專利名稱：增強造血干細胞植入過程的材料和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文公開的一些方面和實施方案涉及增強造血干和祖細胞植入的材料和方法。
背景技術(shù)：
造血干和祖細胞(Hematopoieticstem and progenitor cell，HSPC)移植是獲準(zhǔn)用于治療某些惡性與非惡性血液病和代謝疾病的療法。用于移植的HSPC來源包括骨髓、動員的外周血和臍帶血(umbilical cord blood, UCB) (Goldman 和 Horowitz，2002 ；Fruehauf 和kggawiss，2003 =Broxmeyer,等，2006)。醫(yī)生常規(guī)地進行骨髓、動員的外周血干細胞和臍帶血的移植。這些過程要求從健康的正常供體或者從產(chǎn)生給定癥狀之前或處于恢復(fù)之中的患者收獲足夠數(shù)量的造血干和祖細胞。接著將所收獲的材料施用給其造血系統(tǒng)以及推定地其患病或異常組織和細胞已被清除的患者。移植之后，移植的干細胞移動或“歸巢”到適宜的骨髓微環(huán)境小生境(niche)，在此小生境中存活、增殖并生成新的干細胞，這一過程被稱作自我更新(Porecha等，2006 ；Broxmeyer, 2006 ；Hall等，2006)。所述細胞也分化成為譜系限制性祖細胞和成熟細胞，從而恢復(fù)了接受者的健康所必需的具有造血功能的造血系統(tǒng)。祖細胞經(jīng)常存在于所移植的材料中，而且可能是這些移植物產(chǎn)生成熟細胞所必需的。然而，因為祖細胞并不是干細胞，不能自我更新，所以它們僅在有限的時間內(nèi)參與移植治療。因為移植的過程對移植材料產(chǎn)生壓力，所以成功的移植需要移植足夠的細胞以應(yīng)對該過程中殺死或破壞的細胞。這為臍帶血移植物的移植帶來了巨大的問題，因為這些移植物僅包含非常有限數(shù)目的干細胞。因此，臍帶血移植物經(jīng)常不能成功地用于移植成年人。 類似地，10-25%的患者和正常供體無法動員足夠的細胞以用于移植過程。在一些患者人群中，特別是用某些化學(xué)治療藥物治療的人群，50%以上的患者無法動員。一般來說，可移植的細胞越多，移植成功的可能性就越大。例如，現(xiàn)今最好的做法建議外周血干細胞移植過程通常要求每公斤接受患者體重施用最少大約2百萬個⑶34+細胞，可獲得的以及隨后移植的CD34+細胞越多，患者的結(jié)局就越好(Pulsipher，2009)。干細胞數(shù)量不足、無法遷移/歸巢到適宜的骨髓小生境或造血干和祖細胞的移植效率及自我更新差可不利地影響移植結(jié)局，其由多步驟的群體恢復(fù)(repopulation)過程來度量。嘗試了許多方法在離體背景下擴增分離移植物中人造血干和祖細胞的數(shù)量，但是成果非常有限。提高HSPC移植效率的策略需要克服醫(yī)療行業(yè)所面臨的這一挑戰(zhàn)。本發(fā)明中公開的一些方面和實施方案滿足了這一需求。

發(fā)明內(nèi)容
本公開內(nèi)容的一些方面涉及對造血干和祖細胞收獲和/或植入的增強，其中一些方面包括但不僅限于離體存活、自我更新和歸巢到適宜的骨髓小生境，以提高造血干和祖細胞治療的成功率。本公開內(nèi)容的一些方面包括增加收獲自供體的具有長期群體恢復(fù)能力的造血干和祖細胞數(shù)量的方法。這些方法中的一些包括如下步驟鑒定抑制前列腺素(例如前列腺素E)生物合成的化合物，或拮抗參與前列腺素應(yīng)答的至少一種前列腺素受體的化合物；以及在從供體外周血或骨髓收獲造血干和祖細胞之前向供體提供藥學(xué)有效量的所述化合物。在一個實施方案中，前列腺素E生物合成抑制劑和/或前列腺素E受體拮抗劑的施用與一種或多種臨床上獲準(zhǔn)的造血干和祖細胞動員劑(例如，粒細胞集落刺激因子(Granulocyte-Colony Stimulating Factor, G-CSF))聯(lián)用，來增加可通過血液分離法 (apheresis)收集的造血干和祖細胞的數(shù)量以用于造血移植物移植。在一個實施方案中，化合物選自環(huán)加氧酶抑制劑，包括例如吲哚美辛氯苯基)羰基]-5-甲氧基-2-甲基-IH-吲哚-3-基}乙酸)或其可藥用鹽。在另一些實施方案中，環(huán)加氧酶抑制劑選自 阿司匹林、布洛芬、塞來昔布、羅非昔布、美洛昔康、艾托考昔、伐地考昔、萘普生、雙氯芬酸、 利克飛龍、依托度酸、酮咯酸或其可藥用鹽。在一些實施方案中，環(huán)加氧酶抑制劑對C0X-1 和C0X-2 二者都有作用，通常情況下優(yōu)先作用于C0X-2。在一些實施方案中，可使用的另一種化合物是美洛昔康。本公開內(nèi)容的另一些方面包括增強收獲的造血干和/或祖細胞(hematopoietic stem and/or progenitor)移植物在接受者中長期群體恢復(fù)能力的方法。在接受者的造血系統(tǒng)有缺陷的情況下這是特別有用的。所述方法包括如下步驟a)從供體中收獲移植物， 其中所述供體已經(jīng)過有效量的抑制前列腺素氏生物合成的化合物和/或前列腺素氏受體拮抗劑的處理；b)將移植物與有效量的前列腺素氏或者一種或多種其衍生物離體接觸；以及c)將處理過的移植物施用于接受者。在一個實施方案中，所述方法還包括下述步驟向移植接受者提供有效量的前列腺素&或一種其衍生物或任何具有PGE2活性的分子，從而增強移植物向適宜治療小生境的歸巢。本公開內(nèi)容的另一些方面包括提高干細胞中病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效力的方法。這些方法中的一些可包括如下步驟提供含有至少一個待轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因的病毒載體；提供至少一個經(jīng)有效量的前列腺素&或其衍生物離體處理過的干細胞，以及將所述病毒載體轉(zhuǎn)染進經(jīng)PG&或其衍生物處理的干細胞。一些實施方案包括增強造血干和/或祖細胞動員的方法，包括如下步驟鑒定造血干和/或祖細胞的來源；提供降低PGE2生物合成和/或活性的化合物；和將造血干和/ 或祖細胞的來源與有效量的所述降低PGE2生物合成和/或活性的化合物相接觸。在一些實施方案中，所述降低PGE2活性的化合物為非留體抗炎化合物，其中所述非留體抗炎化合物作用于環(huán)加氧酶-1和環(huán)加氧酶-2。在一些實施方案中，所述非留體抗炎化合物主要作用于環(huán)加氧酶-2。在一些實施方案中，所述非留體抗炎化合物選自阿司匹林、塞來昔布、羅非昔布、艾托考昔、伐地考昔、布洛芬、萘普生、雙氯芬酸、依托度酸，酮咯酸和利克飛龍。在另一些實施方案中，所述非留體抗炎化合物為吲哚美辛，而在又一些實施方案中所述非甾體抗炎化合物為美洛昔康。
在一些實施方案中，向患者施用一段時間的所述非留體抗炎化合物，所述時間段與使用至少一種增強造血干和祖細胞動員的額外化合物的共治療相重疊。在一些實施方案中，所述增強造血干和祖細胞動員的化合物選自G-CSF和普樂沙福(plerixafor)。在一些實施方案中，向患者施用至少3天的所述非留體抗炎化合物。另一些實施方案包括增強來自供體的造血干和/或祖細胞動員的方法，其包括如下步驟提供作為至少一種PGE2受體之拮抗劑的化合物；以及在從供體收獲造血干或祖細胞之前向所述造血干或祖細胞供體施用有效量的所述化合物。在一些實施方案中，至少一種PG&受體的拮抗劑選自=N-[ [4 ‘ -[[3-丁基-1，5-二氫-5-氧代-1-[2-(三氟甲基)苯基]-4H-1，2，4-三唑-4-基]甲基][1，r-聯(lián)苯基]_2_基]磺?；鵠-3-甲基-2-噻吩甲酰胺 (L-161,982)和4- ，9-二乙氧基-1，3-二氫-1-氧代-2H-苯并[f]異吲哚_2_基)-N-(苯磺酰基)-苯乙酰胺(GW627368X)。而另一些實施方案包括將造血干和或祖細胞(hematopoietic stem and or progenitor)植入接受者，其包括如下步驟從來源收獲包含造血干和祖細胞的細胞群，所述來源已經(jīng)過至少一種降低來源中PGE2生物合成和/或活性的化合物處理；將所述造血干細胞群與增加PGE2活性的化合物離體接觸；以及將與所述增加PGE2活性的化合物離體接觸的所述造血干和祖細胞移植入接受者。在一些實施方案中，所述造血干細胞抽取自骨髓供體。而在另一些實施方案中，所述造血干細胞收獲自從血液供體抽取的血液樣品。而在又一些實施方案中，所述細胞抽取自臍帶或胎盤。一些實施方案包括增加造血干和/或祖細胞植入率的方法，其包括如下步驟提供具有PGE2活性的化合物；和將所述具有PGE2活性的化合物與造血干和/或祖細胞群離體相接觸。在一些實施方案中，具有PG&活性的化合物選自任何E系列的前列腺素或E系列前列腺素的任何衍生物，例如PGEi、PGE2, PGE3或PGE1, PGE2, PGE3的二甲基衍生物，包括例如二甲基16，16- 二甲基PGE2。在一些實施方案中，所述具有PGE2活性的化合物與所述造血干和/或祖細胞群接觸至少1小時。一些實施方案包括用基本上沒有PGE2活性的緩沖液將與所述具有PGE2活性的化合物相接觸的所述造血干和/或祖細胞沖洗至少一次的步驟。 而另一些實施方案還包括如下步驟將與所述具有PG&活性的化合物相接觸的所述造血干和/或祖細胞引入患者?？蓞⒄障铝蟹窍拗菩愿綀D、描述和權(quán)利要求更好地理解本發(fā)明的這些和其它特征、方面和優(yōu)點。附圖簡述

圖1A.檢測PGE2增強造血干細胞植入之作用的實驗的略圖(上圖)；舉例說明 CD45. 1和CD45. 2細胞群的代表性流式細胞術(shù)結(jié)果圖示(下圖)。圖1B.陰性細胞百分比相對于植入細胞數(shù)的圖(上圖)；嵌合百分比相對于競爭劑比例的散點圖(左下圖)；不同條件下測定的CRU/100K細胞的柱狀圖(右下圖)。圖1C.概述在20周期間針對用和不用dmPGE2處理的細胞繪制的恢復(fù)群體之細胞頻率的表格。圖1D.多譜系重建的代表性FACS圖(髓細胞、B和T淋巴細胞，左上圖)。計數(shù)/ CD3的圖(右上圖)。中間行，在一級接受者中32周時(左圖)和在二級接受者中12周時 (右圖)檢測到的總WBC百分比的柱狀圖。在一級接受者中20周時和在二級接受者中12周時檢測到的嵌合百分比圖(下圖)。圖2k. MACS微珠除去LirT骨髓的代表性FACS門控選擇(FACS gating)，其顯示 Lin—門控細胞(gated cell)的c_kit+和Sea-I+的門控選擇(左圖)。針對不同EP受體進行作圖的計數(shù)(中圖)和針對不同受體繪制的mRNA相對于循環(huán)數(shù)的變化(右圖)。圖2B. SSC相對于⑶34的代表性FACS圖(左圖)；針對不同EP受體繪制的計數(shù) (中圖)和針對不同受體繪制的mRNA相對于循環(huán)數(shù)的變化(右圖)。圖3A.實驗略圖(上圖)；針對不同處理進行作圖的％ CFSE+(下圖)。圖3B.舉例說明實驗方案的示意圖；暴露于16，16-二甲基前列腺素E2(ClmPGE2)和多種對照后檢測的％歸巢效率(左下圖)和改變倍數(shù)(右下圖)。圖3C.實驗略圖(左圖)；針對不同處理的⑶45. 2相對于⑶45. 1的FACS圖(中圖)；針對不同處理繪制的％歸巢效率圖(右圖)。圖4A.以灰色顯示的CXCR4受體表達同工型對照的代表性流式細胞術(shù)圖示(頂行)；舉例說明鼠和人HSPC脈沖式暴露于PGE2對CXCR4表達之結(jié)果的柱狀圖，針對不同條件進行作圖的CXCR4變化(底行)。
針對不同處理的百分比歸巢效率的柱狀圖。
作為dmPGE2濃度的函數(shù)進行作圖的膜聯(lián)蛋白V+SKL的百分比。
針對不同條件進行作圖的存活素增加的倍數(shù)。
針對暴露于dmPGE2的不同時間進行作圖的，相對于對照活性歸一化的變化圖 4B.圖 5A.圖 5B.圖 5C.
百分比。圖6A.代表性流式細胞術(shù)圖示，其顯示門控SKL細胞的DNA含量(7AAD染色)，處于S+G2M期的SKL百分比，以及經(jīng)dmPGE2處理的細胞周期中SKL的增加倍數(shù)(左圖)；該圖顯示三個實驗的合并數(shù)據(jù)(右圖)。圖6B.實驗略圖以及顯示在不同處理下測量的處于S+G2/M期的歸巢SKL細胞之增加倍數(shù)的柱狀圖。漫畫圖顯示實驗方案(左圖)；在有和沒有dmPG&存在下測得的S+G2/M 增加倍數(shù)的柱狀圖。
圖7A.對不同處理后測定的CFU-GM/mL血作圖的柱狀圖。 圖7B.對不同處理后測定的CFU-GM/mL血作圖的柱狀圖。 圖8.總結(jié)舉例說明PGE2影響細胞周期中SLAM SKL之?dāng)?shù)據(jù)的表格。 圖9.經(jīng)對照和dmPGE2處理之細胞的遷移相對于SDF-I濃度的圖。 圖10.⑶34+細胞遷移百分比相對于SDF-I濃度和/或AMD3100的圖。AMD3100為 (1，1-[1，4-亞苯基雙(亞甲基)]雙[1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷]八氫溴化物二水合物)， 以商品名Mozobil 出售。圖11. SKL細胞歸巢效率百分比相對于用dmPGE2和/或AMD3100以及多種對照處理的柱狀圖。圖12. FACS圖(左圖)；以及說明有和沒有dmPGE2時所測定的細胞周期中SKL變化倍數(shù)的柱狀圖(右圖)。圖13.實驗方案的略圖(左圖)；顯示加入和不加入dmPGE2所測定的S+G2/M期增加的柱狀圖。圖14.起始暴露于dmPGE2 (正方形)或?qū)φ?載劑(vehicle)，菱形)后隨時間測得的一系列移植物中嵌合百分比的圖。圖15.使用載劑(淺灰色)吲哚美辛(深灰色)或黃岑苷元(灰色)所測定的 CFU-GM/ml血的柱狀圖(左圖)；用G-CSF(淺灰色)；G-CSF加吲哚美辛(灰色陰影)或 G-CSF加黃岑苷元(灰色)所收集數(shù)據(jù)的圖。圖16.使用G-CSF以及G-CSF加吲哚美辛所測得的，相比于G-CSF，CFU/ml血的增加倍數(shù)的柱狀圖。圖17.使用G-CSF或G-CSF加吲哚美辛處理后測得的，SKL細胞(左側(cè))或SLAM SKL細胞(右側(cè))之動員細胞的表型分析柱狀圖。圖18.使用載劑(vehicle)或吲哚美辛(左圖)或者AMD3100或AMD3100加吲哚美辛(右圖)，對CFU-GM/ml血作圖的柱狀圖。圖 19.用載劑、吲哚美辛、AMD3100 ；G-CSF ；AMD3100 加 GROBeta ；AMD3100 加吲哚美辛或者G-CSF加吲哚美辛處理后測得的，對CFU-GM/ml外周血作圖的柱狀圖。圖20.載劑(透明)、G-CSF(黑)、G-CSF加美洛昔康(((8E) _8_[羥基-[(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)氨基]甲叉]-9-甲基-10，10-二氧代-10 λ6-硫雜-9-氮雜雙環(huán) [4. 4. 0]十碳-1,3, 5-三烯-7-酮)(淺灰)或G-CSF加吲哚美辛(灰)處理后，CFU-GM/ ml血的柱狀圖。圖21.用G-CSF (淺灰)或G-CSF加吲哚美辛(灰)(左圖)測得的競爭性群體恢復(fù)單位(Competitiive Repopulating unit, CRU)的柱狀圖；以及用載劑、G-CSF 對 SKL 細胞測得的CXCR4MFI ；不錯開、錯開一天或錯開兩天(右圖)。圖22.用G-CSF (菱形)或G-CSF加吲哚美辛(正方形)測得的百分比嵌合相對于 PBMC =BM比的圖(左圖)；用G-CSF(淺灰)或G-CSF加吲哚美辛(灰色)所測得的CRU/2 百萬PBMC。圖23. PMN相對于G-CSF (菱形)或G-CSF加美達佳(美洛昔康)(正方形)動員的PBMC移植后天數(shù)的圖。圖PLT相對于G-CSF (菱形)或G-CSF加美達佳(美洛昔康)(正方形)動員的PBMC移植后天數(shù)的圖。圖25.漫畫圖，其總結(jié)了設(shè)計用于測試單獨G-CSF或G-CSF加美洛昔康處理狒狒之作用的實驗。圖26.從用G-CSF或G-CSF加美洛昔康處理的4只不同的狒狒抽取的每mL血中 CD34+細胞(左側(cè))或CFU-GM(右側(cè))的圖。圖27.使用對C0X-1或C0X-2選擇性不同的不同化合物所檢測的CFU-GM/ml血的柱狀圖。圖28. G-CSF或G-CSF加不同量的阿司匹林或布洛芬處理細胞后，相比于G-CSFJjf 檢測的CFU-GM/mL血的變化倍數(shù)的柱狀圖。圖29.用G-CSF或不同水平的美洛昔康處理后外周血中所測得的G_CSF/mL血的柱狀圖。圖30.用G-CSF或不同水平的美洛昔康處理后骨髓中所測得的G-CSF/股骨的柱狀圖。發(fā)明詳述
為了促進對這項新技術(shù)原理的理解，接下來參照其優(yōu)選實施方案，使用具體的語言對其進行描述。但是，需要理解的是，這并不是意在對這一新技術(shù)的范圍進行限定，如本新技術(shù)相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所進行地，考慮了對本新技術(shù)原理的改變、修改和進
一步應(yīng)用。前列腺素氏(Prostaglandin E2，PGE2)是大量存在的生理性類二十烷酸 (eicosanoid)，其是癌癥、炎癥和多種其它生理系統(tǒng)的已知中介物。已有多個研究小組研究了 PG&在血細胞生成中的作用，但研究結(jié)果難以協(xié)調(diào)一致。例如，體內(nèi)和體外研究證明， PGE2可負(fù)調(diào)節(jié)髓細胞生成=PGE2促進BFU-E和CFU-GEMM集落形成，并增強CFU-S和CFU-GM 的增殖。另一方面，PG&可刺激HSPC并對血細胞生成具有兩階段作用(biphasic effect) PG&短期離體處理骨髓細胞顯示出刺激靜息細胞群、可能從干細胞或更原始的祖細胞產(chǎn)生細胞周期中(cycling)人CFU-GM。另外，最近有顯示離體暴露于16，16-二甲基PG&增加小鼠骨髓細胞的群體恢復(fù)(!^populating)能力以及斑馬魚中腎髓的恢復(fù)(North等，2007)。 這些研究表明PGE2參與調(diào)節(jié)血細胞生成，但沒有將PGE2與造血干細胞歸巢(homing)相關(guān)聯(lián)。換句話說，之前的研究傾向于認(rèn)為PGE2參與調(diào)節(jié)HSPC分化，而對細胞歸巢沒有直接的作用。如本文所證明的，PGE2對長期的恢復(fù)群體的HSPC具有直接的穩(wěn)定的作用，并通過增強自我更新的HSPC的存活、歸巢和增殖來促進植入(engraftment)。本文公開的一個方面是抑制環(huán)加氧酶活性，其增加造血干和祖細胞在外周血系統(tǒng)中循環(huán)的頻率。在一個非限制性實施例中，施用環(huán)加氧酶抑制劑，例如在從接受動員劑給藥前一天開始，通過經(jīng)口或全身性途徑向造血干細胞供體每天施用50yg吲哚美辛，增強了外周血中干細胞和祖細胞的動員。將環(huán)加氧酶抑制劑(例如吲哚美辛)與臨床上批準(zhǔn)的動員劑(例如G-CSF)同時使用，產(chǎn)生協(xié)同作用從而動員祖細胞。造血干細胞和祖細胞的動員也可通過向供體提供有效量的前列腺素E受體拮抗劑來實現(xiàn)。本公開的一些方面證明離體暴露于PGE2提高移植后的HSPC頻率，并為PGE2處理的HSPC提供了競爭性的優(yōu)勢。用PG&離體處理骨髓干細胞增強了小鼠中的總干細胞植入，導(dǎo)致干細胞存活增強、歸巢效率提高并增加干細胞的自我更新。采用有限稀釋競爭性移植模型證明dmPGE2誘導(dǎo)的HSPC頻率提高，所述模型在同一動物中進行的直接頭對頭 (head-to-head)分析中比較了對照和dmPG&處理的細胞的植入。例如，未處理的造血移植物或純化的造血干細胞群(例如，小鼠中的SKL細胞或人中的CD34+細胞)與每Iml培養(yǎng)基(例如IMDM)中濃度為0. 001-10 μ M PGE2/1-10百萬細胞的真正(authentic) PGE2或其更穩(wěn)定的類似物16，16- 二甲基PGE2(或任何其它的活性PGE類似物)在冰上孵育1_6小時。孵育之后，用無菌鹽水洗3遍，靜脈內(nèi)施用于接受者?；谟肞oisson統(tǒng)計學(xué)計算HSPC 頻率和分析競爭性群體恢復(fù)單位(CRU)，該過程證明了 PGE2脈沖處理的HSPC具有 4倍的競爭優(yōu)勢。采用1/4數(shù)量的PG&處理的細胞相對對照細胞的頻率分析證明了等同的重建 (reconstitution)。此外，使用對照或PGE2處理的細胞在二級移植接受者中觀察到了完全的造血重建，表明PGE2對HSPC的自我更新沒有不良影響。事實上，觀察到了 LTRC活性增加的趨勢，因為在系列移植之前沒有對細胞或動物進行額外的處理，所以表明短期PGE2暴露對一級移植中觀察到的HSPC的增強作用是長期的。經(jīng)PGE2處理細胞的植入增強在觀周中保持穩(wěn)定。移植后90天在二級植入動物中的分析顯示出完全的多譜系重建和持續(xù)的高 HSPC頻率，表明短期PGE2處理對長期恢復(fù)群體的HSPC的穩(wěn)定作用。增強的植入可源自HSPC頻率、歸巢、存活和/或增殖的變化。North等提出，PGE2 不影響HSPC歸巢；但他們的研究并沒有特別地評估HSPC。出人意料地，在本文中PGE2誘導(dǎo)的HSPC頻率的提高在超過20周的時間段內(nèi)保持穩(wěn)定，并在二級移植中維持。在競爭性移植模型中的直接比較顯示，HSPC短期暴露于PG&產(chǎn)生 4倍的競爭性優(yōu)勢。盡管在對照和PGE2處理的細胞之間總移植細胞的歸巢效率沒有差異，但觀察到經(jīng)PGE2處理的分選出的 SKL細胞的歸巢效率提高，有力地表明PGE2對HSPC歸巢具有直接的作用。這些結(jié)果提示PGE2對HSPC或HSPC長期群體恢復(fù)能力的更強的作用，而非如以前研究所提出的僅僅是短期作用。為了說明而提供的并且不限于此的一種可能性是PGE2對HSPC功能的影響可能通過參與HSPC歸巢和自我更新的α -趨化因子受體CXCR4趨化因子受體的上調(diào)以及調(diào)節(jié) HSPC存活和增殖的凋亡蛋白存活素(Survivin)的抑制劑來介導(dǎo)。流式細胞術(shù)和QRT-PCR顯示，在ka-1+，c_kit+，Lineage—(SKL)小鼠骨髓細胞和 CD;34+人臍帶血細胞(human cord blood cell，UCB)上,所有 4 種 PGE2 受體(EP1-EP4)都表達，沒有顯著的受體亞型表達的差異。在分析與HSPC功能相關(guān)的幾種功能性特征時，觀察到在PGE2暴露后SKL細胞(26. 8% )和CD34+ UCB細胞(17. 3% ) ± CXCR4表達顯著增加， 并且在暴露后6小時，CXCR4mRNA顯著上調(diào)。增加的CXCR4與經(jīng)PGE2處理的移植物的體內(nèi)骨髓歸巢活性的 2倍增加相一致，并且在未處理的骨髓(P < 0. 001，3次實驗，η = 6只小鼠/組/實驗，獨立檢測)和在相同動物的頭對頭式競爭的純化SKL細胞中(ρ<0.001，3 次實驗，η = 5只小鼠/組/實驗，獨立檢測)都觀察到，表明了 PGE2對HSPC的直接作用。 通過用選擇性CXCR4拮抗劑AMD3100進行處理，歸巢效率的增加顯著地降低。PGE2處理增加SKL細胞的CXCR4mRNA及表面表達。此外，C)(CR4拮抗劑AMD3100顯著降低PGE2對歸巢的增強作用，表明，盡管不能排除對粘附分子表達和功能的額外作用，但增強的CXCR4表達和對骨髓SDF-I的趨化性在很大程度上導(dǎo)致了歸巢增強。本文公開的一個方面是用PGE2處理接受者在體內(nèi)增強了移植進接受者的干細胞的存活。在移植時和之后每天向接受者胃腸外施用PGE2或其活性類似物來增強干細胞，可增加移植HSPC的存活。例如，PG&或其活性類似物可在臨接受造血移植物之前和之后每天以0. 0001-10 μ M的量施用于患者。PGE2體外處理在處理后M小時內(nèi)導(dǎo)致細胞周期中活躍的SKL細胞比例的增加。此外，與僅用載劑(vehicle)脈沖處理的移植細胞相比，在BrdU處理的接受者小鼠中經(jīng)PGE2 處理細胞的移植顯示多于 2倍的供體SKL細胞處于細胞周期中的S+G2/M期。存活素被認(rèn)為是HSPC進入細胞周期和前進所必需的，而存活素在條件敲除小鼠中的缺失表明其是HSPC的維持所必須的。本文報道的研究發(fā)現(xiàn)在經(jīng)PGE2處理的SKL細胞中，存活素mRNA和蛋白水平升高，并伴有活性胱天蛋白酶-3 (caspase-3)( 一種介導(dǎo)凋亡的蛋白酶)的降低。存活分析表明，在體外PG&劑量依賴性地降低SKL細胞的凋亡，與存活素蛋白表達的1. 7倍增加和活性胱天蛋白酶-3的減少(減少23-59% ；暴露后M-72小時) 相一致。由存活素介導(dǎo)的HSPC存活的增強很可能對增強植入有貢獻。脈沖暴露于PGE2將細胞周期中HSPC的比例增加了 2倍，同時HSPC頻率、CRU和BrdU+SKL細胞歸巢增加，并且在一級和二級移植中維持增加的HSPC的頻率。對這些結(jié)果的一個非限制性的解釋是PGE2 的脈沖式暴露可引發(fā)單一輪次的HSPC自我更新。例如，EP2和EP4受體活化與糖原合酶激酶-3 (glycogen synthase kinase-3，GSK-3)的磷酸化以及 β-聯(lián)蛋白(β-catenin)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增強有關(guān)(Hull等，2004 ；Regan, 2003)，其為Wnt通路的下游，已顯示涉及HSPC存活和自我更新(Fleming等，2008 ；Khan和Bendal 1，2006)?？赡芡ㄟ^EP4但不排他的限于EP4 的PG&信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能直接增加β-聯(lián)蛋白。已有人提出GSK-3和Wnt通路之間存在協(xié)同的交互對話(cross-talk) (Wang 等，2004)。存活素也促進HSPC處于細胞周期中，其是通過p21WAFVGDKN1實現(xiàn)的(Fukuda等， 2004)，其已知涉及HSPC功能(Cheng等，2000)，并阻斷胱天蛋白酶-3活性(Li等，1998 ； Tamm等，1998)。最近有報道稱p21參與HSPC的自我更新(Janzen等，2008)。本文所報道研究中的一個發(fā)現(xiàn)是PGE2上調(diào)存活素并降低胱天蛋白酶_3，表明存活素通路可能參與 PG&對自我更新增加的作用。有趣的是，注意到存活素(Peng等，2006)和CXCR4 (Staller 等，2003 Jagzag等，200 的轉(zhuǎn)錄被轉(zhuǎn)錄因子低氧誘導(dǎo)因子-a (hypoxia-inducible factor-lalpha, HIF-I α )所上調(diào)，其可被 PG& 所穩(wěn)定(Liu 等，2002 ；Piccoli 等，2007)，有可能將某些一些PGE2應(yīng)答性通路與HSPC的細胞存活、歸巢和增殖/自我更新相關(guān)聯(lián)。這些研究表明，在PGE2處理后觀察到的HSPC頻率 4倍的增加來自于 2倍或更多的HSPC歸巢到接受者骨髓，以及增加 2倍的HSPC經(jīng)歷自我更新。這些結(jié)果可以幫助定義PGE2增強HSPC功能的新作用機制，并且其表明出人意料的協(xié)助造血移植的治療方法， 尤其是針對細胞數(shù)有限導(dǎo)致植入潛力差的造血移植物。本文公開的一個方面是增強干細胞基因治療中病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法。離體理干細胞增加這類細胞的自我更新分裂和存活，這是成功進行病毒載體介導(dǎo)的基因整合的重要因素。PGE2促進的干細胞自我更新分裂/存活可合并到現(xiàn)有干細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)方案中，從而增加干細胞治療中的總體基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。本文報道的是使用PG&來增強HSPC植入的一些方法，其為包括下列的多步驟過程供體細胞的動員、HSPC的維持和HSPC在接受者體內(nèi)的歸巢。在一些條件下，這些方法導(dǎo)致HSPC頻率增加4倍，植入可能例如源自以下的累加作用在PGE2直接的影響下HSPC歸巢增加2倍和HSPC細胞周期活性增加2倍。盡管確切的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚未確定，但是對該作用的一個非限制性解釋是植入的增強是由于例如C)(CR4和存活素的因子上調(diào)所導(dǎo)致的。PG&提高HSPC歸巢和存活和/或增殖的能力可具有臨床上的意義，尤其是在HSPC 數(shù)量有限(例如UCB和一些動員的PB產(chǎn)物)或者用于干細胞基因治療中病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的情況下。我們的有限稀釋移植研究顯示，與未經(jīng)此處理的對照細胞相比，用1/4數(shù)目的經(jīng)
理的細胞能達到等同的植入結(jié)果。這些結(jié)果證明，在HSPC數(shù)目有限的情況下使用？6氏的功效?？瓷先ト克姆NEP受體亞型都在HSPC上表達，并不清楚這些受體中那種(或它們的全部)參與植入功能。與這些結(jié)果相一致的是，增強的植入/恢復(fù)可通過體內(nèi)施用？6氏而實現(xiàn)，或者如果PGE2體內(nèi)施用，可進一步地有助于離體暴露于PGE2的HSPC的植入。材料和方法材料小鼠C57B1/6 小鼠購自 Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME，USA)。B6. SJL-PtrcAPep3B/BoyJ(BOYJ)和F1C57B1/6/B0YJ為內(nèi)部培育的雜合體。所有的動物均采用微隔離籠飼養(yǎng)，并可連續(xù)攝食和飲用酸化水。移植研究用的小鼠在接受放射性輻照時并在移植后30天中接受飼喂多西環(huán)素(doxycycline)。印第安那大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物管理及使用委員會批準(zhǔn)了全部的動物實驗方案。流式細胞術(shù)除另有說明，所有的抗體均購自BD Biosciences。為檢測和分選小鼠KL和SKL細胞，使用與PE-Cy7綴合的鏈霉親和素(用于對生物素標(biāo)記的MACS譜系抗體(Miltenyi Biotech, Auburn, CA)染色)、c-kit-APC、Sea-1-PE 或 APC_Cy7、CD45. I-PE 和CD45. 2-FITC。使用抗人⑶34-APC檢測UCB⑶34+細胞。對于多譜系分析，使用 APC-Cy7-Mac-l、PE-Cy7-B_220 和 APC-CD3。用抗 EP1、EP2、EP3 和 EP4 的兔 IgG(Cayman Chemicals)和 FITC-山羊-抗兔 IgG (Southern Biotech, Birmingham, AL)第二染色來檢測 EP 受體。使用鏈霉親和素-PECy7、c-kit-APC、Sca-l-APC-Cy7 和 CXCR4-PE 分析 CXCR4 的表達。用FITC-膜聯(lián)蛋白-V檢測凋亡。對于存活素和活性胱天蛋白酶-3的檢測，用CytoFix/ CytoPerm試劑盒(BD)透化并固定細胞，用抗活性胱天蛋白酶-3-FITC的流式細胞術(shù)試劑盒 (BD)或存活素-PE (R&D Systems)染色。對于細胞周期分析，用7AAD或FITC-BrdU流式細胞術(shù)試劑盒(BD)對細胞染色。 所有的分析都在LSRII上進行，用FACSA ria或FACSV antage分選儀(BD)進行分選。用 Cell Quest Pro和uiva軟件(BD)進行數(shù)據(jù)獲取和分析。方法有限稀釋法競爭性和非競爭性移植用無菌無熱源PBS 中 1 μ M dmPGE2 (Cayman Chemical，Ann Arbor,MI)/IXlO6 細胞或0.01%乙醇在冰上處理WBM細胞(⑶45. 2)2小時。孵育后，將細胞洗兩遍并與2 X IO5同系⑶45. 1競爭劑骨髓細胞以0.075 1,0. 25 1、1 1和2. 5 1的比例混合并通過尾靜脈注射(每個稀釋度5只小鼠)移植進入經(jīng)致死量輻照過的⑶45. 1小鼠(1100-cGy，分劑量)。每個月用流式細胞術(shù)測定PB中的CD45. 1和CD45. 2細胞。對于頭對頭(head-to-head) 競爭性移植，用載劑或dmPGE2處理來自⑶45. 1小鼠和⑶45. 2小鼠的WBM，將其與來自 CD45. 1/⑶45. 2小鼠的2 X IO5個競爭劑骨髓細胞以0.075 1,0. 25 1、1 1和2.5 1 的比例相混合，并移植進入經(jīng)致死量輻照的⑶45. 1/⑶45. 2小鼠。每月檢測PB中⑶45. 1、 CD45. 2 和 CD45. 1/CD45. 2 細胞。使用 L-CALC 軟件(Stem Cell Technologies, Vancouver BC, Canada)通過Poisson統(tǒng)計法對HSPC頻率進行定量，嵌合的分布< 5%被認(rèn)為是陰性接受者。按照(Harrison，1980)的描述計算競爭性群體恢復(fù)單位(Competitive !^populating unit,CRU)。對于二級移植，在移植后第20周將來自之前1 1比例移植的Fl雜合小鼠的 2X IO6個WBM細胞以非競爭性方式注射進入經(jīng)致死量輻照的Fl雜合小鼠，每月評價PB嵌合和三譜系重建。HSPC 體內(nèi)歸巢至骨髓的分析用 CFSE (Molecular Probes, Eugene, OR)標(biāo)記 ⑶45.2WBM，清洗，用ΙμΜ dmPG&或載劑在冰上對其進行處理。處理后，清洗細胞，將 2X IO7個細胞移植進經(jīng)致死量輻照的⑶45. 2小鼠。16小時后，沖洗股骨和脛骨，用MACS 微珠(Miltenyi Biotech)去除小鼠骨髓的Lin+細胞組分，用生物素(譜系)、c_kit (K)和 Sca-I (S)特異性的與熒光團綴合的抗體進行染色，測定CFSE+WBM(非譜系去除)、KL和SKL 細胞的總數(shù)。對于同類系(congenic)歸巢研究，在冰上用1 μ M的dmPGE2、載劑或PBS處理Lin"⑶45. 1細胞。孵育后，清洗細胞，將2 X IO6個細胞移植進⑶45. 2小鼠。16小時后，收獲接受者的骨髓，譜系去除，染色以及測定供體CD45. ISKL細胞。對于使用分選的SKL細胞的競爭性頭對頭歸巢研究，對來自⑶45. 2和⑶45. 1小鼠的LirT細胞進行FACS分選，用dmPGE2 或載劑將細胞處理2小時，清洗，將3 X IO4個⑶45. 1 (載劑或dmPGE2處理的)加3 X IO4個 ⑶45. 2 (dmPGE2或載劑處理的)SKL細胞移植進經(jīng)致死量輻照的Fl雜合小鼠。為評價CXCR4 在歸巢研究中的作用，在冰上用載劑或ΙμΜ的ClmPGE2力卩10 μ M的AMD3100 (AnorMecHnc.， Vancouver, BC, Canada)處理Lin_CD45. 2細胞，將2 X IO6個處理過的細胞注射進經(jīng)致死量輻照的⑶45. 1小鼠。移植后16小時分析歸巢的SKL細胞。EP受體、CXCR4和存活素的表達針對SKL和每種EP受體對來自⑶45. 2小鼠的副本LirT細胞樣品進行染色，通過FACS測定KL和SKL細胞上的表面受體表達。對于人EP受體，經(jīng)過學(xué)術(shù)評審委員會的批準(zhǔn)，UCB獲自Wishard醫(yī)院，hdianapolis，IN。用 Ficol 1-Paque Plus (Amer sham Biosciences)分離單個核細胞(mononuclear cell),用 MACS 微珠(Miltenyi Biotech)選擇 CD34+細胞(Fukuda and Pelus，2001)。對副本細胞樣品進行⑶34和每種EP受體的染色，通過FACS檢測表面表達。為了評價CXCR4、存活素和活性胱天蛋白酶-3，用1 μ M dmPGE2或載劑將LirT細胞或⑶34+UCB細胞在冰上處理2小時， 清洗，然后在RPMI-1640+10%胎牛血清(FBQ中37°C下培養(yǎng)M小時。如上文所述對細胞進行SKL (小鼠細胞)和CXCR4、存活素和/或活性胱天蛋白酶-3的染色，并用FACS進行分析。細胞周期分析對于體外細胞周期分析，用1 μ M dmPGE2或載劑將LirT細胞處理2 小時，清洗，在含有 rmSCF(50ng/ml) (R&DSystems, Minneapolis, MN)、rhFlt_3 和 rhTPO(每種 100ng/ml) (Immunex，Seattle, WA)的 Stem Cell Pro 培養(yǎng)基(Stem Cell Technologies) 中培養(yǎng)。20小時后，對細胞進行SKL染色，固定并透化，用7AAD (BD Biosciences, San Jose, CA)染色。通過FACS法檢測DNA的含量從而測定處于S+G2/M期的SKL細胞比例。對于體內(nèi)細胞周期分析，對⑶45. 2小鼠進行致死量的輻照，并移植5 X IO6個來自⑶45. 1小鼠經(jīng) ΙμΜ dmPG&或載劑處理2小時的LirT細胞。移植時，接受者小鼠在飲用水中接受Img/ mLBrdU(Sigma Aldrich,St. Louis,MO)以及 lmg/小鼠的 BrdU LP。16 小時后，分離接受者的骨髓，譜系去除并對⑶45. 1、SKL和BrdU進行染色。采用FACS法檢測每只小鼠中BrdU+ 的歸巢(CD45. 1+) SKL細胞的比例。凋亡測定在冰上用0. InM到1 μ M的dmPGE2或載劑對照處理LirT細胞，清洗，在不含生長因子的RPMI-1640+2% FBS中37°C下孵育，誘導(dǎo)凋亡。M小時后，對細胞進行SKL 和膜聯(lián)蛋白-V染色，用FACS法檢測膜聯(lián)蛋白-V+的SKL細胞的比例。逆轉(zhuǎn)錄和QRT-PCR 使用絕對RNA純化試劑盒(Stratagene，La Jolla, CA)獲取總 RNA0 用隨機引物(Promega，Madison，WI)和 MMLV-逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)在含有 ImM dNTP 和 RNA酶抑制劑的50 μ L體積中逆轉(zhuǎn)錄恒定量的RNA，如所述(Fukuda和Pelus，2001)。加入無DNA酶與RNA酶的水(Ambion，Austin，TX)，獲得等于IOng RNA/ μ L的終濃度，將5 μ L用于QRT-PCR。為SYBR Green QRT-PCR設(shè)計引物，擴增子大小為75_150bp。在30 μ L總體積中進行QRT-PCR，其使用 Platinum SYBR Green qPCR supermix UDG with Rox (Invitrogen, Carlsbad, CA)，在 ABI-7000 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA)儀器中進行，活化步驟 50°C 2分鐘，95°C變性2分鐘，擴增45個循環(huán)，95°C -15秒、50°C -30秒、72°C -30秒，然后
13解離，以確保僅獲得單一產(chǎn)物?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的一些方面的非留體抗炎化合物包括但不僅限于例如下列的化合物塞來昔布(Celecoxib)甲基苯基)_3_ (三氟甲基)吡唑基]苯磺酰胺)，以商品名Celebrex: 出售；羅非昔布(Rofecoxib) (4-(4-甲磺?；交?_3_苯基-5H-呋喃-2-酮)，以商品名Vioxx 出售；阿司匹林O-乙酰氧基苯甲酸)；艾托考昔 (Etoricoxib) (5-氯-6'-甲基-3_[4_(甲磺?；?苯基]-2，3 ‘ _ 二吡啶)；伐地考昔 (Valdecoxib) 0-(5-甲基_3_苯基異P惡唑_4_基)苯磺酰胺)，以商品名Bextra 出售；布洛芬(Ibuprofen) ((&S)-2-(4-異丁基苯基)丙酸)；萘普生(Naproxen) ((+) - (S)-2-(6-甲氧基萘-2-基)丙酸)；雙氯芬酸(Diclofenac) (2_ (2，6_ 二氯苯基氨基)苯基)乙酸)， 以商品名Voltaren 出售；利克飛龍(Licofelone) ( -(4_氯苯基)_2，2_ 二甲基_7_苯基-2，3-二氫-IH-吡咯嗪-5-基]乙酸)；吲哚美辛(Indomethacin) (Z-(I_[ (4-氯苯基) 羰基]-5-甲氧基-2-甲基-Ι/f-吲哚_3_基}乙酸)；美洛昔康(melOXicam)((8￡)-8-[羥基-[(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)氨基]甲烯]-9-甲基-10，10- 二氧代-10 λ 6-硫雜-9-氮雜雙環(huán)[4. 4. 0]十碳-1，3，5-三烯-7-酮)，以商品名Metacam出售；依托度酸(Etodolac) (2-(1，8-二乙基-4，9-二氫-3//-吡喃[3,4-b]吲哚基)乙酸)；酮咯酸(ketorolac) ((士)-5-苯甲?；?2，3-二氫-IH-吡咯嗪-1-羧酸，2-氨基-2-(羥甲基)-1，3-丙二醇)， 以商品名Toradol出售。作為至少一種？6氏受體之拮抗劑的化合物包括但不僅限于可從Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, U. S. A.)或其它化學(xué)品供應(yīng)公司獲得的化合物。統(tǒng)計學(xué)分析所有的匯總的值都以平均值士SEM的形式表示。適當(dāng)?shù)夭捎梦④?Excel (Microsoft Corp, Seattle, WA)的成對或不成對、雙尾t檢驗函數(shù)來確定統(tǒng)計學(xué)差異。本文中，尤其是在一些圖中，術(shù)語‘dmPGE2’和‘dmPGE’可互換使用。
實施例1. PGE2增加長期群體恢復(fù)HSPC的頻率和植入使用有限稀釋競爭性移植模型，應(yīng)用移植入⑶45. 1/⑶45. 2雜合小鼠的⑶45. 2和 ⑶45. 1同類系移植物，證明HSPC短期暴露于PGE2產(chǎn)生長期的對HSPC和競爭性群體恢復(fù)單位(CRU)頻率的增強。接下來參照圖1A，用載劑或dmPG&分別處理來自⑶45. 1或⑶45. 2 小鼠的骨髓。CD45. 1/CD45.2雜合體骨髓細胞用作競爭劑。將有限稀釋物移植進經(jīng)致死量輻照(1100-cGy，分劑量(split dose))的CD45. 1/CD45. 2雜合小鼠，20周時分析PB中的嵌合情況。顯示了檢測每個細胞群的代表性流式細胞術(shù)圖(底部的圖)。接下來參照圖1B，通過Poisson統(tǒng)計學(xué)確定的12周時經(jīng)載劑(紅)或dmPGE2 (藍) 脈沖處理的細胞的頻率分析(上圖)；Po = 85，560 (載劑)和Po = 23，911 (經(jīng)dmPGE2處理)。顯示12周時的PB中嵌合和CRU分析(均值士SEM)。數(shù)據(jù)代表2個匯總的實驗，η = 5只小鼠/組/實驗，每個均獨立檢測。接下來參照圖1C，20周的時間段里在經(jīng)載劑或dmPGE2處理的骨髓的接受者中的 HSPC頻率分析。變化倍數(shù)表明，與載劑相比，dmPG&脈沖處理的細胞的植入頻率增加。接下來參照圖1D，代表性的多譜系重建(髓細胞、B和T淋巴細胞)的FACS圖。 接下來參照圖ID的中間圖，一級移植(32周，左圖)和接受來自20周時一級移植小鼠之移植物的一組4只小鼠的12周后分析(右圖)。一級移植20周時(二級移植的時間)和二級移植后12周(下圖)，與載劑相比理的細胞顯示出嵌合增加。20周一級移植的數(shù)據(jù)來自兩個匯總的實驗，η = 5只小鼠/組/實驗，每個均獨立檢測。12周二級移植的數(shù)據(jù)，η = 4只小鼠/組，每個均獨立檢測。仍然參照圖1D，系列移植評估了移植的造血移植物中HSPC的自我更新和擴增。為了研究離體暴露于dmPG&和載劑的長期群體恢復(fù)細胞(long-term repopulating cell, LTRC)的擴增，在移植后20周時從一級移植動物收獲骨髓，并移植入二級接受者中。二級移植后12周的PB分析顯示來自所有移植小鼠的細胞出現(xiàn)多譜系重建，標(biāo)志著一級移植的 LTRC的自我更新。在一級供體中觀察到的由暴露于dmPGE2引起的嵌合的增加也在未經(jīng)任何額外處理的二級移植中見到。此外，在二級移植中也觀察到以前經(jīng)dmPGE2處理過的HSPC 的競爭性增加的趨勢，在二級移植中對髓細胞譜系的重建有輕微的偏好。這一模型允許在同一動物中定量比較來自對照和dmPGE2處理組的HSPC植入和競爭性(圖1A)，以及宿主細胞的內(nèi)源群體恢復(fù)。在移植后12周，對外周血(peripheral blood,PB)的分析顯示，與載劑處理的細胞相比，經(jīng)dmPGE2處理的細胞的嵌合增加，HSPC頻率和競爭性群體恢復(fù)單位(CRU)增加 4倍，其為公認(rèn)的對長期群體恢復(fù)能力的量度(圖 1B)。在整個20周的移植后隨訪過程中，保持了 4倍的HSPC頻率增加，表明dmPGE2脈沖暴露的作用是穩(wěn)定的(圖1C)。在移植后32周，觀察到PB中B淋巴細胞和T淋巴細胞以及髓細胞譜系的重建，在未處理競爭劑細胞、經(jīng)dmPGE2或載劑處理的細胞之間沒有可分辨的差異(圖 1D)。2.小鼠和人造血干和祖細胞(hematopoietic stem and progenitor, HSPC) 表達PG&受體據(jù)報道，PGE2與4種特異性的高度保守的G蛋白偶聯(lián)受體EP1-EP4相互作用 (Sugimoto和Narumiya，2007 ；Tsuboi等，2002)。EP受體的全部功能解釋了 PGE2所引起的多種有時是相反的應(yīng)答(Breyer等，2001)。PG&受體亞型在HSPC上的表達以前是未知的?，F(xiàn)在參照圖 2A，富含造血祖細胞(hematopoietic progenitor cell，HPC)的 c_kit+ LirT(KL) 細胞和富含HSPCWka-l+ c-kit+ LirT(SKL)細胞上EP受體的分析顯示，所有4種EP受體(EP3+、EP2、EP1和EP4)都表達。此外，現(xiàn)在參照圖2A(右圖)，QRT-PCR在FACS法分選的KL和SKL細胞中檢測到全部4種EP受體的mRNA。接下來參照圖2A (中圖)，EP3解離曲線顯示多個峰，與已知的EP3多剪接變體相一致(Namba等，1993)。對于KL或SKL細胞， 觀察到任何EP受體亞型之間的表面表達或mRNA水平?jīng)]有顯著的定量差異。接下來參照圖 2B (右圖)，與小鼠細胞類似，全部四種受體亞型都在人⑶34+UCB細胞表面表達，QRT-PCR分析檢測到全部四種EP受體的mRNA(圖2B)。3.短期PGE2暴露增加HSPC的歸巢效率脈沖式暴露于PGE2后所觀察到的HSPC植入的增強可能是來自增加的HSPC數(shù)和 /或細胞周期狀態(tài)有利于細胞的作用或者對宿主骨髓中HSPC歸巢或增殖的作用。不論其原因，骨髓小生境(niche)是HSPC自我更新和分化所必需的，很可能只有那些歸巢進入這些小生境的HSPC才可提供長期群體恢復(fù)。接下來參照圖3A，為評估HSPC歸巢，在冰上用 ClmPGE2或載劑將CFSE標(biāo)記的全骨髓(whole bone marrow，WBM) CD45. 2細胞脈沖式處理2 小時，清洗，靜脈內(nèi)(IV)注射進經(jīng)致死量輻照的CD45. 2宿主中。16小時后，對歸巢到骨髓的總CFSE+細胞以及KL和SKL細胞群中歸巢事件數(shù)進行定量。當(dāng)評價總WBM細胞時，在dmPG&和載劑處理的細胞之間沒有觀察到歸巢到骨髓的CFSE+細胞百分比的差異；但是，與對照相比，顯著更多的SKL細胞歸巢到骨髓。接下來參照圖:3B，在同類系模型中，與載劑處理的或未處置的細胞相比，對于dmPGE2處理的細胞也觀察到顯著更高的SKL細胞百分比。 在未處理和載劑處理的細胞之間，未見到歸巢效率的顯著差異。下面參照圖3C，為了確定dmPGE2對SKL細胞歸巢的增強作用是直接的還是間接的，將頭對頭式移植模型中富集的HSPC歸巢與其它細胞進行比較。通過FACS分選從CD45. 2 和⑶45. 1小鼠中分離高度純化的SKL細胞，用dmPGE2或載劑進行處理，將3 X IO4個載劑處理的⑶45. 1細胞加3X IO4個dmPGE2處理的⑶45. 2細胞移植進⑶45. 1/CD45. 2小鼠。用同類系品系同時移植另外一組入同種品系，交換處理組以檢測品系歸巢的任何偏好。與使用WBM的研究相似，純化SKL細胞的dmPGE2脈沖暴露將其歸巢效率增加了 2倍，有力地表明 PGE2對HSPC的直接作用。盡管SKL細胞不是均質(zhì)的HSPC細胞群，但是高度富含LTRC (Okada 等，1992 ；Spangrude 和 Scollay，1990)。4. PGE2增加HSPC的CXCR4，而CXCR4拮抗劑AMD3100阻斷歸巢的增強下面參照圖4A，基質(zhì)細胞衍生因子-1α (stromal-cell-derived factor lalpha, SDF-I α )/CXCR4軸參與HSPC的運輸(trafficking)和歸巢。本研究評價了經(jīng)dmPGE2處理的HSPC歸巢的提高是否是SDF-I α /CXCR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增加的結(jié)果。在KL和SKL細胞上， Lin—細胞脈沖暴露于dmPGE2增加了 CXCR4的表達(圖4Α)；類似地，dmPGE2脈沖暴露如預(yù)期地增加了 OTM+UCB細胞上CXCR4的表達。QRT-PCR證明，與載劑相比，dmPGE2處理的細胞中CXCR4mRNA水平提高，在第6小時觀察到最大提高(未顯示數(shù)據(jù))?，F(xiàn)在參照圖4B，為了確定上調(diào)的CXCR4是否在PGE2處理后所觀察到的歸巢增強中發(fā)揮作用，使用了選擇性CXCR4拮抗劑AMD3100，其體外抑制向SDF-I的遷移以及體內(nèi)抑制 HSPC歸巢。PGE2脈沖暴露將SKL細胞的歸巢增加了 2倍，而經(jīng)載劑或dmPGE2脈沖處理的細胞與AMD3100 —起孵育降低了 SKL細胞的歸巢，并消除了經(jīng)dmPGE2脈沖處理的細胞的歸巢效率提高。5. PGE2減少HSPC的凋亡，與存活素增加相一致PGE2的處理導(dǎo)致HSPC頻率和CRU增加 4倍(圖1)，但歸巢僅增強 2倍(圖 3)，表明其它事件參與植入的增強。在正常和惡性血細胞生成中，凋亡是重要的調(diào)節(jié)過程， 而PGE2牽涉抗凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，EP受體的下游信號分子cAMP的活化抑制CD34+細胞的凋亡。一種與這些結(jié)果一致的假說是dmPGE2處理影響HSPC的存活和/或增殖，其導(dǎo)致了植入增強。為評價dmPGE2對HSPC存活的作用，用0. InM-I μ M的dmPGE2或載劑脈沖處理LirT細胞，在減少血清的無生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在SKL細胞中，脈沖暴露于dmPGE2 劑量依賴性地減小凋亡(圖5A)，1 μ M時達到 65%的抑制。在正常和惡性造血細胞中，凋亡蛋白存活素的抑制劑是凋亡和增殖的重要調(diào)節(jié)子?，F(xiàn)在參照圖5Β，這些結(jié)果證明，在HSPC中PG&對存活素有影響。在dmPG&脈沖處理后第對小時，小鼠SKL細胞和CD34+UCB細胞中，細胞內(nèi)的存活素水平顯著高于(分別為1.7 和2. 4倍)對照，QRT-PCR分析顯示存活素mRNA與對照相比升高?，F(xiàn)在參照圖5C，相對于對照，降低的活性胱天蛋白酶-3與SKL細胞暴露于dmPGE2 后M、48和72小時所見的存活素增加相一致。6. PGE2處理增加HSPC增殖
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存活素調(diào)節(jié)HSPC進入細胞周期并在細胞周期中前進。另外，參與HSPC增殖和自我更新的聯(lián)蛋白位于EP受體通路的下游。？6氏調(diào)節(jié)這些細胞周期調(diào)節(jié)蛋白的能力提示HSPC自我更新和增殖的增加可能導(dǎo)致(1!^6氏脈沖處理的細胞的植入增強。為驗證這一假說，分析了經(jīng)dmPGE2或載劑體外脈沖處理的SKL細胞的細胞周期狀態(tài)。現(xiàn)在參照圖6Α， 脈沖暴露于dmPGE2增加SKL細胞中DNA含量，標(biāo)志著細胞周期中細胞增加(左圖、右上象限)。在3個實驗中，與對照相比，經(jīng)dmPGE2處理后，超過60%的SKL細胞處于細胞周期的 S+G2/M期(圖6Α右圖)。對KL或LirT細胞的細胞周期比未見顯著性作用(未顯示數(shù)據(jù))； 提示dmPGE2選擇性增加處于細胞周期中狀態(tài)的早期HSPC。為驗證體外觀察到的dmPGE2對HSPC細胞周期增強的作用，用dmPGE2脈沖處理骨髓細胞并注射進移植后用BrdU處理的同類系小鼠，16小時后測定供體BrdU+SKL細胞的比例?，F(xiàn)在參照圖6B，對于移植前經(jīng)dmPGE2脈沖處理的細胞，觀察到了 S+G2/M期的歸巢SKL 細胞比例增加 2倍，證實HSPC短期暴露于dmPGE2在體內(nèi)刺激HSPC進入細胞周期并在周期中前進。7.雙重C0X1/C0X2抑制劑吲哚美辛對內(nèi)源性PGE2生物合成的抑制動員HSPC因為PGE2增加CXCR4受體表達并且SDF-1/CXCR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對于HSPC的運輸和在骨髓中的存留十分重要。因此，與這些結(jié)果相一致的一個假說是雙重C0X1/C0X2抑制劑吲哚美辛對內(nèi)源性PGE2生物合成的抑制也會動員HSPC。參照圖7A和7B，顯示了每天單獨皮下6015(^8/1^吲哚美辛或150叫/1^黃岑苷元(圖7A)或與G-CSF聯(lián)用(圖7B)4天對CFU-GM動員的作用?，F(xiàn)在參照圖7A，每天一次共4天皮下施用150 μ g/kg吲哚美辛使得動員的祖細胞數(shù)增加4倍?，F(xiàn)在參照圖7B，吲哚美辛與G-CSF共施用產(chǎn)生高度協(xié)同性的外周血干細胞動員增加。脂加氧酶抑制劑黃岑苷元(baicalein)對基線或G-CSF誘導(dǎo)的 CFU-GM動員沒有作用，提示觀察到的作用是對環(huán)加氧酶通路抑制特異性的。數(shù)據(jù)表示為動員的CFU-GM/ml血的均值士SEM，N = 3只小鼠，各自獨立檢測。 8.小鼠和人HSPC脈沖暴露于PGE2增加CXCR4表達。為評價CXCR4，在冰上用1 μ M dmPGE2或載劑對照處理譜系_的小鼠骨髓細胞或 ⑶34+UCB細胞2小時，清洗，在RPMI-1640/10%熱失活胎牛血清(HI-FBQ培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng)M小時，對SKL(小鼠細胞)或⑶34(人)和CXCR4進行染色并通過FACS進行分析。 現(xiàn)在參照圖4A，dmPGE2處理M小時后CXCR4在鼠KL和SKL細胞和人類⑶34+UCB細胞上的表達。數(shù)據(jù)以dmPGE2或溶劑(n = 3)處理所引起的CXCR4平均熒光強度(MFI)的變化的均值士 SEM的形式表示。QRT-PCR分析證明CXCR4的mRNA增加2. 65倍。9.小鼠SKL細胞脈沖暴露于PGE2增加SDF-1 α的遷移。用ClmPGE2或載劑脈沖處理新分離的譜系_小鼠骨髓細胞2小時，清洗，重懸于10% HI-FCS中，并在37°C下培養(yǎng)16小時。孵育后，清洗細胞，重懸于RPMI/0. 5% BSA，使其在侵襲小室(transwell)中向rmSDF-la遷移4小時。通過流式細胞術(shù)檢測總細胞遷移?，F(xiàn)在參照圖9，對于用dmPGE2脈沖處理的細胞，總SKL細胞遷移顯著較高。數(shù)據(jù)是3次實驗的遷移百分比的均值士SEM。與載劑處理的細胞相比，dmPGE2處理的細胞的忭< 0. 05。10.人⑶34+細胞脈沖暴露于PGE2增加向SDF-I α的遷移。用dmPG&或載劑脈沖處理新分離的UCB⑶34+細胞2小時，清洗，重懸于10 % HI-FCS，在37°C下培養(yǎng)16小時。孵育后，清洗細胞，重懸于RPMI/0. 5% BSA中，通過流式細胞術(shù)測定向rhSDF-Ι的遷移。為阻斷CXCR4受體，在遷移測定之前，將副本細胞與5yg/ml 的AMD3100 —起孵育30分鐘?，F(xiàn)在參照圖10，數(shù)據(jù)為3次實驗的遷移百分比的均值士SEM。11.阻斷CXCR4受體阻斷了 PGE2對SKL細胞歸巢的增強為評價CXCR4在歸巢中的作用，將譜系TD45. 2細胞與載劑或1 μ M的dmPGE2加 10 μ M AMD3100共同孵育，將2X IO6個經(jīng)處理的細胞注射進經(jīng)致死量輻照過的⑶45. 1小鼠，移植后16小時，回收歸巢的SKL細胞并用FACS分析?，F(xiàn)在參照圖11，在10 μ M AMD3100 不存在和存在時，經(jīng)載劑和dmPGE2處理的細胞歸巢到骨髓的效率。在歸巢測定之前，將細胞與AMD3100 —起孵育30分鐘。12. PGE2在體外增加鼠SKL細胞的細胞周期比率用載劑或1 μ M dmPGE2處理譜系^細胞2小時，清洗，在含rmSCF、rhFlt3和rhTpo 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。20小時后，對細胞進行SKL和Hoechst-33342和派洛寧-Y(Pyronin-Y) 染色。通過FACS檢測處于細胞周期中的SKL細胞的比例?，F(xiàn)在參照圖12，顯示門控SKL細胞之細胞周期分布的代表性流式細胞術(shù)圖以及來自三次實驗的經(jīng)dmPGE2處理的細胞與載劑對照相比細胞周期中細胞增加倍數(shù)的綜合數(shù)據(jù)，平均值士 SEM，n = 9只小鼠，各自獨立檢測。通過FACS檢測處于細胞周期中的SKL細胞的比例。顯示門控SKL細胞之細胞周期分布的代表性流式細胞術(shù)圖以及來自三次實驗的經(jīng)dmPGE2處理的細胞與載劑對照相比細胞周期中細胞增加倍數(shù)的綜合數(shù)據(jù)，平均值士SEM，η = 9只小鼠，各自獨立檢測。13.在體外，PGE2增加高度純化的CD150+48_ (SLAM) SKL細胞的細胞周期比率?，F(xiàn)在參照圖8，表中總結(jié)了使用LirT骨髓細胞收集的數(shù)據(jù)，所述細胞經(jīng)ΙμΜ dmPGE2或載劑處理2小時并在生長因子存在(50ng/ml rmSCF，各100ng/ml的rhFlt-3和 rhTPO)的情況下培養(yǎng)20小時，針對SLAM SKL、Hoechst-33342和Pyronin-Y進行染色，通過FACS對DNA和RNA的含量進行定量來測定處于Go、Gi、S和&/M期的SLAM SKL細胞的比例。數(shù)據(jù)是均值士SEM，n = 9只小鼠，各自獨立檢測。(b)Gi+S+G2/M期的細胞百分比；η = 9只小鼠的綜合數(shù)據(jù)。W與載劑對照相比P < 0. 05。14.脈沖式暴露于PGE2在體內(nèi)增加歸巢SKL細胞的增殖和細胞周期比率。用dmPG&或載劑處理⑶45. 1譜系-骨髓細胞，并移植進經(jīng)致死量輻照過的⑶45. 2 小鼠。移植后立即在飲水中提供并通過腹膜內(nèi)(IP)注射施用BrdU。16小時后，分析骨髓， 通過FACS分析BrdU+的⑶45. I+SKL細胞的比例。現(xiàn)在參照圖13，用dmPGE2或載劑處理 CD45. 1譜系_骨髓細胞，并移植進經(jīng)致死量輻照的CD45.2小鼠。移植后立即在飲水中提供并通過IP注射施用BrdU。16小時后，分析骨髓，以及通過FACS分析BrdU+的⑶45. I+SKL 細胞的比例。較高比例的經(jīng)dmPGE2處理的SKL歸巢到骨髓。數(shù)據(jù)為均值士SEM，η = 5只小鼠，各自獨立檢測。15. PGE2脈沖式暴露后干細胞的長期群體恢復(fù)活性維持對于頭對頭式的競爭性分析中，用載劑或dmPGE2處理來自⑶45. 1和⑶45. 2小鼠的WBM，并以多種比例與2 X IO5個來自⑶45. 1/⑶45. 2小鼠的競爭劑骨髓細胞混合并移植進經(jīng)致死量輻照的⑶45. 1/CD45. 2小鼠。每月檢測外周血中CD45. 1、⑶45. 2和⑶45. 1/ ⑶45. 2細胞的比例。對于二級、三級和四級移植，將來自之前以1 1比例移植的⑶45. 1/ ⑶45. 2小鼠的2X IO6個WBM以非競爭性方式注射進經(jīng)致死量輻照的⑶45. 1/⑶45. 2小鼠。 每月檢測外周血中⑶45. UCD45. 2和⑶45. 1/CD45. 2細胞的比例?，F(xiàn)在參照圖14，對于一級移植在第20周(二級移植的時間)以及在一個亞組中第32周(二級移植的12周分析的時間)，對于二級移植在第12周和第M周，以及類似地對于三級和四級移植在各自在第 12周，顯示出與載劑相比經(jīng)dmPG&處理的細胞的嵌合增加。20周一級移植的數(shù)據(jù)來自2 個匯總的實驗，η = 5只小鼠/組/實驗，各自獨立檢測。二級、三級和四級移植的數(shù)據(jù)，η =5只小鼠/組，各自獨立檢測。16.針對吲哚美辛和G-CSF的外周血干細胞(peripheral blood stem cell, PBSC)的動員方案每48小時共4天向小鼠皮下(SC)給予明膠中的150 μ g/kg吲哚美辛或150 μ g/ kg黃岑苷元(脂加氧酶抑制劑)，同時給以或不給以G-CSF。按照以前的描述測定CFU-GM 動員(Pelus 等，Experimental Hematology 33(2005)295-307)?，F(xiàn)在參照圖 7A 和 7B，雙重環(huán)加氧酶抑制劑吲哚美辛和G-CSF的組合協(xié)同動員小鼠HSPC。每天單獨皮下(SC)施用 150 μ g/kg吲哚美辛或150ug/kg黃岑苷元(脂加氧酶抑制劑)(圖7A)或者與G-CSF —起施用(圖7B) 4天對CFU-GM動員的作用。數(shù)據(jù)表示為均值士 SEM動員的CFU_GM/ml血，N = 3只小鼠，各自獨立檢測。現(xiàn)在參照圖16，小鼠每天兩次皮下注射G-CSF (每只小鼠1 μ g)或G-CSF+吲哚美辛(每只小鼠 50μ g)4 天。按照(Pelus 等，Experimental Hematology 33(2005)295-307) 的描述測定CFU-GM的動員。聯(lián)用處理的小鼠顯示CFU-GM/單位血的增加倍數(shù)大于僅用 G-CSF處理的動物。通過FACS分析用上述方案動員的來自小鼠外周血的低密度單個核細胞。對于SKL 和 SLAM-SKL 細胞的檢測，用 Sca-1-PE-Cy7、c-kit-APC、CD150_PECy5、CD48-FITC、Lineage Cocktai I-Biotin染色，并用鏈霉親和素-APC-Cy7進行第二染色?，F(xiàn)在參照圖17，在BD-LSR II上進行分析。經(jīng)G-CSF或者G-CSF和吲哚美辛組合處理的小鼠外周血中表型限定的HSPC 的流式細胞術(shù)分析。N = 5只小鼠/組，各自獨立檢測。17.吲哚美辛加AMD3100聯(lián)合動員HSPC。在4天里對小鼠通過每天兩次皮下注射施用載劑或吲哚美辛(50 μ g/小鼠)。第五天對小鼠施用載劑或AMD3100 (5mg/kg)。1小時后，處死小鼠，按以前的描述檢測CFU-GM 動員(Pelus 等，Experimental Hematology 33(2005)295-307)。現(xiàn)在參照圖 18，載劑或吲哚美辛單獨處理導(dǎo)致的CFU-GM動員(左圖)。單次施用AMD3100或吲哚美辛處理+AMD3100 導(dǎo)致的CFU-GM動員(右圖)。數(shù)據(jù)表示為均值士 SEM，n = 5只小鼠/組，各自獨立檢測。18.吲哚美辛與多種動員方案聯(lián)用的動員效率的比較用載劑、吲哚美辛(50 μ g/只小鼠，每天兩次皮下施用，4天)、AMD3100(5mg/kg， 第5天)、G-CSF (1 μ g/只小鼠，每天兩次皮下施用，4天)、AMD3100+GR0 β (分別為5mg/kg 和20mg/kg,第5天)、AMD3 100+吲哚美辛(吲哚美辛50 μ g/小鼠，每天兩次皮下施用， 4天；AMD3100，5mg/kg，第5天)或G-CSF+吲哚美辛(分別為Iyg和50 μ g，每天兩次皮下施用，4天)。按以前的描述檢測CFU-GM的動員(Pelus等，Experimental Hematology 33(2005)295-307)?，F(xiàn)在參照圖19，針對如上所述的多種處理方案繪制的CFU_GM/ml外周血。用載劑、G-CSF(1 U g/小鼠，每天兩次皮下施用，4天)、G-CSF+吲哚美辛(50 μ g/ 小鼠，每天兩次皮下施用，4天)或G-CSF+美洛昔康(0. 3mg/kg,每天兩次皮下施用，4 天)處理小鼠。按以前的描述檢測CFU-GM的動員(Pelus等，Experimental Hematology33 000幻四5-307)?，F(xiàn)在參照圖20，柱狀圖，其顯示了吲哚美辛+G-CSF以及類似作用的 NSAID美洛昔康+G-CSF誘導(dǎo)之動員的比較。數(shù)據(jù)表示為均值士SEM，n = 5只小鼠/組，各自獨立檢測。19. NSAID錯開給藥使得HSPC上CXCR4的表達恢復(fù)。用G-CSF(lyg/小鼠，每天兩次皮下施用，4天)或G-CSF+吲哚美辛(50yg/小鼠， 每天兩次皮下施用，4天)動員⑶45. 1小鼠，在第5天收集外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) PBMC以多種比例與CD45. 2骨髓混合，移植入致死量輻照過(llOOcGy，分劑量)的⑶45.2小鼠?，F(xiàn)在參照圖21，顯示移植后12周的競爭性群體恢復(fù)單位(左圖)。數(shù)據(jù)表示為來自兩次實驗的平均值士SEM，N= 5只小鼠/組/實驗， 各自獨立檢測。因為與單獨的G-CSF相比，吲哚美辛與G-CSF共同施用動員的PBMC的植入沒有改善，所以猜想歸巢的缺陷可能是CXCR4受體表達降低的結(jié)果，這可通過錯開吲哚美辛和G-CSF的處理而減輕。用G-CSF(1 μ g/小鼠，每天兩次皮下施用，4天)、G-CSF+吲哚美辛不錯開(50yg/小鼠，每天兩次皮下施用，4天)、G-CSF+吲哚美辛錯開1天(吲哚美辛先開始并且施用4天，在吲哚美辛處理的第二天開始施用G-CSF，施用4天，使得在收集 PBMC之前有一天只施用G-CSF而不施用吲哚美辛)或者G-CSF+吲哚美辛錯開2天(吲哚美辛先開始并且施用4天，在吲哚美辛處理的第三天開始施用G-CSF，施用4天，使得在收集 PBMC之前有兩天只施用G-CSF而不施用吲哚美辛)?，F(xiàn)在參照圖21 (右圖)，顯示SKL細胞上CXCR4的表達。數(shù)據(jù)以均值士 SEM的形式表示，N= 5只小鼠/組，各自獨立檢測。20.與G-CSF單獨動員的PBMC相比，來自經(jīng)G-CSF加NSAID處理的小鼠的已動員 PBMC顯示顯著增強的長期干細胞功能。用G-CSF或G-CSF+吲哚美辛(錯開1天)動員CD45. 1小鼠，將PBMC與CD45. 2 競爭劑骨髓一起移植進經(jīng)致死量輻照的⑶45. 2小鼠?，F(xiàn)在參照圖22，顯示移植后12周多種供體競爭劑比例下的嵌合(左圖)和競爭性群體恢復(fù)單位(右圖)。數(shù)據(jù)以均值士SEM 的形式表示，N = 5只小鼠/組，各自獨立檢測。21.與G-CSF單獨動員的PBMC相比，當(dāng)移植入經(jīng)致死量輻照的小鼠時，來自經(jīng) G-CSF加NSAID動員的小鼠的PBMC更快地恢復(fù)外周血中性粒細胞計數(shù)。用G-CSF或G-CSF+美洛昔康(錯開1天)動員小鼠，將2 X IO6個PBMC移植進入經(jīng)致死量輻照的接受者。用Hemavet 950 FS(Drew Scientific)每兩天對血中的中性粒細胞進行計數(shù)，直到完全恢復(fù)(與對照亞組相比)。用Hemavet 950 FS(Drew Scientific)每兩天對血中的血小板進行計數(shù)，直到完全恢復(fù)(與對照亞組相比)?，F(xiàn)在參照圖23，每兩天對外周血(PB)中的中性粒細胞進行計數(shù)，直到完全恢復(fù)(與對照亞組相比)。這些數(shù)據(jù)以均值士SEM的形式表示，N= 10只小鼠/組，各自獨立檢測?，F(xiàn)在參照圖對，每兩天對外周血(PB)中的血小板進行計數(shù)，直到完全恢復(fù)(與對照亞組相比)。數(shù)據(jù)以均值士SEM的形式表示，N= 10只小鼠每組，各自獨立檢測。22.測定G-CSF和美洛昔康在狒狒中對細胞動員的作用現(xiàn)在參照圖25，第一組狒狒按照如下的給藥方案進行動員，lOug/kg體重的 G-CSF，2周清除(wash out)期后，用10ug/kg的G-CSF加0. lmg/kg的美洛昔康處理動物。 第二組狒狒按照如下的給藥方案進行動員，lOug/kg體重的G-CSFWO. lmg/kg的美洛昔康， 2周清除期后，用10ug/kg的G-CSF。現(xiàn)在參照圖沈，通過FACS分析檢測PB中的CD34+細胞，按照以前的描述測定CFU-GM/ml血。G-CSF和美洛昔康的共施用增加了⑶34+細胞的動員(左圖)以及所測定的CFU-GM/抽取的血單位。23.小鼠中對PBSC動員的最佳增強需要抑制COXl和COXl酶。用G-CSF動員小鼠，將使用G-CSF和多種NSAIDS組合(阿司匹林[C0X-1 和 C0X-2]；利克飛龍[C0X-2 和 5-L0X] ；SC-560 [C0X-1]；戊?；畻钏?valeryl salicylate) [C0X-1]；伐地考昔[C0X-2] ；NS-398 [C0X-2])的動員方案的 PB 中 CFU-GM進行比較?，F(xiàn)在參照圖27，總結(jié)了這些檢測的結(jié)果，這些數(shù)據(jù)以均值士SEM的形式表示，N = 4 只小鼠/組，各自獨立檢測。與被認(rèn)為高度選擇性地抑制這兩種異構(gòu)酶中僅一種的化合物相比，已知對COXl和2均有抑制作用的化合物更好地動員集落形成細胞。為檢測兩種常用的COX抑制劑的效果，用G-CSF或者G-CSF和阿司匹林或布洛芬的組合(口服(PO)，1天兩次，4天)來動員小鼠，按照以前的描述測定CFU-GM?，F(xiàn)在參照圖觀，對于僅用G-CSF處理的對照組小鼠、用G-CSF加10、20或40mg/kg阿司匹林處理的小鼠以及用G-CSF加10、20 或40mg/kg布洛芬治療的小鼠，用柱狀圖形式表示G-CSF+阿司匹林和G-CSF+布洛芬動員 CFU-GM至外周血的劑量應(yīng)答性分析。數(shù)據(jù)以均值士SEM的形式表示，η = 4只小鼠/組，各自獨立檢測。24.檢測美洛昔康對小鼠CFU的劑量依賴性作用。用G-CSF和如下劑量的美洛昔康動員小鼠，0. 0(對照)、0· 02,0. 2,0. 5,1. 5和 :3mg/kg體重的美洛昔康(每天兩次皮下施用，四天)，按照以前的描述檢測CFU-GM?，F(xiàn)在參照圖29，在動物的外周血或動物骨髓樣品中檢測美洛昔康對HSPC的劑量應(yīng)答(圖30)，這些數(shù)據(jù)以均值士SEM的形式表示，η = 3只小鼠每組，各自獨立檢測。盡管用圖表和前述的描述說明并描述了這一新技術(shù)，但是其僅被認(rèn)為是對特性的舉例說明而非限制。需要理解的是，僅展示和描述了優(yōu)選的實施方案，而要求對在此新技術(shù)精神范圍內(nèi)的所有改變和修改加以保護。同樣，雖然使用特定的實施例、理論論證、說明和舉例來例證這一新技術(shù)，這些例證以及所附的討論不應(yīng)以任何方式解釋為對本技術(shù)的限制。本申請中參考的所有的專利、專利申請和文本的參考，科學(xué)論文、出版物等在此作為整體以參考的形式整合到本申請中。參考文獻Breyer, R. 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權(quán)利要求
1.增強造血干和祖細胞動員的方法，包括如下步驟 鑒定造血干和/或祖細胞的來源；提供降低PGE2活性的化合物；和將造血干和或祖細胞的來源與有效量的所述降低細胞和周圍PGE2活性的化合物相接觸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述降低PGE2活性的化合物為非留體抗炎化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述非留體抗炎化合物作用于環(huán)加氧酶-1和環(huán)加氧酶-2。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述非留體抗炎化合物主要作用于環(huán)加氧酶-2。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述非留體抗炎化合物選自阿司匹林、塞來昔布、羅非昔布、艾托考昔、伐地考昔、布洛芬、萘普生、雙氯芬酸、依托度酸、酮咯酸和利克飛龍。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述非留體抗炎化合物為吲哚美辛。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述非留體抗炎化合物為美洛昔康。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述非甾體抗炎化合物施用于患者一段時間，該時間段與至少一種額外的增強造血干和祖細胞動員的化合物的共處理重疊。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述增強造血干和/或祖細胞動員的額外的化合物選自G-CSF和普樂沙福。
10.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述非留體抗炎化合物施用于患者至少3天。
11.增強來自供體的造血干和/或祖細胞動員的方法，其包括如下步驟 提供作為至少一種PGE2受體之拮抗劑的化合物；和從造血干和/或祖細胞的供體中收獲造血干和祖細胞之前，向所述供體施用有效量的所述化合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中至少一種PG&受體的所述拮抗劑選自 N-[[4' -[[3-丁基-1，5-二氫-5-氧代-l-[2-(三氟甲基)苯基]-4H-1，2，4-三唑-4-基] 甲基][1，1 ‘-聯(lián)苯基]-2-基]磺?；鵠-3-甲基-2-噻吩甲酰胺和4- G，9- 二乙氧基-1， 3- 二氫-1-氧代-2H-苯并[f]異吲哚-2-基)-N-(苯磺?；?-苯乙酰胺。
13.增強接受者中造血干和/或祖細胞植入的方法，包括如下步驟從經(jīng)過至少一種降低來源中PGE2活性的化合物處理的來源中收獲包含造血干和/或祖細胞的細胞群；將所述造血干和祖細胞的群與PGE2活性離體相接觸；和將與具有PGE2活性的所述化合物相接觸的所述造血干和祖細胞體內(nèi)移植入接受者。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述造血干和祖細胞的來源為從骨髓供體中抽取的骨髓樣品。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述造血干和祖細胞的來源為從血液供體中抽取的血液樣品。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述細胞來源為臍帶或胎盤。
17.提高造血干和祖細胞植入率的方法，包括如下步驟 提供具有PGE2活性的化合物；和將具有PGE2活性的化合物與造血干和祖細胞的細胞群離體相接觸。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中具有PGE2活性的所述化合物選自PGE2和dmPGE2。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中具有PG&活性的所述化合物與所述細胞群接觸至少 1小時。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其還包括如下步驟用基本上沒有PGE2活性的緩沖液將與具有PGE2活性的所述化合物相接觸的細胞群的至少一部分清洗至少一次。
21.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其還包括如下步驟將與具有PGE2活性的所述化合物相接觸的細胞群的至少一部分引入患者。
22.增強干細胞中病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法，包括如下步驟 提供含有至少一個待轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因的病毒載體；提供經(jīng)有效量的具有PGE2活性的分子離體處理的至少一個干細胞；和用所述病毒載體轉(zhuǎn)染經(jīng)具有PGE2活性的分子處理的干細胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中具有PGE2活性的分子選自E系列前列腺素和E系列前列腺素的二甲基衍生物。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中具有PGE2活性的分子選自PGE2和dmPGE2。
25.增強造血干和/或祖細胞在移植接受者中存活的方法，包括如下步驟 提供具有PGE2活性的分子；鑒定造血干或祖細胞移植的接受者；和向所述移植接受者施用治療有效量的具有PGE2的分子。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述具有PG^S性的分子選自E系列前列腺素和 E系列前列腺素的二甲基衍生物。
27.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述具有PGE2活性的分子選自PGE2和dmPGE2。
全文摘要
本公開涉及增強造血干細胞(HSPC)和祖細胞(HSPC)植入過程的方法。降低PGE2生物合成的化合物或PGE2受體拮抗劑單獨地或與其它造血動員劑(如AMD3100和G-CSF)聯(lián)合地體內(nèi)處理HSPC供體，使得循環(huán)中可用HSPC增加。減少PGE2細胞合成的化合物包括非甾體抗炎化合物，例如吲哚美辛。用有效量的PGE2或其至少一種衍生物例如16，16-二甲基前列腺素E2(dmPGE2)離體處理HSPC促進了HSPC的植入。類似的方法也可用于增加病毒介導(dǎo)的向HSPC中轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的效率。
文檔編號A61P7/00GK102245758SQ200980149522
公開日2011年11月16日 申請日期2009年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日
發(fā)明者喬納森·霍格特, 普拉蒂夫哈·辛格, 路易斯·M·佩盧斯 申請人:印第安納大學(xué)研究與技術(shù)公司