專利名稱：疫苗制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒和基于病毒的疫苗的穩(wěn)定劑型。在低于水的冰點的溫度下使病毒穩(wěn)定的難點是在冷凍和融化過程中防止結(jié)構(gòu)和功能組分的物理破壞。為了確保儲存期間的穩(wěn)定性，感染性病毒的原種通常儲存在<60°c下。此外，病毒的冷藏(例如5_8°C)制劑可能具有有限的穩(wěn)定性。發(fā)明一般背景改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)是痘病毒科(Poxviridae)正痘病毒屬 (Orthopoxvirus)的高度減毒的成員。被工程化改造以表達外源基因的痘病毒是在生物醫(yī)學(xué)研究中用于靶蛋白合成和疫苗開發(fā)的公認工具。它們的有利特性包括對重組DNA的大包裝能力、靶基因表達的精確的病毒特異性控制、在宿主中缺乏持久性或基因組整合、作為疫苗的高免疫原性以及載體和疫苗容易生產(chǎn)。在安全性顧慮主導(dǎo)的人類中復(fù)制缺陷型病毒的開發(fā)后，MVA作為痘苗病毒(VV)天花疫苗的替代物出現(xiàn)。在雞胚成纖維細胞中傳代超過570代之后，MVA失去了 VV的廣譜細胞宿主范圍，在許多哺乳動物來源的細胞、包括人類細胞中不能有效生長。MVA已經(jīng)用于超過100，000人的初次天花疫苗接種而沒有嚴重問題，并且在試驗動物中測試后被認為是無致病力的。對于大多數(shù)目的來說，MVA載體的產(chǎn)生需要來自質(zhì)粒的單一基因組插入片段，該片段帶有一個或兩個置于VV特異性啟動子控制下的重組基因。在MVA基因組或編碼VV蛋白胸腺嘧啶核苷激酶或血細胞凝集素的基因座中天然存在的缺失位點，被用作插入重組基因序列的位點。許多早期研究致力于開發(fā)對抗人類多種病毒感染的MVA候選重組疫苗，所述多種病毒包括引起AIDS、流感、早期兒童呼吸道疾病、麻疹、日本腦炎、登革熱或瘧疾的病毒。因為迫切需要對抗AIDS的有效疫苗，產(chǎn)生免疫缺陷病毒抗原的重組MVA是在人類中作為候選疫苗而被評估的第一批載體病毒之一。病毒在其天然環(huán)境之外通常是不穩(wěn)定的，所述環(huán)境在細胞區(qū)室與細胞外流體之間可能相當(dāng)不同。如果某些條件不能維持，純化的病毒可能不能正常發(fā)揮作用或保持可溶。此外，病毒滴度可能受到蛋白水解、聚集和亞最適緩沖條件的影響。例如，在疫苗接種中使用的純化病毒通常需要儲存較長時間，同時保持其原始結(jié)構(gòu)完整性和/或活性。儲存“貨架壽命”的范圍可以從數(shù)周到一年以上不等，并依賴于病毒的性質(zhì)和使用的儲存條件。為了確保穩(wěn)定性，治療性病毒制劑一般作為凍干物質(zhì)提供，其在臨使用前溶解在獨立包裝的水溶性稀釋劑中；然而，這種方法增加了制造成本，并牽涉不正確給藥的增加風(fēng)險，因為凍干蛋白需要在臨使用前溶解，并且經(jīng)常在凍干過程后觀察到感染性滴度的損失。 可選地，治療性病毒制劑可以作為溶液提供，其含有用于增加穩(wěn)定性的添加劑。例如，已經(jīng)提出了可用于配制蛋白溶液的添加劑例如游離氨基酸(例如亮氨酸、色氨酸、絲氨酸、精氨酸和組氨酸)。一些目前在市場上可獲得的病毒制劑含有蛋白質(zhì)作為穩(wěn)定劑。人血清白蛋白(HSA)或純化的明膠可用于抑制病毒溶液中的化學(xué)和物理變化。但是，添加這些蛋白牽涉用于除去病毒污染的復(fù)雜過程。此外，它們可能產(chǎn)生強過敏反應(yīng)，其限制了它們的應(yīng)用。液體病毒制劑通常作為冷凍固體儲存。常規(guī)的深低溫保藏法利用各種添加劑來促進玻璃化。玻璃化是通過快速移除或添加熱量或通過與添加劑混合，將材料轉(zhuǎn)變成不含任何晶體結(jié)構(gòu)的玻璃樣無定形固體的過程。玻璃狀固體的固化發(fā)生在玻璃化轉(zhuǎn)變溫度下(由于過冷現(xiàn)象，其低于熔化溫度Tm)。在低溫生物學(xué)中使用或由生活在極地區(qū)域的生物體天然產(chǎn)生的添加劑被稱為低溫保護劑。常規(guī)的低溫保護聚焦于獲得對生物材料的長期儲存最為有利的固體狀態(tài)，即聚焦于從液體向固體狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。然而，本研究令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，一旦獲得固體冷凍狀態(tài)后，病毒組合物可能不穩(wěn)定。發(fā)明概述本發(fā)明的第一方面提供了液體或冷凍液體組合物，其包含(a)改良的安卡拉痘苗(MVA)病毒或其變體或衍生物；以及(b)甘露糖醇，其中(b)是組合物的唯一穩(wěn)定劑。本發(fā)明的組合物是穩(wěn)定的。甘露糖醇通常在凍干病毒疫苗劑型中用作增量或結(jié)塊劑。例如，Maa等Q004， J. Pharm. Sci. 93 (7) :1912-1923)公開了包含甘露糖醇、葡聚糖和肌醇的流感疫苗噴霧冷凍干燥劑型。作者主要使用甘露糖醇作為吸濕劑，但是也假設(shè)通過增加脫水粒子的機械強度而改進疫苗穩(wěn)定性。在凍干的基于MVA的疫苗中使用甘露糖醇作為穩(wěn)定劑，在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的。Zang 等(2007，Chem. Res. Chinese U. ,23(3) =329-332)描述了包含海藻糖、甘露糖醇、 葡聚糖和肌醇的穩(wěn)定的凍干MVA疫苗組合物。據(jù)報道，海藻糖和葡聚糖促進蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)的保護，而甘露糖醇和肌醇據(jù)說起到自由基氧化抑制劑的作用。甘露糖醇已被用于液體疫苗劑型中，包括基于MVA的疫苗。美國專利申請 No. 11/202，516在其一般性公開內(nèi)容中將甘露糖醇與海藻糖和/或葡萄糖的組合列于可能的賦形劑中。然而，沒有描述所預(yù)期的甘露糖醇的性質(zhì)。同樣，美國專利申請No. 10/379，572 公開了口服MVA-天花疫苗劑型，其任選共同包含甘露糖醇以及其他賦形劑包括AFFA ( 一種營養(yǎng)級魚油)、羥乙基淀粉和甘油。同樣地，沒有描述甘露糖醇的所預(yù)期的功能性質(zhì)。美國授權(quán)專利7，256，037描述了 MVA液體劑型，其任選包含甘露糖醇作為等滲劑。在液體和冷凍液體病毒疫苗組合物中使用甘露糖醇作為穩(wěn)定劑，也已有報道。在 WO 2001/066137和WO 2005/052116中，敘述了甘露糖醇由于既是低溫保護劑又是自由基清除劑而將其作為病毒穩(wěn)定劑。W02001/066137也陳述了組合物的病毒可以任選是痘苗病毒。此外，美國專利4，147，772也敘述了甘露糖醇作為液體疫苗劑型的穩(wěn)定劑。然而，這些公開都沒有使用甘露糖醇作為唯一穩(wěn)定劑。相反，穩(wěn)定性是使用可以包含甘露糖醇的賦形劑的組合而獲得的。使用“變體”，我們是指病毒基因組不具有與改良的安卡拉痘苗病毒(MVA) (GenBank登記號AY603355，VRL 2004年5月15日)100%的核酸序列同一性，但仍然能夠賦予對天花的免疫性并感染雞胚成纖維細胞，同時不能在人類HeLa細胞系中復(fù)制。例如， 基因組可以包含與MVA的核酸序列具有至少90%同一性的核酸序列，更優(yōu)選與所述核酸序列至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一。百分同一性可以通過本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法來確定，例如使用Expasy實驗室網(wǎng)站上的 LALIGN 程序(Huang 和 Miller，Adv. App 1. Math. (1991) 12 :337-357)，使用整體比對選項(global alignment option)、計分矩陣(scoring matrix)BL0SUM62、孔間隙罰分 (opening gap penalty)—14、擴展|1]|5|^罰分(extending gap penalty)_4 白勺參使用“衍生物”，我們是指包含基因組插入、缺失和/或取代的重組MVA。使用“穩(wěn)定的”，我們是指在8°C 士2°C或-23°C 士5°C下儲存4周后，組合物的病毒滴度為使用前原始病毒滴度的至少20%，優(yōu)選為原始感染性的至少30%或40%或50%或 60%或70%或80%或85%或90%，最優(yōu)選為原始病毒滴度的至少95%、96%、97%、98%或 99%。優(yōu)選情況下，在儲存至少3個月后并且優(yōu)選在儲存6個月、1年、2年、3年或4年后， 最優(yōu)選在儲存5年或更多年后，組合物的病毒滴度維持在該/這些水平上。使用“穩(wěn)定劑”，我們是指與缺乏某種試劑的相同組合物相比，促進病毒滴度維持的試劑。典型情況下，可以在冷凍儲存的一個月至幾個月內(nèi)的比較性研究中檢測不穩(wěn)定性。 然而，由本發(fā)明的試劑提供的穩(wěn)定性效應(yīng)可能擴展到組合物的整個使用壽命，其可以是5 年或更長時間。優(yōu)選情況下，在8°C 士2°C或-23°C 士5°C下儲存4周后，包含穩(wěn)定劑的組合物與不含穩(wěn)定劑的相同組合物相比，具有高至少20%的病毒滴度，更優(yōu)選高至少30%或 40 %或50 %或60 %或70 %或80 %或85 %或90 %的病毒滴度。優(yōu)選情況下，在儲存至少3 個月后并且優(yōu)選在儲存6個月、1年、2年、3年或4年后，最優(yōu)選在儲存5年或更多年后，包含穩(wěn)定劑的組合物的病毒滴度與不含穩(wěn)定劑的相同組合物相比，維持在該/這些水平上。 使用“穩(wěn)定劑”，我們不包括典型的藥物組合物賦形劑，例如(但不限于)防腐劑、緩沖劑、抗微生物劑、增量/填充劑、黏度調(diào)節(jié)劑、等滲劑、去污劑、乳化劑和表面活性劑。相反，使用“穩(wěn)定劑”，我們包括了簡單的糖例如蔗糖、右旋糖、葡萄糖和果糖，糖醇 /多元醇例如甘油、山梨糖醇、木糖醇、赤蘚糖醇和肌醇，以及血清白蛋白例如人血清白蛋白 (HSA)或牛血清白蛋白(BSA)。病毒滴度可以使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的任何標準技術(shù)，例如噬菌斑測定法(在適合時)或TCID5tl測定法等來測量。在病毒噬菌斑測定法中，在包含在某些營養(yǎng)培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)物中形成可見的結(jié)構(gòu)。通過在細胞培養(yǎng)物中繁殖，病毒產(chǎn)生被稱為噬菌斑的細胞破壞區(qū)。這些噬菌斑可以憑視覺檢測，有時使用裸眼，有時通過其他技術(shù)例如染色、顯微術(shù)、紅細胞吸附或免疫熒光，以確定病毒滴度。TCID5tl (組織培養(yǎng)感染劑量50)測定法測定當(dāng)接種到大量易感組織培養(yǎng)物中時將感染50%的個體培養(yǎng)物的感染性因子、例如病毒的量。為了測定TCID5tl，按照例如基本上如下所述的US 5，391，491的方法(含有或不含血清)制備雞胚胎細胞(CEC)。將微孔板接種有100 μ ICEC懸液，濃度為切105士20%個細胞/ml。將板在36°C 士2°C下在CO2培養(yǎng)箱中溫育過夜。稀釋前，將樣品和對照制劑(對照)用超聲波處理。將樣品和對照以10倍的步級在細胞培養(yǎng)基中稀釋，產(chǎn)生覆蓋整數(shù)對數(shù)或半對數(shù)步級的連續(xù)稀釋液。稀釋步級的適合數(shù)量取決于預(yù)計的病毒滴度。重組MVA空白對照樣品從未稀釋的樣品開始測試。分別將100 μ 1每種制備的樣品或?qū)φ障♂屢恨D(zhuǎn)移8次到含有CEC單層的制備好的微孔板中。另外8個孔用細胞培養(yǎng)基接種，作為陰性(細胞)對照。隨后將微孔板在
權(quán)利要求
1.一種液體或冷凍液體組合物，其包含(a)改良的安卡拉痘苗(MVA)病毒或其變體或衍生物；以及(b)甘露糖醇，其中(b)是組合物的唯一穩(wěn)定劑。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中甘露糖醇在10°C至0°C之間的儲存溫度下提供穩(wěn)定效應(yīng)。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中組合物是疫苗或在哺乳動物、優(yōu)選為人類中用于基因治療、病毒治療、免疫治療或癌癥治療。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中組合物是活疫苗。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中病毒用于免疫接種，以對抗由選自下列的微生物引起的疾病或病癥腺病毒、單純性皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、細胞肥大病毒、愛潑斯坦巴爾病毒、乙型肝炎病毒、流感病毒、人類乳頭瘤病毒、副流感病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、鼻病毒、甲型肝炎病毒、痘苗病毒、大天花病毒、 類天花病毒、輪狀病毒、嗜人類T淋巴細胞病毒-1、人類免疫缺陷病毒(HIV)、狂犬病病毒、風(fēng)疹病毒、黃熱病毒、蟲媒病毒、阿菲波菌(Afipia spp)、布魯菌(Brucella spp)、 類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderia pseudomallei)、衣原體(Chlamydia)、貝納柯克斯體(Coxiella burnetii)、土拉熱弗朗西絲菌(Francisella tularensis)、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)、單核細胞增生性李其jf特菌(Listeria monocytogenes) > 鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)、麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、立克次氏體(Rickettsiae)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)、鼠疫耳口爾森氏菌(Yersinia pestis)、皰原蟲(Plasmodium spp)、小泰累爾梨漿蟲(Theileria parva)、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)、小球隱孢子蟲 (Cryptosporidium parvum)、禾[|什曼原蟲(Leishmania)、克氏維蟲(Trypanosoma cruzi)禾口新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中組合物基本上是水性的。
7.權(quán)利要求1的組合物，其包含0.01%至40%(w/v)的甘露糖醇。
8.權(quán)利要求7的組合物，其包含0.至10% (w/v)的甘露糖醇。
9.權(quán)利要求8的組合物，其包含約5%(w/v)的甘露糖醇。
10.一種使液體或冷凍液體組合物穩(wěn)定的方法，所述組合物包含改良的阿卡拉痘苗病毒(MVA)或其變體或衍生物，所述方法包含添加足夠量的甘露糖醇，其中甘露糖醇是組合物的唯一穩(wěn)定劑。
11.權(quán)利要求10的方法，其中組合物用于權(quán)利要求3或4任一項中限定的目的。
12.權(quán)利要求10或11的方法，其中組合物的病毒如權(quán)利要求5中所限定。
13.權(quán)利要求10到12任一項的方法，其中組合物如權(quán)利要求6到9任一項中所限定。
14.甘露糖醇的應(yīng)用，用于使包含改良阿卡拉痘苗病毒(MVA)或其變體或衍生物的液體或冷凍液體組合物穩(wěn)定，其中甘露糖醇是組合物的唯一穩(wěn)定劑。
15.權(quán)利要求14的應(yīng)用，其中組合物用于權(quán)利要求3或4任一項中限定的目的。
16.權(quán)利要求14到15的應(yīng)用，其中組合物的病毒如權(quán)利要求5中所限定。
17.權(quán)利要求14到16任一項的應(yīng)用，其中組合物如權(quán)利要求6到9任一項中所限定。
全文摘要
一種液體或冷凍液體組合物，所述組合物包含改良的安卡拉痘苗(MVA)病毒或其變體或衍生物以及甘露糖醇，其中甘露糖醇是組合物的唯一穩(wěn)定劑。甘露糖醇可以在0至+10℃下或在冷凍液體組合物中、例如在-10℃至-30℃或-20℃至-23.5℃之間提供穩(wěn)定效應(yīng)。MVA可以在哺乳動物、優(yōu)選為人類中用作疫苗，用在基因治療、病毒治療、免疫治療或癌癥治療中。
文檔編號A61K39/285GK102215866SQ200980145709
公開日2011年10月12日 申請日期2009年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月14日
發(fā)明者克麗斯塔·陶爾, 曼弗雷德·歐貝瑞瑟, ?？赂窭滋亍じ？思{ 申請人:巴克斯特醫(yī)療保健股份有限公司, 巴克斯特國際公司