)施例中，方法包括組合物的應(yīng)用，該組合物包括可以與BMP6鍵合并且使BMP6失活的化合物。因此，本發(fā)明可以與BMP6的拮抗劑相關(guān)。例如，化合物可以是能夠與BMP6鍵合的抗體或其片段?？梢允褂靡阎姆椒óa(chǎn)生與BMP6多肽特異性鍵合的抗體。優(yōu)選對(duì)BMP6多肽的哺乳動(dòng)物直系同源特異的抗體，而且更優(yōu)選對(duì)人類BMP6特異的抗體?？贵w可以是多克隆的，單克隆的(mAbs)，人源化抗體或嵌合抗體，單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)(ab' )2片段，由FAb 表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段，抗獨(dú)特性(抗-id)抗體，和以上任何的表面抗原結(jié)合片段?？梢赃x擇特別抗原性的BMP6表面抗原，例如為了抗原性的BMP6多肽的常規(guī)篩選或?yàn)榱诉x擇蛋白質(zhì)的抗原區(qū)域通過(guò)施加理論方法給BMP6的氨基酸序列(Hopp和Wood (1981)，Procc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 78 :3824-28 ；Hopp 禾口 Wood(1983)Mol. Immunol. 20 :483-89 ；Sutcliffe 等，(1983) Science 219:660-66)。通過(guò)上述標(biāo)準(zhǔn)程序可以制造相似性是IO8M.1,優(yōu)選 IO9IT1 到 IOiciIT1,或更強(qiáng)的單克隆抗體(Harlow 禾口 Lane, supra ；Goding(1986)Monoclonal Antibodies principles and Practice (2d ed) Academic Press,紐約；禾口美國(guó)專利第 4，381，292 號(hào)；和 4，618，577 號(hào))。抗體可以針對(duì)BMP6的粗細(xì)胞提取物或其基本純化的片段產(chǎn)生。如果使用BMP6片段，它們優(yōu)選包括至少10個(gè)，和更優(yōu)選，至少20個(gè)BMP6蛋白質(zhì)的連續(xù)氨基酸。BMP6-特異的抗原和/或免疫原可以與激發(fā)免疫應(yīng)答的載體蛋白連接。例如，目標(biāo)多肽與鎖孔血藍(lán)蛋白(KLH)的載體共價(jià)連接，而且共軛物在費(fèi)式完全佐劑中乳化，其提高了免疫應(yīng)答。根據(jù)傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方案使合適的免疫系統(tǒng)例如實(shí)驗(yàn)室兔或?qū)嶒?yàn)小鼠免疫。通過(guò)合適的實(shí)驗(yàn)例如使用固定的相應(yīng)BMP6多肽的固相酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)檢驗(yàn)BMP6-特異性抗體的存在。也可以使用其他試驗(yàn)例如放射性免疫測(cè)定或熒光測(cè)定?？梢詫MP6多肽特異的嵌合抗體制造成包含來(lái)自不同動(dòng)物種族的不同部分。例如，免疫球蛋白恒定區(qū)可以與鼠科mAb的各種區(qū)域連接，使得抗體從人類抗體衍生出生物活性，和從鼠科片段衍生出鍵合特異性。將基因拼接在一起產(chǎn)生嵌合抗體，該基因?qū)?lái)自各個(gè)種族的合適區(qū)域進(jìn)行編碼(Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. (1984)81 :6851-6855 ； Neuberger 等，Nature (1984) 312 :604-608 ；Takeda 等，Nature (1985) 31 :452-454)。人源化抗體(嵌合抗體的一種形式)可以通過(guò)借助重組DNA技術(shù)將小鼠抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs) (Carlos, Τ. Μ.，J. Μ. Harlan. 1994. Blood 84 :2068-2101)移植到人類的框架區(qū)域和恒定區(qū)域的背景中產(chǎn)生(RiechmannLM等，1988 Nature 323:323-327)。人源化抗體包含鼠科序列和人類序列，從而進(jìn)一步降低或消除免疫抗原性，而同時(shí)保留抗體特異性(Co MS，禾口 Queen C. 1991 Nature 351 :501-501 ；Morrison SL. 1992Ann. Rev. Immun. 10 239-265)。人源化抗體及其產(chǎn)生方法是本領(lǐng)域公知的(美國(guó)專利第5，530，101，5，585，089， 5，693，762，和 6，180，370 號(hào))?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域公知的方法產(chǎn)生重組的BMP6-特異性單鏈抗體，通過(guò)使Fv 區(qū)域的重和輕鏈片段借助氨基酸橋連接形成的單鏈多肽(美國(guó)專利第4，946，778 ； Bird，Science (1988) 242 :423-426 ;Huston 等，Proc. Natl. Acad. Sci.美國(guó)(1988)85 5879-5883 ；和 Ward 等，Nature (1989) 334 :544-546)。用于抗體產(chǎn)生的其他合適技術(shù)包括淋巴細(xì)胞暴露給抗原性多肽或可選地暴露給噬菌體載體或類似載體中的抗體庫(kù)的選擇(Huse等，Science (1989)246 :1275-1281)。本發(fā)明的多肽和抗體可以改性使用或不改性使用。通常，抗體通過(guò)連接物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記(共價(jià)的或非共價(jià)的)，該物質(zhì)提供可檢測(cè)的信號(hào)，或是對(duì)表達(dá)目標(biāo)蛋白的細(xì)胞有毒的物質(zhì)(Menard S等，Int J.Biol Markers (1989) 4 :131-134)。大量的標(biāo)記和共軛技術(shù)都是公知的而且在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中都有廣泛報(bào)道。合適的標(biāo)記包括放射性核素、酶、酶作用物、輔因子、抑制劑、熒光部分、熒光發(fā)光鑭系金屬，化學(xué)發(fā)光部分，生物發(fā)光部分，磁性粒子等(美國(guó)專利第 3，817，837 ；3，850，752 ；3，939，350，；3，996，345 ；4，277，437 ；4，275，149 ；和4，366，對(duì)1)。同樣，可以產(chǎn)生重組的免疫球蛋白(美國(guó)專利第4，816，567號(hào))?？梢詡鬏敿?xì)胞質(zhì)多肽的抗體而且抗體通過(guò)與膜穿透毒蛋白結(jié)合到達(dá)它們的靶點(diǎn)(美國(guó)專利第 6，086，900)。在另一個(gè)實(shí)施例中，方法涉及包括化合物的組合物的應(yīng)用，該化合物可以與ALK6 鍵合并且活化或阻滯ALK6的活性。例如，這種化合物可以是可以與ALK6鍵合的抗體或其片段。因此，本發(fā)明可以包括ALK6的激動(dòng)劑或拮抗劑。例如，抗體可以鍵合ALK6和阻止 BMP6的鍵合，從而防止BMP6活化ALK6和驅(qū)動(dòng)黑素生成或黑色素轉(zhuǎn)移。以上列舉了抗體產(chǎn)生的公知技術(shù)的細(xì)節(jié)。在另一個(gè)實(shí)施例中，方法涉及包括核酸的組合物的應(yīng)用，該核酸能夠通過(guò)與DNA 或RNA的相互作用調(diào)節(jié)ALK6或Cdc42的表達(dá)，DNA或RNA為ALK6或Cdc42或其功能部分編碼。在優(yōu)選的實(shí)施例中，核酸是RNA分子，尤其是可以對(duì)mRNA編碼ALK6或Cdc42進(jìn)行針對(duì)性的反義核酸相互作用或RNA干擾的RNA分子。例如，用于靶向Cdc42mRNA的合適 RNAi 分子可以是 5 ‘ -GAUAACUCACCACUGUCCATT-3 '和 5 ‘ -UGGACAGUG⑶GA⑶UAUCTT-3 ‘ 寡核糖核苷酸；或可以用于抑制Cdc42的5 ‘ -GACUCCUUUCUUGCUUGUUTT-3 ‘和 5 ‘ -AACAAGCAAGAAAGGAGUCTT-3 ‘寡核糖核苷酸，或其他這種合適的和特異性的序列。其在本領(lǐng)域技術(shù)人員確定其他合適的序列的技能范圍內(nèi)，該序列可以表現(xiàn)出針對(duì)ALM或 Cdc42mRNA 的 RNAi。RNAi是序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因在動(dòng)植物中沉默的方法，由與沉默的基因序列同源的雙鏈RNA(dsRNA)激發(fā)。關(guān)于RNAi在C. elegans, Drosophila，植物，和人類的沉默基因中的應(yīng)用的方法是本領(lǐng)域公知的(Fire A等，1998Nature 391 :806-811 ；Fire,A. Trends Genet.15,358-363(1999) ；Sharp, P. A. RNA 干擾 2001。Genes Dev。15，485-49(^2001)； Hammond, S. Μ.等，Nature Rev. Genet. 2,110-1119(2001) ；Tuschl, Τ. Chem. Biochem. 2, 239-245(2001) ；Hamilton，A 等，Science 286,950-952(1999) ；Hammond, S. Μ.等，Nature 404,293-296(2000) ；Zamore, P. D.等，Cell 101，25-33 (2000) ；Bernstein, E 等，Nature 409,363-366(2001) ；Elbashir, S. Μ.等，Gene Dev. 15，188-200 (2001) ；W00129058 ； W09932619 ；Elbashir SM 等，2001 Nature 411 :494-498 ；Novina CD 禾口 Sharp P。 2004Nature 430 :161-164 ；Soutschek J 等 2004Nature 432 :173-178)。核酸調(diào)節(jié)劑通常用作研究試劑，診斷法，和治療法。例如，可以以強(qiáng)特異性抑制基因表達(dá)的反義寡核苷酸通常用于闡明特定基因的功能(參考例如美國(guó)專利6，165，790)。 核酸調(diào)節(jié)劑通常用于例如區(qū)分生物途徑的各個(gè)成員的功能。例如，反義低聚物已經(jīng)用于動(dòng)物和人類的疾病狀態(tài)中的治療部分而且已經(jīng)證明在許多臨床試驗(yàn)中是安全和有效的(Milligan JF 等，Current Concepts in Antisense Drug Design, J Med Chem. (1993)36 :1923-1937 ；Tonkinson JL等，Antisense Oligodeoxynucleotides as Clinical Therapeutic Agents, Cancer Invest。(1996) 14:54-65)。在一個(gè)實(shí)施例中，方法包括確定組合物的方法的應(yīng)用，該確定組合物的方法是確定以下列舉的影響ALK6或Cdc42的物質(zhì)的方法。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，物質(zhì)是ALK6的拮抗劑。適合用于本發(fā)明的一些ALK6 拮抗劑包括硬化蛋白，腱蛋白樣蛋白質(zhì)和卵泡抑素相關(guān)蛋白(FSRP)。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中拮抗劑是硬化蛋白(SEQ ID3)。
通常優(yōu)選小分子調(diào)節(jié)具有酶功能和/或包含蛋白質(zhì)作用域的蛋白質(zhì)的功能。在本領(lǐng)域稱為“小分子”化合物的化學(xué)試劑是典型的有機(jī)，非肽類分子，具有大于10，000的分子量，優(yōu)選大于5，000，更優(yōu)選大于1，000，和最優(yōu)選大于500道爾頓。這類調(diào)節(jié)劑包括化學(xué)合成的分子，例如來(lái)自組合化學(xué)庫(kù)的化合物。合成化合物可以是基于ALK6已知的或推斷的性質(zhì)設(shè)計(jì)或確定的或可以是通過(guò)篩選化合物庫(kù)確定的。可選的合適的這一類調(diào)節(jié)劑是天然化合物，尤其是來(lái)自有機(jī)體例如植物或真菌的次生代謝產(chǎn)物，其也可以由于ALK6-調(diào)節(jié)活性而被篩選化合物庫(kù)確定。產(chǎn)生和獲得化合物的方法是本領(lǐng)域公知的(Schreiber SL, Science (2000) 151 :1964-1969 ；Radmann J 和 Gunther J, Science (2000) 151 :1947-1948)。由篩選試驗(yàn)確定的小分子化合物調(diào)節(jié)劑，如以下描述的，可以用作先導(dǎo)化合物，候選的臨床化合物可以從先導(dǎo)化合物設(shè)計(jì)，優(yōu)化，和合成。候選小分子調(diào)節(jié)劑的活性可以通過(guò)迭代二級(jí)功能驗(yàn)證(如以下進(jìn)一步描述的)，結(jié)構(gòu)確定，和候選調(diào)節(jié)劑改性和測(cè)試而改進(jìn)幾倍。另外，產(chǎn)生具有特定臨床和藥理性質(zhì)的候選臨床化合物。例如，試藥可以進(jìn)行衍生化和使用體外和體內(nèi)試驗(yàn)再篩選從而為藥物開(kāi)發(fā)優(yōu)化活性和降低毒性。ALK6的拮抗劑可以抑制黑色素從黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)移到角化細(xì)胞，從而降低皮膚和/或頭發(fā)色素沉著。另一方面，ALK6的激動(dòng)劑可以促進(jìn)黑色素從黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)移到角化細(xì)胞，從而增加皮膚和頭發(fā)色素沉著。從美容的角度看這兩種效果都是需要的，另外這種效果可以帶來(lái)醫(yī)療好處。例如為了美容，目前在西歐和美國(guó)(和其他地方)需要被太陽(yáng)曬黑的外表。 在一些亞洲國(guó)家，為了美容，需要具有相對(duì)白皙的外表。另外，從保護(hù)的角度看，由于黑色素可以保護(hù)皮膚免受太陽(yáng)的傷害作用，可能需要增加皮膚中的黑色素含量。受體優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選是靈長(zhǎng)類和尤其是人類。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種組合物，該組合物包括可以調(diào)節(jié)ALK6或Cdc42的活性或表達(dá)的物質(zhì)，用于調(diào)節(jié)受體的皮膚和/或頭發(fā)的色素沉著。以上提供了合適的物質(zhì)的細(xì)節(jié)，而且調(diào)節(jié)的目的可以是美容或治療方面的。特別優(yōu)選的物質(zhì)包括BMP6或功能活性的變體或其片段，和硬化蛋白。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包括可以調(diào)節(jié)ALK6或Cdc42的活性或表達(dá)的物質(zhì)的組合物在生產(chǎn)藥物方面的用途，該藥物是用于治療與皮膚的反常色素沉著相關(guān)的的疾病。 這種治療可以是治愈作用的，或可以是為了緩解癥狀。通常需要根據(jù)本發(fā)明的組合物是適合皮膚外敷劑的?？梢允褂萌魏纬Ｓ玫耐庥脛┬屠缛芤?，懸浮劑，凝膠，乳霜，軟膏或油膏等。這種外用劑型的制備在制藥配方領(lǐng)域作為例子進(jìn)行描述，例如，Gennaro 等(1995)Remingtonr s Pharmaceutical Science，Mack Publishing中描述的。對(duì)于外敷劑，組合物也可以作為粉末或噴霧給藥，尤其是以氣溶膠的形式。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了一種評(píng)估物質(zhì)調(diào)節(jié)黑色素從黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)移到角化細(xì)胞或潛在地從角化細(xì)胞轉(zhuǎn)移到角化細(xì)胞的能力的方法，該方法包括以下步驟-提供測(cè)試物質(zhì)；以及-確定測(cè)試物質(zhì)與ALK6相互作用的能力。在一些實(shí)施例中，方法包括確定物質(zhì)與ALK6鍵合的能力。ALK6可以在細(xì)胞上，或可以提供在支架上。 方法優(yōu)選包括提供細(xì)胞表達(dá)ALK6和確定測(cè)試物質(zhì)與被所述細(xì)胞表達(dá)的ALK6相互作用的能力，尤其是在細(xì)胞的表面上表達(dá)的ALK6。優(yōu)選表達(dá)ALK6的細(xì)胞是黑素細(xì)胞。通過(guò)確定測(cè)試物質(zhì)與ALK6相互作用的能力，可以確定有潛力在調(diào)節(jié)黑素轉(zhuǎn)移或黑素生成方面具有活性的物質(zhì)。本發(fā)明的方法優(yōu)選包括確定測(cè)試物質(zhì)調(diào)節(jié)ALK6的活性和/或表達(dá)的能力。在一個(gè)實(shí)施例中，方法可以包括確定測(cè)試物質(zhì)活化ALK6的能力，即確定測(cè)試物質(zhì)是否是ALK6的激動(dòng)劑。在可選的實(shí)施例中，方法可以包括確定測(cè)試物質(zhì)使ALK6失活的能力，即確定測(cè)試物質(zhì)是否是ALK6的拮抗劑。本領(lǐng)域的技術(shù)人員有許多方法可以確定測(cè)試物質(zhì)是否可以調(diào)節(jié)ALK6的活性。例如，可以確定測(cè)試物質(zhì)對(duì)下游信號(hào)分子的影響，下游信號(hào)分子受到ALK6活性化的影響?？蛇x地，可以確定測(cè)試物質(zhì)對(duì)mRNAs或蛋白質(zhì)的表達(dá)的影響，mRNAs或蛋白質(zhì)的表達(dá)受到ALK6活性化的影響。這可以包括確定，例如a)R-SmadS的補(bǔ)充(受體調(diào)節(jié)的 Smads, Smad-I, -5，-8)以及在與ALK6鍵合的時(shí)候R-Smads隨后的磷酸化；b)通過(guò)抑制劑 Smads (I-Smads)阻斷R-Smads的活性化，例如Smad6和7 ；或c)通過(guò)Smurfs使ALK6選擇性地降解(Smad泛素化調(diào)節(jié)因子)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員有許多方法可以確定測(cè)試物質(zhì)增加ALK6表達(dá)的能力。例如，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以定量地確定細(xì)胞中的ALK6mRNA水平(例如，使用定量的rtPCR)，或可以定量地確定細(xì)胞表面上的蛋白質(zhì)表達(dá)(例如使用免疫熒光技術(shù)，ELISA，二維電泳法或質(zhì)譜法)。在一個(gè)實(shí)施例中，方法可以包括通過(guò)測(cè)試物質(zhì)對(duì)Cdc42的表達(dá)或活性化的影響 (優(yōu)選是Cdc42的表達(dá))來(lái)確定測(cè)試物質(zhì)與ALK6相互作用能力的步驟。確定Cdc42的表達(dá)的方法包括測(cè)量細(xì)胞中或細(xì)胞上的Cdc42的數(shù)量，或確定合成Cdc42蛋白質(zhì)的前體的數(shù)量，例如為Cdc42編碼的mRNA。確定Cdc42蛋白質(zhì)表達(dá)水平或Cdc42mRNA水平所需的技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。確定蛋白質(zhì)水平的技術(shù)可以包括免疫染色(例如免疫熒光，西方墨點(diǎn)法)，ELISA，二維電泳法或質(zhì)譜法。確定mRNA水平的技術(shù)可以包括北方
墨點(diǎn)法，逆轉(zhuǎn)錄酶PCR，定量PCR，微陣列或Affymetrix 芯片。特別地，本發(fā)明關(guān)注可以以影響黑素生成或黑色素轉(zhuǎn)移的方式與ALK6相互作用物質(zhì)。因此，尤其需要確定測(cè)試物質(zhì)對(duì)黑素生成或黑色素轉(zhuǎn)移的影響。在本申請(qǐng)中詳細(xì)列舉了實(shí)現(xiàn)這一目的的方法，例如確定物質(zhì)對(duì)從黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)移到角化細(xì)胞或潛在地從角化細(xì)胞轉(zhuǎn)移到角化細(xì)胞的黑素體的數(shù)量的影響。這可以使用本申請(qǐng)中描述的熒光染色技術(shù)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的方法可以包括提供BMP6的步驟。通過(guò)在方法中提供BMP6，可以確定測(cè)試物質(zhì)調(diào)節(jié)ALK6的活性的能力是其生物向心配合體的存在。這種方法可能與生理?xiàng)l件更相關(guān)，因?yàn)檫@種方法評(píng)估化合物在與BMP6的競(jìng)爭(zhēng)中與ALK6相互作用的能力。本發(fā)明的又一個(gè)方面提供了一種評(píng)估物質(zhì)調(diào)節(jié)黑色素從黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)移到角化細(xì)胞，或潛在地從角化細(xì)胞轉(zhuǎn)移到角化細(xì)胞的能力的方法，該方法包括以下步驟-提供測(cè)試物質(zhì)；-提供表達(dá)Cdc42的細(xì)胞；以及-確定測(cè)試物質(zhì)調(diào)節(jié)Cdc42的活性和/或表達(dá)的能力。
優(yōu)選表達(dá)Cdc42的細(xì)胞是黑素細(xì)胞或角化細(xì)胞，更優(yōu)選是黑素細(xì)胞。方法可以包括將被測(cè)試物質(zhì)處理過(guò)的細(xì)胞中的Cdc42的活性和/或表達(dá)與對(duì)照細(xì)胞中的Cdc42的活性和/或表達(dá)進(jìn)行比較?？梢允褂迷S多對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的方法確定Cdc42的表達(dá)水平。 在本發(fā)明的實(shí)施例中，可以使用免疫熒光，西方墨點(diǎn)法或通過(guò)確定Cdc42mRNA的水平來(lái)確定表達(dá)。如上所述，其他合適的方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)可能是顯而易見(jiàn)的。


現(xiàn)參考附圖，僅僅通過(guò)實(shí)例的方式描述本發(fā)明的實(shí)施例，其中-圖1的A和B示出表皮角化細(xì)胞和表皮黑素細(xì)胞細(xì)胞毒性對(duì)BMP6體外孵化的評(píng)估結(jié)果。A.用10ng/ml和100ng/ml的BMP6處理正常人類表皮角化細(xì)胞培養(yǎng)(女性-68 ； p2)24h，48h 和 72h。B.用lOng/ml和lOOng/ml的BMP6處理正常人類表皮黑素細(xì)胞培養(yǎng)⑴女性-68 ； P4和(ii)女性_42;p372h。通過(guò)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞病理學(xué)改變?cè)u(píng)估細(xì)胞毒性。未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞
毒性效應(yīng)。-圖2的A和B示出正常人類表皮黑素細(xì)胞中BMP6和ALK6蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測(cè)結(jié)^ οA.⑴BMP6(綠色)的雙熒光標(biāo)記；(ii)酪氨酸酶(紅色)和(iii)BMP6和酪氨酸酶的合并圖像，證實(shí)人類表皮黑素細(xì)胞(F39-MC)中的BMP6蛋白質(zhì)表達(dá)。(iv)示出相應(yīng)的亮視場(chǎng)像。B.⑴BMP6(綠色)，(ii)ALK6(紅色)的雙熒光標(biāo)記以及(iii)示出人類表皮黑素細(xì)胞(F39-MC)中BMP6和ALK6 (黃色)的共定位。(iv)示出相應(yīng)的亮視場(chǎng)像。-圖3的A和B示出表皮黑素細(xì)胞-角化細(xì)胞共培養(yǎng)中，劑量依賴型的BMP-6激發(fā)的黑素體轉(zhuǎn)移的定量分析結(jié)果。A.對(duì)匹配的黑素細(xì)胞-角化細(xì)胞共培養(yǎng)(F39MC-KC)實(shí)施雙免疫熒光法，由BMP-6 不斷增加的濃度(l，10，50，100* 500ng/ml)激發(fā)黑素細(xì)胞-角化細(xì)胞共培養(yǎng)Mh。使用抗-gplOO抗體(綠色)和抗細(xì)胞角蛋白抗體(紅色)的雙熒光標(biāo)記示出轉(zhuǎn)移到角化細(xì)胞的熒光斑點(diǎn)的數(shù)量的明顯劑量依賴型增加。細(xì)胞核用DAPI染色。B.對(duì)于每個(gè)不同的處理組在五個(gè)隨機(jī)選擇的微觀領(lǐng)域(每個(gè)領(lǐng)域總共有20個(gè)細(xì)胞)中的轉(zhuǎn)移的黑素體的量化。數(shù)值表達(dá)為與未激發(fā)的對(duì)照水平相比每個(gè)角化細(xì)胞的gp-100陽(yáng)性斑點(diǎn)數(shù)量的百分比增加。具有* = P < 0. 05，** = P < 0. 01，和= P < 0. 001的三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的裝置是士SEM。-圖4的A和B示出是否BMP6向上調(diào)節(jié)Cdc42和ALK6(BMP6受體)在表皮黑素細(xì)胞中的表達(dá)。正常人類表皮黑素細(xì)胞培養(yǎng)(女性39y-MC)中Cdc42mRNA表達(dá)的RT-PCR分析。A.指定時(shí)間內(nèi)的100ng/ml BMP6處理B.以指定的劑量進(jìn)行BMP6處理2h。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)Cdc42mRNA。GAPDH用作可比較負(fù)載的內(nèi)部對(duì)照。
C.使用或不使用lOOng/ml BMP6處理正常人類表皮黑素細(xì)胞培養(yǎng)(女性42y_EM)。 對(duì)ALK6進(jìn)行熒光標(biāo)記(綠色)并且示出與⑴未處理的對(duì)照試驗(yàn)相比在(ii)BMP6的影響下ALK6的表達(dá)增加。相應(yīng)的亮視場(chǎng)像(下方處的畫(huà)面)。-圖5的A和B，以及補(bǔ)充-1示出實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，表明Cdc42表達(dá)的誘導(dǎo)增加背部絲狀偽足形成和黑素體轉(zhuǎn)移。A. FM55細(xì)胞的背表面被(ii)組成型活化(CA)人類GFP_Cdc42 (61L)轉(zhuǎn)染而導(dǎo)致背部絲狀偽足數(shù)量的大量增加而且與只有(i)GFP存在下的絲狀偽足相比，被(iii)顯性陰性(DN)人類GFP-Cdc42(15A)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞抑制背部絲狀偽足。方框區(qū)域的更高功率圖(下方的畫(huà)面)。使用場(chǎng)發(fā)射SEM(FEI，Quanta 400)以IOkev的加速電壓產(chǎn)生的SEM圖像。B.(左邊的畫(huà)面)對(duì)轉(zhuǎn)染的FM55細(xì)胞-角化細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)施雙免疫熒光法。(i) 只有GFP在FM55和角化細(xì)胞中(ii)組成型活化(CA)人類GFP_Cdc42 (61L)在FM55和角化細(xì)胞中(iii)顯性陰性(DN)人類GFP-Cdc42(15A)在FM55和角化細(xì)胞共培養(yǎng)中。用抗-gp 100抗體(綠色)和抗細(xì)胞角蛋白抗體(紅色)的雙熒光標(biāo)記揭示在不同構(gòu)成的存在下轉(zhuǎn)移到角化細(xì)胞的熒光斑點(diǎn)的數(shù)量明顯增加。細(xì)胞核用DAPI染色。B.(右邊的畫(huà)面)對(duì)于每個(gè)不同的處理組在五個(gè)隨機(jī)選擇的微觀領(lǐng)域(每個(gè)領(lǐng)域總共有20個(gè)細(xì)胞)中的轉(zhuǎn)移的黑素體的量化。數(shù)值表達(dá)為與未激發(fā)的對(duì)照水平相比每個(gè)角化細(xì)胞的gp-ΙΟΟ陽(yáng)性斑點(diǎn)數(shù)量的百分比增加。具有*** = P < 0. 001的三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的裝置是士 SEM。補(bǔ)充-1 通過(guò)GFP表達(dá)(綠色)證實(shí)FM55細(xì)胞的選擇。為了證實(shí)黑素細(xì)胞的身份，用黑素細(xì)胞特異性的抗-HMB-45/gplOO (紅色)對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記。細(xì)胞核用 DAPI染色。-圖6的A和B示出表明使用選擇性的BMP6拮抗劑(硬化蛋白)抑制BMP6誘導(dǎo)的黑素體轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。A在加入或不加入其選擇性拮抗劑，重組人類硬化蛋白GOOng/ml)的重組人類BMP6 (lOOng/ml)的存在或不存在情況下，對(duì)匹配的黑素細(xì)胞-角化細(xì)胞共培養(yǎng)(F36y MC-KC)實(shí)施雙免疫熒光法Mh。使用抗-gplOO抗體(綠色)和抗細(xì)胞角蛋白抗體(紅色) 的雙熒光標(biāo)記揭示出與基線水平相比在BMP6的存在下轉(zhuǎn)移到角化細(xì)胞的熒光斑點(diǎn)的數(shù)量的明顯增加，當(dāng)向共培養(yǎng)中加入選擇性拮抗劑硬化蛋白時(shí)，轉(zhuǎn)移到角化細(xì)胞的熒光斑點(diǎn)的數(shù)量明顯減少。細(xì)胞核用DAPI染色。B.對(duì)于每個(gè)不同的處理組在五個(gè)隨機(jī)選擇的微觀領(lǐng)域(每個(gè)領(lǐng)域總共有20個(gè)細(xì)胞)中的轉(zhuǎn)移的黑素體的量化。數(shù)值表達(dá)為與未激發(fā)的對(duì)照水平相比每個(gè)角化細(xì)胞的 gp- οο陽(yáng)性斑點(diǎn)數(shù)量的百分比增加。具有# = P < 0. 01，= P < 0. 001的三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的裝置是士SEM。圖7的A和B示出表明使用選擇性的BMP6拮抗劑(硬化蛋白)抑制BMP6誘導(dǎo)的 Cdc42和ALK6受體的表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。A. Cdc42mRNA 表達(dá)的 RT-PCR 分析在加入或不加入其選擇性拮抗劑，重組人類硬化蛋白GOOng/ml)的重組人類 BMP6 (lOOng/ml)的存在或不存在情況下，培養(yǎng)正常人類表皮黑素細(xì)胞(女性42y_EM) 2h。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)Cdc42mRNA。GAPDH用作可比較負(fù)載的內(nèi)部對(duì)照。
B.在加入或不加入其選擇性拮抗劑，重組人類硬化蛋白GOOng/ml)的重組人類 BMP6(100ng/ml)的存在或不存在情況下，培養(yǎng)正常人類表皮黑素細(xì)胞(女性42y_EM) 12h。 對(duì)ALK6進(jìn)行熒光標(biāo)記(綠色)并且示出在硬化蛋白的影響下BMP6誘導(dǎo)的ALK6表達(dá)的抑制。相應(yīng)的亮視場(chǎng)像(下方的畫(huà)面)。-圖8示出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果表明使用選擇性的BMP6拮抗劑(硬化蛋白)抑制BMP6 誘導(dǎo)的絲狀偽足形成。在加入或不加入其選擇性拮抗劑，重組人類硬化蛋白GOOng/ml) 的重組人類BMP6(100ng/ml)的存在或不存在情況下，培養(yǎng)正常人類表皮黑素細(xì)胞(女性 42y-EM)72h。使用場(chǎng)發(fā)射SEM(FEI，Quanta 400)以IOkev的加速電壓產(chǎn)生的SEM圖像。-圖9的A，B和C示出表明BMP6對(duì)人類表皮黑素生成，酪氨酸酶活性和酪氨酸酶在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。A.在加入或不加入其選擇性拮抗劑，重組人類硬化蛋白GOOng/ml)的重組人類 BMP6 (lOOng/ml)的存在或不存在情況下，處理正常人類表皮黑素細(xì)胞(F62;p4)72h。在使用不同藥物處理之后，細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的黑色素水平的變化。氫氧化鈉溶解之后通過(guò)分光光度法G75nm)確定黑色素含量。結(jié)果表達(dá)為與未激發(fā)的對(duì)照水平相比黑色素含量(Pg/ 細(xì)胞)的變化。具有* = P < 0. 05，* = P < 0. 01的三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的裝置是士SEM。B.在加入或不加入其選擇性拮抗劑，重組人類硬化蛋白GOOng/ml)的重組人類 BMP6 (lOOng/ml)的存在或不存在情況下，處理正常人類表皮黑素細(xì)胞(F62y ;p4) 72h。(下方處的畫(huà)面)為了評(píng)估酪氨酸酶的活性，電轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)提取物以及用L-DOPA染色細(xì)胞膜。 (上方處的畫(huà)面)與未激發(fā)的對(duì)照水平相比，譜帶強(qiáng)度的光密度掃描和值表達(dá)為成倍增加。 具有* = P < 0. 01的三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的裝置是士SEM。C.在加入或不加入其選擇性拮抗劑，重組人類硬化蛋白GOOng/ml)的重組人類 BMP6 (lOOng/ml)的存在或不存在情況下，處理正常人類表皮黑素細(xì)胞(F62y ;p4) 72h。上方處的畫(huà)面通過(guò)RT-PCR檢測(cè)酪氨酸酶mRNA以及GAPDH用作可比較負(fù)載的內(nèi)部對(duì)照。下方處的畫(huà)面通過(guò)西方墨點(diǎn)法檢測(cè)酪氨酸酶蛋白質(zhì)以及肌動(dòng)蛋白用作可比較負(fù)載的內(nèi)部對(duì)照。
具體實(shí)施例方式引言在黑色素轉(zhuǎn)移生物學(xué)的研究中，本發(fā)明者們研究了骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)家族成員在該過(guò)程中的潛在作用。在本申請(qǐng)中描述了一種控制黑色素從人類皮膚黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)移到人類皮膚角化細(xì)胞的新機(jī)理。這包括BMP6的作用，BMP6可以以劑量依賴的形式激發(fā)該過(guò)程。而且，選擇性BMP6拮抗劑(硬化蛋白)抑制BMP6-誘導(dǎo)的黑素體轉(zhuǎn)移，以及阻擋 BMP6-誘導(dǎo)的納米細(xì)管(稱為絲狀偽足)的產(chǎn)生，如對(duì)人類黑素細(xì)胞進(jìn)行的掃描電子顯微鏡 (SEM)分析所證明的。仔細(xì)分析BMP6誘導(dǎo)絲狀偽足形成的分子機(jī)理，使用逆轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn) BMP6在人類黑素細(xì)胞中以劑量依賴的方式激發(fā)(細(xì)胞增殖周期42) Cdc42的表達(dá)。對(duì)具有轉(zhuǎn)染組成型活性(CA) Cdc42和顯性-陰性Cdc42的FM55細(xì)胞進(jìn)行SEM分析，證實(shí)黑素細(xì)胞中的絲狀偽足形成和黑素體轉(zhuǎn)移需要Cdc42。CA-Cdc42誘導(dǎo)背部絲狀偽足的形成而DN_Cdc42 抑制背部絲狀偽足。預(yù)測(cè)BMP6作為前體分子合成，該前體分子被分割成產(chǎn)生一個(gè)具有大約15kd的計(jì)算分子量的132個(gè)氨基酸成熟多肽。BMP6(前體)是57kD蛋白質(zhì)，長(zhǎng)度為513個(gè)氨基酸，局部化為人體的染色體6pM。BMP6的成熟形態(tài)的每個(gè)多肽鏈包含三個(gè)潛在的N-連接糖基化位置?；钚缘腂MP-6蛋白質(zhì)分子可能是二聚體。用與加工相關(guān)蛋白質(zhì)TGFi3 (Gentry等，Mol. cell. Biol. 8 :4162(1988)類似的方法將BMP6加工成成熟形態(tài)，包括二聚化和移除N-封端區(qū)域。GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(編號(hào)-P22004)中提供了人類BMP6前體并且整合到UniprotKB/ Swiss-Prot (參考SEQ ID NO 1)中。據(jù)相信成熟多肽包括SEQ ID NO 1的氨基酸374-513。 其他活性BMP-6多肽包括包含SEQ ID NO 1的氨基酸382-513，388-513和412-513的多肽。Biffs通過(guò)與幾乎所有正常細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的受體復(fù)合物結(jié)合而發(fā)揮作用，受體復(fù)合物由型I受體和型II受體組成。當(dāng)作為單體存在時(shí)，BMPR-I以低親和力與BMP結(jié)合。然而，當(dāng)BMPR-I和BMPR-II作為異質(zhì)二聚體存在時(shí)，它們與BMP的親和力大體上增加(Hogan 1996)。一旦分泌，BMP 二聚體通過(guò)協(xié)同地與型I受體和型II受體都結(jié)合而激發(fā)信號(hào)。BMP6 的每個(gè)單體都可以與型I受體和型II受體都連接。因此四聚受體復(fù)合物的組合體對(duì)于傳導(dǎo)信號(hào)到細(xì)胞中是必要的。型II受體是組成型-活性激酶，其基于配體結(jié)合使型I受體轉(zhuǎn)磷酸化。然而，型I 受體通過(guò)磷酸化活化細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)，因此決定細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的特異性。包括BMP6的BMPs可以與 2 個(gè)型 I 受體結(jié)合，包括 BMPR-IA (ALK-3 jeq ID 4)，和 BMPR-I B(ALK6 ； Seq ID 2)。雖然BMPR-I A和BMP-I B結(jié)構(gòu)上相似但是它們變現(xiàn)出不同的空間和時(shí)間表達(dá)模式。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BMP6誘導(dǎo)其本身的同源受體ALK6(編號(hào)000238)的表達(dá)。選擇性的BMP6拮抗劑硬化蛋白抑制BMP6-誘導(dǎo)的ALK6表達(dá)以及黑素細(xì)胞中Cdc42的表達(dá)，表明 Cdc42參與為了 BMP6信號(hào)的可能的擴(kuò)增循環(huán)。同時(shí)這些發(fā)現(xiàn)表明發(fā)射至黑素細(xì)胞BMP受體的Cdc42信號(hào)參與絲狀偽足形成從而控制黑素體轉(zhuǎn)移至角化細(xì)胞。GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(編號(hào)-Q9BQB4)中提供硬化蛋白(SOST)的氨基酸序列并且整合到 UniprotKB/Swiss-Prot (參考 SEQ ID NO 3)中。SOST 的 C-封端區(qū)域(SEQ ID 3 的氨基酸169-203)在SOST 二聚化中發(fā)揮作用。SOST的N-封端區(qū)域(SEQ ID 3的氨基酸23-58) 與BMP6上的型I受體和型II受體結(jié)合位點(diǎn)都相互作用，而且一部分核區(qū)域(SEQ ID 3的氨基酸134-166)可以與型II受體結(jié)合位點(diǎn)相互作用使得這些SOST區(qū)域特異的抗體可以阻擋或削弱BMP與SOST的結(jié)合。最后，也已經(jīng)表明BMP6可以通過(guò)激發(fā)黑素細(xì)胞中限速酶(酪氨酸酶)的表達(dá)和活性而誘導(dǎo)黑素生成。在本申請(qǐng)中，已經(jīng)第一次表明BMP6可以控制黑色素在黑素細(xì)胞和角化細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移，而且潛在地從角化細(xì)胞轉(zhuǎn)移到角化細(xì)胞。這至少部分地通過(guò)Cdc42的作用而發(fā)生。 BMP拮抗劑以及基于它們的結(jié)構(gòu)和作用的分子可以用作哺乳動(dòng)物的皮膚和頭發(fā)色素沉著的新調(diào)節(jié)劑。材料&方法細(xì)胞培養(yǎng)分離和培養(yǎng)匹配的表皮角化細(xì)胞和表皮黑素細(xì)胞。在知情同意和當(dāng)?shù)氐难芯總惱砦瘑T會(huì)同意的情況下，正常人類腹部皮膚由具有皮膚光-型11(女性68y，39y，36y)和皮膚光-型VI (女性42y)的正常健康白種人捐獻(xiàn)者在選擇整形手術(shù)之后提供。
所有的細(xì)胞培養(yǎng)試劑都來(lái)自^witrogen公司(佩斯里，蘇格蘭)除非另有說(shuō)明。 在RPMI1640培養(yǎng)基中收集皮膚樣品并且在證的手術(shù)內(nèi)加工處理皮膚樣品。按照以上所述 (Kauser等，2003)建立表皮黑素細(xì)胞培養(yǎng)然后表皮黑素細(xì)胞培養(yǎng)在K-SFM和fegle’ s最低必須培養(yǎng)基(EMEM)的混合物中生長(zhǎng)，Eagle’ s最低必須培養(yǎng)基中添加了 FBS, IX濃縮的非必需氨基酸混合物，青霉素(100U/ml)/鏈霉素(100yg/ml)，2mM L-谷氨酸鹽，5ng/ ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，和5ng/ml內(nèi)皮素-1 (Sigma, Poole, Dorset, UK)。按照以上所述(Kauser等，200 建立完全匹配的表面角化細(xì)胞(即來(lái)自同樣的皮膚樣本)然后在無(wú)血清培養(yǎng)基(K-SFM)中生長(zhǎng)，無(wú)血清培養(yǎng)基中添加了 25μ g/ml牛垂體提取物(BPE)， 0. 2ng/mlrEGF,青霉素(100U/ml) /鏈霉素(100 μ g/ml)，以及2mM L-谷氨酸鹽。每?jī)商煅a(bǔ)充一次培養(yǎng)基。使用分別抗gplOO的抗-角化蛋白抗體(Abcam，Cambridge, UK)和黑素細(xì)胞-特異性的NKI/beteb抗體(Monosan，Uden, Netherlands)鑒定角化細(xì)胞和黑素細(xì)胞的原代培養(yǎng)。對(duì)于共培養(yǎng)，將黑素細(xì)胞(第4代)和角化細(xì)胞(第二代)接種到8孔Lab-Tek 腔室載玻片系統(tǒng)(ICN Biomedicals, Aurora公司，OH, USA)上，細(xì)胞密度是1 X IO4細(xì)胞/ 孔，以及比例是1個(gè)黑素細(xì)胞對(duì)10個(gè)角化細(xì)胞。共培養(yǎng)物在K-SFM和MEM的混合物(共培養(yǎng)培養(yǎng)基)中保存整夜(16h)從而使細(xì)胞附著，然后補(bǔ)充培養(yǎng)基再保存Mh。在評(píng)估lOOng/ml重組人類BMP-6 (R&D系統(tǒng)，牛津郡，UK)和400ng/ml重組人類硬化蛋白(R&D系統(tǒng)，牛津郡，UK)的作用之前，共培養(yǎng)在血清-缺乏的培養(yǎng)基(即缺少優(yōu)級(jí)胎牛血清和牛垂體提取物)中孵化16h以移除生長(zhǎng)因子的外因來(lái)源。BMP-6劑量的評(píng)估表皮黑素細(xì)胞(MC)和表皮角化細(xì)胞(KC)被接種到6孔板的血清補(bǔ)充充足的MEM 黑素體和K-SFM角化細(xì)胞培養(yǎng)基中Mh。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到添加了 lOng/ml和lOOng/mlBMP-6 的無(wú)血清(所謂缺乏的)培養(yǎng)基中保持Mh，4 !和72h。通過(guò)形態(tài)學(xué)中的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞病理學(xué)改變?cè)u(píng)估細(xì)胞毒性。將大約ι χ IO4MC接種到Lab-tek 8孔腔室載玻片系統(tǒng)的每個(gè)孔中然后使MC附著Mh。然后使用無(wú)菌PBS沖洗細(xì)胞3次以及添加350 μ 1缺乏的無(wú)血清黑素細(xì)胞培養(yǎng)基然后在37°C和5% CO2條件下孵化Mh。然后使用無(wú)菌PBS沖洗細(xì)胞3次以及用或不用IOOng/ ml BMP-6孵化12h。然后使用無(wú)菌PBS輕輕地沖洗細(xì)胞三次以及在20°C下將細(xì)胞混合在冰冷的甲醇中10分鐘。將載玻片保存在_20°C直到實(shí)施免疫細(xì)胞化學(xué)法。西方墨點(diǎn)分析在合流T225燒瓶中使MC受到胰蛋白酶作用并且接種到裝滿培養(yǎng)基的T25燒瓶中而且使其附著整夜。在處理前Mh，用少量的培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基Mh。使用無(wú)菌PBS沖洗細(xì)胞3次，然后只在少量培養(yǎng)基中孵化或在帶有l(wèi)OOng/mlBMP-6的少量培養(yǎng)基中孵化不同的時(shí)間段(I-Mh)。在不同的實(shí)驗(yàn)中，用不同濃度的BMP-6處理細(xì)胞12h。使來(lái)自細(xì)胞提取物的40mg總蛋白質(zhì)在還原的SDS-8 % -PAGE中電泳和在PVDF膜 (Mi 11 ipore公司，Bedford, ΜΑ)上涂污。在室溫下用5 %的牛奶PBS/0. 075 % Tween 20阻擋膜濁以及在4°C下用一代抗體探測(cè)整夜。分子量階梯(Magik Marker, Invitrogen)在5%的牛奶PBS/0. 075% Tween 20中孵化而且膠片帶用lml5%的牛奶PBS/0. 075% Tween-20 (陰性對(duì)照)，或Iml的兔抗酪氨酸酶(在5%的牛奶PBS/0.075% Tween 20中的1 200多克隆抗體)和Iml羊抗肌動(dòng)蛋白(在5%的牛奶PBS/0.075% Tween 20中的1 1000多克隆抗體)在搖擺平臺(tái)上在4°C下孵化整夜。大量沖洗之后，用與二代抗體結(jié)合的三葵過(guò)氧化物孵化墨點(diǎn)池。然后用Iml稀釋在5%的牛奶PBS/0. 075% Tween-20中的HRP-羊抗人類lgG(H+L) (Zymed,USA) (1 500)孵化分子量階梯而且膠片帶用Iml抗兔lgG，與整個(gè)抗體(HRP) 二代抗體(Amersham Biosciences, UK) (1 700 稀釋在 5% 的牛奶 PBS/0. 075% Tween 20中)連接的三葵過(guò)氧化物在搖擺平臺(tái)上在室溫下孵化池。重復(fù)沖洗程序而且膠片帶在LumiGLOR試劑和Peroxide (BioLab Ltd, UK)中在室溫下孵化2分鐘。通過(guò)在各個(gè)曝光時(shí)間將墨點(diǎn)帶置于KodakXRA X-射線膠片(kodak，UK)下檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)，然后在顯影液(kodak，UK)中顯影直到譜帶出現(xiàn)，用自來(lái)水漂洗，在定影液(kodak，UK)中定影直到膠片變成藍(lán)色，然后用自來(lái)水沖洗，然后晾干。然后標(biāo)記膜并且為光密度分析進(jìn)行掃描，使用分析軟件(Image Master Total lab version 1. 11)對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平進(jìn)行半定量評(píng)估。免疫熒光染色用PBS沖洗被冰冷的甲醇凝結(jié)的細(xì)胞，然后用10%驢血清阻滯以檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)。對(duì)于雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，第一代原始抗體，BMP-6 (Abeam,劍橋，英國(guó))，BMPR-IB/ALK-6 (R&D系統(tǒng)，牛津郡，英國(guó))或Nki/beteb(l 30) (Monosan，Uden，荷蘭)在4°C下被作用整夜，然后在室溫下用FITC-結(jié)合的二代抗體孵化lh。二代原始抗體，cytokeratind 100) (Abeam, 劍橋，英國(guó))或β-Actind 100) (Santa Cruz,USA)在室溫下作用lh，然后是TRITC-結(jié)合的二代抗體(1 100) (Jackson Immunoresearch Laboratories 公司，West Grove,美國(guó))。使用 DAPI (Vector Laboratories,Burlingame, CA)將細(xì)胞核染色。借助使用 100X 或 40 X物鏡的冷卻的Hamamatsu數(shù)碼相機(jī)捕集圖像并且使用hint Shop Pro (Jasc Software Ver. 7. CA,USA)后處理。陰性對(duì)照包括省略原始抗體和用來(lái)自二代抗體宿主的非免疫血清替代和包括二代抗體。黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)移的定量分析用不同劑量的BMP-6刺激匹配的黑素細(xì)胞-角化細(xì)胞共培養(yǎng)并且與未刺激的細(xì)胞進(jìn)行比較。通過(guò)計(jì)算在3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中每個(gè)孔被放大100X的5個(gè)隨機(jī)顯微鏡視野中(油浸法)受體角化細(xì)胞內(nèi)的熒光gplOO-陽(yáng)性斑點(diǎn)的數(shù)量對(duì)黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)行評(píng)估。為了避免計(jì)算可能仍然與黑素細(xì)胞相關(guān)的黑色素小顆粒，我們只計(jì)算不與黑素細(xì)胞直接接觸的角化細(xì)胞內(nèi)的gpioo-陽(yáng)性斑點(diǎn)。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)用1-，10-, 50-, 100-和500ng/ml的BMP6處理從1 X IO6黑素細(xì)胞得到的總 RNA4h或用100ng/ml的BMP6處理一段指定的時(shí)間(圖4A)。對(duì)于一些實(shí)施例，在IOOng/ mlBMP6的存在或不存在下，使用或不使用400ng/ml的硬化蛋白處理黑素細(xì)胞。用脫氧核糖核酸酶OlIAGEN，UK)處理RNA樣品，然后確定濃度。然后使用用于逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的 SuperscriptIIIFirst-Mrand合成方法來(lái)合成第一鏈cDNA。對(duì)于所有樣品，反應(yīng)中的 RNA的最終濃度是1μ g/ΙΟΟμ 1。在生產(chǎn)者描述的條件下用QIAGENFast Cycling PCR試劑盒OlIAGEN，UK)實(shí)施PCR。簡(jiǎn)單地說(shuō)，使用以下循環(huán)條件95°C下15分鐘(階段1)； 96?！悌栂?5s ；引物退火15s (對(duì)于Cdc是42-65°C，酪氨酸酶_58°C以及GAPDH-60°C )； 72?！鉉T25s (階段2)X30個(gè)周期。表1示出了用于RT-PCR反應(yīng)的引物而且該引物來(lái)自SigmaGenosys，英國(guó)。PCR產(chǎn)品在1 X TAE緩沖液中分離在瓊脂糖凝膠上并且用溴化乙錠染色。IKbDNA加DNA階梯(Invitrogen，加利福利亞)用作DNA的標(biāo)記。表1.半定量RT-PCR的引物
權(quán)利要求
1.一種評(píng)估物質(zhì)調(diào)節(jié)黑色素從黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)移到角化細(xì)胞的能力的方法，所述方法包括以下步驟-提供測(cè)試物質(zhì)；以及-確定所述測(cè)試物質(zhì)與ALK6相互作用的能力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括提供表達(dá)ALK6的細(xì)胞和確定所述測(cè)試物質(zhì)與所述細(xì)胞表達(dá)的ALK6相互作用的能力。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述表達(dá)ALK6的細(xì)胞是黑素細(xì)胞。
4.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，包括確定所述測(cè)試物質(zhì)調(diào)節(jié)ALK6活性的能力。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中確定了所述測(cè)試物質(zhì)活化ALK6的能力。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中確定了所述測(cè)試物質(zhì)使ALK6失活的能力。
7.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述確定測(cè)試物質(zhì)與ALK6相互作用的能力的步驟包括確定所述測(cè)試物質(zhì)對(duì)Cdc42的表達(dá)或活化的影響。
8.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，包括提供BMP6的步驟。
9.一種評(píng)估物質(zhì)調(diào)節(jié)黑色素從黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)移到角化細(xì)胞的能力的方法，所述方法包括以下步驟-提供測(cè)試物質(zhì)；-提供表達(dá)Cdc42的細(xì)胞；以及-確定所述測(cè)試物質(zhì)調(diào)節(jié)Cdc42的活性和/或表達(dá)的能力。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述表達(dá)Cdc42的細(xì)胞是黑素細(xì)胞或角化細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，包括將所述測(cè)試物質(zhì)處理過(guò)的細(xì)胞中的Cdc42 的活性和/或表達(dá)與對(duì)照細(xì)胞中Cdc42的活性和/或表達(dá)進(jìn)行比較。
12.—種調(diào)節(jié)受體的皮膚和/或頭發(fā)的黑色素沉著的方法，所述方法包括對(duì)受體施用組合物，所述組合物包括可以調(diào)節(jié)ALK6或Cdc42的活性或表達(dá)的物質(zhì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述物質(zhì)通過(guò)調(diào)節(jié)ALK6的活性調(diào)節(jié)Cdc42的表達(dá)。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其中包括將所述組合物應(yīng)用到受體的皮膚和/ 或頭發(fā)的外表面上。
15.根據(jù)權(quán)利要求12到14中任意一項(xiàng)所述的方法，所述方法是通過(guò)調(diào)節(jié)皮膚和/或頭發(fā)的黑色素沉著水平而美容淡化或加深皮膚和/或頭發(fā)顏色的美容方法。
16.根據(jù)權(quán)利要求12到15中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述物質(zhì)能夠相對(duì)于正常生理水平增加ALK6的活性。
17.根據(jù)權(quán)利要求12到15中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述物質(zhì)能夠相對(duì)于正常生理水平降低ALK6的活性。
18.根據(jù)權(quán)利要求12到15中任意一項(xiàng)所述的方法，包括應(yīng)用含有化合物的組合物，所述化合物能夠與ALK6結(jié)合并且活化或阻滯ALK6的活性。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，包括應(yīng)用含有BMP6或其片段或變體的組合物，其中所述片段或變體是功能活性的。
20.根據(jù)權(quán)利要求12到15中任意一項(xiàng)所述的方法，包括應(yīng)用含有核酸的組合物，所述核酸能夠通過(guò)編碼ALK6或Cdc42或其功能部分的DNA或RNA的相互作用而調(diào)節(jié)ALK6或 Cdc42的表達(dá)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述核酸是RNA分子。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述核酸是能夠?qū)幋aALK6或Cdc42的mRNA 進(jìn)行針對(duì)性的反義作用或RNA干擾的RNA分子。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述核酸是用于通過(guò)RNAi靶向 Cdc42 mRNA 的 RNA 分子，所述 RNAi 具有序列 5，-GAUAACUCACCACUGUCCATT-3，和 5，-UGGACAGUGGUGAGUUAUCTT-3，寡核糖核苷酸；或 5，-GACUCCUUUCUUGCUUGUUTT-3，和 5’ -AACAAGCAAGAAAGGA⑶CTT-3’ 寡核糖核苷酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求12到22中任意一項(xiàng)所述的方法，所述方法包括應(yīng)用通過(guò)影響權(quán)利要求1到11中所述的ALK6或Cdc42的物質(zhì)的識(shí)別方法識(shí)別出的組合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述物質(zhì)是選自硬化蛋白，腱蛋白樣蛋白質(zhì)和卵泡抑素相關(guān)蛋白(FSRP)的ALK6拮抗劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)研究或調(diào)節(jié)黑色素在皮膚中的色素沉著有用的組合物和方法。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及包括能夠調(diào)節(jié)ALK6(SEQ ID 2)或Cdc42的活性或表達(dá)從而能夠?qū)谏貜暮谒丶?xì)胞到角化細(xì)胞以及潛在地從角化細(xì)胞到角化細(xì)胞的轉(zhuǎn)移進(jìn)行調(diào)節(jié)的物質(zhì)的組合物。本發(fā)明也涉及鑒定這種組合物的試驗(yàn)，以及調(diào)節(jié)皮膚色素沉著的方法。
文檔編號(hào)A61K8/64GK102209522SQ200980144906
公開(kāi)日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2009年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月10日
發(fā)明者休曼·庫(kù)馬·辛格, 德斯蒙德·約翰·托賓 申請(qǐng)人:布拉德福德大學(xué)