專利名稱：Muc-1胞質結構域肽作為癌癥的抑制劑的制作方法
Muc-1胞質結構域肽作為癌癥的抑制劑
背景技術：
本申請要求美國臨時申請系列號61/106，380(遞交日為2008年10月17日)和美國臨時申請系列號61/177，109(遞交日為2009年5月11日)的權益，在此將所述兩個申請的全部內容通過引用而并入。1.發(fā)明領域本發(fā)明涉及細胞生長的調控，更具體而言涉及癌細胞生長的調控。特別地，源自 MUCl胞質結構域的特定區(qū)域的MUCl肽被顯示抑制MUCl的寡聚化和核易位，引起表達MUCl 的腫瘤細胞的抑制甚至死亡。2.相關技術粘蛋白是被廣泛0-糖基化的蛋白質，其主要由上皮細胞表達。被分泌的和膜-結合的粘蛋白形成物理屏障，所述物理屏障保護上皮細胞的頂端邊緣免受由存在于與外部環(huán)境的接觸面的毒素、微生物和其它形式的應激所誘導的損傷。跨膜粘蛋白I(MUCl)還可通過其胞質結構域向細胞內部發(fā)信號。除了存在海膽精子蛋白-腸激酶-集聚蛋白(SEA)結構域之外，MUCl與其它的膜-結合粘蛋白沒有序列相似性(Duraisamy等人，2006)。在這方面，MUCl被翻譯為單一的多肽，然后在SEA結構域處進行自我切割(autocleavage) (Macao, 2006)。MUCIN-末端亞基(MUCl-N)含有可變數目的串聯(lián)重復，所述串聯(lián)重復具有高比例的經0-糖基化修飾的絲氨酸和蘇氨酸(Siddiqui等人，1988)。MUC1_N延伸超過細胞的多糖包被并通過非共價結合至跨膜的MUClC-末端亞基(MUCl-C)而被束縛于細胞表面(Merlo， 1989)。MUCl-C由58個氨基酸的胞外結構域、觀個氨基酸的跨膜結構域和72個氨基酸的與不同信號分子相互作用的胞質結構域組成(Kufe，2008)。MUCl-N脫落進入所述保護性的物理屏障中，留下MUCl-C在細胞表面作為推定的受體以轉導引起生長和生存的細胞內信號(Ramasamy 等人，2007 ；Ahmad 等人，2007)?？色@得的證據表明人的癌在促進腫瘤發(fā)生中利用了 MUCl功能。在此情形中，隨著轉化和極性的喪失，在乳腺癌和其它上皮癌中MUCl以高水平表達在整個細胞表面(Kufe，1984)。其它的工作顯示了 MUCl的過表達引起了錨定不依賴性生長 (anchorage-independent growth)和腫瘤發(fā)生(Li 等人，2003a ；Raina 等人，2004 ；Ren 等人，2004 ；Wei等人，200 ，這至少部分地是通過對β _聯(lián)蛋白的穩(wěn)定化作用(Huang等人， 2005)。此外，與對于正常上皮細胞的生存功能一致，MUCl的過表達引起了癌細胞對應激誘導的凋亡的抗性(Ren等人，2004 ；Yin和Kufe, 2003 ；Yin等人，2004 ；Yin等人，2007)。至頂端膜的限制的喪失允許了與表皮生長因子受體(EGFR)形成復合物以及對 EGFR介導的信號傳導的共活化(Li等人，2001 ；Ramasamy等人，2007)。癌細胞對MUCl的過表達還與MUCl-C在胞質中的聚積以及此亞單位對核(Li等人，200 ；Li等人，2003c)和線粒體(Ren等人，2004 ;Ren等人，2006)的靶向相關。重要地，MUCl-C的寡聚化對于其核靶向以及與不同效應子的相互作用言是必需的(Leng等人，2007)。例如，MUCl-C胞質結構域(MuCl-CD)作為 c-Src(Li 等人，2001)，c_Abl (Raina 等人，2006)，蛋白激酶 C δ (Ren 等人，200 和糖原合成酶激酶3β (Li等人，1998)的底物起作用，并且直接與Wnt通路的效應子β -聯(lián)蛋白(Yamamoto等人，1997 ；Huang等人，2005)以及ρ53腫瘤抑制因子(Wei等人，2005)相互作用。因此，雖然寡聚化似乎是重要的，沒有直接的證據表明干擾MUCl寡聚體的形成將在腫瘤細胞中有任何有益效果，更沒有表明這可以如何被實現。發(fā)明概述因此，根據本發(fā)明，提供了抑制受試者中MUCl-陽性腫瘤細胞的方法，包括向所述受試者施用含有至少4個連續(xù)的MUCl殘基且不多于20個連續(xù)的MUCl殘基的MUCl肽，并且所述MUCl肽包含序列CQC，其中CQC的氨基-末端半胱氨酸在其NH2-端被至少一個氨基酸殘基掩蓋，所述至少一個氨基酸殘基無需對應于天然的MUC-I跨膜序列。所述肽可包含至少5個連續(xù)的MUCl殘基，至少6個連續(xù)的MUCl殘基，至少7個連續(xù)的MUCl殘基，至少8個連續(xù)的MUCl殘基并且所述序列可更特別地包含CQCR(SEQ ID NO 54), CQCRR(SEQ ID NO 50), CQCRRR(SEQ IDNO 51)，CQCRRRR(SEQ ID NO :52)，CQCRRK(SEQ ID NO :4)，或 CQCRRKN(SEQ ID NO 53)。所述肽可含有不多于10個連續(xù)的MUCl殘基，不多于11個連續(xù)的MUCl殘基， 不多于12個連續(xù)的MUCl殘基，不多于13個連續(xù)的MUCl殘基，不多于14個連續(xù)的MUCl殘基，不多于15個連續(xù)的MUCl殘基，不多于16個連續(xù)MUCl的殘基，不多于17個連續(xù)的MUCl 殘基，不多于18個連續(xù)的MUCl殘基或不多于19個連續(xù)的MUCl殘基。所述肽可與細胞遞送結構域(例如聚-D-R、聚-D-P或聚-D-K)融合。所述肽可全包含L氨基酸，全包含D氨基酸或者包含L和D氨基酸的混合。所述MUCl-陽性腫瘤細胞可以是癌細胞、白血病細胞或骨髓瘤細胞，例如前列腺或乳腺癌細胞。施用可包括靜脈內、動脈內、腫瘤內、皮下、局部的或腹膜內施用，或者局部、 區(qū)域性、全身性或連續(xù)施用。抑制可包括誘導所述腫瘤細胞的生長停滯，所述腫瘤細胞的凋亡和/或包含所述腫瘤細胞的腫瘤組織的壞死。所述受試者可以是人。所述方法還可包括向所述受試者施用第二種抗癌療法。所述第二種抗癌療法可以是外科手術、化學療法、放射療法、激素療法、毒素療法、免疫療法和冷凍療法。所述第二種抗癌療法可在所述肽之前、在所述肽之后或與所述肽同時被施用。所述方法還可包括在施用所述肽之前評估所述受試者的腫瘤細胞中MUCl的表達的步驟和/或所述方法還可包括評估所述肽對于所述受試者的腫瘤中MUCl的表達的影響的步驟。所述肽可以0. l-500mg/kg/d或10_100mg/kg/d被施用。所述肽可被每天施用，例如施用7天、2周、3周、4周、一個月、6周、8周、兩個月、12周或三個月。所述肽可被每周施用，例如施用2周、3周、4周、6周、8周、10周或12周。在另一個實施方式中，提供了藥物組合物，其包含(a)含有至少4個連續(xù)的MUCl 殘基且不多于20個連續(xù)的MUCl殘基的MUCl肽，并且所述MUCl肽包含序列CQC，其中CQC 的氨基-末端半胱氨酸在其NH2-端被至少一個氨基酸殘基掩蓋，所述至少一個氨基酸殘基無需對應于天然的MUC-I跨膜序列，和(b)藥學上可接受的載體、緩沖劑或稀釋劑。所述肽可以是至少5、6、7或8個連續(xù)的MUCl殘基。所述肽可以是不多于10個連續(xù)的MUCl殘基， 不多于11個連續(xù)的MUCl殘基，不多于12個連續(xù)的MUCl殘基，不多于13個連續(xù)的MUCl殘基，不多于14個連續(xù)的MUCl殘基，不多于15個連續(xù)的MUCl殘基，不多于16個連續(xù)的MUCl 殘基，不多于17個連續(xù)的MUCl殘基，不多于18個連續(xù)的MUCl殘基或不多于19個連續(xù)的 MUCl殘基。所述肽可與細胞遞送結構域(例如聚-D-R、聚-D-P或聚-D-K)融合，或與細胞轉導結構域(例如HIV tat細胞轉導結構域)融合。所述肽的長度可以是至少8個殘基， 并且至少兩個非相鄰的殘基通過其側鏈形成橋。所述橋可包含連接子、經化學修飾的側鏈或烴鉚合(hydrocarbon stapling)。所述連接子可包含穩(wěn)定所述肽的α-螺旋結構的修飾。所述緩沖劑可包含巰基乙醇、谷胱甘肽或抗壞血酸或其它保持所述肽為單體狀態(tài)的還原劑。在另一個實施方式中，提供了抑制細胞內的MUCl-寡聚化和核轉運的方法，包括使表達MUCl的細胞與含有至少4個連續(xù)的MUCl殘基且不多于20個連續(xù)的MUCl殘基的 MUCl肽接觸，并且所述MUCl肽包含序列CQC，其中CQC的氨基-末端半胱氨酸在其NH2-端被至少一個氨基酸殘基掩蓋，所述至少一個氨基酸殘基無需對應于天然的MUCl跨膜序列。所述肽可包含至少5個連續(xù)的MUCl殘基，至少6個連續(xù)的MUCl殘基，至少7個連續(xù)的MUCl殘基，至少8個連續(xù)的MUCl殘基并且所述序列可更特別地包含CQCR，CQCRR，CQCRRR，CQCRRRR， CQCRRK,或CQCRRKN。所述肽可含有不多于10個連續(xù)的MUCl殘基，不多于11個連續(xù)的MUCl 殘基，不多于12個連續(xù)的MUCl殘基，不多于13個連續(xù)的MUCl殘基，不多于14個連續(xù)的 MUCl殘基，不多于15個連續(xù)的MUCl殘基，不多于16個連續(xù)的MUCl殘基，不多于17個連續(xù)的MUCl殘基，不多于18個連續(xù)的MUCl殘基或不多于19個連續(xù)的MUCl殘基。所述肽可與細胞遞送結構域(例如聚-D-R、聚-D-P或聚-D-K)融合。所述肽可全包含L氨基酸，全包含D氨基酸或者包含L和D氨基酸的混合。所述表達MUCl的細胞可以是腫瘤細胞，例如癌細胞、白血病細胞或骨髓瘤細胞， 例如前列腺或乳腺癌細胞。所述腫瘤細胞可位于活的受試者中。所述活的受試者可以是人受試者。在另一實施方式中，提供了模擬MUCl肽的結構和MUC-I結合能力的肽模擬物，所述MUCl肽含有至少4個連續(xù)的MUCl殘基且不多于20個連續(xù)的MUCl殘基，并且包含序列 CQC，其中CQC的氨基-末端半胱氨酸在其NH2-端被至少一個氨基酸殘基掩蓋，所述至少一個氨基酸殘基無需對應于天然的MUCl跨膜序列。另一個實施方式提供了含有至少3個連續(xù)的MUCl殘基且不多于20個連續(xù)的MUCl殘基的MUCl肽，并且所述MUCl肽包含序列CQC， 其中所述肽的所有氨基酸殘基均為D-氨基酸。所述肽還可包含序列KRRCQC (SEQ ID NO 49)。癌細胞可以是，例如，乳腺癌、肺癌、結腸癌、胰腺癌、腎癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液癌、神經組織癌、黑色素瘤、卵巢癌、睪丸癌、前列腺癌、宮頸癌、陰道癌或膀胱癌細胞。本發(fā)明還包括殺死癌細胞的方法。此方法可包括，在進行上面所述的方法之前、 之后或同時，使受試者暴露于一種或多種另外的療法。所述療法可以是，例如，一種或多種形式的電離輻射和/或一種或多種化療劑。所述一種或多種化療劑可以是，例如，順鉬、卡鉬、丙卡巴胼、氮芥、環(huán)磷酰胺、喜樹堿、異環(huán)磷酰胺、美法倫(melphalan)、苯丁酸氮芥、bisulfan、亞硝基脲、更生霉素、柔紅霉素、多柔比星、博來霉素、plicomycin、絲裂霉素、依托泊甙(etoposide)、verampil、鬼臼毒素、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉酚、反式鉬 (transplatinum)、5_氟脲嘧啶、長春花新堿、長春滅瘟堿、甲氨蝶呤、或前述任一的類似物。 還構想作為組合療法的是激素療法、免疫療法、毒素療法、冷凍療法和外科手術。構想本申請中所描述的任何方法或組合物可相關于本申請中所描述的任何其它方法或組合物被實施。
當在權利要求和/或說明書中與術語“包含”共同使用時，使用用語“a”或“an” 可指“一個”，但是其也與下列意思一致“一個或多個”，“至少一個”和“一個或多于一個”。 用語“大約”指加或減所述數字的5%。本發(fā)明的其它目標、特征和優(yōu)勢將通過下面的詳述變得顯然。然而，應當理解，詳細的描述和特定的實施例雖然表明了本發(fā)明的特定實施方式，但是僅是通過例證的方式給出的，因為通過這種詳細的描述，在本發(fā)明精神和范圍內的各種變化和修飾對于本領域技術人員而言將是顯然的。


下列附圖形成了本說明書的一部分并且被包括以進一步表明本發(fā)明的某些方面。 通過參考這些附圖中的一幅或多幅并結合詳細說明，可更好地理解本發(fā)明。圖1A-D. MUCl/CQC肽阻礙MUCl的寡聚化。(圖1A)顯示了 MUC1-C亞基和MUC1-CD 的72-氨基酸序列的圖示。N-末端的15個氨基酸(陰影的序列)MUC1/CQC和突變的MUCl/ AQA肽帶有聚-dAr g轉導結構域而被合成。(圖1B)在BIAcore中將His-MUCl-CD (1. 4mg/ ml)固定于傳感芯片上。在所述傳感芯片上方1(^11處注射順(1/^0(。通過BIAevaluation 軟件3. O版本分析原始的結合數據并使其與1 ILanguir結合模型擬合。(圖1C)使純化的 His-MUCl-CD(l. 5mg/ml)與 PBS、200 μ M MUCl/CQC 或 200 μ M MUC1/AQA— 同在室溫下孵育1小時。在非還原性的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中分離蛋白并通過使用抗-MUCl-C的蛋白質印跡法來進行分析。(圖1D)瞬時轉染293細胞以表達空的載體或GFP-MUC1-CD和 Flag-MUCl-⑶。轉染后48小時，用5 μ MMUCl/CQC或MUC1/AQA處理所述細胞3天。然后收獲所述細胞用于以抗-MUCl-C進行的蛋白質印跡法(左圖)。還用抗-Flag沉淀了全細胞裂解物，并且用所示抗體對沉淀物進行了蛋白質印跡分析(右圖)。圖 2A-C. MUC1 /CQC 肽阻礙 MUC1 -C 的核定位。(圖 2A)用 5 μ M FITC-標記的 MUCl/ CQC肽孵育ZR-75-1細胞所示的時間，然后通過流式細胞術進行分析。平均熒光指數(MFI) 被包括在每幅圖中。(圖2B-C)在5 μ M MUCl/CQC或MUCl/AQA肽的存在下孵育ZR-75-1 (圖 2Β)和MCF-7 (圖2C)細胞3天。用所示的抗體對全細胞裂解物(WCL)(左圖)和核裂解物 (右圖)進行蛋白質印跡測試。圖3A-D. MUCl/CQC肽誘導S期停滯和壞死。用5 μ M MUCl/CQC或MUCl/AQA處理 ZR-75-1 (圖2Α-Β)和MCF-7 (圖2C-D)細胞3和4天。將細胞固定并通過流式細胞術分析其細胞周期分布(圖2Α和2C)。圖中包括了在Gl、S和G2/M期的細胞的百分比。還用碘化丙啶對細胞進行了染色并且通過流式細胞術分析了壞死(圖2Β和2D)。圖中包括了壞死細胞的百分比。圖4Α-Ε. MUC1/CQC對于表達MUCl的乳腺癌細胞的選擇性。(圖4Α)用空的慢病毒 (載體)或表達MUCl siRNA的慢病毒(載體)穩(wěn)定地感染ZR-75-1細胞。用所示的抗體對經感染細胞的裂解物進行蛋白質印跡分析。(圖4B)ZR-75-l/載體細胞是未處理的(菱形)，而ZR-75-1/載體(方形)和ZR-75-l/MUClsiRNA (三角形)細胞是用5 μ M MUCl/CQC 肽處理了所示的時間。通過臺盼藍排除法(trypan blue exclusion)確定了存活的細胞數目。(圖4C) 293細胞是未處理的(菱形)，和用5 μ M MUCl/CQC (方形)或MUC1/AQA (三角形)處理了所示的時間。通過臺盼藍排除法確定了存活的細胞數目。(圖4D)MCF-10A細胞是未處理的(左圖)，和經5μΜ MUC1/CQC(中間圖)或MUC1/AQA(右圖)處理的。第3 天，分析細胞的細胞周期分布。(圖4Ε) MCF-10A細胞是未處理的(菱形)，和用5μΜ MUCl/ CQC(SB)或MUC1/AQA(三角形)處理了所示的時間。通過臺盼藍排除法確定了存活的細胞數目。圖5A-C. MUC1/CQC肽阻礙ZR-75-1乳腺瘤異種移棺物的牛長。(圖5Α)將17- β -雌二醇栓植入4-6周大的雌性Balb-cnu/nu小鼠中。24h后，將ZR-75-1乳腺癌細胞(包埋在基質膠中)皮下注射到側腹中。當腫瘤為約150mm3時，將所述小鼠配對成組并每天腹膜內注射PBS (載體對照；閉和的方形)，50mg/kg MUC1/AQA肽(對照肽，開放的方形)或IOmg/ kg MUC1/CQC肽(閉合的三角形)，注射21天。另一組每天以50mg/kg MUC1/CQC肽處理， 處理6天(開放的三角形)。每周對小鼠進行兩次稱重并且每4天進行腫瘤的測量。(圖 5B和5C) ·在第M天(星號)，用H&E (圖5B)以及抗MUCl的抗體(圖5C)對收獲自對照組和經50mg/kg/d χ 6d處理的組的腫瘤進行染色。圖6A-B. MUCl/CQC肽在ZR-75-1腫瘤上的長期效果。(圖6A)如圖5A的圖注中所描述的，用ZR-75-1細胞注射小鼠。當腫瘤為約275mm3時，將所述小鼠配對成組并每天腹膜內注射PBS (載體對照；開放的方形)，或30mg/kg MUC1/CQC肽(閉合的方形)，注射21天。 在第32天，當腫瘤達到約1200mm3時處死對照小鼠。監(jiān)測經處理的小鼠直至第52天時收獲腫瘤用于H&E染色(圖6B)。 圖7. MUC17~mer抑制前列腺癌。用5 μ M CQC短肽(7_mer)或5 μ MCQC長肽 (15-mer)處理DU145前列腺癌細胞4天。通過MTT測試測量細胞的生長。數據代表與未處理的細胞(對照)相比生長抑制的百分比。圖8. MUCl-⑶鉚合肽的序列。圖9A. MUCl-CD-鉚合肽對于H1650非小細胞肺癌細胞的生長的影響。為了評估對 MUCl功能的抑制的敏感度，用1和5μ M MUCl CQC鉚合肽(G0-200-1B)處理H1650NSCLC細胞7天。用5 μ M G0-200-1B對Η1650細胞的處理與顯著的生長抑制和之后的細胞數量減少相關。圖9Β. G0-200-2B對于細胞增殖的影響。在含有10%加熱失活的胎牛血清及100 單位/mL青霉素、100 μ g/ml鏈霉素和2mmol/L L-谷氨酸的DMEM中培養(yǎng)H-1975非小細胞肺癌細胞系。在處理的前一天重新接種細胞。用5μΜ G0-200-2B處理細胞3天，并且通過臺盼藍排除法確定細胞的存活。圖10.不同MUCl-CD CQC-區(qū)域肽對于激素依賴性乳腺癌細胞的生長的影響。為了確定暴露于不同的包含MUCl-⑶CQC-區(qū)域的肽是否影響生長，用5μ M不同的肽處理 ZR-75-1乳腺癌細胞4天并監(jiān)測細胞增殖。顯著地，與未經處理的細胞相比，有較大的生長抑制。圖11.不同MUCl-⑶CQC-區(qū)域肽對于非小細胞癌細胞的生長的影響。用5μΜ G0-203、G0-203-2或G0-203cyc處理A549非小細胞肺癌細胞7天。通過臺盼藍排除法確定第7天時的存活細胞數目，并且通過與未經處理的細胞生長比較來計算生長抑制百分比。圖12.不同MUCl-⑶CQC-區(qū)域肽對于H1975非小細胞癌細胞的生長的影響。用 5μ M不同的MUCl-⑶CQC-區(qū)域肽處理Η1975非小細胞肺癌細胞6天。通過臺盼藍排除法確定第6天時的存活細胞數目。結果顯示用5 μ M不同的肽處理Η1975細胞與顯著的生長抑制相關。圖13.不同MUCl-CD CQC-區(qū)域肽對于三重陰件乳腺癌細胞的牛長的影響。用5 μ M 不同的MUCl-⑶CQC-區(qū)域肽處理MDA-MB-231三重陰性乳腺癌細胞6天。通過臺盼藍排除法確定第6天時的存活細胞數目。結果顯示用不同的肽處理MDA-MB-231細胞與顯著的生長抑制相關。圖14.較短的G0-203肽對于ZR-75-1乳腺癌細胞的增殖的影響。在補充了 10%加熱失活的胎牛血清、100單位/mL青霉素和ΙΟΟμ g/ml鏈霉素的RPMI1640中培養(yǎng)人ZR-75-1 乳腺癌細胞。每天用5 μ M的不同的肽處理細胞，處理4天，并且通過臺盼藍排除法確定細胞的存活。與 G0-210 相反，每天用 5μΜ G0-203 (SEQ ID NO :53)、G0-207 (SEQ IDNO 4)、 G0-208 (SEQ ID NO 50)和 G0-209 (SEQ ID NO 54)處理 ZR-75-1 乳腺癌細胞，處理 4 天，與顯著的生長抑制相關。圖15A-D. G0-203與不同的抗癌藥物組合的效果。使ZR-75-1細胞暴露于單獨的及與G0-203相組合的、所示濃度的順鉬(圖15A)、多柔比星(圖15B)、rh_TNF-a (圖15C) 和紫杉酚(圖15D)。對于順鉬、多柔比星和紫杉酚而言，處理是相繼進行的，其中將細胞暴露于這些試劑72h，繼以用5μΜ G0-203處理72h。在用rh_TNF進行的研究中，使細胞同時暴露于單獨的及與5 μ M G0-203相組合的、不同濃度的rh-TNF 72h。利用MTS檢測確定細胞的存活。圖16. G0-203與抗癌試劑是加成的或協(xié)同的。圖中顯示了相對于不同效力水平 (被影響的部分)的組合指數。通過用抗癌藥物和G0-203的所示組合處理細胞而獲得了所述效力水平。
具體實施例方式I.本發(fā)明發(fā)明人和其它人已經廣泛研究了 MUCl在癌癥中的作用。如上文所述，人MUCl是異源二聚體糖蛋白，其被翻譯為單一的多肽并在內質網被切割為N和C末端亞基(Ligtenberg 等人，1992 ；Macao等人，2006 ；Levitin等人，2005)。MUCl的異常過表達(正如在大多數人類癌癥中所發(fā)現的(Kufe等人，1984))引起錨定不依賴性生長和腫瘤發(fā)生(Li等人，2003a ； Huang等人，2003 ；Schroeder等人，2004 ；Huang等人，2005)。其它的研究顯示，MUCl的過表達引起了對由氧化應激和遺傳毒性的抗癌試劑所誘導的凋亡的抗性(Yin和Kufe，2003 ； Ren 等人，2004 ；Raina 等人，2004 ；Yin 等人，2004 ；Raina 等人，2006 ；Yin 等人，2007)。受束縛的和分泌的粘蛋白家族在提供上皮細胞表面的保護性屏障方面發(fā)揮作用。 隨著上皮層的損傷，相鄰細胞間的緊密連接被破壞，并且由于細胞引起heregulin誘導的修復程序而喪失極性(Vermeer等人，2003)。MUCl-N從細胞表面脫落(Abe和Kufe，1989)， 留下MUCl-C作為環(huán)境應激信號對細胞內部的傳導者起作用。在這方面，MUCl-C與ErbB受體家族的成員形成細胞表面復合物，并且MUCl-C響應heregulin刺激而被靶向核(Li等人，2001 ；Li等人，2003c)。MUCl-C還通過MUCl胞質結構域(⑶)與聯(lián)蛋白家族成員間的直接相互作用在整合ErbB受體與Wnt信號通路中起作用(Huang等人，2005 ；Li等人，2003c ； Yamamoto 等人，1997 ；Li 等人，1998 ；Li 等人，2001 ；Li 和 Kufe, 2001)。其它的研究顯示， MUCl-⑶被糖原合酶激酶3 β、c-Src、蛋白激酶C δ和C-Abl磷酸化(Raina等人，2006 ；Li等人，1998 ；Li 等人，2001 ；Ren 等人，2002)。弓丨起MUCl-C的核靶向的機制是不清楚的。含有經典的核定位信號(NLS)的蛋白質通過首先結合至輸入蛋白α及而后轉而結合至輸入蛋白β被輸入到核中(Weis，2003)。 裝載物(cargo)-輸入蛋白α/β復合物通過結合至核孔蛋白而?？吭诤丝?，并通過依賴于 Ran GTP酶的機制被轉運通過所述孔。經典的NLS是具有4_5個堿性氨基酸的單一簇的單分體或具有被10-12個氨基酸的連接體間隔開的兩簇堿性氨基酸的二分體。MUCl-CD包含不符合原型單分體NLS的RRK基序(Hodel等人，200 。然而，含有非經典NLS的某些蛋白通過直接結合至輸入蛋白β而被轉運通過核孔(Kau等人，2004)。輸入蛋白B與數種核孔蛋白聯(lián)合(Ryan和W^ente，2000)，包括位于核孔復合體的胞質面和核質面的Nup62 (Percipalle 等人，1997)。其它的研究顯示聯(lián)蛋白是通過不依賴于輸入蛋白和核孔蛋白的機制被輸入到核中的(Suh 和 Gumbiner，2003)。在2006年，發(fā)明人報道了 MUCl是通過涉及結合至Nup62的機制被輸入到核中的。 他們還表明了 MUCl通過MUCl胞質結構域中的CQC基序形成寡聚體并且MUCl的寡聚化對于核輸入是必需的。在本申請中，他們將此工作延伸至包括對于CQC基序在寡聚體形成中所起的作用的進一步理解。他們還表明了對應于此區(qū)域的短肽能夠破壞MUCl寡聚體的形成，防止向腫瘤細胞的核內轉運。這些肽能夠抑制腫瘤細胞生長，以及在此類細胞中誘導凋亡、甚至腫瘤組織的壞死。下面詳細描述了本發(fā)明的這些方面及其它方面。II. MUClA.結構MUCl是表達在正常分泌性上皮細胞頂端邊緣上的粘蛋白型糖蛋白(Kufe等人， 1984)。在被合成為單一的多肽，并當前體在內質網中被切割為兩個亞基后，MUCl形成異源二聚體(Ligtenberg等人，1992)。所述切割可由自催化過程介導(Levitan等人， 2005)。> 250kDa的MUCIN-末端(MUClN-ter，MUCl-N)亞基含有可變數目的、20個氨基酸的串聯(lián)重復，所述串聯(lián)重復具有高度保守的變異而是不完全重復并且經0-連接的多糖修飾(Gendler等人，1988 ；Siddiqui等人，1988)。MUC1-N通過與約23kDa的C-末端亞基 (MUClC-ter,MUCl-C) 二聚化而被束縛在細胞表面，所述C-末端亞基包括58個氨基酸的胞外結構域、觀個氨基酸的跨膜結構域和72個氨基酸的胞質結構域(CD ；SEQ IDNO 1) (Merlo 等人，1989)。人MUCl序列如下所示GSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA GVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAV CQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTY HTHGRYVPPSSTDRSPYEKYSAGNGGSSLSYTNPAVAATSANL (SEQ ID NO :2)粗體的序列表示CD，而加下劃線的部分是實施例中所描述的寡聚體抑制肽(SEQ ID NO 3)。隨著正常上皮細胞向癌的轉化，MUCl在細胞溶質中及在整個細胞膜上異常地過表達(Kufe等人，1984 ；Perey等人，1992)。與細胞膜相聯(lián)合的MUCl通過網格蛋白介導的內吞作用而被靶向至內體(Kinlough等人，2004)。此外，MUC1-C，而非MUC1-N，被靶向至核 (Baldus 等人，2004 ；Huang 等人，2003 ；Li 等人，2003a ；Li 等人，2003b ；Li 等人，2003c ；Wei 等人，2005 ；Wen等人，2003)和線粒體(Ren等人，2004)。B.功能
MUCl 與 ErbB 受體家族的成員(Li 等人，2001b ；Li 等人，2003c ；Schroeder 等人， 2001)、以及與Wnt效應子β-聯(lián)蛋白(Yamamoto等人，1997)相互作用。表皮生長因子受體和c-Src在Y-46處磷酸化MUCl胞質結構域(MUCl-OT)，并從而增加MUCl和β -聯(lián)蛋白的結合(Li等人，2001a ;Li等人，2001b)。MUCl與β -聯(lián)蛋白的結合還由糖原合酶激酶3 β 和蛋白激酶C δ調控(Li等人，1998 ;Ren等人，2002)。MUCl與β-聯(lián)蛋白在核內共定位 (colocalize) (Baldus 等人，2004 ；Li 等人，2003a ；Li 等人，2003c ；Wen 等人，2003)并且共同活化Wnt靶基因的轉錄(Huang等人，2003)。其它的研究顯示，MUCl也直接與p53結合并調控P 53靶基因的轉錄(Wei等人，2005)。值得注意地，MUCl的過表達足以誘導錨定不依賴性生長和腫瘤發(fā)生(Huang等人，2003 ；Li等人，2003b ；Ren等人，2002 ；Schroeder等人， 2004)。大多數線粒體蛋白質在核內被編碼并通過線粒體外膜和內膜中的易位復合體被輸入到線粒體中。某些線粒體蛋白質含有N-末端線粒體靶向序列并且與線粒體外膜中的 Tom20相互作用(Truscott等人，2003)。其它的線粒體蛋白質含有內部的靶向序列并且與 Tom70受體相互作用(Truscott等人，200 。最近的工作顯示，沒有內部靶向序列的線粒體蛋白質通過HSP 70和HSP90的復合物被遞送至iTon^O (Young等人，2003)。III. MUCl 肽A.結構本發(fā)明構想了各種MUCl肽的設計、生產和用途。這些肽的結構特征如下。首先，所述肽具有不多于20個連續(xù)的MUCl殘基。因此，術語“具有不多于20個連續(xù)殘基的肽”(甚至當包括術語“包含”時)不能被理解為包含更多數目的連續(xù)的MUCl殘基。第二，所述肽將含有CQC基序，并且也可包括CQCR基序，CQCRR基序和CQCRRK基序。因此，所述肽將至少具有MUCl-C結構域的這三個連續(xù)的殘基。第三，所述肽將具有至少一個附著于CQC基序中第一個C殘基的NH2-末端側的氨基酸殘基，從而所述第一個C殘基被附著于其上的所述至少一個氨基酸所“掩蓋”。所述殘基可以是來自于MUCl的(即，來自跨膜結構域)、可以是隨機選擇的(20個天然存在的氨基酸或其類似物中的任意一個)，或者可以是另一個肽序列(例如，用于純化的標簽序列、穩(wěn)定化序列或細胞遞送結構域)的一部分。一般而言，所述肽將為50個殘基或更少，再次的，其包含不多于20個連續(xù)的MUCl 殘基?？偟拈L度可以是 4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24， 25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49 或 50個殘基。構想了 4-50個殘基，5-50個殘基，6-50個殘基，7-50個殘基，7-25個殘基，4-20 個殘基，5-20個殘基，6-20個殘基，7-20個殘基和7_15個殘基的肽長度的范圍。連續(xù)的 MUCl 殘基的數目可以是4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19 或20。構想了 4-20 個殘基，5-20個殘基，6-20個殘基，7-20個殘基和4_15個殘基，5-15個殘基，6-15個殘基或 7-15個殘基的連續(xù)殘基的范圍。本發(fā)明可利用L-構型的氨基酸、D-構型的氨基酸或其混合。雖然L-氨基酸代表蛋白質中所發(fā)現的絕大多數氨基酸，在一些由奇特的海洋-居住的生物體(例如芋螺(cone snail))所產生的蛋白質中發(fā)現了 D-氨基酸。它們也是細菌的肽多糖細胞壁的豐富的組分。D-絲氨酸可作為腦中的神經傳遞素。對于氨基酸構型的L和D約定不是指氨基酸本身的光學活性，而是指甘油醛異構體的光學活性，理論上可從所述甘油醛合成那種氨基酸(D-甘油醛是右旋性的；L-甘油醛是左旋性的)?！叭獶”肽的一種形式是逆-反肽。對天然存在的多肽的逆-反修飾涉及對具有與相應的L氨基酸相反的α碳立體化學的氨基酸的合成組合，即，相對于天然的肽序列是相反順序的D-氨基酸。逆-反類似物因而具有倒轉的末端和倒轉的肽鍵方向(NH-C0而不是 C0-NH)，而大概維持了如同在天然肽序列中的側鏈拓撲結構。參見美國專利6，261, 569，在此通過引用而并入。如上文所提及的，本發(fā)明構想了融合或綴合細胞遞送結構域(也稱為細胞遞送載體，或細胞轉導結構域)。這類結構域在本領域是公知的并且一般被表征為短的兩性或陽離子性肽及肽衍生物，通常含有多個賴氨酸和精氨酸殘基(Fischer，2007)。特別感興趣的是聚-D-Arg和聚-D-Lys序列(例如，右旋性的殘基，8個殘基長)，而其它的顯示在下表1 中。表 1
CDD/CTD 肽__SEQ ID NO
QAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE RQIKIWFQNRRMKWKK RRMKWKK
RRWRRWVRRWVRRWRR_
權利要求
1.在受試者中抑制MUCl-陽性腫瘤細胞的方法，所述方法包括向所述受試者施用含有至少4個連續(xù)的MUCl殘基和不多于20個連續(xù)的MUCl殘基的 MUCl肽，并且所述MUCl肽包含序列CQC (SEQ IDNO :4)，其中CQC的氨基-末端半胱氨酸在其NH2-末端被至少一個氨基酸殘基所掩蓋，所述至少一個氨基酸殘基無需對應于天然的 MUC-I跨膜序列。
2.權利要求1的方法，其中所述肽包含至少5，6，7或8個連續(xù)的MUCl殘基。
3.權利要求1的方法，其中所述肽含有不多于10個連續(xù)的MUCl殘基，不多于11個連續(xù)的MUCl殘基，不多于12個連續(xù)的MUCl殘基，不多于13個連續(xù)的MUCl殘基，不多于14 個連續(xù)的MUCl殘基，不多于15個連續(xù)的MUCl殘基，不多于16個連續(xù)的MUCl殘基，不多于 17個連續(xù)的MUCl殘基，不多于18個連續(xù)的MUCl殘基或不多于19個連續(xù)的MUCl殘基。
4.權利要求1的方法，其中所述MUCl-陽性腫瘤細胞是癌細胞、白血病細胞或骨髓瘤細胞。
5.權利要求4的方法，其中所述癌細胞是前列腺或乳腺癌細胞。
6.權利要求1的方法，其中所述肽與細胞遞送結構域融合。
7.權利要求6的方法，其中所述細胞遞送結構域是聚-D-R，聚-D-P或聚-D-K。
8.權利要求1的方法，其中施用包括靜脈內、動脈內、腫瘤內、皮下、局部或腹膜內施用。
9.權利要求1的方法，其中施用包括局部、區(qū)域、全身或連續(xù)施用。
10.權利要求1的方法，其中抑制包括誘導所述腫瘤細胞的生長停滯、所述腫瘤細胞的凋亡和/或包含所述腫瘤細胞的腫瘤組織的壞死。
11.權利要求1的方法，其進一步包括向所述受試者施用第二種抗癌療法。
12.權利要求11的方法，其中所述第二種抗癌療法是外科手術、化學療法、放射療法、 激素療法、毒素療法、免疫療法和冷凍療法。
13.權利要求11的方法，其中所述第二種抗癌療法在所述肽之前施用。
14.權利要求11的方法，其中所述第二種抗癌療法在所述肽之后施用。
15.權利要求11的方法，其中所述第二種抗癌療法與所述肽同時施用。
16.權利要求1的方法，其中所述受試者是人。
17.權利要求1的方法，其中所述肽以0.l-500mg/kg/d被施用。
18.權利要求1的方法，其中所述肽以10-100mg/kg/d被施用。
19.權利要求1的方法，其中每天施用所述肽。
20.權利要求19的方法，其中每天施用所述肽，施用7天、2周、3周、4周、一個月、6周、 8周、2個月、12周或3個月。
21.權利要求1的方法，其中每周施用所述肽。
22.權利要求21的方法，其中每周施用所述肽，施用2周、3周、4周、6周、8周、10周或 12周。
23.權利要求1的方法，其中所述肽包含的均為L氨基酸。
24.權利要求1的方法，其中所述肽包含的均為D氨基酸。
25.權利要求1的方法，其中所述肽包含L和D氨基酸的混合。
26.權利要求1的方法，還包括在施用所述肽之前，評估所述受試者的腫瘤細胞中MUCl的表達的步驟。
27.權利要求1的方法，還包括評估所述肽對于所述受試者的腫瘤細胞中MUCl的表達的影響的步驟。
28.藥物組合物，其包含(a)含有至少4個連續(xù)的MUCl殘基且不多于20個連續(xù)的MUCl殘基的MUCl肽，并且所述MUCl肽包含序列CQC，其中CQC的氨基-末端半胱氨酸在其NH2-末端被至少一個氨基酸殘基所掩蓋，所述至少一個氨基酸殘基無需對應于天然的MUC-I跨膜序列；和(b)藥學上可接受的載體、緩沖劑或稀釋劑。
29.權利要求28的組合物，其中所述肽是至少5，6，7或8個連續(xù)的MUCl殘基。
30.權利要求28的組合物，其中為不多于10個連續(xù)的MUCl殘基，不多于11個連續(xù)的 MUCl殘基，不多于12個連續(xù)的MUCl殘基，不多于13個連續(xù)的MUCl殘基，不多于14個連續(xù)的MUCl殘基，不多于15個連續(xù)的MUCl殘基，不多于16個連續(xù)的MUCl殘基，不多于17個連續(xù)的MUCl殘基，不多于18個連續(xù)的MUCl殘基或不多于19個連續(xù)的MUCl殘基。
31.權利要求觀的組合物，其中所述肽與細胞遞送結構域或細胞轉導結構域融合。
32.權利要求31的組合物，其中所述細胞轉導結構域是HIVtat細胞轉導結構域。
33.權利要求31的組合物，其中所述細胞遞送結構域是聚-D-R，聚-D-P或聚_D_K。
34.權利要求觀的組合物，其中所述肽的長度是至少8個殘基，并且至少兩個非相鄰的殘基通過其側鏈形成橋。
35.權利要求34的組合物，其中所述橋包含連接子，經化學修飾的側鏈或烴鉚合。
36.權利要求34的組合物，其中所述連接子包含穩(wěn)定所述肽的α-螺旋結構的修飾。
37.權利要求觀的組合物，其中所述緩沖劑包含β-巰基乙醇、谷胱甘肽或抗壞血酸。
38.抑制細胞中MUCl-寡聚化和核轉運的方法，所述方法包括使表達MUCl的細胞與含有至少4個連續(xù)的MUCl殘基且不多于20個連續(xù)的MUCl殘基的MUCl肽接觸，并且所述MUCl 肽包含序列CQC，其中CQC的氨基-末端半胱氨酸在其NH2-末端被至少一個氨基酸殘基所掩蓋，所述至少一個氨基酸殘基無需對應于天然的MUCl跨膜序列。
39.權利要求38的方法，其中所述肽是至少5，6，7或8個連續(xù)的MUCl殘基。
40.權利要求38的方法，其中為不多于10個連續(xù)的MUCl殘基，不多于11個連續(xù)的 MUCl殘基，不多于12個連續(xù)的MUCl殘基，不多于13個連續(xù)的MUCl殘基，不多于14個連續(xù)的MUCl殘基，不多于15個連續(xù)的MUCl殘基，不多于16個連續(xù)的MUCl殘基，不多于17個連續(xù)的MUCl殘基，不多于18個連續(xù)的MUCl殘基或不多于19個連續(xù)的MUCl殘基。
41.權利要求38的方法，其中所述肽與細胞遞送結構域融合。
42.權利要求41的方法，其中所述細胞遞送結構域是聚-D-R，聚-D-P或聚_D_K。
43.權利要求43的方法，其中所述表達MUCl的細胞是腫瘤細胞。
44.權利要求43的方法，其中MUCl-陽性腫瘤細胞是癌細胞、白血病細胞或骨髓瘤細胞。
45.權利要求44的方法，其中所述癌細胞是前列腺或乳腺癌細胞。
46.權利要求43的方法，其中所述腫瘤細胞位于活的受試者內。
47.權利要求46的方法，其中所述活的受試者是人受試者。
48.肽模擬物，其模擬MUCl肽的結構及其結合MUC-I的能力，其中所述MUCl肽含有至少4個連續(xù)的MUCl殘基且不多于20個連續(xù)的MUCl殘基并且包含序列CQC，其中CQC的氨基-末端半胱氨酸在其NH2-末端被至少一個氨基酸殘基所掩蓋，所述至少一個氨基酸殘基無需對應于天然的MUCl跨膜序列。
49.MUCl肽，其含有至少4個連續(xù)的MUCl殘基且不多于20個連續(xù)的MUCl殘基并且包含序列CQC，其中所述肽的所有氨基酸殘基都是D-氨基酸。
50.權利要求49的肽，其包含序列KRRCQC。
全文摘要
本發(fā)明提供了來自MUC1胞質結構域的肽及其使用方法。這些肽可抑制MUC1的寡聚化，從而在體內預防腫瘤細胞生長，誘導腫瘤細胞凋亡和腫瘤組織的壞死。
文檔編號A61K38/17GK102245632SQ200980149998
公開日2011年11月16日 申請日期2009年10月16日 優(yōu)先權日2008年10月17日
發(fā)明者D·W·庫弗, S·克哈班達 申請人:屬腫瘤有限責任公司, 達娜-法勃腫瘤研究所公司