專利名稱：用于誘導(dǎo)抗金黃色葡萄球菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的多肽的制作方法
用于誘導(dǎo)抗金黃色葡萄球菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的多肽相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求2008年11月沈日提交的美國臨時(shí)申請No. 61/200, 308的權(quán)益，該申請通過引用并入本文。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌("S. aureus")是負(fù)責(zé)許多疾病和狀況的細(xì)菌病原體。盡管金黃色葡萄球菌通常在健康人的鼻和皮膚中建群，通常僅僅導(dǎo)致較小的感染(如丘疹、癤)，但它也能導(dǎo)致全身感染。由金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的疾病和狀況的實(shí)例包括菌血癥、感染性心內(nèi)膜炎、毛囊炎、癤、癰、膿皰病、大皰性膿皰病、蜂窩織炎、botryomyosis、毒性休克綜合征、燙傷皮膚綜合征、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、感染性和炎性眼病、骨髓炎以及關(guān)節(jié)和骨的其它感染，以及呼吸道感染{The Staphylococci in Human Disease, Crossley and Archer (eds.), Churchill Livingstone Inc. 1997 ； Archer, 1998, Clin. Infect. Dis. 26:1179-1181)。通常，粘膜和表皮屏障提供抗金黃色葡萄球菌感染的保護(hù)；但是，由于損傷(如燒傷、創(chuàng)傷或手術(shù)程序)導(dǎo)致的這些天然屏障的打斷和損害免疫系統(tǒng)的疾病(如糖尿病、末期腎疾病、癌癥)都顯著增加感染的風(fēng)險(xiǎn)。機(jī)會性金黃色葡萄球菌感染可以變得非常嚴(yán)重，通常導(dǎo)致嚴(yán)重的發(fā)病率或死亡率。在20世紀(jì)60年代引入的甲氧苯青霉素很大程度克服了金黃色葡萄球菌的青霉素抗性的問題。但是，在金黃色葡萄球菌中出現(xiàn)了甲氧苯青霉素抗性，以及對很多有效抗該生物的其它抗生素(如氨基糖苷類、四環(huán)素、氯霉素、大環(huán)內(nèi)酯類和林可胺類(Lincosamides)) 的抗性。甲氧苯青霉素抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)成為世界范圍內(nèi)最重要的醫(yī)源性病原體之一，并且具有嚴(yán)重感染控制問題?？梢圆捎没诿庖邔W(xué)的策略來控制金黃色葡萄球菌感染和金黃色葡萄球菌的傳播?；诿庖邔W(xué)的策略包括被動和主動免疫。被動免疫采用靶定金黃色葡萄球菌的免疫球蛋白。主動免疫誘導(dǎo)抗金黃色葡萄球菌的免疫應(yīng)答。潛在的金黃色葡萄球菌疫苗靶定金黃色葡萄球菌多糖和多肽。可以用作可能的疫苗成分的多糖的實(shí)例包括金黃色葡萄球菌5型和8型莢膜多糖(Shinefield et al., 2002，N. Eng. J. Med. 346:491-496)?？梢杂米骺赡艿囊呙绯煞值亩嚯牡膶?shí)例包括膠原蛋白粘附素、纖維蛋白原結(jié)合蛋白和聚集因子(Mamo et al. , 1994，F(xiàn)EMS Immunol. Med. Mic. 10:47-54; Nilsson et al., 1998，J. Clin. Invest. 101:2640-2649; Josefsson et al. , 2001，J. Infect. Dis. 184:1572-1580)。已經(jīng)從金黃色葡萄球菌基因組測序獲得了關(guān)于金黃色葡萄球菌多肽序列的信息(Kuroda et al. , 2001，Lancet 357:1225-1240; Baba et al.，2000，Lancet 359:1819-1827; Kunsch et al. , European Patent Publication EP 0 786 519， published July 30，1997)。在某種程度上，已經(jīng)采用了生物信息學(xué)，從而嘗試表征從基因組測序獲得的多肽序列(參見，例如上文引用的EP 0 786 519)。已經(jīng)使用了諸如涉及展示技術(shù)和來自受感染患者的血清的那些技術(shù)，從而嘗試幫助鑒定編碼潛在抗原的基因(例如，參見2001年12月27日公開的lister等人的PCT 國際公開號WO 01/98499; 2002年8月1日公開的Meinke等人的PCT國際公開號WO 02/059148; Etz et al.，2002，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6573—6578)。發(fā)明概述
本發(fā)明公開了包含與SEQ ID NO :1結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸序列的多肽，以及這種多肽在生產(chǎn)藥物組合物中的用途，所述組合物提供抗金黃色葡萄球菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答。 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列代表在本文中稱作SAC0L0912的金黃色葡萄球菌抗原的全長蛋白序列。發(fā)現(xiàn)具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列、含有NH2-末端組氨酸標(biāo)記物 ("his-tag")的SEQ ID NO: 1的衍生物在金黃色葡萄球菌感染的動物模型中產(chǎn)生抗金黃色葡萄球菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答。本發(fā)明描述了包含一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有對SEQ ID NO: 1 所示氨基酸序列的最多八個(8個)氨基酸改變。在一個實(shí)施方案中，所述多肽免疫原不由 SEQ ID NO: 1和/或SEQ ID N0: 6組成。所述多肽可以用作免疫原，其中提及“免疫原”， 表示該多肽提供抗金黃色葡萄球菌的保護(hù)性免疫的能力，所述金黃色葡萄球菌包括但不限于表達(dá)SEQ ID NO: 1的金黃色葡萄球菌菌株。當(dāng)在本文描述的多肽、免疫原和/或治療方法的上下文中使用時(shí)，提及“保護(hù)性” 免疫或免疫應(yīng)答表示可檢測水平的抗金黃色葡萄球菌感染的保護(hù)作用。這包括降低金黃色葡萄球菌感染或獲得由所述感染導(dǎo)致的病癥的可能性，以及降低感染和/或由所述感染導(dǎo)致的病癥的嚴(yán)重程度的治療和/或預(yù)防措施。因此，保護(hù)性免疫應(yīng)答包括，例如，降低細(xì)菌負(fù)荷、改善與所述細(xì)菌感染相關(guān)的一種或多種病癥或癥狀，和/或延遲由金黃色葡萄球菌感染導(dǎo)致的疾病進(jìn)展的開始的能力?？梢杂脛游锬Ｐ?，如本文描述的那些動物模型來評估保護(hù)作用水平。例如，本文描述的某些多肽在鼠、致死攻擊模型和大鼠、留置導(dǎo)管、亞致死攻擊模型中都提供了保護(hù)作用?！安“Y”是全部或部分由金黃色葡萄球菌感染導(dǎo)致的任何狀況。提及包含一種氨基酸序列，所述氨基酸序列具有對SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的最多八個(8個)氨基酸改變，表示存在SEQ ID NO: 1相關(guān)區(qū)域，并且可能存在或不存在另外的多肽區(qū)域。每個氨基酸改變獨(dú)立地是氨基酸取代、缺失或添加。本發(fā)明的另一方面描述了包含SEQ ID NO: 1相關(guān)多肽和與該多肽共價(jià)連接的一個或多個另外的區(qū)域或部分的免疫原，其中每個區(qū)域或部分獨(dú)立地選自具有至少一種以下特性的區(qū)域或部分增強(qiáng)免疫應(yīng)答、促進(jìn)純化或促進(jìn)多肽穩(wěn)定性。在一個實(shí)施方案中，SEQ ID NO: 1相關(guān)多肽由一種氨基酸序列組成，所述氨基酸序列具有對SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的最多八個(8個)氨基酸改變。在一個另外的實(shí)施方案中，包含在該免疫原內(nèi)的 SEQ ID NO: 1相關(guān)多肽提供抗金黃色葡萄球菌的保護(hù)性免疫，所述金黃色葡萄球菌包括但不限于表達(dá)SEQ ID NO: 1的金黃色葡萄球菌菌株。另外的區(qū)域或部分可以是，例如，另外的多肽區(qū)域或非肽區(qū)域。關(guān)于例如多肽提及“純化的”或“基本上純化的”，表示所述多肽存在于一種環(huán)境中，所述環(huán)境中缺乏與所述多肽天然相關(guān)和/或代表存在的總蛋白的至少約10%的一種或多種其它多肽。
提及“分離的”，表示與自然中存在的形式不同的形式。所述不同的形式可以是例如，與自然中存在的純度不同的純度，和/或自然中不存在的結(jié)構(gòu)。自然中不存在的結(jié)構(gòu)包括例如具有組合在一起的不同區(qū)域的重組結(jié)構(gòu)。在本文可互換使用的術(shù)語“蛋白”或“多肽，，表示連續(xù)的氨基酸序列，并且不提供最小或最大的大小限制。蛋白中存在的一個或多個氨基酸可以含有翻譯后修飾，如糖基化或二硫鍵形成。本發(fā)明的另一方面描述了能在患者中誘導(dǎo)抗金黃色葡萄球菌的保護(hù)性免疫的組合物。所述組合物包含藥學(xué)可接受的載體和免疫學(xué)有效量的本文描述的多肽或免疫原。所述多肽或免疫原可以提供抗表達(dá)SEQ ID NO: 1的多肽的金黃色葡萄球菌菌株的保護(hù)性免疫。關(guān)于多肽、免疫原或其組合物的術(shù)語“免疫學(xué)有效量”表示足夠的量，其使得當(dāng)引入患者時(shí)產(chǎn)生足夠水平的預(yù)期的多肽或免疫原，導(dǎo)致抗金黃色葡萄球菌的免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到該水平可以改變。該量應(yīng)該足以顯著預(yù)防金黃色葡萄球菌感染和/或降低金黃色葡萄球菌感染的可能性或嚴(yán)重性。本發(fā)明的另一個方面描述了包含重組基因的核酸分子，所述重組基因編碼產(chǎn)生抗金黃色葡萄球菌的免疫應(yīng)答的多肽。重組基因含有重組核酸分子，其中所述核酸分子的所述核苷酸序列編碼多肽以及用于適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和加工的調(diào)節(jié)元件(其可以包括翻譯和翻譯后元件)。重組基因可以獨(dú)立于宿主基因組存在，或可以是宿主基因組的部分。所述核酸分子可以是表達(dá)載體。優(yōu)選地，表達(dá)載體也含有用于在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)、選擇標(biāo)記、有限數(shù)目的有用的限制酶位點(diǎn)和高拷貝數(shù)目的潛能。術(shù)語“核酸”或“核酸分子”是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)。重組核酸分子是其序列和/或形式在自然中不存在的核酸分子。重組核酸分子的實(shí)例包括純化的核酸、組合在一起提供與自然中存在的核酸不同的核酸的兩個或更多個核酸區(qū)域，以及天然彼此相關(guān)的一個或多個核酸區(qū)域(例如，上游或下游區(qū)域)的缺乏。本文還描述了重組細(xì)胞。所述重組細(xì)胞包含重組基因，所述重組基因編碼提供抗金黃色葡萄球菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的多肽。重組細(xì)胞可以用于制備所述重組基因編碼的多肽，本文也描述了制備方法。該方法包括使包含編碼所述多肽的重組核酸的重組細(xì)胞生長， 并且純化所述多肽。本發(fā)明的另一方面描述了提供抗金黃色葡萄球菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的多肽，所述多肽通過包括以下步驟的方法制備在宿主中使含有編碼所述多肽的重組核酸分子的重組細(xì)胞生長并純化所述多肽。可以采用不同的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了對患者進(jìn)行抗金黃色葡萄球菌感染治療的方法。所述方法包括在患者中誘導(dǎo)抗金黃色葡萄球菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答。術(shù)語“治療”是指治療性治療和預(yù)防性措施這兩者。需要治療的患者包括已經(jīng)有感染的那些，以及傾向于患感染的那些，或感染可能性正在降低的那些。另外的實(shí)施方案包括免疫學(xué)有效量的SEQ ID NO: 1相關(guān)多肽或其免疫原在制備用于誘導(dǎo)患者中抗金黃色葡萄球菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的藥物中的用途。除非特定的術(shù)語互相排斥，提及“或”，表示之一或兩者的可能性。有時(shí)，短語例如 “和/或”被用于突出顯示之一或兩者的可能性。
提及開放式的術(shù)語例如“包含”，允許另外的要素或步驟。有時(shí)，短語例如“一個或多個”與或不與開放式術(shù)語一同使用來突出顯示另外的要素或步驟的可能性。除非明確地指出，提及術(shù)語例如“一個”、“一種”或“該”，不局限于一，并且包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文明確指出另外的意思。例如，“一個細(xì)胞”不排除“多個細(xì)胞”。有時(shí)，短語例如一個或多個被用于突出顯示可能存在復(fù)數(shù)形式。從本文提供的包括不同實(shí)施例的另外的描述，本發(fā)明的其它特征和益處是明顯的。提供的實(shí)施例舉例說明了在實(shí)施本發(fā)明中有用的不同成分和方法。實(shí)施例不限制所要求保護(hù)的發(fā)明。根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以鑒定和采用對于實(shí)施本發(fā)明有用的其它成分和方法。附圖簡述


圖1圖解了 SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。加下劃線的部分代表SEQ ID NO: 1的實(shí)質(zhì)部分，僅僅缺乏SEQ ID NO: 1的起始甲硫氨酸。氨基末端不加下劃線的區(qū)域是組氨酸標(biāo)記物區(qū)。圖2圖解了 SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。圖3圖解了編碼SEQ ID NO: 2的核酸序列(SEQ ID N0: 3)。編碼氨基末端組氨酸標(biāo)記物的部分加下劃線。圖4A (實(shí)驗(yàn)1)和B (實(shí)驗(yàn)2)圖解了來自兩個攻擊實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，所述實(shí)驗(yàn)使用羥基磷酸鋁佐劑中的SEQ ID N0: 2多肽(實(shí)線)或使用單獨(dú)的佐劑(虛線)。發(fā)明詳述
下文提供的實(shí)施例中用SEQ ID N0: 2舉例說明了 SEQ ID NO: 1相關(guān)多肽提供抗金黃色葡萄球菌感染的保護(hù)性免疫的能力。SEQ ID N0: 2是SEQ ID NO: 1的衍生物，其含有氨基末端組氨酸標(biāo)記物。該組氨基酸標(biāo)記物促進(jìn)多肽純化和鑒定。與SEQ ID NO: 1結(jié)構(gòu)上相關(guān)的多肽包括這樣的多肽其含有存在于不同金黃色葡萄球菌菌株中的對應(yīng)區(qū)域和天然存在的區(qū)域的衍生物。SEQ ID NO: 1的氨基酸序列圖解于圖2中。圖1中圖解了 SEQ ID NOs: 1和2所示氨基酸序列之間的關(guān)系。I. SAC0L0912 (SEQ ID NO: 1)序列
金黃色葡萄球菌SAC0L0912是保守的、表面表達(dá)的蛋白。SAC0L0912具有SEQ ID N0: 1所示的氨基酸序列。該序列在目前已經(jīng)測序過的13種金黃色葡萄球菌菌株之間是保守的。表1列出了所述13種金黃色葡萄球菌菌株、它們的對應(yīng)NCBI GenBank登記號(修訂版本和最初的提交編號)，以及每種基因組序列的提交者。表 1
權(quán)利要求
1.包含一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有對SEQID NO: 1所示氨基酸序列的最多8個氨基酸改變，其中所述多肽不是SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 6，并且其中所述多肽提供抗金黃色葡萄球菌的保護(hù)性免疫。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包含SEQID NO: 1的選自氨基酸5_60、氨基酸 9-64、氨基酸1-56、氨基酸4-59、氨基酸8_63、氨基酸2_57、氨基酸3_58、氨基酸7_62和氨基酸6-61的部分。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的多肽，其中所述多肽是基本上純化的。
4.權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽提供抗表達(dá)SEQID NO: 1的金黃色葡萄球菌菌株的保護(hù)性免疫。
5.免疫原，其包含由一種氨基酸序列組成的多肽和與所述氨基酸序列共價(jià)連接的一個或多個另外的區(qū)域或部分，所述氨基酸序列具有對SEQ ID NO: 1的最多8個氨基酸改變， 其中每個區(qū)域或部分獨(dú)立地選自具有至少一種以下特性的區(qū)域或部分增強(qiáng)免疫應(yīng)答、促進(jìn)純化或促進(jìn)多肽穩(wěn)定性。
6.權(quán)利要求5的免疫原，其中所述多肽提供抗表達(dá)SEQID NO: 1的金黃色葡萄球菌菌株的保護(hù)性免疫。
7.能夠在患者中誘導(dǎo)抗金黃色葡萄球菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的組合物，該組合物包含免疫學(xué)有效量的(a)權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)的多肽；或，(b)權(quán)利要求5或權(quán)利要求6的免疫原；和藥學(xué)可接受的載體。
8.能在患者中誘導(dǎo)抗金黃色葡萄球菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的組合物，所述組合物包含免疫學(xué)有效量的包含一種氨基酸序列的多肽和藥學(xué)可接受的載體，所述氨基酸序列具有對SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的最多8個氨基酸改變，其中所述多肽不由SEQ ID NO: 1 所示的氨基酸序列組成。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述組合物提供抗表達(dá)SEQID NO: 1的金黃色葡萄球菌菌株的保護(hù)性免疫。
10.權(quán)利要求7-9的任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包含佐劑。
11.包含重組基因的核酸分子，所述重組基因包含編碼權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列。
12.權(quán)利要求11的核酸分子，其中所述核酸分子是表達(dá)載體。
13.包含重組基因的重組細(xì)胞，所述重組基因包含編碼權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列。
14.制備多肽免疫原的方法，該方法包括以下步驟(a)使權(quán)利要求13的重組細(xì)胞在表達(dá)所述多肽的條件下生長；和(b)純化所述多肽。
15.在患者中誘導(dǎo)抗金黃色葡萄球菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給所述患者施用免疫學(xué)有效量的一種或多種以下物質(zhì)的步驟(a)權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)的多肽；(b)權(quán)利要求5或權(quán)利要求6的免疫原；(c)具有SEQID NO: 1所示氨基酸序列的多肽；(d)具有SEQID NO: 6所示氨基酸序列的多肽；或，(e)權(quán)利要求7-10的任一項(xiàng)的組合物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述患者是人。
17.免疫學(xué)有效量的一種或多種以下物質(zhì)在制備用于在患者中誘導(dǎo)抗金黃色葡萄球菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的藥物中的用途(a)權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)的多肽；(b)權(quán)利要求5或權(quán)利要求6的免疫原；(c)具有SEQID NO: 1所示氨基酸序列的多肽；(d)具有SEQID NO: 6所示氨基酸序列的多肽；或，(e)權(quán)利要求7-10的任一項(xiàng)的組合物。
18.權(quán)利要求17的用途，其中所述藥物提供抗表達(dá)SEQID NO: 1的金黃色葡萄球菌菌株的保護(hù)性免疫。
19.權(quán)利要求17或18的用途，其中所述患者是人。
全文摘要
本發(fā)明公開了包含與SEQIDNO1結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸序列的多肽，以及這種多肽和其組合物的用途。SEQIDNO:1是全長金黃色葡萄球菌序列。發(fā)現(xiàn)含有氨基末端組氨酸標(biāo)記物的SEQIDNO:1的衍生物產(chǎn)生抗金黃色葡萄球菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
文檔編號A61K39/40GK102292104SQ200980155350
公開日2011年12月21日 申請日期2009年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月26日
發(fā)明者D. 科普 L., D. 舒爾茨 L., A. 米勒 M., B. 麥尼利 T., 王心民 申請人:默沙東公司