專利名稱：細(xì)環(huán)病毒分離株和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)環(huán)病毒(Torque teno virus) ( “TTV”)的新核苷酸和氨基酸序列， 包括其新基因型，所有這些用于制備治療和預(yù)防豬和其他動物的疾病的疫苗。按照本發(fā)明實踐提供的疫苗有效對抗多種豬TTV基因型和分離株。診斷和治療用多克隆和單克隆抗體也是本發(fā)明的特征，如在病毒繁殖和疫苗制備中有用的感染性克隆。特別重要的是，其中公開了疫苗，其包含作為抗原的單TTV開放閱讀框的表達蛋白質(zhì)——最特別的是來自O(shè)RFl或 0RF2，以及還包含全長ORFl和0RF2-編碼蛋白質(zhì)的片段。
背景技術(shù)：
細(xì)環(huán)病毒(“TTV”)也被稱為輸血傳染的病毒，其通常被歸于環(huán)病毒科 (Circoviridae)家族。通常認(rèn)為，TTV首先分離自人輸注患者(例如參見Nishizawa等， Biochem. Biophys. Res. Comm. vol. 241，1997，pp. 92—97)。后來，TTV 或 TTV-樣病毒已經(jīng)從包括豬在內(nèi)的其他哺乳動物中得以鑒定，而且很多菌株或分離物已經(jīng)被公布(例如參加 McKeown 等，Vet. Microbiol, vol. 104，2004，pp 113-117)。后來的工作顯示，TTV和TTV-類病毒非常普通；然而，TTV的發(fā)病機理以及其對其他疾病狀態(tài)(例如，由其他病毒和細(xì)菌引起的那些)可能產(chǎn)生的作用仍然是不清楚的。例如，TTV感染在人類中包括甚至在健康個體中看起來是普遍的，而且此類感染通常是無癥狀的，并且保留數(shù)年之久。另外，通常不能在細(xì)胞培養(yǎng)中繁殖該病毒并且缺乏任何明確的機械論疾病模型，這使得TTV生物學(xué)的任何總體表征是困難的。盡管TTV病毒血癥在遭受其他病毒病(諸如肝炎或HIV/AIDS)的人類患者中增加，但是也有相當(dāng)多的醫(yī)學(xué)文獻提出TTV 實際上是無毒性的，并且期待與已知疾病狀態(tài)的任何清楚的實際的聯(lián)系。例如參見Biagini 等，Vet. Microbiol, vol. 98，2004，pp. 95-101。關(guān)于豬，情況類似。有相當(dāng)多的工作提出，TTV感染與很多疾病有關(guān)并促進很多疾病，諸如豬環(huán)狀病毒病(及其各種臨床表現(xiàn)，諸如斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征 (postweaning multisystemic wasting syndrome)和由于肺損害而復(fù)雜化的呼吸系統(tǒng)疾病)和PRRSV-相關(guān)疾病(豬呼吸繁殖綜合征病毒)。例如參見已公布的國際專利申請 W02008/150275和W02008/127279。Krakowka等也報告了豬中一種經(jīng)常致命的疾病，稱為 PDNS (豬皮炎及神經(jīng)病變綜合癥(porcine dermatitis and neuropathy syndrome))，其被描述為彌漫性血管內(nèi)凝血的表現(xiàn)形式，并且由血清型ITTV和PRRSV病毒引起的混合感染可能牽涉其中(Am. J. Vet Res, vol 69 (12)，2008，pp. 1615-1622。PDNS 病也與豬環(huán)狀病毒病 (特別是PCV-2)有關(guān)而且也與細(xì)菌感染相關(guān)。因此，盡管已經(jīng)完成相當(dāng)多的工作，但是決定性關(guān)聯(lián)豬TTV感染與具體病理學(xué)的工作仍然很少。然而，已經(jīng)相當(dāng)清楚的是，TTV感染可加強很多疾病狀態(tài)。因此，對各類TTV試劑存在需求，諸如高親和性抗體，以及例如TTV的肽片段或高度免疫的全毒粒，其促進我們對總體TTV生物學(xué)的理解以及直接或間接對TTV可能作用的很多疾病狀態(tài)接種。因此，盡管TTV是豬疾病的主要病因因子這種可能性存在，但是看起來更可能的是，很多豬疾病需要一種以上的病毒存在，或者某些“主要”病原體的主要作用被TTV感染加強。如所述，通過向受侵襲或潛在受侵襲動物施用抗TTV劑，豬的很多疾病可以被治療或減輕，這種可能性是存在的。盡管對TTV具有廣泛接受的興趣，但是有效的疫苗還沒有出現(xiàn)。TTV是由負(fù)極性單鏈環(huán)狀DNA構(gòu)成的小的無包膜病毒?；蚪M包括三個重疊的主要開放閱讀框0RF1、0RF2和0RF3，并且ORFl編碼衣殼蛋白。(Biagini等，前述)。關(guān)于其詳述討論，請參見下面的參考文獻，其通過參考并入=Kakkola等，Virology, vol. 382(2008)， pp. 182-189 ；Mushahwar 等，Proc. Natl. Acad. Sci, USA, vol 96，(1999)pp. 3177-3182 ；和 Τ. Kekarainen and J. Segales, "Torque teno virus infection in the pig and its potential role as a model of human infection，，, The Veterinary Journal, 2007年 12 月13曰接受，2008發(fā)表。盡管基因組相對簡單，但是在細(xì)胞培養(yǎng)中或通過其他體外方法繁殖病毒通常是非常困難的。本發(fā)明涉及重組構(gòu)建，藉此TTV可以被體外繁殖，包括通過傳染性克隆。更具體而言，本發(fā)明涉及這樣的發(fā)現(xiàn)有效的疫苗實際上可以從TTV制備，最特別的是當(dāng)TTV抗原是單ORF的表達產(chǎn)物或其片段時。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供ORFl蛋白質(zhì)疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供治療或預(yù)防動物中由細(xì)環(huán)病毒(TTV)感染引起的疾病或病癥的方法， 包括由TTV直接引起的疾病狀態(tài)，以及TTV起作用或被其加強的疾病狀態(tài)。在優(yōu)選的實例中，所治療的動物是豬?？杀籘TV加強而且也可以按照本發(fā)明的實踐治療或預(yù)防的豬的疾病狀態(tài)，包括由豬環(huán)狀病毒(PCV)以及豬呼吸繁殖綜合征病毒(PRRQ引起或與之有關(guān)的那些疾病狀態(tài)。本發(fā)明也包括施用組合疫苗，所述組合疫苗即抗原的二價或多價組合，其可以包括對抗非TTV病原體的活抗原、修飾活抗原或滅活抗原，并適當(dāng)選擇佐劑。部分基于如本文所公開的獨特的TTV氨基酸序列，本發(fā)明還提供用于區(qū)分用上述 TTV疫苗接種的豬類動物與感染TTV野毒株(field strains)的豬類動物之間的診斷試劑
品.ο本發(fā)明的代表性實施方式包括分離的多核苷酸序列，所述分離的多核苷酸序列包括選自下述的多核苷酸(al)基因型 2 序歹Ij TTV13 的 DNA (SEQ ID NO 1)；基因型 2 序列 TTV10 的 DNA (SEQ ID NO 2)；或其編碼TTV衣殼蛋白或者所述蛋白質(zhì)片段的片段；(a2)基因型 1 序列的 DNA，選自 ttvgl_7(SEQ ID NO :4)、ttvGTl-17 (SEQ ID NO 5)、ttvGTl-21(SEQ ID NO :6)、ttvgtl_27 (SEQ ID NO :3)、ttvgtl_178 (SEQ ID NO :7)，或其編碼TTV衣殼蛋白或者所述蛋白質(zhì)片段的片段；(b) (a)中任意序列的互補序列；
(c)在嚴(yán)格條件下與(a)或(b)的序列雜交的多核苷酸，所述嚴(yán)格條件定義為在0.5M NaHPO4,7 % SDSUmM EDTA中在65 °C下與濾膜結(jié)合DNA雜交，并在68 °C于 0. 1XSSC/0. 1% SDS 中漂洗；(d)與(a)或(b)的多核苷酸至少70%同源的多核苷酸；(e)與(a)或(b)的多核苷酸至少80%同源的多核苷酸；(f)與(a)或(b)的多核苷酸至少90%同源的多核苷酸；和(g)與(a)或(b)的多核苷酸至少95%同源的多核苷酸。本發(fā)明進一步提供為任何此類DNA多核苷酸序列的互補序列的RNA多核苷酸分子，以及表達任何此類RNA或DNA多核苷酸的載體和質(zhì)粒，和從此類核苷酸序列表達的TTV 病毒的載體和質(zhì)粒，其中所述病毒是活的，或者完全或部分被減毒。本發(fā)明還提供DNA疫苗，所述DNA疫苗包括如前所述的多核苷酸序列和用作感染性克隆的相應(yīng)的核苷酸序列。本發(fā)明提供由基因型2TTV13(SEQ ID NO 1)或基因型2TTV10 (SEQ ID NO 2)多核苷酸的開放閱讀框中任一種編碼的多肽，或者是與所述多肽或與其片段至少90%同源的多肽，包括其他另外相同的氨基酸通過保守置換而被置換的選擇。本發(fā)明還提供由(所有血清型l)ttvgl-7(SEQ ID NO 10)、ttvGTl_17 (SEQ ID NO ll)、ttvGTl-21(SEQ ID NO : 12)、ttvgtl_27 (SEQ ID NO :13)和ttvgtl-178(SEQ ID NO :9) ORFl多核苷酸的開放閱讀框中任一種編碼的多肽，或者與該多肽或與其片段至少90%同源的多肽，包括其他另外相同的氨基酸通過保守置換而被置換的選擇。盡管如在本領(lǐng)域中所報告提供對抗TTV (或者限制TTV加強其他疾病的能力)的有效疫苗連續(xù)失敗，但是本發(fā)明提供此類有效疫苗，其優(yōu)選包含由表達單TTV開放閱讀框產(chǎn)生的多肽或其混合物。在優(yōu)選的實施方式中，多肽從ORFl表達，并且優(yōu)選的混合物包括 ORFl和0RF2以及ORFl和0RF3的多肽組合。在進一步優(yōu)選的實施方式中，并且利用本文公開的大量多肽序列信息，進一步提供多肽疫苗，其中抗原通過下述定義(a) TTV13 (SEQ NO :1)或TTVlO (SEQ ID NO :2)衣殼蛋白的前100個N-端氨基酸；或(b)與其至少90%同源的氨基酸序列；或(c)其富含精氨酸區(qū)域。


圖1 (圖A和B)顯示通過免疫方法對ORFl蛋白質(zhì)的檢測。圖2證實經(jīng)密碼子優(yōu)化的TTVgl ORFl蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的成功表達，利用6X His標(biāo)記進行親和純化。圖3提供Chromos構(gòu)建物pcTV-TTVl-7 ORFl (伴有酵母轉(zhuǎn)化酶)表達質(zhì)粒的載體圖，(在整合進入CHO細(xì)胞中的人工染色體之后)從中表達免疫接種ORFl蛋白質(zhì)。圖4提供各種TTV菌株的系統(tǒng)樹，包括百分比同一性的編譯。圖5(圖A、B和C)通過從各種TTV分離株表達的ORFl蛋白質(zhì)的相同富含精氨酸區(qū)域的鑒定。圖6提供所裝配的TTVgl-178的載體圖。圖7顯示Chromos表達的glTTV ORFl與攻擊對照相比顯著減少肺損害以及再次與攻擊對照(challenge control)相比降低glTTV病毒血癥的程度和持續(xù)時間。序列表說明
SEQIDNO 1提供基因型gt2TTV 10DNA序列。
SEQIDNO 2提供基因型2gt2TTV 13DNA序列。
SEQIDNO 3提供基因型lttvgtl-27DNA序列。
SEQIDNO 4提供基因型lttvgtl-7DNA序列。
SEQIDNO 5提供基因型lttvgtl-17DNA序列。
SEQIDNO 6提供基因型lttvgtl-21DNA序列。
SEQIDNO 7提供基因型lttvgl-178DNA序列。
SEQIDNO 8提供TTV菌株AY823991 ORFl的氨基酸序列。
SEQIDNO 9提供TTV菌株ttvgtl-178 ORFl (TTV基因型1)的氨基酸序列。
SEQIDNO 10提供TTV菌株ttvgtl-70RFl的氨基酸序列。
SEQIDNO :11提供TTV菌株ttvgtl-17 ORFl的氨基酸序列。
SEQIDNO 12提供TTV菌株ttvgtl-21 ORFl的氨基酸序列。
SEQIDNO 13提供TTV菌株ttvgtl-27 ORFl的氨基酸序列。
SEQIDNO :14提供TTV菌株gt2TTV10 ORFl (基因型2)的氨基酸序列。
SEQIDNO 15提供TTV菌株gt2TTV13 ORFl的氨基酸序列。
SEQIDNO :16提供已知菌株AY823991基因型2的DNA序列。
SEQIDNO :17提供已知菌株AY823990基因型1的DNA序列。
SEQIDNO 18提供76057-3TTV衣殼編碼序列，在其克隆進入pUC57 GenScript
載體中時針對大腸桿菌進行密碼子優(yōu)化。SEQ ID NO 19提供76057-4TTV衣殼編碼序列，在其克隆進入hvitrogen pETioi/D- TOPO 表達質(zhì)粒中時針對大腸桿菌進行密碼子優(yōu)化。SEQ ID NO 20提供76057-5TTV衣殼編碼序列，其在克隆進入pUC57 GenScript 載體中時對釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)進行密碼子優(yōu)化。SEQ ID NO 21提供編碼ttvgtl_7 ORFl的具有酵母轉(zhuǎn)化酶表達標(biāo)記(YI)的構(gòu)建物的DNA序列。SEQ ID NO 22提供來自O(shè)RFl衣殼蛋白對應(yīng)殘基167-185的ttvgtl肽序列(基于相應(yīng)的AY823990序列進行編號)，其以酰胺化形式的C-端AA使用。SEQ ID NO 23提供來自O(shè)RFl衣殼蛋白對應(yīng)殘基459-479的ttvgtl肽序列(基于相應(yīng)的AY823990序列進行編號)。SEQ ID NO 24提供來自O(shè)RFl衣殼蛋白對應(yīng)殘基612-637的ttvgtl肽序列(基于相應(yīng)的AY823990序列進行編號)。SEQ ID NO :25 提供 TTV 菌株 AY823990 ORFl 的氨基酸序列。SEQ ID NOS定義引物序列。結(jié)合序列的描述符，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到，很多稍微不同的縮寫通?；Q用于具體血清型，例如，glTTV、TTVgl、基因型1TTV、血清型lTTV、gtlTTV等。基因型2 存在類似的情況。
具體實施例方式下面的定義和介紹性內(nèi)容適用本說明書。術(shù)語“豬的(porcine)”和“豬(swine) ”在本文互換使用并且指的是為豬科 (Suidae)家族成員的任意動物，諸如例如豬(pig)?！安溉閯游铩卑ú溉閯游锞V的任何溫血脊椎動物，包括人類。為了本發(fā)明的目的，“感染性DNA分子”是編碼將病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯到合適的宿主細(xì)胞中的功能毒粒中所必需的元件的DNA分子。同樣，“分離的多核苷酸分子”是指包含本發(fā)明的多核苷酸分子的組合物，所述多核苷酸分子從其天然出現(xiàn)的狀態(tài)純化至任何可檢測的程度，若有的話。為了本發(fā)明的目的，第二多核苷酸分子的核苷酸序列(RNA或DNA)與第一多核苷酸分子的核苷酸序列是“同源的”，或者與所述第一多核苷酸分子具有“同一性”，其中基于遺傳密碼的簡并，第二多核苷酸分子的核苷酸序列編碼與第一多核苷酸分子的核苷酸序列相同的多氨基酸，或者當(dāng)其編碼與第一多核苷酸分子的核苷酸序列所編碼的多氨基酸充分類似的多氨基酸以便用于實踐本發(fā)明的情況。同源多核苷酸序列也指有義和反義鏈，并且在所有情況下是指任意此類鏈的互補序列。為了本發(fā)明的目的，多核苷酸分子用于實踐本發(fā)明，并因此是同源的或具有同一性，其中，其可以被用作診斷探針，以檢測感染豬的流體或組織樣品中TTV病毒或病毒多核苷酸的存在，例如通過標(biāo)準(zhǔn)雜交或擴增技術(shù)。 一般而言，如基于BLASTN算法(美國國家衛(wèi)生研究院國家生物技術(shù)信息中心，另外稱為 NCBI (Bethesda, Maryland, USA))，如果第二多核苷酸分子的核苷酸序列與第一多核苷酸分子的核苷酸序列具有至少約70%的核苷酸序列同一性，則其與第一多核苷酸分子的核苷酸序列是同源的。在根據(jù)本發(fā)明實踐的具體計算實例中，參考BLASTP 2. 2. 6[Tatusova TA and TL Madden,"BLAST 2sequences_a new tool for comparing protein and nucleotide sequences. ” (1999) FEMSMicrobiol Lett. 174 :247-250.]。簡言之，兩個氨基酸序列被比對以最優(yōu)化比對分?jǐn)?shù)，利用下述空位開放罰分10，空位擴展罰分0. 1，以及Henikoff and Henikoff 的 “blosum62” 記分矩陣(Proc. Nat. Acad. ki. USA 89:10915-10919.1992)。百分比同一性然后計算為相同匹配總數(shù)XlOO/較長序列的長度+引入到較長序列中以比對兩個序列的缺口數(shù)目。優(yōu)選地，同源核苷酸序列具有至少約75%的核苷酸序列同一性，甚至更優(yōu)選至少約80^^85^^90%和95%的核苷酸序列同一性。因為遺傳密碼是簡并的，因此同源核苷酸序列可以包括任意數(shù)目的“靜默”堿基變化，即，仍然編碼相同氨基酸的核苷酸置換。同源核苷酸序列還可以含有非靜默突變，S卩，導(dǎo)致編碼的多氨基酸中氨基酸差異的堿基置換、缺失或加成，只要該序列與由第一核苷酸序列編碼的多氨基酸保持至少約 70%的同一性，或另外對實踐本發(fā)明有用。在這方面，可以進行一些保守氨基酸置換，其通常被認(rèn)為不是鈍化總體蛋白質(zhì)功能諸如關(guān)于帶正電的氨基酸(并且反之亦然)，賴氨酸、 精氨酸和組氨酸；關(guān)于帶負(fù)電的氨基酸(并且反之亦然)，天冬氨酸和谷氨酸；以及關(guān)于一些電中性的氨基酸組(并且在所有情況中同樣反之亦然)，(1)丙氨酸和絲氨酸，(2)天冬酰胺、谷氨酰胺和組氨酸，(3)半胱氨酸和絲氨酸，(4)甘氨酸和脯氨酸，(5)異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸，(5)甲硫氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，(6)苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和酪氨酸， (6)絲氨酸和蘇氨酸，(7)色氨酸和酪氨酸，(8)以及例如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。
同源核苷酸序列可以通過比較核苷酸序列來測定，例如通過使用上述BLASTN?？蛇x地，同源核苷酸序列可以通過在選擇條件下雜交來測定。例如，如果第二多核苷酸分子的核苷酸序列在中等嚴(yán)格條件下與SEQ ID N0:1的互補序列雜交，例如在0. 5M NaHPO4,7% 十二烷基硫酸鈉(SDS)、lmM EDTA中在65°C與濾膜結(jié)合DNA雜交，并在0. 2XSSC/0. 1% SDS 中在42°C漂洗(參見Ausubel 等編者，Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, 1994，pp. 6. 0. 3-6. 4. 10)，或者在以其他方式導(dǎo)致編碼TTV病毒的序列雜交的條件(如下定義)下與SEQ ID NO :1的互補序列雜交，則第二多核苷酸分子的核苷酸序列與SEQ ID NO :1(或任何其他特定多核苷酸序列)同源。雜交條件中的變更可以經(jīng)驗確定或基于探針的鳥苷/胞嘧啶(GC)堿基配對的長度和百分比精確計算?？梢匀缭赟ambrook等(Eds.)， Molecular CloninR :A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press :Cold Spring Harbor, New York(1989)，pp. 9. 47to 9. 51 中所述計算雜交條件。在另一實施方式中，如在本領(lǐng)域已知的，如果第二核苷酸序列在高度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 1的互補序列雜交，例如在0. 5MNaHP04,7% SDSUmM EDTA中在65°C與濾膜結(jié)合DNA雜交，并在0. 1XSSC/0. 1% SDS中在68°C漂洗，則第二核苷酸序列與SEQ IDNO 1(或本發(fā)明的任何其他序列)同源。此外應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的分離的多核苷酸分子和分離的RNA分子包括合成分子和通過重組技術(shù)諸如通過體外克隆和轉(zhuǎn)錄獲得的分子。本發(fā)明的多肽和多核苷酸本發(fā)明的典型實施方式包括分離的多核苷酸序列，其包含選自下述的多核苷酸(al)基因型 2 序列 TTV13 的 DNA (SEQ ID NO 1)；基因型 2 序列 TTVlO 的 DNA (SEQ ID NO 2)；或其編碼TTV衣殼蛋白或者所述蛋白質(zhì)片段的片段；(a2)基因型 1 序列的 DNA，選自 ttvgl_7(SEQ ID NO 4)、ttvGTl-17 (SEQ ID NO 5)、ttvGTl-21(SEQ ID NO :6)、ttvgtl_27 (SEQ ID NO :3)、ttvgtl_178 (SEQ ID NO :7)，或其編碼TTV衣殼蛋白或者所述蛋白質(zhì)片段的片段；(b) (a)中任意序列的互補序列；(c)在嚴(yán)格條件下與(a)或(b)的序列雜交的多核苷酸，所述嚴(yán)格條件定義為在0.5M NaHPO4,7 % SDSUmM EDTA中在65 °C與濾膜結(jié)合DNA雜交，并在68 °C于 0. 1XSSC/0. 1% SDS 中漂洗；(d)與(a)或(b)的多核苷酸至少70%同源的多核苷酸；(e)與(a)或(b)的多核苷酸至少80%同源的多核苷酸；(f)與(a)或(b)的多核苷酸至少90%同源的多核苷酸；和(g)與(a)或(b)的多核苷酸至少95%同源的多核苷酸。本發(fā)明也提供由基因型2TTV13(SEQ ID NO 1)或基因型2TTV10 (SEQ ID NO 2) 多核苷酸的開放閱讀框中任一種編碼的多肽，或者與該多肽或與其片段至少90%同源的多肽，包括其他另外相同的氨基酸通過保守置換而被置換的選擇。本發(fā)明還提供由(所有血清型l)ttvgl-7(SEQ ID NO 10)、ttvGTl_17 (SEQ ID NO ll)、ttvGTl-21(SEQ ID NO : 12)、ttvgtl_27 (SEQ ID NO :13)和ttvgtl-178(SEQ ID NO :9) ORFl多核苷酸的開放閱讀框中任一種編碼的多肽，或者與該多肽或與其片段至少90%同源的多肽，包括其他另外相同的氨基酸通過保守置換而被置換的選擇。
在優(yōu)選的實施方式中，多肽從ORFl表達，并且優(yōu)選的混合物包括ORFl和0RF2以及ORFl和0RF3的多肽組合。在進一步優(yōu)選的實施方式中，進一步提供TTV多肽類疫苗，其中抗原通過下述定義(a) TTV13(SEQ NO :1)或 TTV10(SEQ ID NO :2)的 ORFl 衣殼蛋白的前 300 個 N-端氨基酸；或(b)與其至少90%同源的氨基酸序列；(b)TTV13(SEQ NO 1)或 TTVlO (SEQ ID NO 2)的 ORFl 衣殼蛋白的前 200 個 N-端氨基酸；或(b)與其至少90%同源的氨基酸序列；(c)TTV13(SEQ NO 1)或 TTVlO (SEQ ID NO 2)的 ORFl 衣殼蛋白的前 100 個 N-端氨基酸；或(b)與其至少90%同源的氨基酸序列；(d)(所有血清型 l)ttvgl-7(SEQ ID NO 10)、ttvGTl-17 (SEQ ID N0:11)、 ttvGTl-21(SEQ ID NO : 12)、ttvgtl_27 (SEQ ID NO : 13)和 ttvgtl-178 (SEQ ID NO :9)中任一種的ORFl衣殼蛋白的前300個N-端氨基酸，或與其至少90%同源的多肽；(e)(所有血清型 l)ttvgl-7(SEQ ID NO 10)、ttvGTl-17 (SEQ ID N0:11)、 ttvGTl-21(SEQ ID NO : 12)、ttvgtl_27 (SEQ ID NO : 13)和 ttvgtl-178 (SEQ ID NO :9)中任一種的ORFl衣殼蛋白的前200個N-端氨基酸，或與其至少90%同源的多肽；和(f)(所有血清型 l)ttvgl-7(SEQ ID NO 10)、ttvGTl-17 (SEQ ID N0:11)、 ttvGTl-21(SEQ ID NO : 12)、ttvgtl_27 (SEQ ID NO : 13)和 ttvgtl-178 (SEQ ID NO :9)中任一種的ORFl衣殼蛋白的前100個N-端氨基酸，或與其至少90%同源的多肽。更多的遺傳操作由本發(fā)明提供的DNA和氨基酸序列信息也使得系統(tǒng)分析病毒基因及其編碼基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能成為可能。編碼本發(fā)明的病毒基因產(chǎn)物的多核苷酸的知識也使得識別并雜交編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的反義多核苷酸或其片段可用。全長和片段反義多核苷酸在本方面是有用的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的片段反義分子包括(i)特異性識別并雜交特定RNA (如通過編碼本發(fā)明的病毒多肽的DNA的序列比較所測定)的那些，以及 ( )識別并雜交編碼編碼蛋白質(zhì)的變體的RNA的那些。與編碼其他TTV肽的RNA/DNA雜交的反義多核苷酸通過序列比較來鑒定特征或通過分子家族的特征序列也是可鑒定的。此類技術(shù)(見實施例8)在研究TTV多肽中的抗原結(jié)構(gòu)域方面也有用，并且還可以用于區(qū)分感染環(huán)病毒科的遠(yuǎn)程相關(guān)的非TTV成員的宿主動物。實施例4提供關(guān)于有效的密碼子優(yōu)化以增強本發(fā)明的構(gòu)建物在酵母和大腸桿菌中的表達的指導(dǎo)。疫苗制劑本發(fā)明的疫苗可以按照公認(rèn)的習(xí)慣配制，以包含包括人(如果適用)在內(nèi)的動物可接受的載體，諸如標(biāo)準(zhǔn)緩沖劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑和/或增溶劑，并且還可以被配制成便于持續(xù)釋放。稀釋劑包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油和類似物。等滲性添加劑包括氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖及其他。穩(wěn)定劑包括白蛋白及其他。其他合適的疫苗媒介物和添加劑，包括配制改進活疫苗特別有用的那些，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的， 或者對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。例如參見Remington' s Pharmaceutical Science, 18th ed.，1990，Mack Publishing，其通過參考并入本文。
本發(fā)明的疫苗還可以包含一種或多種另外的免疫調(diào)節(jié)組分，諸如例如佐劑或細(xì)胞因子，以及其他。可以用在本發(fā)明的疫苗中的佐劑的非限定性實例包括RIBI佐劑體系 (Ribi Inc.，Hamilton, MT)、明礬、礦物凝膠諸如氫氧化鋁凝膠、水包油乳狀液、油包水乳狀液諸如例如弗氏完全和不完全佐劑、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)、QS-21 (Cambridge Biotech Inc. ， Cambridge MA)、 SAF-M (Chiron, Emeryville CA) > AMPHIGEN 1i ^O > 苷、Quil A或其他皂苷組分(saponin fraction)、一磷酰脂質(zhì)Α、離子多糖和阿夫立定脂質(zhì)-胺佐劑。用于本發(fā)明疫苗的水包油乳狀液的非限定性實例包括改性SEAM62和SEAM1/2 制劑。改性 SEAM62 是含 5 % (ν/ν)角鯊烯(Sigma)、1 % (v/v) SPAN 85 去污劑(ICI Surfactants) ,0. 7% (v/v) TWEEN 80 去污劑(ICI Surfactants) ,2. 5% (v/v)乙醇、 200 μ g/ml Quil A、100 μ g/ml膽固醇和0. 5% (v/v)卵磷脂的水包油乳狀液。改性SEAMV2 是含 5% (v/v)角鯊烯、(v/v) SPAN 85 去污劑、0.7% (v/v)Tween 80 去污劑、2. 5% (v/v)乙醇、100μ g/ml Quil A和50 μ g/ml膽固醇的水包油乳狀液。可以被包括在疫苗中的其他免疫調(diào)節(jié)劑包括例如一種或多種白細(xì)胞介素、干擾素或其他已知的細(xì)胞因子。另外的佐劑體系允許結(jié)合T輔助細(xì)胞和B細(xì)胞表位，產(chǎn)生一種或多種類型的共價 T-B表位連接結(jié)構(gòu)，其可以另外被脂質(zhì)化(with may be additionally lipdated)，諸如在 W02006/084319, W02004/014957 和 W02004/014956 中所述的那些。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，ORFI TTV蛋白質(zhì)或其他TTV蛋白質(zhì)或其片段用5% AMPHIGEN 配制。本發(fā)明的疫苗可以任選被配制用于持續(xù)釋放本發(fā)明的病毒、感染性DNA分子、質(zhì)?；虿《据d體。此類持續(xù)釋放制劑的實例包括與生物相容性聚合物復(fù)合材料結(jié)合的病毒、 感染性DNA分子、質(zhì)?；虿《据d體，所述聚合物諸如例如聚乳酸、乳酸乙醇酸共聚物、甲基纖維素、透明質(zhì)酸、膠原等。在藥物遞送媒介物中可降解聚合物的結(jié)構(gòu)、選擇和用途已經(jīng)在數(shù)個出版物中進行綜述，包括 A. Domb 等，1992，Polymers for Advanced Technologies 3 279192，其通過參考并入本文。選擇和應(yīng)用藥物制劑中的聚合物的其他指導(dǎo)可以在本領(lǐng)域已知的教科書中找到，例如M. Chasin and R. Langer (eds), 1990,"Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems，，in :Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol.45, M. Dekker, NY，其也通過參考并入本文。可選地，或另外地，病毒、質(zhì)?；虿《据d體可以被微囊包埋以改進施用和功效。微囊包埋抗原的方法在本領(lǐng)域是熟知的，并且包括例如在美國專利3，137，631 ；美國專利3，959，457 ；美國專利4，205，060 ；美國專利4，606，940 ；美國專利4，744, 933 ；美國專利5，132，117 ；和國際專利公布W095/28227中描述的技術(shù)，所有這些通過參考并入本文。脂質(zhì)體也可以用于提供病毒、質(zhì)粒、病毒蛋白或病毒載體的持續(xù)釋放。關(guān)于如何制備和使用脂質(zhì)體制劑的詳情可在美國專利4，016，100 ；美國專利4，452，747 ；美國專利 4，921，706 ；美國專利4，927，637 ；美國專利4，944，948 ；美國專利5，008，050 ；和美國專利 5，009, 956以及其他地方找到，所有這些通過參考并入本文。上述疫苗任一種的有效量可以通過常規(guī)方法確定，開始于低劑量病毒、病毒蛋白質(zhì)?；虿《据d體，然后增加劑量同時監(jiān)控效果。有效量可以在單次施用疫苗之后或者在多次施用疫苗之后獲得。當(dāng)確定最佳劑量/動物時可以考慮已知的因素。這些包括動物的種類、大小、年齡和一般狀況，動物中其他藥物的存在，及類似因素。實際劑量優(yōu)選在考慮來自其他動物研究的結(jié)果之后來選擇(例如參見下面的實施例2和3)。一種檢測是否已經(jīng)達到適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答的方法是在接種之后測定動物中的血清轉(zhuǎn)變和抗體滴度(antibody titer)。接種的時間選擇和加強的數(shù)目——如果存在的話—— 優(yōu)選由醫(yī)生或獸醫(yī)基于分析所有相關(guān)因素來決定，這些因素中的一些在上面描述。本發(fā)明的病毒、蛋白質(zhì)、感染性DNA分子、質(zhì)粒或病毒載體的有效劑量可以利用已知技術(shù)并考慮可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的因素諸如待被接種的動物的重量來確定。本發(fā)明的病毒在本發(fā)明疫苗中的劑量優(yōu)選在約IO1至約IO9Pfu(噬斑形成單位)的范圍內(nèi)，更優(yōu)選約IO2至約l(fpfu，以及最優(yōu)選約IO3至約l(fpfu。本發(fā)明的質(zhì)粒在本發(fā)明疫苗中的劑量優(yōu)選在約0. 1μ g至約IOOmg的范圍內(nèi)，更優(yōu)選約1μ g至約10mg，甚至更優(yōu)選約10 μ g至約 Img0本發(fā)明的感染性DNA分子在本發(fā)明疫苗中的劑量優(yōu)選在約0. 1 μ g至約IOOmg的范圍內(nèi)，更優(yōu)選約Iyg至約10mg，甚至更優(yōu)選約IOyg至約lmg。本發(fā)明的病毒載體在本發(fā)明疫苗中的劑量優(yōu)選在約IO1Pfu至約IO9Pfu的范圍內(nèi)，更優(yōu)選約IO2Pfu至約108pfu，甚至更優(yōu)選約IO3至約l(fpfu。合適的劑量大小在約0. 5ml至約IOml的范圍內(nèi)，更優(yōu)選約Iml至約 5ml。按照本發(fā)明的實踐病毒蛋白或肽疫苗的合適劑量范圍通常是1至50微克/劑量或更高的量，這可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法確定，其中佐劑的量通過關(guān)于每種此類物質(zhì)的公認(rèn)的方法確定。在與豬接種相關(guān)的本發(fā)明的優(yōu)選實例中，動物的最適宜年齡目標(biāo)在約1天與21 天之間，其在斷奶前(at pre-weening)也可以符合其他預(yù)定的接種諸如抗豬肺炎支原體 (Mycoplasma hyopneumoniae)。另外，育種母豬的優(yōu)選接種時間表包括類似的劑量，并安排每年再接種。^^本發(fā)明還考慮抗-TTV抗體(例如，單克隆和多克隆抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、人源化、人、豬和⑶R-嫁接抗體，包括包含特異性識別本發(fā)明的TTV多肽的⑶R序列的化合物)。術(shù)語“特異性”表示本發(fā)明的抗體的可變區(qū)專有識別和結(jié)合TTV多肽(即，盡管在多肽家族中發(fā)現(xiàn)的序列同一性、同源性或相似性，其能區(qū)別單TTV多肽與相關(guān)多肽)，并且其被允許(任選地)通過與抗體可變區(qū)外具體而言Ab分子恒定區(qū)中的序列相互作用而與其他蛋白質(zhì)相互作用(例如，金黃色釀膿葡萄球菌(S. aureus)蛋白質(zhì)A或ELISA技術(shù)中的其他抗體)。測定本發(fā)明抗體的結(jié)合特異性的篩選試驗是熟知的并且在本領(lǐng)域被常規(guī)實踐。 關(guān)于此類試驗的綜合討論，參見 Harlow 等(Eds)，Antibodies ALaboratory Manual ；Cold Spring Harbor Laboratory ； Co Id Spring Harbor, NY (1988), Chapter 6。識別并結(jié)合本發(fā)明TTV多肽的片段的抗體也考慮在內(nèi)，條件是所述抗體首先并首要對所述片段所源自的本發(fā)明的TTV多肽具有特異性，如上定義。為清楚起見，“抗體”是指作為對特異性抗原免疫應(yīng)答的結(jié)果可以與該抗原結(jié)合的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白是由具有“恒定區(qū)”和“可變區(qū)”的“輕”和“重”多肽鏈組成的血清蛋白質(zhì)，并且基于恒定區(qū)的組成被分類(例如，IgA, IgD, IgE, IgG和IgM)?？贵w可以以多種形式存在，包括例如？￥1油’1(油’)2，以及以單鏈存在，并且包括合成多肽，其含有一個或多個抗體單鏈多肽序列的全部或部分。診斷試劑盒本發(fā)明還提供診斷試劑盒。所述試劑盒對區(qū)分自然感染TTV病毒野毒株的豬類動物與用本文所述的任意TTV疫苗接種的豬類動物可以是有價值的。該試劑盒還可以是有價值的，原因在于潛在感染TTV病毒野毒株的動物可以在臨床癥狀存在之前被檢測到并從群中移走，或者遠(yuǎn)離幼稚或接種動物進行隔離。試劑盒包括試劑，用于分析來自豬類動物的樣品是否存在指定TTV病毒的特定組分的抗體。本發(fā)明的診斷試劑盒可以包括來自0RF1、2 或3的肽或多個肽作為組分，其在野毒株中但不是在感興趣的疫苗中存在，或者反之亦然， 并且通過如在說明書實施例1和2中提供的廣泛氨基酸測序使得選擇此類合適的肽結(jié)構(gòu)域成為可能。如本領(lǐng)域已知的，本發(fā)明的試劑盒可以可選地包括經(jīng)由融合蛋白質(zhì)提供的肽作為組分。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“融合肽”或“融合蛋白質(zhì)”意指由TTV病毒蛋白質(zhì)，優(yōu)選 0RF1，的至少一部分和異源肽或蛋白質(zhì)組成的單多肽鏈。實施例實施例1豬TTV全基因組的克隆A. TTV 基因型 2.利用DNA血液小試劑盒(blood mini kit) (Qiagen)按照制造商的方案，從豬血清純化DNA。在50 μ L Tris-EDTA緩沖液中從柱中洗脫出DNA。然后經(jīng)由隨機引物滾環(huán)擴增 (random primed rolling circle amplification)擴增 DNA。簡言之,然后將 5uL 純化 DNA 禾口 IOOng 隨機六聚體(random hexamers) (Invitrogen)力口至 71 μ 1 /K并在 95°C力口熱 3min 且在冰上冷卻。然后添加ImM dNTP’ s、100ng隨機六聚體(Invitrogen)、1 XphU9聚合酶緩沖液和1 μ L phi29聚合酶，并將反應(yīng)在30°C溫育過夜。將總體積的五分之一用EcoRI消化并在0. 8% Ε-gel (Invitrogen)上電泳以檢測 2. 7kB片段的存在。利用Qiagen PCR純化試劑盒按照制造商的方案純化EcoRI消化的材料并連接到EcoRI消化的/蝦堿性磷酸酶處理的pGem3zf(+)載體(ftOmega)中。連接DNA 用于化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(competent Ε. coli)DH5a。在LB/amp瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。使質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)化菌落分離并用EcoRI消化以驗證約2. 7kB插入片段存在。選擇四個克隆G、7、10和13)并提交至ACGT，Inc.進行序列測定。序列數(shù)據(jù)的比對表明，克隆 10和13顯示與TTV公布序列同源，并且相比基因型1其比對更接近TTV基因型2。這些克隆隨后被命名為TTVlO和TTV13。PAH TTV基因型2測序數(shù)據(jù)分析.TTV13(SEQ ID NO 2)和 TTVlO (SEQ ID NO :1)與公布的 TTV基因型 2AY823991DNA 序列(SEQ ID NO 16)的核苷酸比對。
(1)TCATGACAGGGTTCACCGGAAGGGCTGCAAAA-TTACAGCTAAAACCACA (1)TAATGACAGGGTTCACCGGAAGGGCTGCAAAA-TTACAGCTAAAACCACA (1)TAATGACAGGGTTC-CAGGAAGTGCTGCAAAAATTACAGCTAAAACCACA (50)AGT-CTAACACAATAAACCACAAAGTATTACAGGAAACTGCAATAAATTT (50)AAT-CTAACACAATAAACCACAAAATATTACAGGAAACTGCAATAAATTT (50)ACTACTTACACAT—AACCACAAAATATTTCAGGAAACTGCAATAATTTT
(99) AGAAATAAGTTACACATAACCACCA------------AACCACAGGAAAC
(99) AGAAATAAATTACACATAACCACCA------------AACCACAGGAAAC
(98)CAACACACATTGCACAAAACCACAAGATATCAACATAAACCACAGGAAACAY823991
TTV13
TTVlO
AY823991
TTV13
TTVlO
AY823991
TTV13
TTVlO
AY823991(137TGTGCAAAAAAGAGGAAATAAATTTCATTGGCTGGGCCTGAAGTCCTCAT
TTV13(137TCTGCAAAAAAGAGGAAATAAATTTCATTGGCTGGTCCATAAGTCCTCAT
TTVlO(148TCTGCAAAAAAGAGGAAGTAAATGCTATTGGCTAAATCTGAAGTCTTCAT
AY823991(187TAGAATAATAAAAGAACCAATCAGAAGAACTTCCTCTTTTAGAGTATATA
TTV13(187TAGAATACAAAAAGAACCAATCAGAAACACTTCCTCTTTTAGAGTATATA
TTVlO(198TAGCATACACAACCAACCAATCAGAAACACTTCCTCATTTGAAGTATATA
AY823991(237AGTAAGTGCGCAGACGAATGGCTGAGTTTATGCCGCTGGTGGTAGACACG
TTV13(237AGTAAGTGCGCAGACGAATGGCTGAGTTTATGCCGCTGGTGGTAGACACG
TTVlO(248AGTAAATGCGCAGACGAATGGCTGAGTTTATGCCGCTGGTGGTAGACACG
AY823991(287AACAGAGCTGAGTGTCTAACCGCCTGGGCGGGTGCCGGAGCTCCTGAGAG
TTV13(287AACAGAGCTGAGTGTCTAACCGCCTGGGCGGGTGCCGGAGCTCCTGAGAG
TTVlO(298AACAGAGCTGAGTGTCTAACCGCCTGGGCGGGTGCCGGAGCTCCAGAGAG
AY823991(337CGGAGTCAAGGGGCCTATCGGGCAGGCGGTAATCCAGCGGAACCGGGCCC
TTV13(337CGGAGTCAAGGGGCCTATCGGGCAGGCGGTAATCCAGCGGAACCGGGCCC
TTVlO(348CGGAGTCAAGGGGCCTATCGGGCGGGCGGTAATCCAGCGGAACCGGGCCC
AY823991(387CCC-TCGATGGAAGAAAGATGGCTGACGGTAGCGTACTGCGCACACGGAT
TTV13(387CCCCTCCATGGAAGAAAGATGGCTGACGGTAGCGTACTGCGCCCACGGAT
TTVlO(398CCC-TCCATGGAGGAGAGATGGCTGACGGTAGCGTACGCCGCCCACGGAT
AY823991(436TATTCTGCAGCTGTAAAGACCCGAAAAAACATCTTGAAAAATGCCTTACA
TTV13(437TATTCTGCGACTGTAAAGACCCGAAAAAACATCTTGAAAAATGCCTTACA
TTVlO(447TATTCTGCGCCTGCAGTAAGCCCAAAGACCACCTTGAAAAATGCCTTTCC
AY823991(486GACGCTATCGCAGACGCCGAAGAAGACCGACACGGAGATGGAGGCACCGG
TTV13(487GACGCTATCGCAGACGCCGAAGGAGACCGACAAGAAGATGGAGGCACCGG
TTVlO(497ACCGCTATCGCCGACGCCGAAGGAGACCCACCAGGAGATGGAGGAGAAGG
AY823991(536AGGTGGAGACGCTACTTTCGATATCGGTATCGACGCGCTCCTCGCCGCCG
TTV13(537AGGTGGAGACGCTACTTTCGATATCGGTATCGACGCGCTCCTCGCCGCCG
TTVlO(547AGGTTCCAGCGCTACTTTCGATATCGGTATAGACGCGCTCCTCGCCGCCG
AY823991(586CCG-—CACAAAGGTAAGGAGACGGAGG—AAAAAAGCTCCGGTCATAC
TTV13(587CCG-—CACAAAGGTAAGGAGACGGAGG—AGGAAAGCTCCGGTCATAC
TTVlO(597CCGACGCTACAAGGTAAGGAGACGGAGGGTTAAAAAGGCTCCGGTCATTC
AY823991(630AATGGTTCCCTCCTAGCCGGAGAACCTGCCTCATAGAGGGATTTTGGCCG
TTV13(631AATGGAACCCTCCTAGCCGGAGGACCTGCCTCATAGAGGGGTTCTGGCCG
TTVlO(647AATGGTTCCCCCCAACAGTCAGAAACTGTTTTATCAAGGGAATCTGGCCG
AY823991(680TTGAGCTACGGACACTGGTTCCGTACCTGTCTCCCCTTTAGGCGGTTAAA
TTV13(681TTGAGCTACGGACACTGGTTCCGTACCTGTCTCCCCTTTAGAAGAAAAAA
TTVlO(697TTGAGCTACGGACACTGGCTCCGTACCTGTCTCCCTATGAGAAAAGAAAA
AY823991(730TGGACTAGTATTCCCGGGTGGAGGTTGTGACTGGAGCCAGTGGAGTTTAC
TTV13(731TGGACTAATATTTACGGGAGGAGGTTGTGACTGGACTCAGTGGAGCTTAC
TTVlO(747CGGACTCATATTCCTAGGAGGTGGCATAGACTGGACTGTCTGGAGTTTAC
AY823991(780)AAAACCTTTACAATGAAAAACTTAACTGGAGAAATATATGGACAGCTAGT
TTV13(781)AAAACCTTTATCATGAAAAACTAAACTGGAGAAATATATGGACAGCTAGT
TTVlO(797)AGAATCTATACCATGAAAAACTAAACTGGAGGAATGTGTGGACTTCTTCA
AY823991(830)AATGTTGGAATGGAATTCGCTAGATTTTTAAAAGGAAAGTTTTACTTTTT
TTV13(831)AACGTGGGAATGGAATTCGCTAGATTTTTAAAAGGAAAATTCTACTTTTT
TTVlO(847)AATGATGGCATGGAGTTCGCTAGATTCAGATATGCAAAGTTTAAATTTTT
AY823991(880)CAGACATCCATGGAGAAATTATATAATAACTTGGGATCAAGATATACCAT
TTV13(881)TAGACATCCTTGGAGAAACTATATAGTGACTTGGGATCAGGACATTCCTT
TTVlO(897)TAGACACACAACCAGATCCTACGTAGTAACATGGGACCAAGACATACCAT
AY823991(930)GCAGGCCACTACCTTATCAAAACCTGCATCCACTCCTAATGCTACTAAAA
TTV13(931)GTAAACCTTTACCATATCAGAACTTACACCCATTATTAATGCTATTAAAA
TTVlO(947)GTAAACCTTTACCATACACAAATTTACATCCATTTGTAATGCTTCTAAAA
AY823991(980)AAACAGCACAAAATTGTACTTTCACAGCAAAACTGTAACCCAAACAGAAA
TTV13(981)AAACAACACAAATTAGTACTCTCACAACAAAACTGTAACCCTAACAGAAA
TTVlO(997)AAACATCATAAAGTAGTTCTAAGCAAACAAGACTGTAATCCTAGAAAAAT
AY823991(1030)ACAAAAACCTGTCACATTAAAATTCAAACCTCCGCCAAAACTAACATCAC
TTV13(1031)ACAAAAACCTGTAACTTTAAAATTCAGACCGCCACCAAAACTAACTTCAC
TTVlO(1047)GGACAAACCAGTCACCTTAAAAATAAAGCCACCACCAAAACTCACATCAC
AY823991(1080)AATGGAGACTAAGTAGAGAATTAGCAAAGATGCCACTAATAAGACTTGGA
TTV13(1081)AATGGAGACTAAGTAGAGAATTAGCAAAAATGCCACTCATTAGACTAGGA
TTVlO(1097)AGTGGAGACTAAGCAGAGAATTATCAAAAATACCGCTCTTAAGACTAGGA
AY823991(1130)GTAAGCTTTATAGACCTAACAGAACCATGGGTAGAAGGGTGGGGAAATGC
TTV13(1131)GTTAGTTTTATAGACTTAACAGAACCGTGGCTAGAAGGTTGGGGAAATGC
TTVlO(1147)GTTTCTTTAATAGACTTCAGAGAACCATGGGTTGAAGGTTTTGGAAATGC
AY823991(1180)ATTTTATTCCGTGCTAGGATATGAAGCAGTAAAAGACCAAGGACACTGGT
TTV13(1181)ATTTTACTCAGTACTAGGATATGAAGCCATAAAAGAACAAGGACACTGGT
TTVlO(1197)ATTCTTTAGTACTTTAGGATATGAAGCAGATAAAAGCAATTTAAAAACAA
AY823991(1230)CAAACTGGACACAAATAAAATACTATTGGATCTATGACACGGGAGTAGGA
TTV13(1231)CAAATTGGTCACAAATTAAATATTACTGGATATATGATACAGGAGTAGGA
TTVlO(1247)GCGCTTGGTGCCAATGTAAATACTTCTGGATATATGATACCGGAGTAAAT
AY823991(1280)AATGCAGTATATGTTATACTATTAAAAAAAGACGTTACTGATAATCCAGG
TTV13(1281)AATGCTGTATATGTAGTTATGCTAAAACAAGATGTAGACGACAACCCAGG
TTVlO(1297)AATCATGTATATGTAGTCATGTTAAACAAAGACGCAGGAGATAATGCAGG
AY823991(1330)AAACATGGCAACAACCTTTAAAGCATCAGGAGGACAGCATCCAGATGCAA
TTV13(1331)AAAAATGGCATCAACATTTAAAACAACTCAGGGACAACATCCCAATGCTA
TTVlO(1347) AGACCTAATAACAA------------------------ATCAAAACTCAA
AY823991(1380)TAGATCACATTGAATTGATAAACCAAGGATGGCCTTACTGGTTATACTTT
TTV13(1381)TAGATCACATAGAATTAATAAATGAAGGATGGCCGTACTGGTTATACTTT
TTVlO(1373)TAGCACACATAGAACAGATAGGAGAAGGTTATCCATACTGGTTATATTTT
AY8239911430TATGGTAAAAGTGAACAAGACATTAAAAAAGAGGCACAC-—AGCGCAGA
TTV131431TTTGGTAAAAGTGAACAAGACATAAAAAAGGAAGCACAT-—AGCGCTGA
TTVlO1423TTTGGAAGATCTGAAAGAGACTTAAAAGCACTAGCAACTTCAAACACAAA
AY8239911477AATATCAAGAGAATATACTAGAGACCCAAAATCTAAAAAACTAAAAATAG
TTV131478AATAGCAAGAGAATATGCTACAAATCCAAAATCAAAAAAAACTAAAAATAG
TTVlO1473CATAAGAAACGAATTCAATACTAATCCTAACAGCAAAAAATTAAAAATAG
AY8239911527GAATAGTAGGATGGGCATCTTCAAACTACACAACAACAGGCAGTGATCAA
TTV131528GAATAGTAGGATGGGCATCCTCTAACTTCACAACACCAGGCAGTTCACAA
TTVlO1523CTGTAATAGGATGGGCTAGCAGTAACAACACAGCACAAGATAGTACACAA
AY8239911577AACAGTGGTGGATCAACATCAGCTATACAAGGTGGATATGTAG-----CA
TTV131578AACTCAGGGGGAAATATAGCAGCAATACAAGGAGGATACGTAG-----CA
TTVlO1573---------GGAGCGAATACTCCAATAGAAGGAACATATTTAATATCACA
AY8239911622TATGC-AGG-GTCCGGGGTCA--------TAGGAGCAGGGTCAATAGGAA
TTV131623TGGGC-AGGAGGACAAGGAAAACTAAATCTAGGAGCAGGATCAATAGGAA
TTVlO1614TGTGCTACAAACATCAGGACATACAG-—CAGGAGCAGCACAAATAAATA
AY8239911662ATTTATATCAACAAGGATGGCCATCTAATCAAAACTGGCCTAATACAAAC
TTV131672ATTTGTACCAACAAGGATGGCCATCAAATCAAAACTGGCCAAATACAAAC
TTVlO1661ACCTATTCGCCTCTGGATGGCCTAACTCTCAAAACTATCCACCTTTAAAT
AY8239911712AGAGACAAAACAAACTTTGACTGGGGAATACGAGGACTATGTATACTCAG
TTV131722AGAGACGAAACTAACTTTGATTGGGGACTCAGATCACTTTGTATACTAAG
TTVlO1711CTAGACAAAAACAACTTTGACTGGGGAAAAAGAGCGCTATGTATACTAAG
AY8239911762AGATAACATGCACTTAGGAAGCCAAGAATTAGATGATGAATGCACAATGC
TTV131772AGATAACATGCAATTAGGAAATCAAGAATTAGATGATGAATGTACCATGC
TTVlO1761AAACAACATGAAAATTGGAAACCAAAATTTAGATGATGAGACCACTAT
AY8239911812TCACATTGTTCGGACCCTTTGTAGAAAAAGCAAATCCAATATTTGCAACA
TTV131822TCTCACTCTTTGGACCTTTTGTAGAAAAAGCAAATCCAATATTTGCAACA
TTVlO1811TTGCCCTCTTCGGACCCTTGGTAGAAAAAGCAAA-CTGGGAAGGCCTAGA
AY8239911862ACAGACCCTAAATTCTTTAAACCTGAACTCAAAGACTATAATATAATCAT
TTV131872ACAGACCCTAAATACTTTAAACCAGAACTAAAAGACTATAATTTAATCAT
TTVlO1860AAAAATACCAGAA—CTAAAACCAGAACTCAAAGACTATAATATCTTAAT
AY8239911912GAAATATGCCTTTAAATTTCAGTGGGGAGGACATGGCACAGAAAGATTTA
TTV131922GAAATATGCCTTTAAATTCCAGTGGGGAGGACATGGCACAGAAAGATTTA
TTVlO1908GAGATATAACTTTCGCTTTCAGTGGGGCGGACACGGAACAGAGACCTTCA
AY8239911962AAACCAACATCGGAGACCCCAGCACCATACCCTGCCCCTTCGAACCCGGG
TTV131972AAACAACCATCGGAGACCCCAGCACCATACCCTGCCCCTTCGAACCCGGG
TTVlO1958AAACAAGTATTGGAGACCCCAGCCAAATACCCTGTCCCTACGGACCAGGT
AY8239912012GACCGCTTCCA-CAGCGGGATACAAGACCCCTCCAAGGTACAAAACACCG
TTV132022GACCGCTTCCA-CAGCGGGATACAAGACCCCTCCAAGGTACAAAACACCG
TTVlO2008GAAGCCCCCCAACACCTTGTCAGGA-ACCCCTCCAAGGTACACGAGGGGG
15
AY8239912061TCCTCAACCCCTGGGACTATGACTGTGATGGGATTGTTAGAAAAGATACT
TTV132071TCCTCAACCCCTGGGACTATGACTGTGATGGGATTGTTAGAAAAGATACT
TTVlO2057TCCTCAATGCGTGGGATTATGACTATGATGGAATTGTTAGAAAAGACACT
AY8239912111CTCAAAAGACTTCTCGAACTCCCCACAGAGACAGAGGAGGAGGAGAAGGC
TTV132121CTCAAAAGACTTCTCGAACTCCCCACAGAGACAGAGGAGGAGGAGAAGGC
TTVlO2107CTCAAAAGACTGCTTGCCATCCCCACAGACTC-—GGAGGAGGAGAAAGC
AY8239912161GTACCCACTCCTTGGACAAAAAACAGAGAAAGAGCCATTATCAGACTCCG
TTV132171GTACCCACTCCTTGGACAAAAAACAGAGAAAGAGCCATTATCAGACTCCG
TTVlO2154GTACCCGCTCGCTGGACCCAAAACAGAGAAATTGCCCTCCTCAGACGAAG
AY8239912211ACGAAGAGAGCGTTATCTCAAGCACGAGCAGTGGATCCTCTCAAGAA-—
TTV132221ACGAAGAGAGCGTTATCTCAAGCACGAGCAGTGGATCCGATCAAGAA—
TTVlO2204AAGGAGAGAGCGATATCAGTTCTTCGAGCGACTCATCGACGCAAGAAAGC
AY8239912258GAAGAAACGCAGAGAC-—GAAGACACCACAAGCCAAGCAAGCGACGACT
TTV132268GAAGAGACGCAGAGAC-—GAAAGCACCACAAGCCAAGCAAGCGACGACT
TTVlO2254GAAGAAGAGAAGAGATACAGAAGACGACACAAGCCCTCAAAGCGAAGACT
AY8239912305CCTCAAGCACCTCCAGCGGGTGGTAAAGAGGATGAAAACACTGTGATAGA
TTV132315CCTCAAGCACCTCCAGCGGGTGGTAAAGAGGATGAAAACACTGTGATAGA
TTVlO2304CCTCCAGCATGTCCAGCGACTGGTGAAGAGATTCAGGACCCT-—ATAGA
AY8239912355TAAATATAGAAACCTAGCAGACCCCTCACTCAATGTCACAGGACACATGG
TTV132365TAAATACAGAAACCTAGCAGACCCCTCACTCAATGTCACAGGACACATGG
TTTVlO2351CAAATACAGAAACTTAGCAGACCCCTCATTAAATGTCACAGGACATTTTG
AY8239912405AAAAATTCATGCAGTTACATATTCAAAACGTACAAGAAATAAGAGCTAAA
TTV132415AAAAATTCATGCAACTACATATCCAAAACATACAAGAAATAAGAGCTAAA
TTVlO2401AACACTTCTGCCGCTTACACTATAAAAACATAGCAGAAATCAGAGCTAGA
AY8239912455AATGCTAAAAAATCCCTCAATAAACTTTACTTTTCTGATTAATAGCGGCC
TTV132465AATGCTAAAAAATCCCTCAATAAACTTTACTTTTCTGATTAATAGCGGCC
TTVlO2451AATGCCAAAAAAAACCTCAATAAACTATACTTTTCAGACTAAAAGAAG—
AY8239912505TCCTGTGTCCAACCTATTTTTCCTAAACCCCTTCAAAATGGCGGGCGGGA
TTV132515TCCTGTGTCCAATCTATTTTTTTAAACACCCTTCAAAATGGCGGGAGGGA
TTVlO2499TTT--------ATTTCTTTATTTAAAACACC-------------------
AY8239912555CACAAAATGGCGGAGGGACTAAGGGGGGGGCAAGCCCCCCTNNNNNNNNN
TTV132565CACAAAATGGCGGAGGGACTAAGGG-----------------TGNNNNNN
TTVlO2522-----------------ACTA----------------------GAGGGCG
AY8239912605NNNNNNNNNNNNNNNNNNGGGGGGCGACCCCCCCGCACCCCCCCCTGCGG
TTV132598NNNNNNNNNTAGGCTCTTCG---------CCCCCGCACCCCCCC-TGCGG
TTVlO2533TAGCGGGGGGGGGACC-------------CCCCTGCACCCCCCCATGCGG
AY8239912655GGGCTCCGCCCCCTGCACCCCCGGGAGGGGGGGAAACCCCCCCTCAACCC
TTV132638GGGCTCCGCCCCCTGCACCCCCGGGAGGGGGGGAAACCCCCCCTCAACCC
TTVlO2570GGGCTCCGCCCCCTGCACCCCCGGGAGGGGGGGAAACCCCCCCTCAACCC
AY823991(2705)CCCGCGGGGGG-CAAGCCCCCCTGCACCCCCC-TTV13 (2688)CCCGCGGGGGG-CAAGCCCCCCTGCACCCCCC-TTVlO (2620)CCCGCGGGGGGGCAAGCCCCCCTGCACCCCCCC
AB076001AY823990AY823991TTV13TTVlOAB07600172494948AY823990484848AY8239919276TTV1376TTVlO 核苷酸同一性
AY823991TTV13TTVlO
AY8239919276TTV1376TTV 13與先前公布的AY823991序列相比時顯示92%同一性。然而，TTVlO與 AY823991或TTV13之間僅顯示76%的相似性并且可以被認(rèn)為是分離單獨的基因型。TTVlO (SEQ ID NO 14)禾口 TTV13(SEQ ID NO :15)的 PAH TTV 基因型 ORFl 與 AY823991 ORFl (SEQ ID NO 8)的氨基酸比對 AY823991 Orfl (1) MPYRRYRRRRRRPTRRffRHRR WRRYFRYRYRRAPRRRR-TKVRRR-RKKATTVlOOrfl (1)MPFHRYRRRRRRPTRRffRRRRFQRYFRYRYRRAPRRRRRYKVRRRRVKKATTV130RF1 (I)MPYRRYRRRRRRPTRRffRHRRffRRYFRYRYRRAPRRRR-TKVRRR-RRKAA Y823991 Orfl (49)PVIQWFPPSRRTCLIEGFWPLSYGHWFRTCLPFRRLNGLVFPGGGCDWSQTTVlOOrfl (51)PVIQWFPPTVRNCFIKGIWPLSYGHWLRTCLPMRKENGLIFLGGGIDWTVTTV130RF1 (49)PVIQffNPPSRRTCLIEGFffPLSYGHffFRTCLPFRRKNGLIFTGGGCDffTQA Y823991 Orfl (99)WSLQNLYNEKLNWRNIWTASNVGMEFARFLKGKFYFFRHPffRNYIITffDQTTVlOOrfl (101)WSLQNLYHEKLNWRNVWTSSNDGMEFARFRYAKFKFFRHTTRSYVVTWDQTTV130RF1 (99)WSLQNLYHEKLNWRNIffTASNVGMEFARFLKGKFYFFRHPffRNYIVTffDQA Y823991 Orfl (149)DIPCRPLPYQNLHPLLMLLKKQHKIVLSQQNCNPNRKQKPVTLKFKPPPKTTVlOOrfl (151)DIPCKPLPYTNLHPFVMLLKKHHKVVLSKQDCNPRKMDKPVTLKIKPPPKTTV130RF1 (149)DIPCKPLPYQNLHPLLMLLKKQHKLVLSQQNCNPNRKQKPVTLKFRPPPKA Y823991 Orfl (199)LTSQWRLSRELAKMPLIRLGVSFIDLTEPWVEGWGNAFYSVLGYEAVKDQTTVlOOrfl (201)LTSQWRLSRELSKIPLLRLGVSLIDFREPWVEGFGNAFFSTLGYEADKSNTTV130RF1 (199)LTSQWRLSRELAKMPLIRLGVSFIDLTEPWLEGWGNAFYSVLGYEAIKEQA Y823991 Orfl (249)GHWSNWTQIKYYWIYDTGVGNAVYVILLKKDVTDNPGNMATTFKASGGQHTTVlOOrfl (251) LKTSAWCQCKYFWIYDTGVNNHVYWMLNKDA⑶NAGDLITNQNS-----TTV130RF1 (249)GHffSNffSQIKYYffIYDTGVGNAVYVVMLKQDVDDNPGKMASTFKTTQGQHAY823991 Orfl (299)PDAIDHIELINQGWPYWLYFYGKSEQDIKKEAHS-AEISREYTRDPKSKKTTVlOOrfl (296)—IAHlEQlGEGYPYffLYFFGRSERDLKALATSNTNIRNEFNTNPNSKKTTV130RF1 (299)PNAIDHIELINEGffPYffLYFFGKSEQDIKKEAHS-AEIAREYATNPKSKKA Y823991 Orfl (348)LKIGIVGWASSNYTTTGSDQNSGG-STSAIQGGYVAYAGSG-—VIGAGSTTVlOOrfl (343)LKIAVIGWASSNNTAQDSTQGANTPIEGTYLISHVLQTSGH—TAGAAQTTV130RF1 (348)LKIGIVGWASSNFTTPGSSQNSGG-NIAAIQGGYVAWAGGQGKLNLGAGSA Y823991 Orfl (394)IGNLYQQGWPSNQNWPNTNRDKTNFDWGIRGLCILRDNMHLGSQELDDECTTVlOOrfl (390)INNLFASGffPNSQNYPPLNLDKNNFDffGKRALCILRNNMKIGNQNLDDETTTV130RF1 (397)IGNLYQQGWPSNQNWPNTNRDETNFDWGLRSLCILRDNMQLGNQELDDECA Y823991 Orfl (444)TMLTLFGPFVEKANPIFATTDPKFFKPELKDYNIIMKYAFKFQffGGHGTETTVlOOrfl (440)TMFALFGPLVEKAN-WEGLEKIPELKPELKDYNILMRYNFRFQffGGHGTETTV130RF1 (447)TMLSLFGPFVEKANPIFATTDPKYFKPELKDYNLIMKYAFKFQffGGHGTEA Y823991 Orfl (494)RFKTNI⑶PSTIPCPFEP⑶RFHSGIQDPSKVQNTVLNPWDYDCDGIVRKTTVlOOrfl (489)TFKTSIGDPSQIPCPYGPGEAPQHLVRNPSKVHEGVLNAWDYDYDGIVRKTTV130RF1 (497)RFKTTIGDPSTIPCPFEPGDRFHSGIQDPSKVQNTVLNPWDYDCDGIVRKA Y823991 Orfl (544)DTLKRLLELPTETEEEEKAYPLLGQKTEKEPLSDSDEESVISSTSSGSSQTTVlOOrfl (539)DTLKRLLAIPTDSEEE-KAYPLAGPKTEKLPSSDEEGESDISSSSDSSTQTTV130RF1 (547)DTLKRLLELPTETEEEEKAYPLLGQKTEKEPLSDSDEESVISSTSSGSDQAY82 399 IOrfl (594) EEETQR—RRHHKPSKRRLLKHLQRVVKRMKTL—TTVlOOrfl (588) ESEEEKRYRRRHKPSKRRLLQHVQRLVKRFRTL—TTV130RF1 (597) EEETQR—RKHHKPSKRRLLKHLQRVVKRMKTL—TTV10TTV13 ORF與公布序列的氨基酸比對
權(quán)利要求
1.分離的多核苷酸序列，所述分離的多核苷酸序列包括選自下述的多核苷酸(al)基因型 2 序歹Ij TTV13 的 DNA (SEQ ID NO 1)；基因型 2 序列 TTVlO 的 DNA (SEQ ID NO 2)；或其編碼TTV衣殼蛋白或者所述蛋白質(zhì)片段的片段；(a2)基因型 1 序列的 DNA，選自 ttvgl-7(SEQ ID NO :4)、ttvGTl-17 (SEQ ID NO :5)、 ttvGTl-21(SEQ ID NO :6)、ttvgtl—27 (SEQ ID NO :3)和 ttvgtl-178 (SEQ ID NO :7)，或其編碼TTV衣殼蛋白或者所述蛋白質(zhì)片段的片段；(b)(a)中任意序列的互補序列；(c)在嚴(yán)格條件下與(a)或(b)的序列雜交的多核苷酸，所述嚴(yán)格條件定義為在0.5M NaHPO4,7% SDSUmM EDTA 中在 65°C與濾膜結(jié)合 DNA 雜交，并在 68°C于 0. 1XSSC/0. 1% SDS 中漂洗；(d)與(a)或(b)的多核苷酸至少70%同源的多核苷酸；(e)與(a)或(b)的多核苷酸至少80%同源的多核苷酸；(f)與(a)或(b)的多核苷酸至少90%同源的多核苷酸；和(g)與(a)或(b)的多核苷酸至少95%同源的多核苷酸。
2.RNA多核苷酸分子，所述RNA多核苷酸分子為根據(jù)權(quán)利要求1所述的任意DNA多核苷酸序列的互補序列。
3.載體或質(zhì)粒，所述載體或質(zhì)粒包含根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的多核苷酸。
4.宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體或質(zhì)粒。
5.病毒，所述病毒從根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列表達，其中所述病毒是活的，或者完全或部分被減毒。
6.疫苗，所述疫苗包含根據(jù)權(quán)利要求5所述的病毒。
7.DNA疫苗，所述DNA疫苗包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸序列。
8.多肽，所述多肽由TTV13(SEQID NO 1) ^ TTVlO (SEQ ID NO 2)多核苷酸的開放閱讀框中任一種編碼，或者是與所述多肽或與其片段至少90%同源的多肽。
9.多肽，所述多肽由ttvgl-7(SEQ ID NO 10)、ttvGTl-17 (SEQ IDNO :11)、 ttvGTl-21(SEQ ID NO 12)、ttvgtl_27 (SEQ ID NO : 13)和 ttvgtl-178 (SEQ ID NO :9)多核苷酸的開放閱讀框中任一種編碼，或者是與所述多肽或與其片段至少90%同源的多肽。
10.疫苗，所述疫苗包含根據(jù)權(quán)利要求8或權(quán)利要求9所述的多肽。
11.肽，所述肽包含(a)TTV13(SEQNO :1)或TTV10 (SEQ IDNO :2)衣殼蛋白的前100個 N-端氨基酸；(b)與其至少90%同源的氨基酸序列；或(c)其富含精氨酸區(qū)域。
12.疫苗組合物，所述疫苗組合物包含權(quán)利要求11所述的肽。
13.單克隆或多克隆抗體組合物，所述單克隆或多克隆抗體組合物特異性地結(jié)合權(quán)利要求8、9或11所述的蛋白質(zhì)或肽。
14.疫苗，所述疫苗包含一個或更多個由選自0RF1、0RF2或0RF3的開放閱讀框編碼的多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)環(huán)病毒(“TTV”)的新核苷酸和氨基酸序列，包括其新基因型，所有這些用于制備治療和預(yù)防豬和其他動物的疾病的疫苗。按照本發(fā)明的實踐提供的疫苗有效對抗多種豬TTV基因型和分離株(isolate)。診斷和治療用多克隆和單克隆抗體也是本發(fā)明的特征，如在病毒繁殖和疫苗制備中有用的感染性克隆。本發(fā)明特別重要的方面包括提供TTV ORF1蛋白質(zhì)或其肽片段作為抗原的疫苗。
文檔編號A61K39/12GK102256997SQ200980150532
公開日2011年11月23日 申請日期2009年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月16日
發(fā)明者南希.L.奧伊恩, 唐納.S.鄧亞克, 杰伊.G.卡爾弗特, 杰奎琳.G.馬克斯, 格雷戈里.P.尼澤爾, 米拉.I.斯托瓦, 羅伯特.G.安肯鮑爾, 詹姆斯.R.湯普森, 道格拉斯.S.皮爾斯 申請人:美國輝瑞有限公司