專利名稱：用銅氧還蛋白預(yù)防癌癥的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物以及至少一種用于化學(xué)預(yù)防治療的其它化學(xué)預(yù)防劑的組合物，該組合物用于癌癥相關(guān)治療，且尤其用于抑制哺乳動物細(xì)胞、組織和動物中癌前病變的發(fā)展。本發(fā)明還涉及銅氧還蛋白、和銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物、以及至少一種化學(xué)預(yù)防治療中的其它化學(xué)預(yù)防劑，和/或作為化學(xué)預(yù)防劑在哺乳動物中抑制癌前病變的發(fā)展并最終抑制癌癥的使用和/或施用。背景癌癥化學(xué)預(yù)防是使用天然的、合成的或生物的化學(xué)劑來逆轉(zhuǎn)、抑制或預(yù)防浸潤性癌癥的致癌進(jìn)展。最近在高風(fēng)險群體中進(jìn)行的預(yù)防癌癥的臨床試驗表明，化學(xué)預(yù)防性治療對于高風(fēng)險患者來說是一種實際可行的治療。化學(xué)預(yù)防性治療是基于多病灶區(qū)域致癌作用和多級致癌的概念。在區(qū)域性致癌中，組織區(qū)域的全身性致癌物暴露導(dǎo)致組織中的彌漫性上皮損傷和突變細(xì)胞的克隆性增殖。區(qū)域內(nèi)的這些遺傳突變增加了該區(qū)域中一種或多種癌前病變或惡性病變發(fā)生的可能。多級致癌在這些基因和表型改變的逐步累積中。阻遏多級致癌中的一個或多個步驟可阻止或預(yù)防癌癥的發(fā)展。通常參見Tsao等人，CA Cancer J Clin 54 :150-180(2004)。天青蛋白和其它銅氧還蛋白對癌細(xì)胞具有特異的毒性。天青蛋白誘導(dǎo)J774肺癌細(xì)胞的凋亡。Yamada等人，PNAS 99(22) 14098-14103 Q002)。進(jìn)入J774肺癌細(xì)胞后，天青蛋白位于胞質(zhì)和核組分中，并與腫瘤抑制蛋白P53形成復(fù)合物，從而使其穩(wěn)定并提高其細(xì)胞內(nèi)水平。同前。天青蛋白介導(dǎo)的凋亡的誘導(dǎo)并不限于J774細(xì)胞。天青蛋白還可進(jìn)入諸如人黑素瘤UIS0-Mel-2、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞和骨肉瘤的癌細(xì)胞中。Yamada等人，Infect Immun. 70 :7054-7062(2002) ；Punj 等人，Oncogene. 23 :2367-2378(2004)。天青蛋白使胞內(nèi)p53水平增高，導(dǎo)致Bax形成增加，并在所述細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。更有趣地是，向異種移植 Mel-2或MCF-7人腫瘤的裸鼠腹腔注射天青蛋白導(dǎo)致了所述癌癥的統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著退行。同前。已相當(dāng)成熟地建立了小鼠乳腺器官培養(yǎng)(MMOC)模型來研究乳腺發(fā)育和上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的激素調(diào)控的效應(yīng)?？捎肕MOC分析來評估潛在的化學(xué)預(yù)防劑對激素誘導(dǎo)的乳腺結(jié)構(gòu)分化和DMBA誘導(dǎo)的腺內(nèi)腫瘤發(fā)生前增生泡節(jié)樣病變的的抑制作用。器官培養(yǎng)中的乳腺對激素應(yīng)答以分化成腺泡結(jié)構(gòu)或誘導(dǎo)酪蛋白和乳清蛋白的表達(dá)。來自年輕的未交配的動物的乳腺在胰島素(I) +催乳素(P) +醛固酮(A)存在下孵育6天后可分化成完全成熟的乳腺。這些乳腺在形態(tài)學(xué)上類似于來自妊娠小鼠的乳腺。醛固酮可以用雌激素(E) + 孕酮(Pg)來代替。向培養(yǎng)基中加入氫化可的松(H)刺激了乳腺的功能性分化。Mehta和 Banerjee,Acta Endocrinol. 80 501 (1975) ；Mehta禾口Moon，Breast Cancer Treatment and Prognosis 300，300 (Basil A Stoll 編輯，Blackwell Press 1986)。這樣，在該培養(yǎng)系統(tǒng)中觀察到的激素誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)和功能分化模擬了動物的不同生理階段過程中對激素的反應(yīng)。在MMOC中，小鼠在癌癥形成前表現(xiàn)出獨特的腫瘤前階段。OH小鼠中的這種腫瘤前病變由鼠乳腺腫瘤病毒誘導(dǎo)，或在BALB/c小鼠中由DMBA來誘導(dǎo)。在生長期的第3天和第4天之間將腺體暴露在2 μ g/mlDMBA下，隨后使腺體在僅含胰島素的培養(yǎng)基中復(fù)原 2-3 周，導(dǎo)致了乳房泡病變(MAL)的形成。Hawthorne 等人，Pharmaceutical Biology 40: 70-74(2002) ；Mehta 等人，Methods in Cell Science 19:19-24(1997)。并且，將從含有 DMBA誘導(dǎo)的乳腺病變的腺體中制備的上皮細(xì)胞移植到同源宿主中導(dǎo)致了乳腺癌的形成。 Telang等人，PNAS 76:5886-5890(1979)。這些腫瘤在病理學(xué)上類似于當(dāng)同系小鼠被施用 DMBA時體內(nèi)觀察到的那些。同前。MMOC中DMBA誘導(dǎo)的乳房病變形成可通過多種化學(xué)預(yù)防劑諸如類視黃醇來抑制。 這些劑包含來源于諸如蕓薹寧(brassinin)和白藜蘆醇(resveretrol)、硫醇類、抗氧化劑、鳥氨酸脫羧酶抑制劑諸如0FM0和魚藤素、前列腺素合成抑制劑、Ca調(diào)節(jié)劑等的天然產(chǎn)物的化學(xué)預(yù)防劑。Jang 等人，Science 275:218-220(1997) ；Mehta，Eur. J. Cancer 36: 1275-1282(2000) ；Metha 等人，J. Natl. Cancer Inst. 89 :212-219 (1997)。這些研究清楚地表明該器官培養(yǎng)系統(tǒng)提供了測定針對乳房致癌作用化合物的有效性的獨特模型。其結(jié)果與體內(nèi)施用所述化合物獲得的抑制密切相關(guān)。在醛固酮和氫化可的松存在下，且在雌激素和孕酮不存在下，MMOC可經(jīng)誘導(dǎo)形成雌激素非依賴的MAL。MMOC也可經(jīng)誘導(dǎo)形成乳房導(dǎo)管病變(MDL)。如果用雌激素和孕酮代替醛固酮和氫化可的松被加入培養(yǎng)基中，即可誘導(dǎo)MDL。卵巢留類存在下的腺泡結(jié)構(gòu)很小，但在組織病理學(xué)切片中可觀察到導(dǎo)管內(nèi)損傷。Mehta等人，J. Natl. Cancer Inst. 93 1103-1106(2001)。選擇性作用于卵巢激素依賴的ER+乳腺癌的抗雌激素諸如他莫昔芬抑制MDL形成而非MAL形成。這樣，該經(jīng)過改良的培養(yǎng)模型除了常規(guī)MAL誘導(dǎo)方案外現(xiàn)可用于評價化學(xué)治療劑對MAL和MOL的作用。在化學(xué)轉(zhuǎn)化的實驗MMOC模型中，罕見p53突變或改變，而p53的失活導(dǎo)致腫瘤中提高的非整倍性。在具有C3(l)標(biāo)簽轉(zhuǎn)基因的小鼠中進(jìn)行的進(jìn)一步研究表明，即使在癌基因存在下，P53功能的消除可能是腫瘤形成中的關(guān)鍵事件。研究已顯示p53通過雌激素而失活或被抑制。從而，該模型可用來評價天青蛋白對癌前病變的發(fā)展的作用和天青蛋白在乳腺上皮細(xì)胞中調(diào)節(jié)P53表達(dá)的能力。該模型還可用來評價雌激素受體(ER)抑制化合物與天青蛋白聯(lián)合的作用。實施方案的概述本發(fā)明涉及包含可以是對癌前病變和/或癌癥具有化學(xué)預(yù)防作用的銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物、截短體或結(jié)構(gòu)等價物的肽的組合物。具體地，這些組合物可包含來自銅綠假單胞菌O^seudomonasaeruginosa)的天青蛋白，和/或天青蛋白的50-77 殘基區(qū)域(p28，SEQ IDNO 2)和/或天青蛋白的50-67殘基區(qū)域(pl8，SEQ ID NO :25)。本發(fā)明還涉及可包含具有化學(xué)預(yù)防作用的銅氧還蛋白，和/或銅氧還蛋白的變體、衍生物、截短體或結(jié)構(gòu)等價物的組合物。這些組合物除了別的以外可以是分離的肽或藥物組合物。本發(fā)明的組合物可用于在哺乳動物患者中預(yù)防、阻止、預(yù)防、抑制、逆轉(zhuǎn)或延緩癌前病變和/或癌癥的發(fā)展的方法中。本發(fā)明還涉及包含一種或多種化學(xué)預(yù)防劑的藥物組合物，所述藥物組合物包含銅氧還蛋白和/或銅氧還蛋白的變體、衍生物、截短體或結(jié)構(gòu)等價物，以及至少一種其它化學(xué)預(yù)防劑。在本發(fā)明的一些實施方案中，銅氧還蛋白選自由天青蛋白、假天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、鐵硫菌藍(lán)蛋白、Laz、橙綠屈撓素(auracyanin)、漆樹藍(lán)蛋白和黃瓜堿性蛋白組成的組。在另一些實施方案中，銅氧還蛋白是天青蛋白。在另外的實施方案中，銅氧還蛋白來自選自由銅綠假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)、木糖氧化無色桿菌 (Achromobacter xylosoxidan)、支氣管炎 f専德特菌(Bordetella bronchiseptica)、甲基單胞菌(Methylomonassp.)、腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhea)、焚光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、綠針假單胞菌 (Pseudomonas chlororaphis)、苛養(yǎng)木桿菌(Xylellafastidiosa)和副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)組成的組的生物體。在某些實施方案中，銅氧還蛋白來自銅綠假單胞菌。在另外的實施方案中，銅氧還蛋白是來自銅綠假單胞菌的天青蛋白。在本發(fā)明的藥物組合物的一些實施方案中，第一化學(xué)預(yù)防劑是天青蛋白的截短體，其中截短體包含選自由SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :25組成的組的一個或多個氨基酸序列。在另一個實施方案中，截短體包含SEQ IDNO :2。在另一個實施方案中，截短體由SEQ ID N0:2組成。在另外的實施方案中，截短體包含選自由SEQ ID NO 26、SEQ ID NO :27、 SEQ ID NO28,SEQ ID NO 29,SEQ ID NO30,SEQ ID N0:31、SEQ ID NO 32,SEQ ID N0: 33,SEQ ID NO :34和SEQ ID NO :35組成的組的序列。在另外的實施方案中，截短體為約10 個以上的氨基酸且不超過約100個氨基酸。在另一些實施方案中，截短體為從18到觀個氨基酸、從28到50個氨基酸、從18到100個氨基酸或從28到100個氨基酸。在一些實施方案中，截短體與P53的一個或多個選自由氨基酸1-17、Μ-31、80-276和四7_305組成的組的結(jié)合位點相結(jié)合。在另一些實施方案中，截短體與P53的N末端結(jié)合結(jié)構(gòu)域或p53的 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相結(jié)合。在本發(fā)明的藥物組合物的一些實施方案中，至少一種其它化學(xué)預(yù)防劑(或“第二化學(xué)預(yù)防劑”)是阻止雌激素和/或孕酮的結(jié)合，或阻止雌激素和/或孕酮的產(chǎn)生的抗雌激素。在另一些實施方案中，抗雌激素可以是他莫昔芬、芬維A胺(fenretinide)或芳香酶抑制劑。本發(fā)明還涉及包含包括銅氧還蛋白和/或銅氧還蛋白的變體、衍生物、截短體或結(jié)構(gòu)等價物的一種或多種化學(xué)預(yù)防劑和至少一種其它化學(xué)預(yù)防化合物且還包含藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。在進(jìn)一步實施方案中，藥學(xué)可接受載體適合靜脈內(nèi)施用。在另一個實施方案中，組合物的第一化學(xué)預(yù)防劑是來自選自由銅綠假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、木糖氧化無色桿菌、支氣管炎博德特菌、甲基單胞菌、腦膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、熒光假單胞菌、綠針假單胞菌、苛養(yǎng)木桿菌和副溶血性弧菌組成的組的生物體的銅氧還蛋白。在一些實施方案中，銅氧還蛋白來自銅綠假單胞菌。在另一些實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑是包含選自由 SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :25組成的組的一種或多種氨基酸序列的天青蛋白的截短體。在另一個實施方案中，截短體包含SEQ ID NO :2。在另一個實施方案中，截短體由SEQID NO: 2組成。本發(fā)明還涉及治療哺乳動物患者的方法，所述方法可包括向患者施用治療有效量的上述組合物，該組合物包含第一化學(xué)預(yù)防劑、第二化學(xué)預(yù)防劑和藥學(xué)上可接受的載體，所述第一化學(xué)預(yù)防劑為天青蛋白的截短體，其中截短體包含選自由SEQ ID N0:2和SEQ ID NO :25組成的組的氨基酸序列的一種或多種。在另一個實施方案中，哺乳動物患者是人。在又一個實施方案中，哺乳動物患者比一般群體具有發(fā)生癌癥的更高風(fēng)險。在另一些實施方案中，癌癥選自黑素瘤、乳腺癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、肺癌、結(jié)腸癌、頭頸癌、 膀胱癌、前列腺癌、皮膚癌和宮頸癌。在另一個實施方案中，患者具有選自由以下組成的組的至少一種高風(fēng)險特征吸煙、不良飲食、飲酒、激素替換治療、較高的體重指數(shù)、未經(jīng)產(chǎn)、檳榔使用、頻繁漱口劑的使用、暴露于人乳頭瘤病毒、兒童和慢性日光照射、首次性交的早期年齡、多個性伴侶、口服避孕藥的使用、癌癥的家族史、BRCAl和BRCA2的基因攜帶者身份、 乳腺瘤的病史、家族性腺瘤性息肉病(FAP)、遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌(HNPCC)、紅色或金黃色毛發(fā)和淺膚色表型、著色性干皮病、暴露于氡、多環(huán)芳香烴類、鎳、鉻酸鹽、砷、石棉、 氯甲基醚、苯并[a]芘、輻射、或來自橡膠或涂料的職業(yè)性暴露的芳香胺類、具有氣流阻塞的慢性阻塞性肺疾病、慢性膀胱感染、血吸蟲病、老齡和免疫受損狀況。在另一些實施方案中，患者具有癌前病變或癌癥或癌前病變已被治愈。在又一個實施方案中，藥物組合物通過選自由靜脈注射、肌內(nèi)注射、皮下注射、吸入法、局部施用、透皮貼劑、栓劑、玻璃體注射和口腔組成的組的方式來施用。在進(jìn)一步實施方案中，施用方式是通過靜脈內(nèi)注射。本發(fā)明還涉及在藥瓶中包含一種或多種化學(xué)預(yù)防劑、至少一種其它化學(xué)預(yù)防化合物和藥學(xué)上有效的載體的藥盒，所述化學(xué)預(yù)防劑是銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物、截短體或結(jié)構(gòu)等價物。在一個實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑是天青蛋白的截短體，其中截短包括選自由SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :25組成的組的氨基酸序列中的一個或多個。在另一個實施方案中，藥盒還包括適用于靜脈施用的藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明還涉及通過施用作為第一化學(xué)預(yù)防劑的銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的截短體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物，和施用第二化學(xué)預(yù)防劑來治療哺乳動物患者的方法。在一些實施方案中，第一化學(xué)預(yù)防劑是天青蛋白的截短體，其中截短體包含選自由SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :25組成的組的氨基酸序列中的一個或多個。在另一個實施方案中，截短體包含SEQ ID NO :2。在又一個實施方案中，截短體由SEQ ID NO :2組成。在另一些實施方案中，截短體包含選自由 SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO 30,SEQ ID N0:31、SEQ ID NO :32、SEQ IDNO :33、SEQ ID NO :34 禾口 SEQ ID N0:35 組成的組的序列。在一些實施方案中，截短體與P53的一個或多個選自由氨基酸1-17、24-31、80-276 和四7-305組成的組的結(jié)合位點相結(jié)合。在另外的實施方案中，截短體與p53的N末端結(jié)合結(jié)構(gòu)域或P53的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相結(jié)合。在一些實施方案中，其它化學(xué)預(yù)防劑是抗雌激素，比如他莫昔芬、芬維A胺或芳香酶抑制劑。在另外的實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑是選自由天青蛋白、假天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、鐵硫菌藍(lán)蛋白、Laz、橙綠屈撓素、漆樹藍(lán)蛋白和黃瓜堿性蛋白組成的組的銅氧還蛋白。在另一個實施方案中，銅氧還蛋白是天青蛋白。在另外的實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑是來自選自由銅綠假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、木糖氧化無色桿菌、支氣管炎博德特菌、甲基單胞菌、腦膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、熒光假單胞菌、綠針假單胞菌、 苛養(yǎng)木桿菌和副溶血性弧菌組成的組的生物體的銅氧還蛋白。在一個實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑來自銅綠假單胞菌。本發(fā)明還涉及包括在哺乳動物細(xì)胞中提高p53的表達(dá)的方法，所述方法包括以任意順序施用至少一種化學(xué)預(yù)防劑和施用一種抗雌激素，所述化學(xué)預(yù)防劑可以是銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的截短體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物。在一些實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑是天青蛋白的截短體，其中截短體包含選自由SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :25組成的組的氨基酸序列中的一個或多個。在另一個實施方案中，截短體包含SEQ ID NO :2。在又一個實施方案中， 截短體由SEQ ID N0:2組成。在另一些實施方案中，截短體包含選自由SEQ ID NO 26,SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、 SEQ ID NO 33, SEQ IDNO :；34和SEQ ID NO :35組成的組的序列。在一些實施方案中，截短體與P53的一個或多個選自由氨基酸1-17、Μ-31、80-276和四7_305組成的組的結(jié)合位點相結(jié)合。在另外的實施方案中，截短體與P53的N末端結(jié)合結(jié)構(gòu)域或p53的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相結(jié)合。在一些實施方案中，抗雌激素是他莫昔芬、芬維A胺或芳香酶抑制物。在一些實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑是選自由天青蛋白、假天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、鐵硫菌藍(lán)蛋白、Laz、橙綠屈撓素、漆樹藍(lán)蛋白和黃瓜堿性蛋白組成的組的銅氧還蛋白。在另一個實施方案中，銅氧還蛋白是天青蛋白。在其它的實施方案中，銅氧還蛋白來自選自由銅綠假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、 木糖氧化無色桿菌、支氣管炎博德特菌、甲基單胞菌、腦膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、熒光假單胞菌、綠針假單胞菌、苛養(yǎng)木桿菌和副溶血性弧菌組成的組的生物體。在又一個實施方案中，銅氧還蛋白來自銅綠假單胞菌。本發(fā)明還涉及通過以任意順序施用治療有效量的他莫昔芬和施用治療有效量的至少一種化學(xué)預(yù)防劑而在不降低其化學(xué)預(yù)防作用的情況下減小他莫昔芬的劑量相關(guān)毒性， 所述化學(xué)預(yù)防劑諸如銅氧還蛋白或其變體、截短體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物。在一些實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑是天青蛋白的截短體，其中截短體包含選自由SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 25組成的組的氨基酸序列中的一個或多個。在另一個實施方案中，截短體包含SEQ ID NO 2。在又一個實施方案中，截短體由SEQ ID N0:2組成。在另一些實施方案中，截短體包含選自由 SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO 34 和 SEQ ID NO 35 組成的組的序列。在一些實施方案中，截短體與P53的一個或多個選自由氨基酸1-17、Μ-31、80-276和四7-305組成的組的結(jié)合位點相結(jié)合。在另外的實施方案中，截短體與p53的N末端結(jié)合結(jié)構(gòu)域或p53的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相結(jié)合。在另一個實施方案中，他莫昔芬的劑和化學(xué)預(yù)防劑的劑在同時或接近同時施用。在其它的實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑是選自由天青蛋白、假天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、鐵硫菌藍(lán)蛋白、Laz、橙綠屈撓素、漆樹藍(lán)蛋白和黃瓜堿性蛋白組成的組的銅氧還蛋白。在一些實施方案中，銅氧還蛋白是天青蛋白。銅氧還蛋白可來自選自由銅綠假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、 木糖氧化無色桿菌、支氣管炎博德特菌、甲基單胞菌、腦膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、熒光假單胞菌、綠針假單胞菌、苛養(yǎng)木桿菌和副溶血性弧菌組成的組的生物體。在一些實施方案中，銅氧還蛋白來自銅綠假單胞菌。本發(fā)明還涉及包括通過以任何順序向哺乳動物細(xì)胞施用至少一種化學(xué)預(yù)防劑和施用抗雌激素而在哺乳動物細(xì)胞中降低雌激素受體與P53的結(jié)合的方法，所述化學(xué)預(yù)防劑是銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、截短體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物。在一些實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑是天青蛋白的截短體，其中截短體包含選自由SEQ ID NO :2和SEQ ID N0:25組成的組的氨基酸序列中的一個或多個。在另一個實施方案中，截短體包含SEQ ID NO :2。在又一個實施方案中，截短體由SEQ ID NO :2組成。在另一些實施方案中，截短體包含選自由 SEQ ID NO 26,SEQ ID NO27,SEQ ID NO 28、SEQ ID NO29,SEQ ID NO30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO :32, SEQ IDNO :33、SEQ ID NO :34 禾口 SEQ ID NO :35 組成的組的序列。在一些實施方案中，截短體與選自由氨基酸1-17、Μ-31、80-276和四7_305組成的組的p53的一個或多個結(jié)合位點相結(jié)合。在另外的實施方案中，截短體與P53的N末端結(jié)合結(jié)構(gòu)域或 P53的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相結(jié)合。在另一些實施方案中，抗雌激素是他莫昔芬、芬維A胺或芳香酶抑制劑。在一些實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑是選自由天青蛋白、假天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、鐵硫菌藍(lán)蛋白、Laz、橙綠屈撓素、漆樹藍(lán)蛋白和黃瓜堿性蛋白組成的組的銅氧還蛋白。在另一些實施方案中，銅氧還蛋白是天青蛋白。在另外的實施方案中，銅氧還蛋白來自選自由銅綠假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、木糖氧化無色桿菌、支氣管炎博德特菌、甲基單胞菌、腦膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、熒光假單胞菌、綠針假單胞菌、苛養(yǎng)木桿菌和副溶血性弧菌組成的組的生物體。在另一個實施方案中，銅氧還蛋白來自銅綠假單胞菌。本發(fā)明的這些方面和其它方面、優(yōu)勢和特征將從以下的圖和具體實施方案的詳細(xì)描述中變得明顯。序列描述SEQ ID NO :1.來自銅綠假單胞菌的天青蛋白的氨基酸序列(Ala Glu Cys Ser Val Asp lie Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn Thr AsnAla lie Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn Leu Ser His Pro Gly Asn Leu ProLys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val ThrAsp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Rro Asp Asp Ser Arg Val lie AlaHis Thr Lys Leu lie Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys GluGly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr LeuThr Leu Lys).SEQ ID NO :2. p28的氨基酸序列，銅綠假單胞菌天青蛋白第50-77位殘基(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met AlaSer Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO 3.來自層理席藻(Phormidium laminosum)的質(zhì)體藍(lán)素的氨基酸序列(Glu Thr Phe Thr Val Lys Met Gly Ala Asp Ser Gly Leu Leu Gln Phe Glu ProAla Asn Val Thr Val His Pro Gly Asp Thr Val Lys Trp Val Asn Asn Lys Leu Pro Pro HisAsn lie Leu Phe Asp Asp Lys Gln Val Pro Gly Ala Ser Lys Glu Leu Ala Asp Lys Leu SerHis Ser Gln Leu Met Phe Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Glu lie Thr Phe Ser Ser Asp Phe Pro AlaGly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Cys Ala Pro His Arg Gly Ala Gly Met Val Gly Lys lie Thr Val GluGly).
SEQ ID NO :4.來自氧化亞鐵硫桿菌(Thiobacillus ferrooxidans)的鐵硫菌藍(lán)蛋白的氨基酸序列
(Gly Thr Leu Asp Thr Thr Trp Lys Glu Ala ‘Thr ]LeuProGlnValLysAlaMetLeu Glu Lys Asp Thr Gly Lys Val Ser Gly AspThrValThrTyrSerGlyLysThrVal HisValVal Ala Ala Ala Val Leu Pro Gly PheProPheProSerPheGluValHisAsp LysLys Asn ProThr Leu Glu lie Pro Ala GlyAlaThrValAspValThrPhelieAsn ThrAsn Lys Gly Phe GlyHis Ser Phe Asp lieThrLysLysGlyProProTyrAlaVal MetPro Val lie Asp Pro lie ValAla Gly ThrGlyPheSerProValProLysAspGly LysPhe Gly Tyr Thr Asp Phe Thr Trp HisProThrAlaGlyThrTyrTyrTyrValCys Glnlie Pro Gly His Ala Ala Thr Gly Met Phe GlyLyslieValValLys). SEQ ID NO :5.來自裂環(huán)無色桿菌(Achromobacter cycloclastes)的假天青蛋白的氨基酸序列(Ala Asp Phe Glu Val His Met Leu Asn Lys Gly Lys Asp GlyAlaMetValPheGlu Pro Ala Ser Leu Lys Val Ala ProGly AspThrVal ThrPhelieProThrAspLys GlyHisAsn Val Glu Thr lie Lys GlyMet lieProAsp GlyAlaGluAlaPheLysSer Lyslie Asn GluAsn Tyr Lys Val ThrPhe ThrAlaPro GlyValTyrGlyValLysCys ThrPro His Tyr GlyMet Gly Met ValGly ValValGln ValGlyAspAlaProAlaAsn LeuGlu Ala Val Lys GlyAla Lys AsnPro LysLysAla GlnGluArgLeuAspAlaAla LeuAla Ala Leu Gly Asn).
SEQ ID NO :6.來自糞產(chǎn)堿菌的天售1蛋白的氨基酸序列
(AlaCysAsp Val Ser lie Glu Gly Asn Asp Ser MetGlnPhe AsnThrLysSerlieValVal AspLysThr Cys Lys Glu Phe Thr lieAsn LeuLysHis ThrGlyLysLeuProLysAla AlaMet Gly HisAsn Val Val Val SerLys LysSerAsp GluSerAlaValAlaThrAsp GlyMet Lys Ala GlyLeu Asn Asn AspTyr ValLysAla GlyAspGluArgVallieAla HisThr Ser Val lie Gly GlyGly GluThr AspSerVal ThrPheAspValSerLysLeu LysGlu Gly Glu Asp Tyr Ala PhePheCys SerPhePro GlyHisTrpSerlieMetLys GlyThr lie Glu Leu Gly Ser).
SEQ ID NO :7.來自木糖氧化無色桿菌反硝化亞種I的天 P蛋白的氨基畫I序列
(Ala Gln Cys Glu Ala Thr lieGluSerAsnAspAla
Met GlnTyr Asn Leu Lys Glu Met Val Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val His Leu Lys HisVal Gly Lys Met Ala Lys Val Ala Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Glu Ala Asp LysGln Gly Val Ala Thr Asp Gly Met Asn Ala Gly Leu Ala Gln Asp Tyr Val Lys Ala Gly AspThr Arg Val lie Ala His Thr Lys Val lie Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr Phe Asp ValSer Lys Leu Thr Pro Gly Glu Ala Tyr Ala Tyr Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Met MetLys Gly Thr Leu Lys Leu Ser Asn).SEQ ID NO 8.來自支氣管炎博德特菌的天青蛋白的氨基酸序列(Ala Glu Cys Ser Val Asp lie Ala Gly Thr Asp Gln Met Gln Phe Asp Lys LysAla lie Glu Val Ser Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn Leu Lys HisThr GlyLysLeu ProArg Asn Val Met Gly His Asn Trp ValLeu ThrLysThrAlaAspMet GlnAlaVal Glu LysAsp Gly lie Ala Ala Gly Leu Asp Asn GlnTyrLeuLysAlaGly AspThrArg Val Leu AlaHis Thr Lys Val Leu Gly Gly Gly GluSerAspSerValThr PheAspVal Ala Lys Leu AlaAla Gly Asp Asp Tyr Thr Phe PheCysSerPheProGly HisGlyAla Leu Met Lys Gly ThrLet Lys Leu Val Asp).
SEQID NO :9.來自甲基單胞菌J的天青蛋白的氨基畫？序列
(AlaSerCys Glu Thr Thr Val Thr Ser Gly Asp Thr MetThrTyr SerThrArgSerlieSer ValProAla Ser Cys Ala Glu Phe Thr Val Asn PheGluHis LysGlyHisMetProLys ThrGlyMetGly His Asn Trp Val Leu Ala Lys SerAlaAsp ValGlyAspValAlaLys GluGlyAla HisAla Gly Ala Asp Asn Asn Phe ValThrPro GlyAspLysArgVallie AlaPheThr Pro lie IleGly Gly Gly Glu Lys ThrSerVal LysPheLysValSerAla LeuSerLys Asp Glu Ala Tyr ThrTyr Phe Cys SerTyrPro GlyHisPheSerMetMet ArgGlyThr Leu Lys Leu Glu Glu).
SEQID NO :10.來自腦膜炎奈瑟球菌Z2491的天1f蛋白的氨基 f序列
(Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala AlaGlu Ala ThrProAlaAlaGluAla ProAlaSer Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala ProAlaAsp AlaAlaGluAlaProAla AlaGlyAsn CysAla Ala Thr Val Glu Ser Asn AspAsnMet GlnPheAsnThrLysAsp lieGlnVal Ser LysAla Cys Lys Glu Phe Thr lieThrLeu LysHisThrGlyThrGln ProLysThr Ser Met Gly HisAsn lie Val lie GlyLysThr GluAspMetAspGlylie PheLysAsp Gly Val Gly Ala Ala AspThr Asp TyrValLys ProAspAspAlaArgVal ValAlaHis Thr Lys Leu lie Gly Gly Gly GluGlu&rSer LeuThrLeuAspProAla LysLeuAla Asp Gly Glu Tyr Lys Phe Ala Cys ThrPhePro GlyHisGlyAlaLeuMet AsnGlyLys Val Thr Leu Val Asp).
SEQID NO :11.來自熒光假單胞菌的天青蛋白的氨基丨酸序列(Ala Glu Cys Lys Thr Thr lie Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn Thr Lys AlaIle Glu lie Asp Lys Ala Cys Lys Thr Phe Thr Val Glu Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro LysAsn Val Met Gly His Asn Leu Val lie Ser Lys Gln Ala Asp Met Gln Pro lie Ala Thr Asp GlyLeu Ser Ala Gly lie Asp Lys Asn Tyr Leu Lys Glu Gly Asp Thr Arg Val lie Ala His Thr LysVal lie Gly Ala Gly Glu Lys Asp Ser Leu Thr lie Asp Val Ser Lys Leu Asn Ala Ala Glu LysTyr Gly Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His lie Ser Met Met Lys Gly Thr Val Thr Leu Lys).SEQ ID NO :12.來自綠針假單胞菌的天青蛋白的氨基酸序列(Ala Glu Cys Lys Val Asp Val Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn Thr LysGlu lie Thr lie Asp Lys Ser Cys Lys Thr Phe Thr Val Asn Leu Thr His Ser Gly Ser Leu ProLys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Lys Ser Ala Asp Met Ala Gly lie Ala ThrAsp Gly Met Ala Ala Gly lie Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Gly Asp Ser Arg Val lie Ala HisThr Lys lie lie Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser LysLeu Thr Ala GlyGlu Ser Tyr Glu Phe Phe Cys Ser Phe ProGly HisAsn Ser Met Met Lys Gly Ala Val ValLeu Lys).
SEQID NO :13.來自苛養(yǎng)木桿菌9a5c的天青蛋白的氨基酸序列
(Lys Thr Cys Ala Val Thr lie Ser Ala Asn Asp Gln MetLysPheAspGlnAsn ThrlieLys IleAla Ala Glu Cys Thr His Val Asn Leu Thr LeuThrHisThrGlyLys LysSerAla Arg ValMet Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Thr Thr AspMetGlnAla ValAlaLeu Ala Gly LeuHis Ala Thr Leu Ala Asp Asn Tyr Val Pro LysAlaAspPro ArgVallie Ala His Thr Ala IleIle Gly Gly Gly Glu Arg Thr SerlieThrPhePro ThrAsnThr Leu Ser Lys Asn Val Ser TyrThr Phe Phe Cys SerPheProGlyHisTrp AlaLeuMet Lys Gly Thr Leu Asn Phe Gly Gly).
SEQID NO :14.來自黃瓜(cucumis sativus)的漆樹花青苷的氨基I酸序列
(Met Gln Ser Thr Val His lie Val Gly Asp Asn Thr Gly TrpSerValProSer SerProAsn PheTyr Ser Gln Trp Ala Ala Gly Lys Thr Phe ArgValGlyAspSerLeu GlnPheAsn Phe ProAla Asn Ala His Asn Val His Glu Met GluThrLysGlnSerPhe AspAlaCys Asn Phe ValAsn Ser Asp Asn Asp Val Glu Arg ThrSerProVallieGlu ArgLeuAsp Glu Leu Gly MetHis Tyr Phe Val Cys Thr Val GlyThrHisCysSerAsn GlyGlnLys Leu Ser lie Asn Val ValAla Ala Asn Ala Thr ValSerMetProProPro SerSerSer Pro Pro Ser Ser Val Met Pro ProPro Val Met ProProProSerProSer).
SEQID NO :15.來自橙色綠屈撓菌的橙綠屈撓素A的氨基酸序列
(Met Lys lie Thr Leu Arg Met Met Val Leu AlaValLeuThrAlaMet AlaMetVal Leu Ala Ala Cys Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly GlySerThrGlyGlyGly SerGlySer GlyPro Val Thr lie Glu lie Gly Ser Lys Gly GluGluLeuAlaPheAsp LysThrGlu Leu Thr ValSer Ala Gly Gln Thr Val Thr lie ArgPheLysAsnAsnSer AlaValGln Gln His Asn Trp IleLeu Val Lys Gly Gly Glu AlaGluAlaAlaAsnlie AlaAsnAla Gly Leu Ser Ala Gly Pro AlaAla Asn Tyr Leu ProAlaAspLysSerAsn lielieAla Glu Ser Pro Leu Ala Asn Gly Asn GluThr Val GluValThrPheThrAla ProAlaAla Gly Thr Tyr Leu Tyr lie Cys Thr Val Pro GlyHisTyrProLeuMetGln GlyLysLeu Val Val Asn).
SEQID NO :16.來自橙色綠屈撓菌的橙綠屈撓素B的氨基酸序列
(Ala Ala Asn Ala Pro Gly Gly Ser Asn Val Val AsnGluThrProAlaGln ThrVal Glu Val Arg Ala Ala Pro Asp Ala Leu Ala Phe Ala GlnThrSerLeuSerLeu ProAlaAsn Thr Val Val Arg Leu Asp Phe Val Asn Gln Asn AsnLeuGlyValGlnHis AsnTrpValLeu Val Asn Gly Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala ValAsnThrAlaAlaGln AsnAsnAla AspAla Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp Thr Pro AsnAlaLeuAlaThrTla AlaMetLeu Asn AlaGly Glu Ser Gly Ser Val Thr Phe Arg ThrProAlaProGlyThr TyrLeuTyr lie Cys Thr PhePro Gly His Tyr Leu Ala Gly MetLysGlyThrLeuThr ValThrPro).
SEQID NO :17.來自黃瓜的黃瓜堿性蛋白的氨基酸序列
(Ala Val Tyr Val Val Gly Gly Ser Gly Gly TrpThrPheAsnThrGlu SerTrp Pro Lys Gly Lys Arg Phe Arg Ala Gly Asp IleLeuLeuPheAsnTyrAsnPro SerMetHis Asn Val Val Val Val Asn Gln Gly Gly PheSerThr Cys AsnThrProAla GlyAla LysVal Tyr Thr Ser Gly Arg Asp Gln lie LysLeuPro Lys GlyGlnSerTyr Phelie Cys Asn PhePro Gly His Cys Gln Ser Gly MetLyslieAla ValAsnAlaLeu).
SEQID NO :18.來自淋病奈瑟球菌F62的Laz的氨基E駿序列
(Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu , IaThrProAlaGlyGluAla ProAlaSerGlu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro AlaAspAlaAlaGluAlaProAla AlaGlyAsn Cys AlaAla Thr Val Glu Ser Asn Asp AsnMetGlnPheAsnThrLysAsp lieGlnVal Ser Lys AlaCys Lys Glu Phe Thr lie ThrLeuLysHisThrGlyThrGln ProLysAla Ser Met Gly His AsnLeu Val lie Ala LysAlaGluAetMetAspGlyVal PheLysAsp Gly Val Gly Ala Ala AspThr Asp Tyr ValLysProAspAspAlaArgVal ValAlaHis Thr Lys Leu lie Gly Gly Gly GluGlu SerSerLeuThrLeuAspProAla LysLeuAla Asp Gly Asp Tyr Lys Phe Ala Cys ThrPheProGlyHisGlyAlaLeuMet AsnGlyLys Val Thr Leu Val Asp).
SEQID NO :19.來自副溶血性弧菌的天青蛋白的氨基E駿序列
(Met Ser Leu Arg lie Leu Ala AlaThrLeuAlaLeuAlaGlyLeu SerPheGly Ala Gln Ala Ser Ala Glu Cys Glu Val SerIleAspAlaAsnAspMetMet GlnPheSer ThrLys Thr Leu Ser Val Pro Ala Thr CysLysGluValThrLeuThrLeu AsnHisThr Gly LysMet Pro Ala Gln Srt Mry Gly HidAsnValVallieAlaAspThr AlaAsnlie Gln Ala Val GlyThr Asp Gly Met Ser AlaGlyAlaAspAsnSerTyrVal LysProAsp Asp Glu Arg Val TyrAla His Thr Lys ValValGlyGlyGlyGluSerThr SerlieThr Phe Ser Thr Glu Lys IVfet ThrAla Gly GlyAspTyrSerPhePheCysSer PheProGly His Trp Ala lie Met Gln Gly Lys PheGluPheLys).
SEQID NO :20.來自橙色綠屈撓菌的橙綠屈撓素B的第57-89位氨基酸的氨基酸序列
(His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly Gly Asp Asp ValAla
AlaAla Val Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp).SEQ ID NO :21.來自丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)天青蛋白的第 51-77
位氨基酸的氨基酸序列(Ser Lys Lys Ala Asp Ala Ser Ala lie Thr Thr Asp Gly Met Ser Val Gly IleAsp Lys Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :22.來自腦膜炎奈瑟球菌Laz的第89-115位氨基酸的氨基酸序列(lie Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp Gly lie Phe Lys Asp Gly Val Gly AlaAla Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :23.來自副溶血性弧菌天青蛋白的第52_78位氨基酸的氨基酸序列(Ala Asp Thr Ala Asn lie Gln Ala Val Gly Thr Asp Gly Met SerAla Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :24.來自支氣管炎博德特菌天青蛋白的第51_77位氨基酸的氨基酸序列(Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly lie Ala AlaGly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp).SEQ ID NO :25.來自pl8的氨基酸序列，銅綠假單胞菌天青蛋白第50-67位殘基(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met AlaSer Gly).SEQ ID NO :26.來自pl9的氨基酸序列，銅綠假單胞菌天青蛋白第50-68位殘基(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met AlaSer Gly Leu).SEQ ID NO :27.來自p20的氨基酸序列，銅綠假單胞菌天青蛋白第50_69位殘基(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met AlaSer Gly Leu Asp).SEQ ID NO :28.來自p21的氨基酸序列，銅綠假單胞菌天青蛋白第50_70位殘基(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met AlaSer Gly Leu AspLys).SEQ ID NO :29.來自p22的氨基酸序列，銅綠假單胞菌天青蛋白第50_71位殘基(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met AlaSer Gly Leu Asp Lys Asp).SEQ ID NO :30.來自p23的氨基酸序列，銅綠假單胞菌天青蛋白第50_72位殘基(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met AlaSer Gly Leu AspLys Asp Tyr)SEQ ID NO :31.來自pM的氨基酸序列，銅綠假單胞菌天青蛋白第50_73位殘基(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met AlaSer Gly Leu AspLys Asp Tyr Leu).SEQ ID NO :32.來自p25的氨基酸序列，銅綠假單胞菌天青蛋白第50_74位殘基(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met AlaSer Gly Leu AspLys Asp Tyr Leu Lys).SEQ ID NO :33.來自p^的氨基酸序列，銅綠假單胞菌天青蛋白第50_75位殘基(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met AlaSer Gly Leu AspLys Asp Tyr Leu Lys Pro).SEQ ID NO :34.來自p27的氨基酸序列，銅綠假單胞菌天青蛋白第50_76位殘基(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met AlaSer Gly Leu AspLys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp).SEQ ID NO :35.來自銅綠假單胞菌天青蛋白第36_88位殘基的氨基酸序列(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr AlaAla Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu LysPro Asp Asp Ser Arg Val lie Ala His Thr Lys Leu lie Gly).SEQ ID NO :36和83. p53的引物的核苷酸序列(正向反向)(正向5-
GATGACTGCCATGGAGGAG-3‘反向‘-GTCCATGCAAGGTGATG-3‘).SEQ ID NO 37和84. 18S引物的核苷酸序列(正向反向)(正向 5'-CATGCCCGTTCTTAGTTGGT-3‘反向5' -GAACGCCACTTGTCCCTCTA-3‘).SEQ ID NO :38. ρ 18b的氨基酸序列，銅綠假單胞菌天青蛋白第60_77位殘基(Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys ProAsp Asp).SEQ ID NO :39. p^的0末端12個氨基酸的序列，銅綠假單胞菌天青蛋白第66_77
位殘基(Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :40. P^的0末端10個氨基酸的序列，銅綠假單胞菌天青蛋白第68_77
位殘基(Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :41. p^mc-末端11個氨基酸的序列，銅綠假單胞菌天青蛋白第67-77
位殘基(Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :42.是天青蛋白截短體p28的變體的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Ala Val Val Thr Asp Thr Met Ala Ser GlyLeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :43.是天青蛋白截短體p28的變體的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Leu Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Leu Ala Ser GlyLeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :44.是天青蛋白截短體p28的變體的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Val Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Val Ala Ser GlyLeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :45.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Asp Asp Pro Lys Leu Tyr Asp Lys Asp Leu Gly Ser Ala Met Gly Asp Thr Val ValGly Gln Met Asp Ala Ala Thr Ser Leu).SEQ ID NO :46.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(乙?；?Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met AlaSerGly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp-酉先胺化).SEQ ID NO :47.是六肽的氨基酸序列(Val Ser Pro Pro Ala Arg).SEQ ID NO :48.是六肽的氨基酸序列(Tyr Thr Pro Pro Ala Leu).SEQ ID NO :49.是六肽的氨基酸序列(Phe Ser Phe Phe Ala Phe).SEQ ID NO :50.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala SerGly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Thr Pro Gly Cys).SEQ ID NO :51.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Cys Gln Gly Val Val Thr Asp Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :52.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Cys Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp ).SEQ ID NO :53.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Cys Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :54.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Thr Met Gln Cys Val Val Thr Asp Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :55.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Thr Met Gln Gly Cys Val Thr Asp Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :56.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asn Thr Gln Gly Cys Val Thr Asp Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :57.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asn Thr Gln Gly Val Cys Thr Asp Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :58.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Thr Ala Val Cys Thr Asp Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :59.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Thr Ala Val Val Cys Asp Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :60.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Thr Val Val Cys Asp Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :61.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Thr Val Val Thr Cys Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :62.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Ala Thr Val Thr Cys Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :63.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Ala Thr Val Thr Asp
Gly Met Ala Ser
Gly Met Ala Ser
Gly Met Ala Ser
Gly Met Ala Ser
Gly Met Ala Ser
Gly Met Ala Ser
Gly Met Ala Ser
Gly Met Ala Ser
Gly Met Ala Ser
Gly Met Ala Ser
Gly Met Ala Ser
Gly Met Ala Ser
Cys Met Ala SerGly LeuAsp Lys Asp iyr Leu Lys Pro Asp Asp;.SEQ ID NO 64.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Thr Ala Asp Cys Met Ala Ser Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp;.SEQ ID NO 65.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Thr Ala Asp Gly Cys Ala Ser Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp;.SEQ ID NO :66.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asn Gly Cys Ala Ser Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp;.SEQ ID NO :67.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Ala Thr Met Gly Ser Gly LeuCys Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp;.SEQ ID NO 68.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Leu Thr Ala Ser Gly LeuCys Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp;.SEQ ID NO :69.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp;.SEQ ID NO :70.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp;.SEQ ID NO :71.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Trp Asp Gly Met Ala Ser Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp;.SEQ ID NO :72.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Trp Met Ala Ser Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp;.SEQ ID NO 73.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp;.SEQ ID NO 74.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Trp Asp Gly Met Ala Ser Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp;.SEQ ID NO :75.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Trp Met Ala Ser Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp;.SEQ ID NO :76.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Trp Asp Gly Met Ala SerGly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :77.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Thr Asp Trp Met Ala Ser Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :78.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Trp Asp Trp Met Ala Ser Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :79.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Vrp Trp Asp Trp Met Ala Ser Gly LeuAsp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).SEQ ID NO :80.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(X1 Ser X2 Ala Ala Asp X3 X4 X5 Val Val X6 Asp X7 X8 Ala Ser Gly Leu Asp Lys AspTyr Leu Lys Pro Asp X9).SEQ ID NO :81.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽的氨基酸序列(X1 Asp Pro Lys Leu Tyr Asp Lys Asp Leu Gly Ser Ala X2 X3 Asp X4 Val Val X5 X6X7 Asp Ala Ala X8 Ser X9).SEQ ID NO :82.是陽離子肽Ai^8的氨基酸序列(Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg).SEQ ID NO :85.可與p53相互作用的氨基酸的序列(Ser Gly Leu Asp Lys Asp).附圖簡述

圖1描繪了對腺體進(jìn)行p^和天青蛋白的效力的評價的照片。圖IA顯示了 DMBA 處理的腺體中泡病變的代表性照片，和其與利用DMBA聯(lián)合化學(xué)預(yù)防劑處理的腺體進(jìn)行的對比。圖1B-1G顯示了 p^對泡病變的發(fā)展的作用的代表性照片。圖2描繪了顯示p^針對DMBA誘導(dǎo)的乳房泡病變的效力的圖。圖3描繪了導(dǎo)管病變的代表性切片和P^的作用的照片。圖4描繪了顯示出針對DMBA誘導(dǎo)的導(dǎo)管病變的p^的效力的圖。圖5描繪了天青蛋白的整體3D結(jié)構(gòu)，其中P^肽區(qū)域為粗體(SEQ ID N0. 2)。圖6A描繪了乳房泡病變的代表性切片和M8對乳腺泡病變的發(fā)展的作用的照片。圖6B描繪了乳房病變的代表性切片和P^對所述病變的作用的照片。圖6C描繪了顯示出P^和他莫昔芬對乳房病變的作用的圖。圖7A描繪了存在或不存在雌激素和孕酮時比較乳腺中p53的表達(dá)的圖。圖7B描繪了顯示p28、他莫昔芬和兩者的組合對p53表達(dá)的影響的圖。圖7C描繪了 MMOC的乳腺的代表性切片中p53和Ki67的免疫組織化學(xué)染色的照片。圖7D描繪了小鼠乳腺的代表性切片和所述乳腺中天青蛋白、P^和他莫昔芬對 P53和Ki-67的影響的照片。圖8描繪了 MMOC模型中顯示芬維A胺和p^的組合對MAL發(fā)展的影響的圖。
圖9描繪了顯示MMOC模型中他莫昔芬和p^的組合對MDL發(fā)展的作用的圖。圖10A-L.描繪了小鼠乳腺的代表性切片和芬維A胺與M8單獨地和聯(lián)合地在這些乳腺中的作用的照片。圖11A-C.描繪了顯示天青蛋白來源的肽，？18和!^8滲透到不同組織發(fā)生的癌細(xì)胞系中以及它們的正常對應(yīng)物的照片。(A)顯示37°C下2小時后Alexafluor 568標(biāo)記的 觀或？18的滲透照片。使用陽離子Ai^8(SEQ IDNO :82)作為對照。⑶描繪37°C下2小時后Alexafluor 568標(biāo)記的M8或pl8滲透到同樣細(xì)胞系中的流式細(xì)胞術(shù)分析的圖。(C) 描繪比來自正常細(xì)胞的熒光成倍增加的圖。P^或口18進(jìn)入到4個黑素瘤細(xì)胞系中的相似的觀察顯示了比來自正常細(xì)胞的熒光的幾倍增加。圖12A和B.描繪了顯示azu 60-77 (pl8b)和azu 66-77 (pl2)進(jìn)入到癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中的照片。利用alexafluor 568標(biāo)記的pl8b (A)或pl2(B)在37°C下孵育細(xì)胞2小時，并通過共聚焦顯微術(shù)來記錄圖像。圖13A和B.描繪了天青蛋白和它的肽的細(xì)胞膜毒性的圖。㈧在37°C下10分鐘暴露于不同濃度的p^、pl8和天青蛋白的UISOMel-2細(xì)胞的LDH泄漏分析。包括作為陽性對照的標(biāo)準(zhǔn)裂解緩沖液(cytotox-one試劑)。在k，χ 560nm和kem 590nm處測量暴露后的熒光的改變。將裂解緩沖液定義為100% LDH釋放。數(shù)據(jù)代表對照的陽性熒光的百分比。 數(shù)據(jù)顯示為平均值士SEM。(B)從與p28、pl8和天青蛋白共同孵育的人紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放。人紅細(xì)胞在37°C下與肽孵育30分鐘，并測定了 540nm處的吸光度。0. 1% Triton X-100后的血紅蛋白釋放定義為100%血紅蛋白釋放。數(shù)據(jù)代表了三個平行測定的平均值士 SEM。圖14A-D.描繪了顯示p^和pl8進(jìn)入UIS0_Mel_2細(xì)胞的溫度依賴和競爭性內(nèi)在化。在不同的溫度下通過共聚焦顯微術(shù)來評價Alexafluor 568標(biāo)記的p28 (A)或pl8 (B) 在20 IlM時的滲透。(C)和(D)在未標(biāo)記的肽QOO倍過量)的存在/不存在下，在37 °C下 Alexafluor 568標(biāo)記的p28 (C)或pl8 (D)以5 μ M進(jìn)入UIS0-Mel-2細(xì)胞30分鐘后的共聚焦分析。圖15A-D. (A)描繪了在硫酸肝素(100 μ g/ml)的存在/不存在下，在37°C下觀、 pl8(20yM)*Ar^(SEQ ID NO :82) (10 μ Μ)進(jìn)入UISO-Mel-2細(xì)胞1小時后的共聚焦分析的照片。(B)顯示在抑制物存在下!^8或？18進(jìn)入的流式細(xì)胞術(shù)分析的圖。認(rèn)為抑制物不存在下的細(xì)胞熒光強度(對照)為100%。(C)描繪在抑制物存在下!^8和？18進(jìn)入成纖維細(xì)胞的FRCS分析的圖。(D)描繪了顯示pl8和!^8與窖蛋白1(套組1)的共定位的照片。在 37°C下利用Alexafluor 568標(biāo)記的pl8或p^ (20 μ Μ)或培養(yǎng)基孵育UIS0-Mel-2細(xì)胞2小時。固定細(xì)胞并對其進(jìn)行處理以便抗窖蛋白1免疫染色。在37°C下2小時后，Alexafluor 568標(biāo)記的pl8或p^ (20 μ Μ)進(jìn)入UISO-Mel-2細(xì)胞，隨后進(jìn)行抗高爾基體蛋白97抗體處理的共聚焦分析(套組2)。Alexafluor 568標(biāo)記的天青蛋白、P^和pl8(紅色)與線粒體示蹤物(mitotracker)染料(綠色)(套組幻和溶酶體示蹤物(Lysotracker)染料(綠色)(套組4)在UISO-Mel-2細(xì)胞中的共定位。在37°C下利用20 μ M的天青蛋白、p^、pl8 或僅培養(yǎng)基來孵育細(xì)胞。90分鐘孵育后，加入線粒體示蹤物/溶酶體示蹤物探針并孵育細(xì)胞30分鐘。用DAPI (藍(lán)色)對細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染色。天青蛋白、P^或？18的共定位表現(xiàn)為黃色熒光。
圖16A和B.描繪在37°C下與漸增濃度的天青蛋白、p^或pl8孵育72小時的 UISO-Mel-2細(xì)胞的圖。MTT(A)；直接細(xì)胞計數(shù)(B)。認(rèn)為對照孔中的細(xì)胞存活率(MTT)或細(xì)胞數(shù)目為100%。數(shù)據(jù)代表平均值士 SEM。圖17.描繪M8對人乳腺癌細(xì)胞的生長抑制的圖。在37°C下利用Μ8(0-200μΜ) 孵育MCF-7細(xì)胞Μ、48和72小時。細(xì)胞計數(shù)(A)和MTT分析(B)。使用阿霉素(doxorubicin) 作為陽性對照。認(rèn)為對照孔的細(xì)胞數(shù)目或存活率是100%。數(shù)據(jù)代表對照的平均值％ 士SEM。*，ρ < 0. 05。(C)p^對MCF-7異種移植生長的抑制。對每組的至少10只小鼠在第10天、第14天、第21天和第25天進(jìn)行15 μ mol/kg的紫杉醇腹膜內(nèi)處理，或每天進(jìn)行5 或10mg/kg的p^的腹膜內(nèi)處理，持續(xù)30天。柱形代表平均值士SEM。*，ρ < 0. 05。圖18. (A)和(B)是描繪細(xì)胞周期和P^對乳腺癌細(xì)胞的滲透的FACS分析的圖。 利用ρ28 (50 μ Μ)處理MCF-7 (A)和MDD2細(xì)胞(B) 48小時和72小時。如Yamada等人，Proc Natl Acad Sci USA, 101 :4770-4775(2004)中所描述的，利用碘化丙啶對細(xì)胞進(jìn)行染色并通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。指出了 G1期、3期、(；2/^期和亞G1 (凋亡)期的細(xì)胞的百分比。 (C)包括描繪在無酚紅的MEM中在蓋玻片上過夜培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞和MDD2細(xì)胞的照片，在 37°C下利用20 μ M p28或10 μ M的陽離子(陽性對照)肽，八精氨酸(octaarginine) (Arg8, SEQ ID NO 82)處理細(xì)胞2小時。紅色-Alexa fluor 568標(biāo)記的p28，藍(lán)色-DAPI (核)。圖19. (A)-(D)是描繪細(xì)胞中p53和p^水平的照片。(A)與p^孵育后隨時間變化的MCF-7細(xì)胞中的p53水平。緊接處理前相對p53水平的(％ )增高(0小時作為 100% )0 (B)GST pull-down分析表明GST-ρ^和p53之間的復(fù)合物形成。從左到右為 GST-p28 (10 μ g/反應(yīng)和20 μ g/反應(yīng))，GST_MDM2和單獨的GST。利用抗p53抗體通過免疫印跡(IB)來檢測p53。(C)在摩爾過量的p^存在下p53被GST-MDM2拉下(上圖)。在 P^存在下，三種不同的抗p53抗體，Pab 1801 (32-79氨基酸)、ab M33 Q77-296氨基酸) 和Pabl802 (306-393氨基酸)與GST_p53固定的珠子反應(yīng)。P^通過利用抗P^抗體的免疫印跡來檢測(下圖)。(D)通過摩爾過量的p^片段pl2、pl8和pl8b對p^結(jié)合GST-53 的競爭。結(jié)合的相對量(單獨的M8表示為100% )。記物。(E)是描繪暴露于 P28或天青蛋白后MCF-7核提取物中的P53DNA結(jié)合的圖。H2A處理的MCF-7細(xì)胞的核提取物作為內(nèi)部對照。利用P53的單克隆抗體來定量p53-寡聚核苷酸復(fù)合物。數(shù)據(jù)表示為平行三份的平均值士SEM。圖20.描繪M8誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白(CDK和CDKI)級聯(lián)反應(yīng)的照片。將MCF_7 (A) 和MDD2細(xì)胞⑶暴露于ρ28(50μΜ)持續(xù)Μ、48和72小時，并通過免疫印跡來測定蛋白水平。將MCF-7細(xì)胞在蓋玻片上與P^ —起培養(yǎng)72小時，p21 (C)和細(xì)胞周期蛋白Bl (D)的細(xì)胞內(nèi)定位和相對水平。利用相應(yīng)的特異性抗體來染色P21和細(xì)胞周期蛋白Bi。(E)利用抗p-cdc2抗體(Santa Cruz Biotechnology, CA)來評估磷酸化的cdc2。所有結(jié)果通過作為內(nèi)部對照的肌動蛋白來標(biāo)準(zhǔn)化。發(fā)明詳述定義如本文所用的，除非特別描述為“單個細(xì)胞”，術(shù)語“細(xì)胞”包括該術(shù)語的單數(shù)或復(fù)數(shù)形式。如本文所用的，術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”可互換地用于指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語應(yīng)用于氨基酸聚合物，其中一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物。該術(shù)語還應(yīng)用于天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”也包括修飾，所述修飾包括但不局限于糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸化、谷氨酸殘基的Y羧化、羥基化和ADP核糖基化。應(yīng)理解地是，多肽并不總是全部是直鏈的。例如，作為泛素化的結(jié)果，多肽可以是支鏈的，并且一般作為翻譯后事件(包括天然處理事件和非天然的人工操作引起的事件)的結(jié)果，多肽可以是環(huán)形的(具有或沒有支鏈)。環(huán)狀、支鏈和支鏈環(huán)狀的多肽可通過非翻譯天然方法來合成，以及通過完全合成方法來合成。如本文所用的，術(shù)語“藥理學(xué)活性”表示藥物或其它化學(xué)物質(zhì)對生物系統(tǒng)的作用。 化學(xué)物質(zhì)的作用可以是有利的(治療性的)或有害的(毒性的)。純的化學(xué)物質(zhì)或混合物可以是天然來源的(植物、動物或礦物)，或可以是合成的化合物。如本文所用的，術(shù)語“癌前”意為癌變前的，或不受控制的異常細(xì)胞分裂前。如本文所用的，術(shù)語“抗雌激素”意為阻止雌激素的活性，或以其他方式防止細(xì)胞產(chǎn)生或利用雌激素的物質(zhì)。如本文所用的，術(shù)語“ER”意為雌激素受體。如本文所用的，術(shù)語“病變”意為異常組織的區(qū)域。如本文所用的，術(shù)語“病理狀況”包括解剖上和生理上偏離正常，其構(gòu)成活體動物或其部分之一的正常狀態(tài)的損害、干擾或改變身體機能的表現(xiàn)，并且是對各種因素(如營養(yǎng)不良、工業(yè)危害或氣候)、對特定的傳染物(如蠕蟲、寄生原生動物、細(xì)菌或病毒)、對生物體內(nèi)在缺陷(如遺傳異常)、或?qū)@些因素的組合的反應(yīng)。如本文所用的，術(shù)語“病癥”包括解剖上和生理上偏離正常，其構(gòu)成活體動物或其部分之一的正常狀態(tài)的損害，干擾或改變身體機能的表現(xiàn)。如本文所用的，術(shù)語“患有”包括，目前表現(xiàn)出病理狀況的癥狀，盡管沒有可觀察到的癥狀但具有病理狀況，處于病理狀況的恢復(fù)中或已從病理狀況中恢復(fù)。如本文所用的，術(shù)語“化學(xué)預(yù)防”是指藥物、維生素或其它天然的或合成的生物的或化學(xué)的劑的使用，以試圖降低癌前病變和/或癌癥的發(fā)展或復(fù)發(fā)的風(fēng)險，預(yù)防、抑制、逆轉(zhuǎn)或延遲癌前病變和/或癌癥的發(fā)展或復(fù)發(fā)。如本文所用的，術(shù)語“第二化學(xué)預(yù)防劑”指除天青蛋白的截短體外，藥物、維生素或其它天然的或合成的生物的或化學(xué)的劑，其降低癌前病變和/或癌癥的發(fā)展或復(fù)發(fā)的風(fēng)險，阻止、抑制、逆轉(zhuǎn)或延遲癌前病變和/或癌癥的發(fā)展或復(fù)發(fā)。如本文所用的，術(shù)語“治療”包括預(yù)防、降低、停止或逆轉(zhuǎn)與正在治療的病癥相關(guān)的病癥或癥狀的進(jìn)展或嚴(yán)重度。因此，術(shù)語“治療”視情況包括藥物施用和/或預(yù)防性治療。 治療還可包括防止或減輕病癥諸如癌前病變或癌癥的發(fā)展。如本文所用的，術(shù)語“抑制細(xì)胞生長”意為減緩或停止細(xì)胞分裂和/或細(xì)胞擴增。 該術(shù)語還包括抑制細(xì)胞發(fā)育或增加細(xì)胞死亡?！爸委熡行Я俊笔怯行Х乐?、降低、停止或逆轉(zhuǎn)正在治療對象的特定疾病的發(fā)展、或部分地或整體地減輕特定疾病的現(xiàn)有癥狀的量。治療有效量的測定在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)。如本文所用的，術(shù)語“基本上純的”，當(dāng)用于修飾本發(fā)明的蛋白或其它細(xì)胞產(chǎn)物時， 指的是例如從生長培養(yǎng)基或細(xì)胞內(nèi)容物分離的蛋白形式為基本上沒有或基本上未摻雜其它蛋白和/或其它化合物。術(shù)語“基本上純的”指因子的量以干重計是分離組分的至少約 75%，或至少“75%基本上純的”。更具體地，術(shù)語“基本上純的”是指化合物以干重計是分離組分的至少約85%，或至少“85%基本上純的”。最具體地，術(shù)語“基本上純的”是指化合物以干重計是分離組分的至少約95%，或至少“95%基本上純的”。術(shù)語“基本上純的”也可用于修飾本發(fā)明的合成的蛋白或化合物，其中，例如，合成的蛋白從合成反應(yīng)的試劑和副產(chǎn)物中分離。如本文所用的，術(shù)語“藥物級”當(dāng)指本發(fā)明的肽或化合物時，是基本上或?qū)嵸|(zhì)上從組分分離的肽或化合物，該組分通常伴隨在天然狀態(tài)發(fā)現(xiàn)的該物質(zhì)，包括合成試劑和副產(chǎn)物，以及基本上或?qū)嵸|(zhì)上從可能損壞其藥用的成分分離。例如，“藥物級”肽可從任何致癌物分離。在某些情況下，“藥物級”可以通過想要施用的方法來修飾，例如“靜脈藥物級”，來指定基本上或?qū)嵸|(zhì)上從任何可能使組合物不適于向患者施用的物質(zhì)中分離的肽或化合物。例如“靜脈藥物級”肽可從去垢劑諸如SDS和抗菌劑諸如疊氮化物中分離。術(shù)語“分離的”、“純化的，，或“生物上純的，，指的是物質(zhì)基本上沒有或?qū)嵸|(zhì)上沒有通常在該物質(zhì)的天然狀態(tài)中伴隨該物質(zhì)的組分。因此，根據(jù)本發(fā)明的分離的肽優(yōu)選地不含有在肽的原位環(huán)境中通常與肽有關(guān)的物質(zhì)。多肽的“分離的”區(qū)域是指不包括該區(qū)域所來源的多肽的整個序列的區(qū)域?！胺蛛x的”核酸、蛋白或其相應(yīng)的片段已基本上從其體內(nèi)環(huán)境中移出，從而其可由有經(jīng)驗的技術(shù)人員來操作，諸如但不限于，核苷酸測序、限制性消化、定點誘變和亞克隆到用于核酸片段的表達(dá)載體中以及獲得基本上純的量的蛋白或蛋白片段。本文中關(guān)于肽所用的術(shù)語“變體”，是指與野生型的多肽相比，具有氨基酸替代、缺失或插入的氨基酸序列變體。變體可以是野生型肽的截短體?！叭笔А笔菑亩嚯膬?nèi)部去除一個或多個氨基酸，而“截短體”是從多肽的一端或兩端去除一個或多個氨基酸。因此，可通過操作編碼多肽的基因來生成變體肽。變體可通過改變多肽的基本組成或特征，但不改變其至少某些藥理學(xué)活性而生成。例如，天青蛋白的“變體”可以是保留其抑制哺乳動物癌前細(xì)胞生長的能力的突變的天青蛋白。在一些情況下，變體肽是利用非天然氨基酸(例如 ε-(3，5-二硝基苯甲?；?-Lys 殘基)來合成的。Ghadiri&Fernholz，J. Am. Chem. Soc.， 112 :9633-9635(1990)。在一些實施方案中，與野生型肽或其部分相比，變體具有的替代、 缺失或插入的氨基酸不超過20個。在一些實施方案中，與野生型肽或其部分相比，變體具有的替代、缺失或插入的氨基酸不超過15個。在一些實施方案中，與野生型肽或其部分相比，變體具有的替代、缺失或插入的氨基酸不超過10個。在一些實施方案中，與野生型肽或其部分相比，變體具有的替代、缺失或插入的氨基酸不超過6個。在一些實施方案中，與野生型肽或其部分相比，變體具有的替代、缺失或插入的氨基酸不超過5個。在一些實施方案中，與野生型肽或其部分相比，變體具有的替代、缺失或插入的氨基酸不超過3個。如本文所用的，術(shù)語“氨基酸”是指包含任何天然存在的或非天然存在的或合成的氨基酸殘基的氨基酸部分，即，包含至少一個羧基和與一個、兩個、三個或更多個碳原子，通常為一個(α)碳原子直接連接的至少一個氨基的任何部分。本文中關(guān)于肽所用的術(shù)語“衍生物”是指衍生自目標(biāo)肽的肽。衍生物包括肽的化學(xué)修飾而使肽仍保留其某些基本活性。例如，天青蛋白的“衍生物”可以，例如是化學(xué)修飾的天青蛋白，其保留了天青蛋白抑制哺乳動物細(xì)胞中血管生成的能力。感興趣的化學(xué)修飾包括但不局限于，肽的酰胺化、乙?；?、硫酸化、聚乙二醇(PEG)修飾、磷酸化或糖基化。此外，衍生肽可以是多肽或其片段與化學(xué)化合物的融合，所述化學(xué)化合物諸如但不局限于，另一肽、藥物分子或其它治療劑或藥劑或可檢測探針。術(shù)語“氨基酸序列同一性百分比(％ ) ”被定義為當(dāng)比對兩個序列時，多肽中與候選序列中氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。為了測定氨基酸同一性％，比對序列， 并且如果需要，引入空位來實現(xiàn)最大的序列同一性％ ；保守性替代不被認(rèn)為是序列同一性的部分。測定百分比同一性的氨基酸序列比對方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。通常，使用公眾可獲得的計算機軟件，例如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)軟件來比對肽序列。在具體的實施方案中，使用長復(fù)雜性過濾器(longcomplexity filter)、預(yù)期 (expect) 10、字大小(word size)3、存在性(existence) 11 和延伸(extension) 1 的缺省參數(shù)來使用Blastp (可從美國國立生物技術(shù)信息中心，Bethesda MD獲得)。當(dāng)進(jìn)行氨基酸序列比對時，給定的氨基酸序列A同、與或相對給定的氨基酸序列B 的氨基酸序列同一性％ (其可選地可表達(dá)為給定氨基酸序列A具有或包含同、與或相對給定氨基酸序列B的一定的％氨基酸序列同一性)可按如下來計算%氨基酸序列同一性=X/Y*100其中X是氨基酸殘基的數(shù)目，其通過A和B的序列比對程序或算法的比對評分為相同匹配，和Y是B中氨基酸殘基的總數(shù)目。如果氨基酸序列A的長度不等于氨基酸序列B的長度，A對B的％氨基酸序列同一性不等于B對A的％氨基酸序列同一性。當(dāng)對比較長的序列與較短的序列時，較短序列將為“B”序列。例如，當(dāng)對比截短的肽與相應(yīng)的野生型多肽時，截短的肽將是“B”序列。_既述本發(fā)明提供了包含銅氧還蛋白、銅氧還蛋白的變體、衍生物、截短體和結(jié)構(gòu)等價物的組合物，以及在哺乳動物中預(yù)防癌癥發(fā)展的方法。本發(fā)明還提供了包含化學(xué)預(yù)防劑銅氧還蛋白或其變體、衍生物、截短體和結(jié)構(gòu)等價物和其它化學(xué)預(yù)防劑的組合物。本發(fā)明還提供了保留在哺乳動物中防止癌癥的發(fā)展或癌癥的復(fù)發(fā)的能力的銅氧還蛋白的變體、衍生物、截短體和結(jié)構(gòu)等價物。本發(fā)明還提供了包含銅綠假單胞菌天青蛋白、天青蛋白的變體、衍生物、截短體和結(jié)構(gòu)等價物的組合物，以及其用于治療患者、尤其是處于比普通群體形成癌癥的風(fēng)險更高的風(fēng)險中的患者的用途。最后，本發(fā)明提供了在哺乳動物細(xì)胞、組織和動物中通過在誘導(dǎo)癌前病變之前或之后將細(xì)胞與銅氧還蛋白，或其變體、 衍生物、截短體或結(jié)構(gòu)等價物相接觸，并觀察癌前細(xì)胞和/或癌細(xì)胞的發(fā)展，從而研究癌癥的發(fā)展的方法。對于這些實施方案中的每一個，本發(fā)明提供了銅氧還蛋白或其變體、衍生物、截短體和結(jié)構(gòu)等價物與另一化學(xué)預(yù)防劑的聯(lián)合或共施用。優(yōu)先進(jìn)入細(xì)胞由銅綠假單胞菌加工的氧化還原蛋白，銅氧還蛋白天青蛋白，選擇性地進(jìn)入 J774肺癌細(xì)胞而非進(jìn)入正常細(xì)胞中，并誘導(dǎo)凋亡。Zaborina等人，Microbiology 146 2521-2530(2000)。天青蛋白還可選擇性地進(jìn)入并殺死人黑素瘤UIS0_Mel_2細(xì)胞或人乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞。Yamada 等人，PNAS99 14098-14103 (2002) ；Punj 等人，Oncogene 23 2367-2378(2004)。因此天青蛋白由于其不能進(jìn)入正常細(xì)胞而靶向癌細(xì)胞而非正常細(xì)胞。Fialho 等人，Recent Patents Anticancer Drug Discov. 2 :224_234 (2007)。來自銅綠假單胞菌的天青蛋白優(yōu)先進(jìn)入J774小鼠網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤細(xì)胞中，與腫瘤抑制蛋白P53形成復(fù)合物并使其穩(wěn)定，提高了 p53的細(xì)胞內(nèi)濃度，并誘導(dǎo)了凋亡。Yamada等人，Infection and Immunity 70 :7054_7062 (2002)。對天青蛋白分子的不同結(jié)構(gòu)域的詳細(xì)研究顯示氨基酸50-77 (p28) (SEQ ID NO :2)代表蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)，其對于內(nèi)在化和隨之的凋亡活性很重要。Yamada 等人，Cell. Microbial. 7 :1418_1431 (2005)。協(xié)助胞吞組分細(xì)胞滲透的陽離子細(xì)胞滲透肽(“CPP”)的溫度依賴的進(jìn)入體現(xiàn)在天青蛋白和氨基酸片段50-77 (p28，SEQ ID NO 2)的進(jìn)入中。Yamada，Τ.，等人，Cell Microbiol 7:1418-1431(2005)。天青蛋白的 50-67 (pl8，SEQ ID NO 25)進(jìn)入正常細(xì)胞和惡性細(xì)胞表現(xiàn)出與P28相關(guān)的加速。pl8的較低的Km和較高的Vmax表明當(dāng)氨基酸50-67與磷脂膜結(jié)合時限定了兩親性結(jié)構(gòu)，其更接近地代表了天青蛋白的實際PTD。然而，能量依賴的胞吞過程或孔相關(guān)的過程不是這些肽可獲得的唯一進(jìn)入機制。例如，代謝抑制物和膜潛在抑制物疊氮化鈉和烏本箭毒苷(Na+Κ+ΑΤΡ酶抑制物)，其抑制陽離子肽的進(jìn)入，但并不削弱pl8或p28進(jìn)入到UISO-Mel-2細(xì)胞或成纖維細(xì)胞中(圖15B、C)，表明每個肽可直接透過細(xì)胞膜。pl8、p28和天青蛋白以描述為不依賴發(fā)動蛋白的網(wǎng)格蛋白依賴的載體介導(dǎo)的方式透過質(zhì)膜并到達(dá)隨后的與窖蛋白結(jié)合的內(nèi)體、溶酶體和高爾基體。Kirkham，M和Parton， R. G. ,Biochem Biophys Acta 1746 :349_363 (2005)。諾可唑?qū)B透的顯著抑制和破壞肌動蛋白絲的細(xì)胞松弛素-D對抑制的相對減弱，協(xié)助了窖蛋白介導(dǎo)的進(jìn)入。關(guān)于整體細(xì)胞表面組分和看似不同的分子已描述了這種進(jìn)入方式，所述看似不同的分子即，葡聚糖，和同樣利用窖蛋白來繞開經(jīng)典胞吞途徑的廣泛的病原體或其產(chǎn)物。利用β-甲基環(huán)糊精、菲律賓菌素或制霉菌素從質(zhì)膜去除膽固醇以破壞脂筏，其為提供液體平臺以分離膜組分并將膜區(qū)域化的質(zhì)膜結(jié)構(gòu)域，顯著抑制了 ρ18(50% )和ρ28( 60% )滲透到UISO-Mel-2細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中(分別為35%和42% )，表明pl8和p28通過窖蛋白滲透到質(zhì)膜中的顯著的百分比( 60%)。窖蛋白是質(zhì)膜的脂筏內(nèi)陷的50至IOOnm的Ω形亞群，由起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)子的作用的窖蛋白特異蛋白(窖蛋白-1、_2或_3)的存在所界定。布雷菲德菌素A破壞了高爾基體并抑制了 ρ18累積，因此該通路也用于ρ18和ρ28 進(jìn)入和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運。Ρ18和ρ28通過窖蛋白進(jìn)行的細(xì)胞滲透與證據(jù)一致Ν-糖基化的抑制物在UISO-Mel-2細(xì)胞中使細(xì)胞進(jìn)入減少了 60%，且在成纖維細(xì)胞中使細(xì)胞進(jìn)入分別減少了 25%和35%。pl8和p28進(jìn)入之間的百分比差異與癌細(xì)胞對比正常細(xì)胞中的N-糖基化膜結(jié)構(gòu)的數(shù)目相關(guān)，并且P28和pl8的進(jìn)入的相關(guān)途徑經(jīng)由該機制。圖15B、C。相對于許多其它潛在的抗癌肽，天青蛋白、p28和pl8均以高親和性和高容量與癌細(xì)胞結(jié)合。據(jù)認(rèn)為，結(jié)合后，該蛋白/受體復(fù)合物定位在窖蛋白中并被內(nèi)化，最終移向(通過小窩體(caveosome))高爾基體、ER和核。除窖蛋白介導(dǎo)的進(jìn)入外，動力學(xué)分析還表明p28 和pl8通過非網(wǎng)格蛋白窖蛋白介導(dǎo)的過程滲透質(zhì)膜。非網(wǎng)格蛋白依賴的通路和非窖蛋白依賴的通路可作為組成型內(nèi)化機制而存在，比如用于白細(xì)胞介素2受體和用于某些糖基-磷脂酰肌醇(GPI)錨定的蛋白。Lamaze，C.，等人，Mol Cell 7:661-671(2001) ；Sabharanjak, S.，等人，Dev Cell, 2 411-423 (2002) 癌細(xì)胞中窖蛋白-1表達(dá)高于正常細(xì)胞不太可能為天青蛋白、P28和pl8優(yōu)先進(jìn)入癌細(xì)胞的唯一依據(jù)。成纖維細(xì)胞和許多其它正常細(xì)胞在其表面也具有大量窖蛋白。出現(xiàn)在實施例6-12中的發(fā)現(xiàn)表明天青蛋白的氨基酸50-67和50-77的細(xì)胞滲透因為其對于癌細(xì)胞的優(yōu)先性相對于其它所有目前的CCP是獨特的，并且p28的C末端10-12個氨基酸，天青蛋白的氨基酸50-77含有負(fù)責(zé)細(xì)胞周期抑制和凋亡活性的結(jié)構(gòu)域?；瘜W(xué)預(yù)防天青蛋白，和來源于天青蛋白的肽，比如p28(SEQ ID NO :2)，具有化學(xué)預(yù)防特性。 天青蛋白和P28在小鼠乳腺器官培養(yǎng)中預(yù)防癌前腫瘤前病變的形成。在小鼠乳腺器官培養(yǎng)模型中，發(fā)現(xiàn)50μ g/ml的天青蛋白將腺泡病變的形成抑制了 67%。同樣地，發(fā)現(xiàn)25μ g/ml 的p28將腺泡病變抑制了 67%。參見實施例1。并且，發(fā)現(xiàn)50 μ g/ml的天青蛋白將導(dǎo)管病變的形成抑制了 79%，和25yg/ml的p28將導(dǎo)管病變的形成抑制了 71%。參見實施例1。 共聚焦顯微術(shù)和FAC顯示了天青蛋白和p28進(jìn)入正常小鼠乳腺上皮細(xì)胞(MM3MG)和乳房癌細(xì)胞(4T1)。p28還以溫度、時間和濃度依賴的方式進(jìn)入了人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC) 并以劑量依賴的方式抑制了培養(yǎng)在Matrigel .上的HUVEC的毛細(xì)管形成。銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物以及特別是天青蛋白和p28在預(yù)防癌前腫瘤前病變的形成中的效力的另外的證據(jù)存在于實施例2-4中。在MMOC中天青蛋白和p28 均抑制了乳腺泡病變的發(fā)展以及卵巢激素依賴的乳腺導(dǎo)管病變。P28以劑量依賴的方式抑制了 MAL和MDL的發(fā)展和多樣性。從這些腺體中降低的Ki67表達(dá)顯而易見，抑制是由抗增殖作用引起的。雌激素和孕酮處理的腺體表達(dá)ER和ra，然而當(dāng)用免疫組織化學(xué)分析時與醛固酮和氫化可的松孵育的腺體對類固醇受體不染色。因為P28和天青蛋白抑制非激素依賴的MAL和雌激素孕酮依賴的MDL的發(fā)展，可推斷天青蛋白和p28作用并不完全依賴雌激素受體和孕酮受體，并且可能對非激素依賴的病變和激素依賴的病變均為有效的。以下的實施例中公開了天青蛋白和p28抑制腫瘤前病變的最可能的機制。利用剛體蛋白質(zhì)分子對接禾口聚類分析(rigid-body protein docking andcluster analyses) 的計算機程序，已對P53和天青蛋白的結(jié)合進(jìn)行了廣泛研究并且利用計算機誘變方法驗證了結(jié)構(gòu)分析結(jié)果。參見 Apivo 等人，Biochem Biophys Res Commun. 332 :965_968 (2005)。 如本文所討論的，最近的報道有力地表明抑制腫瘤細(xì)胞生長中天青蛋白作用的機制是由與 P53的物理相互作用介導(dǎo)的。乳腺癌中p53表達(dá)的狀況表明近50-60%的乳腺癌含有野生型 p53。Junk 等人，Neoplasia. 10 :450_461 (2008) ；Gasco 等人，Breast Cancer Res. 4(2) 70-76(2002)。一些研究者還報道了 p53的失活是人類癌癥中的頻繁事件和重要事件之一。 Kastan, Cell. 128 :837_840 (2007)。在雌激素受體(ER)陽性的乳腺癌細(xì)胞中觀察到了 p53的失活或其作用的抑制。 在MCF 7細(xì)胞中，ERa與p53直接結(jié)合并使其功能失活。Sengupta等人，Ann N Y Acad Sci. 1024 54-71(2004) ；Konduri 等人，CancerRes. 2007 ；67 :7746_7755 (2007)。這些研究提出了 ERa介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和對p53介導(dǎo)的凋亡的抑制的機制的明顯的可能性。已通過ChIP分析證明了 ERa和p53的這種相互作用。已顯示在這些細(xì)胞中放射在重建穩(wěn)定的P53方面是有效的并且抑制了在這些細(xì)胞中的存活表達(dá)。放射介導(dǎo)其作用的機制尚不完全清楚，然而推測這可能是放射療法破壞ERa -p53結(jié)合的直接效果。Liu等人，J. Biol. Chem. 281 :9837_9340(2006)。現(xiàn)在已知p28在乳房細(xì)胞中不僅增加核p53的累積，并且誘導(dǎo)p53mRNA的表達(dá)。本文實施例2-4中公開的結(jié)果表明雌激素對p53的干擾可能導(dǎo)致乳房細(xì)胞中p53表達(dá)下降。 然而，在雌二醇存在時DMBA對導(dǎo)管病變的抑制和p28處理后p53的增高的核累積顯示p28 對P53的穩(wěn)定作用可能是抑制這些腺體中MDL形成的原因?，F(xiàn)在還已知p28增強了 p53的表達(dá)且因此對癌前腫瘤前病變具有抑制作用。參見，例如，實施例13-17。實施例4中討論的結(jié)果顯示了雌激素的存在干擾了 p28介導(dǎo)的對 p53mRNA的誘導(dǎo)，但p53/p28相互作用未受影響，這可能是由于p53蛋白上對于ER和p28的不同結(jié)合位點導(dǎo)致的。另一個有趣的觀察是天青蛋白和P28對p53mRNA表達(dá)的作用的差異。因此現(xiàn)在已知銅氧還蛋白和銅氧還蛋白的變體、衍生物、截短體和結(jié)構(gòu)等價物以及特別是天青蛋白和天青蛋白的變體、衍生物、截短體和結(jié)構(gòu)等價物，包括P28，可用于在哺乳動物患者中阻止、抑制、延遲、預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)癌前腫瘤前病變的形成，并因此抑制癌癥的形成，尤其是乳腺癌的形成。如實施例3和4所顯示的，p28或天青蛋白與他莫昔芬聯(lián)合對癌前腫瘤前病變的形成、并因此對癌癥的發(fā)展具有非預(yù)期的，提高的抑制作用。他莫昔芬已成功用于治療ER陽性的乳腺癌患者。其也已獲得批準(zhǔn)在乳腺癌預(yù)防試驗中使用。他莫昔芬抑制了乳房導(dǎo)管病變(MDL)的形成。已證明他莫昔芬的作用是通過雌激素受體通路來介導(dǎo)的。毋庸置疑，他莫昔芬與銅氧還蛋白和/或銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物諸如天青蛋白的聯(lián)合將對癌前腫瘤前病變的形成具有協(xié)同作用。ER-p53復(fù)合物阻止了 p53的表達(dá)。他莫昔芬處理阻止了 ER與p53的結(jié)合，因此在他莫昔芬存在時利用P28對腺體進(jìn)行孵育增強了或提高了這些腺體中p53的表達(dá)。如實施例4和圖7A中所示，利用他莫昔芬和p28孵育腺體導(dǎo)致了與單獨利用p28處理腺體相比 p53mRNA表達(dá)的非預(yù)期的120倍增加。由于銅氧還蛋白之間高度的結(jié)構(gòu)相似性，可能地是其它銅氧還蛋白和/或銅氧還蛋白的變體、衍生物、截短體或結(jié)構(gòu)等價物將在哺乳動物中抑制癌前病變的形成，以及天青蛋白和p28與他莫昔芬聯(lián)合將對癌前病變和癌癥的形成具有協(xié)同作用。這樣的銅氧還蛋白可發(fā)現(xiàn)于諸如細(xì)菌或植物中。已知一些銅氧還蛋白具有與來自銅綠假單胞菌的天青蛋白相似的藥物代謝動力學(xué)活性。例如，來自氧化亞鐵硫桿菌(Thiobacillus ferrooxidans)的鐵硫菌藍(lán)蛋白也可進(jìn)入巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)凋亡。Yamada等人，Cell Cycle3 :1182_1187 (2004)； Yamada 等人，Cell. Micro. 7 1418-1431 (2005)。來自層理席藻(Phormidium laminosum) 的質(zhì)體藍(lán)素和來自裂環(huán)無色桿菌(Achromobacter cycloclastes)的假天青蛋白也具有針對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性。美國專利公開第20060040269號，于2006年2月23日公布。因此認(rèn)為其它銅氧還蛋白也可用于本發(fā)明的組合物和方法中。并且，保留在哺乳動物中抑制癌癥的形成的能力的銅氧還蛋白的變體、衍生物、截短形式和結(jié)構(gòu)等價物也可用于本發(fā)明的組合物和方法中。這些變體和衍生物可包括，但不局限于，銅氧還蛋白的截短體、氨基酸的保守替代和蛋白質(zhì)修飾諸如聚乙二醇化以及α-螺旋的全烴化穩(wěn)定。通過ρ53對癌生長的抑制研究了天青蛋白的氨基酸50-77 (p28，SEQ ID NO 2)和ρ53的相互作用并在以下實施例13-17中進(jìn)行描述。如本文所公開的，ρ28滲透人乳腺癌細(xì)胞并由ρ53介導(dǎo)對人乳腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出抗增殖作用，Ρ53是腫瘤抑制子蛋白，其在應(yīng)激時具有功能活性并觸發(fā)細(xì)胞周期停止或細(xì)胞死亡。利用一系列的GST-pull down分析、甘油梯度離心、微量量熱法實驗、單分子力光譜分析和計算機建模進(jìn)行的實驗顯示，天青蛋白在P53的N末端或DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中結(jié)合并提高了其胞內(nèi)水平。本文實施例13-17中公開的結(jié)果將p28的結(jié)合位點限定到p53的N末端和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，氨基酸1-17、24-31、80-276或297-305中。天青蛋白對于p53的結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括由天青蛋白Met44和Met64所勾勒出的疏水面，這一推論受到該證據(jù)的支持被破壞的疏水面突變體(突變體天青蛋白M44KM64E)對人黑素瘤(Mel-2)細(xì)胞的毒性比野生型天青蛋白要小。這顯示了天青蛋白分子的p53結(jié)合結(jié)構(gòu)域包圍著疏水面。一項最近的分子對接模擬研究顯示了相對于野生型天青蛋白，突變體復(fù)合物的相互作用自由能的 75kJ/mol的顯著減少，再次表明天青蛋白的疏水面的包圍殘基Met44和Met64對與p53的相互作用是重要的。因為Met64殘基在p28的p53結(jié)合位點內(nèi)(P28的氨基酸15)，競爭分析、突變體研究和分子對接實驗明顯顯示了其為天青蛋白與P53結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。腫瘤抑制蛋白p53是重要的核蛋白，其為包括21kDa蛋白p21/Waf 1/Cipl的許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子和細(xì)胞周期進(jìn)程的抑制子。利用P28處理MCF-7細(xì)胞提高了 p53的水平，導(dǎo)致了 p21的較高的胞內(nèi)水平，p21是細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDK)活性(尤其是分別在&期和G2/M期調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程的cdc2和CDK2)的強抑制子。在通過G2/M期的進(jìn)程中，cdc2和CDK2激酶主要分別在與細(xì)胞周期蛋白B和細(xì)胞周期蛋白A的結(jié)合中被激活。在G2/M停滯的細(xì)胞中，CDK抑制子p21與細(xì)胞周期蛋白A有效結(jié)合，雖然在同樣條件下，細(xì)胞周期蛋白Bl不與p21結(jié)合，并且細(xì)胞周期蛋白Bl的水平繼續(xù)增高。這顯示了 p28 在MCF-7細(xì)胞中誘導(dǎo)的G2/M停滯與CDK2和細(xì)胞周期蛋白A的抑制相關(guān)(圖20A)。MCF-7細(xì)胞中p28誘導(dǎo)的p21的增高還伴隨著p27的時間依賴性增高，p27是Cip/ Kip⑶KI家族的另一成員。Hsu等人，2008最近證實根據(jù)由熒光素酶分析所測定的，對p53 的誘導(dǎo)提高了 p21 和 p27 啟動子活性。Cellularand Molecular Life Sciences (CMLS)， 2008。此外，p21啟動子和p27啟動子的p53DNA結(jié)合活性由p53誘導(dǎo)子，孕酮所激活，這意味著不僅P21受p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，p27也受到p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)控?？傊?，數(shù)據(jù)顯示了 p28使p53 水平的增高隨之上調(diào)了 P21和p27，在MCF-7細(xì)胞中誘導(dǎo)胞內(nèi)⑶K2水平和細(xì)胞周期蛋白A 水平的顯著降低和在G2/M細(xì)胞周期的抑制(圖20A)。已報道的細(xì)胞周期蛋白Bl和p21之間的較少結(jié)合或無效結(jié)合，表明暴露于P28后細(xì)胞周期蛋白B/cdc2活性的增高可能反映了 P28誘導(dǎo)的p21的增加所遵循的相似模式。暴露于p28后磷酸化的cdc2 (失活形式)的增加伴隨細(xì)胞周期蛋白Bl的增高的細(xì)胞水平，表明cdc2-細(xì)胞周期蛋白B復(fù)合物的增加通過 cdc2磷酸化的增高來體現(xiàn)。諾可唑在MCF-7和MDA-MB-468人乳腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)了相似的 G2停滯，伴隨高水平的胞質(zhì)細(xì)胞周期蛋白Bi，諾可唑是已知的微管破壞劑，和p21的轉(zhuǎn)錄和翻譯激活劑。分化劑諸如全反式視黃酸(ATRA)和丁酸鈉(SB)在口腔鱗狀癌細(xì)胞中產(chǎn)生了相似的生長抑制現(xiàn)象和G1停滯，其與G1期細(xì)胞周期調(diào)控蛋白⑶K6、p21和ρ27的誘導(dǎo)，和G2 期細(xì)胞周期調(diào)控蛋白⑶Κ2的抑制相關(guān)。由于ρ28在MDD2細(xì)胞中沒有使p21增高，且p27 在這些細(xì)胞中表現(xiàn)為不存在，⑶K2和細(xì)胞周期蛋白A的水平?jīng)]有顯著改變(圖20B)且沒有發(fā)生細(xì)胞周期抑制。關(guān)于P28誘導(dǎo)CDK2和細(xì)胞周期蛋白A復(fù)合物(人類細(xì)胞中cdc2活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物)降低而導(dǎo)致G1和G2/M停滯的其它證據(jù)發(fā)現(xiàn)于對HeLa細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期蛋白ARNAi誘導(dǎo)后的G2延遲中，該誘導(dǎo)使CDK2-細(xì)胞周期蛋白A復(fù)合物失活而導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G2/M。
雖然Cip/Kip家族蛋白諸如p21和p27是細(xì)胞周期蛋白A依賴的⑶K2的有效抑制物，但它們還可作為細(xì)胞周期蛋白D依賴性激酶的陽性調(diào)節(jié)物來行使作用。Cip/Kip家族蛋白能夠穩(wěn)定⑶K4和⑶K6。⑶K4在多種腫瘤中擴增和過表達(dá)，所述腫瘤包括乳腺癌、膠質(zhì)瘤、肉瘤和子宮頸癌，而⑶K6基因在某些類型的惡性腫瘤中擴增，包括鱗狀細(xì)胞癌、膠質(zhì)瘤和淋巴瘤。雖然CDK6的起始水平或?qū)φ账降陀贑DK4，但在暴露于p28的MCF-7細(xì)胞中⑶K6的水平是持續(xù)增高的，而⑶K4并非如此。而且，響應(yīng)于p28時，MDD2細(xì)胞中的⑶K4 和CDK6沒有改變，其中p53和p21沒有增高(圖20B)。Ink4組，CDKI的pl6Ink4a、pl5Ink4b、 PlS1nk4c和pl9Ink4d與在G1調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程的⑶K4和⑶K6特異性結(jié)合并將其抑制。因為 pl6Ink4a基因在MCF-7細(xì)胞中為純合缺失，Ink4⑶KI蛋白應(yīng)對⑶K6表現(xiàn)出與對⑶K4相比較小的抑制作用，這為CDK6中所觀察到的在CDK4水平基本上穩(wěn)定的情況下CDK6的增加提供了合理解釋?？傮w而言，這些結(jié)果表明了 p28結(jié)合p53，提高了 p53的水平，隨之通過p21和p27 失活CDK2-細(xì)胞周期蛋白A復(fù)合物增強了抗增殖活性，導(dǎo)致體外MCF-7乳腺癌細(xì)胞中的G2/ M細(xì)胞周期停滯，并在無胸腺小鼠中抑制了 MCF-7異種移植物的生長。本發(fā)明的組合物本發(fā)明提供了諸如銅氧還蛋白和/或銅氧還蛋白的變體、衍生物、截短體或結(jié)構(gòu)等價物的化學(xué)預(yù)防劑，所述化學(xué)預(yù)防劑單獨存在或與至少一種其它化學(xué)預(yù)防劑相聯(lián)合。在一些實施方案中，第一化學(xué)預(yù)防劑是銅氧還蛋白或其截短體。在一些上述實施方案中，第一化學(xué)預(yù)防劑是天青蛋白的截短體，其中所述截短體包含選自由SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :25組成的組的氨基酸序列中的一個或多個。所述至少一種其它化學(xué)預(yù)防劑可以是抗雌激素，包括阻遏雌激素或孕酮的活性的抗雌激素，比如他莫昔芬或芬維A胺，或阻止雌激素或孕酮產(chǎn)生的抗雌激素，比如芳香酶抑制劑如依西美坦(exemestane)、阿納托唑 (anastrozole)和來曲唑(Ietrozole)或其它具有相似特性的化合物。本發(fā)明還提供了為銅氧還蛋白的變體、衍生物、截短體或結(jié)構(gòu)等價物的化學(xué)預(yù)防劑。在一些實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑是分離的。在一些實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑是基本上純的或藥物級的。在另外的實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑在包含化學(xué)預(yù)防劑或基本上由化學(xué)預(yù)防劑組成的組合物中。在另外的實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑在包含化學(xué)預(yù)防劑和至少一種其它的化學(xué)預(yù)防劑二者的組合物中。在另一個具體的實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑是非抗原性的并且在哺乳動物中，且更具體地在人中，不引起免疫反應(yīng)。在一些實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑小于全長銅氧還蛋白，且保留了銅氧還蛋白的一些藥理學(xué)活性。具體地，在一些實施方案中， 化學(xué)預(yù)防劑可能保留了在小鼠乳腺器官培養(yǎng)中抑制癌前病變的發(fā)展的能力。本發(fā)明還提供了包含至少一種為銅氧還蛋白，或銅氧還蛋白的變體、衍生物、截短體或結(jié)構(gòu)等價物的化學(xué)預(yù)防劑的組合物，具體地在藥物組合物中，所述化學(xué)預(yù)防劑單獨存在或與至少一種其它化學(xué)預(yù)防劑相聯(lián)合。在具體的實施方案中，設(shè)計所述藥物組合物以用于特定的施用模式，例如但不局限于，口服施用、腹膜內(nèi)施用或靜脈施用。這樣的組合物可在水中水合，或可被干燥(例如通過凍干)以用于以后的水合。這樣的組合物可以在除水以外的溶劑中，例如但不局限于，乙醇。由于銅氧還蛋白之間的高度結(jié)構(gòu)同源性，認(rèn)為銅氧還蛋白具有和天青蛋白與p28 相同的化學(xué)預(yù)防性質(zhì)。在一些實施方案中，銅氧還蛋白為，但不局限于，天青蛋白、假天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、鐵硫菌藍(lán)蛋白、橙綠屈撓素、漆樹藍(lán)蛋白、黃瓜堿性蛋白或Laz。在特別具體的實施方案中，天青蛋白來源于銅綠假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、木糖氧化無色桿菌反硝化亞種 I(Achromobacter xylosoxidans ssp. denitrificans I)、支氣管炎博德特菌、甲基單胞菌、 腦膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、熒光假單胞菌、綠針假單胞菌、苛養(yǎng)木桿菌、百日咳石莼菌 (Ulva pertussis)和副溶血性弧菌。在一個具體的實施方案中，天青蛋白來自銅綠假單胞菌。在另外的具體的實施方案中，銅氧還蛋白包含SEQ ID NO: 1-19和25的氨基酸序列。本發(fā)明提供了為銅氧還蛋白的氨基酸序列變體的化學(xué)預(yù)防劑，其與野生型銅氧還蛋白相比具有氨基酸替代、缺失或插入。本發(fā)明的變體可以是野生型銅氧還蛋白的截短體。 在一些實施方案中，本發(fā)明的化學(xué)預(yù)防劑包含小于全長野生型多肽的銅氧還蛋白的區(qū)域。 在一些實施方案中，本發(fā)明的化學(xué)預(yù)防劑包含截短的銅氧還蛋白的約10個以上的殘基、約 15個以上的殘基或約20個以上的殘基。在一些實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑包含截短的銅氧還蛋白的不超過約100個殘基、不超過約50個殘基、不超過約40個殘基、不超過約30個殘基或不超過約20個殘基。在一些實施方案中，銅氧還蛋白與化學(xué)預(yù)防劑，且更具體地為 SEQ ID NO 1-19和25與本發(fā)明的化學(xué)預(yù)防劑具有至少約70%的氨基酸序列同一性、至少約80%的氨基酸序列同一性、至少約90%的氨基酸序列同一性、至少約95%的氨基酸序列同一性或至少約99%的氨基酸序列同一性。在具體的實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑包含銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-77 (p28， SEQ ID NO :2)、天青蛋白殘基50-67 (pl8，SEQ ID NO 25)、天青蛋白殘基50-68 (ρ 19，SEQ ID NO :26)、天青蛋白殘基 50-69 (p20，SEQ ID NO :27)、天青蛋白殘基 50-70 (p21，SEQ ID NO: 28)、天青蛋白殘基 50-71 (p22，SEQ ID NO :29)、天青蛋白殘基 50-72 (p23，SEQ ID NO :30)、 天青蛋白殘基 50-73 (p24，SEQ ID NO :31)、天青蛋白殘基 50-74 (p25，SEQ ID NO 32)、天青蛋白殘基 50-75 (p26，SEQ ID NO :33)、天青蛋白殘基 50-76 (p27，SEQ ID NO 34)或天青蛋白殘基36-88(SEQ ID NO :35)。在另外的實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑由以下所組成銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-77 (SEQ ID NO :2)、天青蛋白殘基50-67 (SEQ ID N0:25)、天青蛋白殘基 50-68 (SEQ ID NO :26)、天青蛋白殘基 50-69 (SEQ ID NO :27)、天青蛋白殘基 50-70 (SEQ ID NO :28)、天青蛋白殘基 50-71 (SEQ ID NO :29)、天青蛋白殘基 50-72 (SEQ ID NO :30)、 天青蛋白殘基50-73 (SEQ IDNO :31)、天青蛋白殘基50-74 (SEQ ID NO :32)、天青蛋白殘基
50-75(SEQID NO :33)、天青蛋白殘基 50-76 (SEQ ID NO 34)或天青蛋白殘基 36-88 (SEQ ID N0:35)。在另外的具體的實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑由天青蛋白以外的銅氧還蛋白的等價殘基組成。還考慮了可設(shè)計其它銅氧還蛋白變體，其具有與天青蛋白殘基50-77 (SEQ ID NO 2)或天青蛋白殘基36-88 (SEQ ID NO 35)相似的藥理學(xué)活性。為實現(xiàn)此目的，利用BLAST、 BLAST2、ALIGN2或Megalign (DNASTAR)將目標(biāo)銅氧還蛋白氨基酸序列與銅綠假單胞菌天青蛋白序列進(jìn)行比對，相關(guān)殘基位于銅綠假單胞菌天青蛋白氨基酸序列上，在目標(biāo)銅氧還蛋白序列上尋找等價殘基，從而設(shè)計等價肽。在本發(fā)明的一個實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑包含橙色綠屈撓菌(Chloroflexus aurantiacus)的橙綠屈撓素的至少第57-89位氨基酸(SEQ IDNO 20)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑包含丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)天青蛋白的至少第
51-77位氨基酸(SEQID NO :21)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑包含腦膜炎奈瑟球菌天青蛋白的至少第89-115位氨基酸(SEQ ID NO :22)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑包含副溶血性弧菌天青蛋白的至少第52-78位氨基酸(SEQ ID NO :23)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，化學(xué)預(yù)防劑包含支氣管炎博德特菌天青蛋白的至少第51-77 位氨基酸(SEQ ID NO 24)?；瘜W(xué)預(yù)防劑還可包括由合成的而非天然存在的氨基酸形成的肽。例如，可將非天然存在的氨基酸整合到所述化學(xué)預(yù)防劑中以延長或優(yōu)化組合物在血流中的半衰期。這樣的化學(xué)預(yù)防劑包括，但不局限于D、L-肽類(非對映異構(gòu)體)Hf^BFutaki等人，J.Biol. Chem. 276 (8) :5836_40 (2001) ；Papo 等人，Cancer Res. 64(16) :5779_86 (2004) ；Miller 等人，Biochem. Pharmacol. 36(1) =169-76, (1987).；含有獨特氨基酸的肽類(例如 Lee 等人，J. Pept. Res. 63 (2) :69_84 (2004))，接有烴類環(huán)鉤的含烯烴的非天然氨基酸(例如 Schafmeister 等人，J.Am· Chem. Soc. 122 :5891_5892 (2000) ；Walenski 等人，Science 305 1466-1470 (2004))，以及包含ε -(3,5- 二硝基苯甲酰基)-Lys殘基的肽。在另外的實施方案中，本發(fā)明的化學(xué)預(yù)防劑是銅氧還蛋白的衍生物。銅氧還蛋白的衍生物是化學(xué)修飾的肽，從而肽仍保留其某些基本活性。例如，天青蛋白的“衍生物”可以是化學(xué)修飾的天青蛋白，其保留了在哺乳動物細(xì)胞、組織或動物中抑制癌前病變發(fā)展的能力。感興趣的化學(xué)修飾包括但不局限于，肽的烴穩(wěn)定、酰胺化、乙?；?、硫酸化、聚乙二醇(PEG)修飾、磷酸化和糖基化，以及本文所公開的方法和技術(shù)。此外，衍生的肽可以是銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物與化學(xué)化合物的融合物，所述化合物例如但不局限于，另一肽、藥物分子或其它治療劑或藥劑或可檢測的探針。感興趣的衍生物包括例如通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的幾種方法進(jìn)行化學(xué)修飾，通過實施修飾本發(fā)明的肽和組合物在血流中的半衰期可以被延長或優(yōu)化，所述方法包括但不局限于環(huán)化肽(例如Monk等人， BioDrugs 19(4) :261_78，(2005) ；DeFreest 等人，J. Pept. Res. 63(5) 409-19 (2004)), N-末端和 C-末端修飾(例如 Labrie 等人，Clin. Invest. Med. 13(5) :275_8，(1990))、和接有烴類環(huán)鉤的含烯烴的非天然氨基酸(例如Schafmeister等人，J. Am. Chem. Soc. 122 5891-5892(2000) ；Walenski 等人，Science 305 1466-1470 (2004))。在一些實施方案中，可利用方法對銅氧還蛋白進(jìn)行改變，所述方法包括但不局限于，降低肽的水解的方法、降低肽的脫酰胺作用的方法、降低氧化的方法、降低肽的免疫原性和/或提高肽的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的方法。認(rèn)為本文所描述的兩種或多種修飾可在一種被修飾的銅氧還蛋白來源的肽中進(jìn)行組合，以及為提高藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)而將本文所描述的一種或多種修飾與其它修飾進(jìn)行組合是本領(lǐng)域中的技術(shù)人員所熟知的。設(shè)計這樣的變體和衍生物的許多方法是本領(lǐng)域中所熟知的。生物轉(zhuǎn)化提高化學(xué)預(yù)防劑，特別是銅氧還蛋白來源的肽諸如天青蛋白的截短體的藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)的一種方法是構(gòu)建對生物轉(zhuǎn)化較不敏感的銅氧還蛋白來源的肽的變體和衍生物。生物轉(zhuǎn)化可能降低肽的藥理活性并提高其從患者體內(nèi)消除的速率。實現(xiàn)該目的的一個途徑是測定最可能被生物轉(zhuǎn)化的氨基酸和/或氨基酸序列，并將這些氨基酸用對該特定轉(zhuǎn)化過程不敏感的氨基酸來替代。在一些實施方案中，銅氧還蛋白來源的肽可包括非天然氨基酸或修飾的氨基酸。 在一些實施方案中，某些非天然氨基酸的導(dǎo)入增強了銅氧還蛋白來源的肽的藥物代謝動力學(xué)活性。這樣的導(dǎo)入可以是位點特異性的并且進(jìn)行這樣的導(dǎo)入以避免體內(nèi)的生物化學(xué)修飾。示例性的非天然氨基酸包括b_氨基酸(例如，b3和b2)、同源氨基酸、環(huán)狀氨基酸、芳香族氨基酸、脯氨酸和焦谷氨酸衍生物、3_取代的丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、環(huán)取代的苯丙氨酸和酪氨酸衍生物、線性核心氨基酸和二氨基酸?？赏ㄟ^定點修飾、核糖體翻譯、或通過肽的化學(xué)合成將這樣的非天然氨基酸整合到肽中。這些方法中的每一種均可用于合成銅氧還蛋白來源的肽。例如，修飾的來源于銅氧還蛋白的肽可通過使用具有非天然氨基酸結(jié)構(gòu)的野生型氨?；鵷RNA合成酶(AARS)來合成以用于產(chǎn)生非天然銅氧還蛋白變體。參見， Hartman,等人，PLoS One, 2 (10) :e972(2007) ；Miranda,等 A, J. Am. Chem. Soc. 129 13153-13159(2007)。核糖體翻譯機器的特異性限制了利用核糖體翻譯可整合到肽中的非天然氨基酸的多樣性。已報道作為AARS底物的90種以上的非天然結(jié)構(gòu)單元包括側(cè)鏈和骨架類似物。Hartman，等人，PLoS One, 2 (10) :e972 (2007)。可利用全酶翻譯系統(tǒng)高效地將 50種以上的非天然氨基酸整合到肽中，所述肽含有達(dá)13種不同的非天然氨基酸。Hartman， 等人，PLoS One, 2 (10) :e972(2007)。在一些實施方案中，可將這樣的氨基酸整合到銅氧還蛋白來源的肽中。其它修飾可包括利用旋光性的α -氨基酸。旋光性的α _氨基酸及其衍生物在藥物、農(nóng)業(yè)化學(xué)品和作為手性配體中的用途正在擴展。尤其是，手性甘氨酸和丙氨酸等價物具有重要作用。已提出了用于構(gòu)建α-氨基酸的至少一種立體選擇性策略，在預(yù)定的立體 it^^r^-M^Mt α_Μ @!。 Lu，·入“Asymmetric Synthesis of α -amino acids Preparation and alkylation ofmonocyclic iminolactones derived from α-Methyl trans-cirmamaldehydda -氨基酸的不對稱合成來源于a -甲基反式肉桂醛的單環(huán)亞胺內(nèi)酯的制備和烷基化)”于2008年9月11日在網(wǎng)上出版(在J. Org. Chem.中待出版)，其公開內(nèi)容在此通過引用并入。修飾的銅氧還蛋白來源的肽可利用旋光性的α-氨基酸來合成以產(chǎn)生富含對映體的重復(fù)。在含天冬氨酸的肽中水解常為一個問題。天冬氨酸易于脫水而形成環(huán)狀亞胺中間物，導(dǎo)致天冬氨酸轉(zhuǎn)化成可能失活的異天冬氨酸類似物，并最終裂解肽鏈。例如，在肽序列中存在天冬氨酸-脯氨酸的情況下，酸催化的環(huán)狀亞胺中間物的形成能導(dǎo)致肽鏈裂解。類似地，在肽序列中存在天冬氨酸-甘氨酸的情況下，環(huán)狀中間物可被水解為原始天冬氨酸形式(無害的)或異天冬氨酸類似物。最終，所有的天冬氨酸形式可完全轉(zhuǎn)化為異天冬氨酸類似物。具有絲氨酸的相似的序列也可脫水以形成能夠裂解肽鏈的環(huán)狀亞胺。肽的裂解可導(dǎo)致降低的血漿半衰期以及降低的肽的特定藥理活性?？紤]到在銅氧還蛋白來源的肽中用其它氨基酸取代天冬酰胺和/或絲氨酸可能導(dǎo)致具有改善的藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)(比如肽的較長的血漿半衰期和提高的藥理活性的特異活性)的肽。在一個所考慮的變體中，銅氧還蛋白來源的肽的一個或多個天冬酰胺殘基可被另一氨基酸殘基所替代，且具體地為被谷氨酸殘基所替代。在另一個所考慮的變體中，銅氧還蛋白來源的肽的一個或多個絲氨酸殘基可被另一氨基酸殘基所替代，且具體地為被蘇氨酸殘基所替代。在銅氧還蛋白來源的肽的一些變體中，一個或多個天冬酰胺殘基和一個或多個絲氨酸殘基是取代的。在一些實施方案中，進(jìn)行了保守性替代。在另外的實施方案中，進(jìn)行了非保守性替代。生物轉(zhuǎn)化中的氨基酸殘基的脫酰胺作用是一個特殊問題。這種堿催化的反應(yīng)通常發(fā)生在含天冬酰胺_甘氨酸或谷氨酰胺_甘氨酸的序列中，并遵循與以上的天冬氨酸_甘氨酸序列類似的機制。天冬酰胺_甘氨酸序列的脫酰胺作用形成了環(huán)狀亞胺中間物，所述環(huán)狀亞胺中間物隨后水解形成天冬氨酸或天冬酰胺的異天冬氨酸類似物。此外，環(huán)狀亞胺中間物可導(dǎo)致D-天冬氨酸或天冬酰胺的D-異天冬氨酸類似物的外消旋作用，所有這些均可能導(dǎo)致肽的失活形式?？紤]了銅氧還蛋白肽中的脫酰胺作用可通過利用另一種氨基酸來替代銅氧還蛋白的天冬酰胺_甘氨酸或谷氨酰胺_甘氨酸序列的甘氨酸、天冬酰胺和/或谷氨酰胺來阻止，并可能導(dǎo)致具有改良的藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)(比如肽的較長的血漿半衰期和提高的藥理活性的特異活性)的肽。在一些實施方案中，銅氧還蛋白來源的肽的一個或多個甘氨酸殘基被另一氨基酸殘基所替代。在具體的實施方案中，銅氧還蛋白來源的肽的一個或多個甘氨酸殘基被蘇氨酸或丙氨酸殘基所替代。在一些實施方案中，銅氧還蛋白來源的肽的一個或多個天冬酰胺或谷氨酰胺殘基被另一氨基酸殘基所替代。在特異的實施方案中，銅氧還蛋白來源的肽的一個或多個天冬酰胺或谷氨酰胺殘基被丙氨酸殘基所替代。在另外的具體的實施方案中，銅綠假單胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的殘基58和/或63處的甘氨酸， 或其它銅氧還蛋白的等價甘氨酸，被丙氨酸或蘇氨酸所替代。在另外的具體的實施方案中， 銅綠假單胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的殘基59處的甲硫氨酸，或另一個銅氧還蛋白來源的肽的等價的甲硫氨酸殘基，被丙氨酸殘基所替代。在其它的具體的實施方案中，銅綠假單胞菌天青蛋白(SEQ IDNO=I)殘基63處的甘氨酸，或另一個銅氧還蛋白來源的肽的等價甘氨酸殘基，被蘇氨酸殘基所替代。在一些實施方案中，進(jìn)行了保守性替代。在另外的實施方案中，進(jìn)行了非保守性替代。在具體的實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽包含以下序列，其中下劃線的氨基酸被置換到野生型銅綠假單胞菌P28序列中LSTAADMQAVVTDTMASGLDKDYLKPDD(SEQ ID NO :42)。氨基酸的可逆氧化和不可逆氧化是另外的生物轉(zhuǎn)化過程，其也可產(chǎn)生可能降低藥理活性、和/或銅氧還蛋白來源的肽的血漿半衰期的問題。半胱氨酸和甲硫氨酸殘基是經(jīng)歷可逆氧化的主要殘基。在較高PH下加速了半胱氨酸的氧化，其中的硫醇更易于去質(zhì)子化并易于形成鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵。這些二硫鍵通過利用二硫蘇糖醇(DTT)或三(2-羧乙基膦)鹽酸鹽(TCEP)來處理可易于在體外逆轉(zhuǎn)。甲硫氨酸通過化學(xué)途徑或光化學(xué)途徑氧化而形成甲硫氨酸亞砜并進(jìn)而形成甲硫氨酸砜，二者均幾乎不可能逆轉(zhuǎn)?？紤]了銅氧還蛋白來源的肽中的氧化可通過用其它殘基替代甲硫氨酸和/或半胱氨酸殘基來防止。在一些實施方案中，銅氧還蛋白來源的肽中的一個或多個甲硫氨酸和/ 或半胱氨酸殘基被另一氨基酸殘基所替代。在具體的實施方案中，甲硫氨酸殘基被亮氨酸或纈氨酸殘基所替代。在其它的具體的實施方案中，銅綠假單胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的殘基56和64處的一個或多個甲硫氨酸，或其它的銅氧還蛋白來源的肽中的等價的甲硫氨酸殘基，被亮氨酸或纈氨酸所替代。在一些實施方案中，進(jìn)行了保守性替代。在另外的實施方案中，進(jìn)行了非保守性替代。在具體的實施方案中，本發(fā)明的銅氧還蛋白肽包含以下序列其中之一，其中下劃線的氨基酸被置換到野生型銅綠假單胞菌P28序列中LSTAADLQGVVTDGLASGLDKDYLKPDD(SEQ ID NO 43)或LSTAADVQGVVTDGVASGLDKDYLKPDD(SEQ ID NO :44)?？赡苡绊戙~氧還蛋白來源的肽的藥理活性、血漿半衰期和/或免疫原性的另一生物轉(zhuǎn)化過程是二酮哌嗪和焦谷氨酸形成。當(dāng)甘氨酸在自N-末端的第三位時，且更特別地當(dāng)脯氨酸或甘氨酸在第1位或第2位時，通常發(fā)生二酮哌嗪形成。該反應(yīng)涉及第二和第三氨基酸之間的酰胺羰基上的N-末端氮的親核攻擊，其導(dǎo)致前兩個氨基酸裂解形成二酮哌嗪。 另一方面，如果谷氨酰胺在N-末端時，焦谷氨酸形成可能是幾乎不可避免的。這是類似的反應(yīng)，其中N末端氮攻擊谷氨酰胺的側(cè)鏈羰基碳而形成脫酰胺的焦谷氨酰肽類似物。該轉(zhuǎn)化還發(fā)生于N-末端含天冬酰胺的肽中，但程度小得多。考慮了通過利用另一氨基酸殘基來替代銅氧還蛋白來源的肽中的來自N-末端的第1位、第2位或第3位中的甘氨酸、來自N-末端的第3位中的脯氨酸或肽的N-末端的天冬酰胺而減少二酮哌嗪和焦谷氨酸形成。在一些實施方案中，來自銅氧還蛋白來源的肽的 N-末端的第1位、第2位或第3位中的甘氨酸被另一氨基酸殘基所替代。在具體的實施方案中，甘氨酸殘基被蘇氨酸或丙氨酸殘基所替代。在另一個實施方案中，來自銅氧還蛋白來源的肽的N-末端的第3位上的脯氨酸被另一氨基酸殘基所替代。在具體的實施方案中，脯氨酸被丙氨酸殘基所替代。在另一實施方案中，N末端的的天冬酰胺被另一氨基酸殘基所替代。在具體實施方案中，天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基所替代。在一些實施方案中，進(jìn)行了保守性替代。在另外的實施方案中，進(jìn)行了非保守性替代?？赡苡绊戙~氧還蛋白來源的肽的藥理活性、血漿半衰期和/或免疫原性的另一生物轉(zhuǎn)化過程是外消旋作用。該術(shù)語寬泛用于指氨基酸或肽的手性完整性的整體丟失。外消旋作用涉及氨基酸的一個對映體(通常是L-形式)堿催化轉(zhuǎn)化為L-對映體和D-對映體的1 1混合物。 通常一個提高肽的穩(wěn)定性的途徑是通過生成逆反(D-異構(gòu)體)肽。肽結(jié)構(gòu)的雙翻轉(zhuǎn)通常使側(cè)鏈的表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)保持完整并被廣泛用于穩(wěn)定生物活性肽。Snyder等人，PLoS Biol. 2 0186-0193(2004)。D-氨基酸取代的Tat如同L-氨基酸一樣被內(nèi)化到細(xì)胞中。Futaki等人， J. Biol. Chem. 276 :5836_5840 (2001) ；Huq 等人，Biochemistry 38 :5172_5177 (1999)。在一些實施方案中，銅氧還蛋白來源的肽的一個或多個氨基酸殘基被該氨基酸殘基的D-異構(gòu)體所替代。在另外的實施方案中，銅氧還蛋白來源的肽的所有氨基酸殘基均被這些殘基的 D-異構(gòu)體所替代。在一個實施方案中，經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽是銅氧還蛋白來源的肽的逆反(D-異構(gòu)體)形式。在一個具體的實施方案中，經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽是DDPKLYDKDLGSAMGDTWGQMDAATSL (SEQ ID NO :45)。保護(hù)銅氧還蛋白來源的肽不受生物轉(zhuǎn)化降解的其它方法為N-乙?；虲-酰胺化。這些衍生物可保護(hù)肽不被降解并可使銅氧還蛋白來源的肽更精確地模仿天然蛋白中的 α氨基和羧基的荷電狀態(tài)。具有N-乙?；?或C-酰胺化的肽可通過商業(yè)供應(yīng)商來提供。在本發(fā)明的一個實施方案中，銅氧還蛋白來源的肽的N-末端可以被乙?；?。在本發(fā)明的另一個實施方案中，銅氧還蛋白來源的肽的C-末端可以被酰胺化。在一個具體的實施方案中，經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來源的肽是乙?；?LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD-酰胺化(SEQ IDNO 46)。環(huán)化是生物轉(zhuǎn)化的另一方式，其對包括本文所描述的銅氧還蛋白的治療性肽可能是有益的。環(huán)化可穩(wěn)定治療性肽，使其貯存更長時間，以更低劑量來施用和較小頻率來施用。已證明環(huán)化保護(hù)肽不受肽酶和蛋白酶降解。可用化學(xué)方法或酶促方法來進(jìn)行環(huán)化。一般酶促環(huán)化比化學(xué)環(huán)化問題較少，因為化學(xué)環(huán)化可能缺少區(qū)域和立體專一性，可能導(dǎo)致多聚化而非環(huán)化，并可能需要復(fù)雜的多步驟過程。事實上，已顯示對于蛋白水解酶硫醚環(huán)化比二硫鍵更具保護(hù)性且更穩(wěn)定。在含羊毛硫抗生素_(甲基)羊毛硫氨酸的細(xì)菌肽中已展示了酶促環(huán)化。E.g.， R. Rink,等人，"Lantibiotic Structures as Guidelines for the Design ofPeptides That Can Be Modified by Lantibioitic Enzymes (羊毛硫抗生素結(jié)構(gòu)作為設(shè)計可被羊毛硫抗生素酶修飾的肽的指南)”44 Biochem.，8873-82 (2005) ；R. Rink，等人，“Production of Dehydroamino Acid-Containing Peptidesby Lactococcus Iactis(通過乳酸乳球菌產(chǎn)生含脫氫氨基酸的肽)”73 :6Applied and Environmental Microbiology, 1792-96 (2007)； R. Rink,等人,“NisC, the Cylcase of the Lantibiotic Nisin, Can Catalyze Cyclization ofDesigned Nonlantibiotic P印tides (羊毛硫抗生素乳鏈菌肽的環(huán)化酶，NisC，可催化所設(shè)計的非羊毛硫抗生素肽的環(huán)化)” 46 Biochem. ,13179-89(2007)(其每一項均在此通過引用并入)。羊毛硫抗生素由革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)生并抑制革蘭氏陽性細(xì)菌的生長。在羊毛硫抗生素中，通過酶介導(dǎo)的絲氨酸和蘇氨酸殘基的脫水作用而產(chǎn)生了脫氫丙氨酸和脫氫酪氨酸。且然后通過酶促方法將半胱氨酸偶聯(lián)到脫水的絲氨酸和蘇氨酸殘基上而形成硫醚環(huán)化。天然存在的羊毛硫抗生素顯示了殘基間通過硫醚鍵的這種偶聯(lián)，所述殘基的間距達(dá)19 個殘基。硫醚環(huán)形成取決于前導(dǎo)肽。環(huán)化的位置取決于環(huán)化酶介導(dǎo)的區(qū)域和立體專一性閉環(huán)作用和可脫水的絲氨酸殘基和蘇氨酸殘基的位置。最為詳細(xì)描述的羊毛硫抗生素是乳鏈菌肽——一種由乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)產(chǎn)生的五環(huán)肽抗生素。乳鏈菌肽由4個甲基羊毛硫氨酸、1個羊毛硫氨酸、2個脫氫丙氨酸、1個脫氫酪氨酸和26個未修飾的氨基酸組成。乳鏈菌肽的5個硫醚交聯(lián)是通過將半胱氨酸殘基添加到源于絲氨酸和蘇氨酸的脫氫丙氨酸和脫氫酪氨酸上而形成。乳鏈菌肽含有通過膜相關(guān)酶復(fù)合物翻譯后引入的含硫醚的氨基酸。該酶復(fù)合物包括運載體MsT、 絲氨酸和蘇氨酸脫氫酶NisB和環(huán)化酶NisC。NisB使絲氨酸殘基和蘇氨酸殘基脫水，使其分別轉(zhuǎn)化為脫氫丙氨酸和脫氫酪氨酸。然后MsC催化半胱氨酸的對映體選擇性與所形成的脫氫殘基偶聯(lián)。NisT協(xié)助經(jīng)修飾的前乳鏈菌肽(prenisin)的轉(zhuǎn)運。另一種酶NisP從前乳鏈菌肽裂解乳鏈菌肽前導(dǎo)肽。環(huán)化酶NisC 已被詳細(xì)描述。Li 等人，“Structure and Mechanism of theLantibiotic Cylclase Involved in Nisin Biosynthesis (乳鏈菌月太生物合成中的羊毛硫抗生素的結(jié)構(gòu)和機制)”311Science，1464-67 (2006)(其全部內(nèi)容在此通過引用并入)。羊毛硫抗生素中環(huán)化的分析已引導(dǎo)對肽中易于環(huán)化的氨基酸序列和特性的鑒定。 已顯示NisB酶更經(jīng)常使位于絲氨酸殘基和蘇氨酸殘基側(cè)面的某些氨基酸脫水。已顯示環(huán)化更經(jīng)常發(fā)生于其中疏水殘基、非芳香性殘基鄰近絲氨酸殘基和蘇氨酸殘基的羊毛硫抗生素前肽中。經(jīng)修飾的半胱氨酸的側(cè)面殘基通常比經(jīng)修飾的蘇氨酸和絲氨酸的側(cè)面殘基具有更少疏水性。已發(fā)現(xiàn)的例外包括六肽VSPPAR(SEQ ID NO 47)、YTPPAL(SEQ IDNO 48)和 FSFFAF (SEQ ID NO :49)。六肽表明在第3位或第4位存在脯氨酸或在兩側(cè)具有苯丙氨酸可防止脫水。通常通過將脫水殘基與位于C-末端的半胱氨酸相偶聯(lián)而形成環(huán)。然而，可通過將脫水殘基與位于N末端的半胱氨酸偶聯(lián)來形成環(huán)。還已顯示乳鏈菌肽脫水和轉(zhuǎn)運酶并不是對乳鏈菌肽特異的，而事實上可用來修飾非乳鏈菌肽的肽(和非羊毛硫抗生素肽)。已顯示當(dāng)諸如人類肽激素的肽的N末端與羊毛硫抗生素前導(dǎo)肽融合時，NisB使所述肽中的絲氨酸殘基和蘇氨酸殘基脫水。在非羊毛硫抗生素肽上，應(yīng)用了相似的環(huán)形成特性；即，脫水的程度可通過可脫水的絲氨酸殘基和蘇氨酸殘基的側(cè)翼區(qū)域的氨基酸組成來控制。絲氨酸和蘇氨酸周圍疏水側(cè)翼殘基(例如，丙氨酸和纈氨酸)的存在使得完全脫水并因此增強了硫醚環(huán)形成。N-末端天冬氨酸和C末端側(cè)翼的精氨酸的存在阻止了脫水。還顯示，脯氨酸殘基和苯丙氨酸殘基的存在不利于脫水。通常，親水側(cè)翼殘基的存在阻止了絲氨酸殘基和蘇氨酸殘基的脫水。疏水側(cè)翼利于脫水；親水側(cè)翼不利于脫水。研究已顯示在脫水發(fā)生處，絲氨酸和蘇氨酸的側(cè)翼殘基的平均疏水性為正一N末端側(cè)鏈上為0. 40且C-末端側(cè)鏈上為0. 13。而且，未經(jīng)脫水的絲氨酸和蘇氨酸側(cè)翼殘基的平均疏水性為負(fù)一N末端側(cè)鏈上為-0. 36且C-末端側(cè)鏈上為-1. 03。脫水不受一系列側(cè)翼的蘇氨酸殘基的存在所限制并且不受乳鏈菌肽前導(dǎo)肽和待脫水的殘基之間的距離所限制。已顯示NisC在與天然存在的羊毛硫抗生素?zé)o關(guān)的肽中催化區(qū)域?qū)Ｒ恍缘牧蛎循h(huán)的形成。通常，必須將這樣的肽與乳鏈菌肽前導(dǎo)肽融合。在一些實例中，硫醚環(huán)可自發(fā)形成， 例如其中脫氫丙氨酸由兩個來自半胱氨酸的氨基酸所間隔。與自發(fā)環(huán)化所不同的是，NisC 催化的環(huán)化對脫水的前乳鏈菌肽具有立體專一性。因此，乳鏈菌肽中的甲基羊毛硫氨酸和羊毛硫氨酸為DL構(gòu)型。據(jù)認(rèn)為非羊毛硫抗生素肽中的環(huán)化也將是立體專一性的。可將這些原理應(yīng)用于本文所描述的化合物中，包括銅氧還蛋白及其變體和截短體。硫醚橋事實上，存在橋下具有達(dá)19個氨基酸的羊毛硫抗生素酶誘導(dǎo)的硫醚橋。橋下具有 2-4個氨基酸的硫醚橋是高豐度的。在一些實施方案中，本發(fā)明的化學(xué)預(yù)防劑，具體為銅氧還蛋白和銅氧還蛋白的衍生物、變體、截短體或結(jié)構(gòu)等價物，比如截短的天青蛋白，可通過將硫醚鍵引入結(jié)構(gòu)中來進(jìn)行修飾。例如，天青蛋白截短體p28(SEQ IDNO :2)可利用這種方法來修飾。利用軟件包 GROMACS(www. gromacs.org)進(jìn)行的延伸的分子動力學(xué)模擬(70ns)表明，在37°C下，來自第6位至第16位的ρ28α螺旋的區(qū)域是不穩(wěn)定的，且肽易于采用β折疊構(gòu)象。這連同事實一所推測的負(fù)責(zé)與Ρ53相互作用的分子的部分保持溶劑接觸，表明ρ28肽的該區(qū)域中引入硫醚橋可能不影響其功能性。
結(jié)構(gòu)1 具有α螺旋結(jié)構(gòu)的天青蛋白截短體結(jié)構(gòu)2 :70ns模擬的結(jié)果p28的氨基酸序列是SEQ ID NO 2(LSTAADMQGWIDGMASGLDKDYLKPDD)。已知作為 pl8 的氨基酸序列為 SEQ ID NO: 25 (LSTAADMQGVVTDGMASG)。序列 SGLDKD (SEQ ID NO. 85)可與 p53 相互作用。硫醚橋可在 N-側(cè)的絲氨酸/蘇氨酸和C側(cè)的半胱氨酸之間形成。絲氨酸/蘇氨酸被脫水且隨后與半胱氨酸偶聯(lián)。蘇氨酸是優(yōu)選的，因為其比絲氨酸更易于脫水。通常，蘇氨酸的疏水側(cè)翼殘基 (至少一個)是優(yōu)選的，因為它們提高了脫水的程度。作為側(cè)翼殘基的帶負(fù)電荷的氨基酸， 谷氨酸和天冬氨酸對脫水具有強烈的負(fù)電效應(yīng)。通常，親水側(cè)翼殘基，尤其是甘氨酸，不利于脫水。在半胱氨酸之前，對帶電荷的親水殘基具有輕微偏好性，尤其是谷氨酸/天冬氨酸。參與成環(huán)的氨基酸的數(shù)量取決于硫醚環(huán)的大小。 在一個實施方案中，截短體天青蛋白序列為LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLTPGC (SEQ ID N0:50)。硫醚橋在p28的第25位和第28位之間形成，且將對羧肽酶進(jìn)行完全防御。第 2位、第3位和第25位將被脫水，但導(dǎo)入序列和認(rèn)為與同p53相互作用相關(guān)的序列均未受硫醚環(huán)導(dǎo)入的影響。同樣地，肽活性不應(yīng)改變。蘇氨酸位于兩個疏水氨基酸之間且因此預(yù)期完全被脫水酶NisB所脫水，根據(jù)特定指導(dǎo)。參見Rink等人，Biochemistry 2005。同樣的指導(dǎo)還預(yù)測了通過環(huán)化酶NisC進(jìn)行的涉及第25位和第28位的環(huán)化，尤其由于天冬氨酸位于半胱氨酸之前。在另一個實施方案中，截短的天青蛋白序列為LSTAADCQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD (S EQ ID NO :51)且硫醚橋在第3位和第7位之間形成。第3位和第7位之間的環(huán)與乳鏈菌肽的環(huán)A相像，并利用了第2位上存在的蘇氨酸。第6位上的天冬氨酸將利于環(huán)化。在另一個實施方案中，截短的天青蛋白序列為LSTAACMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD (S EQ ID NO :52)，且利用了第2位的蘇氨酸來形成硫醚橋。在另一個實施方案中，以上段落中所描述的截短的天青蛋白中的硫醚橋中的兩個或多個在一個肽中組合。在另一個實施方案中，可生成許多截短的天青蛋白序列并通過分析在硫橋下具有 1個羊毛硫氨酸和2-3個其它氨基酸的環(huán)的肽而篩選蘇氨酸環(huán)。這可能包括以下序列中的一個或組合LSTACDMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO53)
LSTAATMQCVVTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO54)
LSTAATMQGCVTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO55)
LSTAANTQGCVTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO56)
LSTAANTQGVCTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO57)
LSTAADMTAVCTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO58)
LSTAADMTAWCDGMASGLDKDYLKPDD (SEQIDNO59)
LSTAADMQTWCDGMASGLDKDYLKPDD (SEQIDNO60)
LSTAADMQTVVTCGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO61)
LSTAADMQATVTCGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO62)
LSTAADMQATVTDCMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO63)
LSTAADMQGVTADCMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO64)
LSTAADMQGVTADGCASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO65)
LSTAADMQGWTNGCASGLDKDYLKPDD (SEQIDNO66)
實踐方法可基因生成大量這樣的序列并以修飾的程度和生產(chǎn)的水平為依據(jù)選擇
用于純化的組。在另一個實施方案中，在p28 (SEQ ID NO 2)的第12位的蘇氨酸和肽的c_末端之間形成了硫醚橋。第13位的Ca和第28位的天冬氨酸之間的距離可能為17. 52埃，大于 1. 5納米，暗示了肽的結(jié)構(gòu)的顯著改變。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，包括為天青蛋白的截短體的第一化學(xué)預(yù)防劑，其中所述截短體包含選自由SEQ ID N0:2和 SEQ ID NO :25組成的組的氨基酸序列的一個或多個；和第二化學(xué)預(yù)防劑。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述第二化學(xué)預(yù)防劑為抗雌激素。
3.如權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其中所述第二化學(xué)預(yù)防劑選自由他莫昔芬、芬維A 胺和芳香酶抑制物組成的組。
4.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述截短體與P53的一個或多個選自由氨基酸1-17、Μ-31、80-276和四7_305組成的組的結(jié)合位點結(jié)合。
5.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述截短體與p53的N-末端結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
6.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述截短體與P53的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
7.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述截短體包含SEQID NO :2。
8.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述截短體由SEQID N0:2組成。
9.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述截短體包含選自由SEQIDNO 26,SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO 34 和 SEQ IDNO 35 組成的組的序列。
10.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，還包括藥學(xué)上可接受的載體。
11.如權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的載體適宜于靜脈內(nèi)施用。
12.如權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其中所述截短體包含SEQIDNO :2。
13.如權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其中所述截短體由SEQIDNO 2組成。
14.一種方法，包括通過向患者施用治療有效量的權(quán)利要求10所述的組合物來治療哺乳動物患者。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述患者是人類。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述患者處于比一般群體高的發(fā)生癌癥的風(fēng)險。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述癌癥選自黑素瘤、乳腺癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、肺癌、結(jié)腸直腸癌、頭頸癌、膀胱癌、前列腺癌、皮膚癌和宮頸癌。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述患者具有選自由以下組成的組的至少一種高風(fēng)險特征吸煙、不良飲食、飲酒、激素替換治療、較高的體重指數(shù)、未經(jīng)產(chǎn)、檳榔使用、頻繁漱口劑的使用、暴露于人乳頭瘤病毒、兒童和慢性日光照射、首次性交的早期年齡、多個性伴侶、口服避孕藥的使用、癌癥的家族史、BRCAl和BRCA2的基因攜帶者身份、乳腺瘤的病史、家族性腺瘤性息肉病(FAP)、遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌(HNPCC)、紅色或金黃色毛發(fā)和淺膚色表型、著色性干皮病、暴露于氡、多環(huán)芳香烴類、鎳、鉻酸鹽、砷、石棉、氯甲基醚、苯并[a]芘、輻射、或來自橡膠或涂料的職業(yè)性暴露的芳香胺類、具有氣流阻塞的慢性阻塞性肺疾病、慢性膀胱感染、血吸蟲病、老齡和免疫受損狀況。
19.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述患者具有癌前病變。
20.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述患者已被治愈癌癥或癌前病變。
21.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述藥物組合物通過選自由以下組成的組的方式來施用靜脈注射、肌內(nèi)注射、皮下注射、吸入法、局部施用、透皮貼劑、栓劑、玻璃體注射和口腔。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述方式是靜脈注射。
23.一種藥盒，包括小管中的權(quán)利要求10所述的組合物。
24.一種方法，包括向哺乳動物患者施用為天青蛋白的截短體的第一化學(xué)預(yù)防劑，其中所述截短體包含選自由SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 25組成的組的氨基酸序列的一個或多個；和向哺乳動物患者施用第二化學(xué)預(yù)防劑。
25.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述第二化學(xué)預(yù)防劑是抗雌激素。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述第二化學(xué)預(yù)防劑選自由他莫昔芬、芬維A胺和芳香酶抑制物組成的組。
27.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述截短體與p53的一個或多個選自由氨基酸 1-17,24-31,80-276和四7_305組成的組的結(jié)合位點結(jié)合。
28.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述截短體與p53的N-末端結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
29.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述截短體與p53的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
30.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述截短體由SEQID N0:2組成。
31.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述截短體包含SEQID NO :2。
32.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述截短體包含選自由SEQIDNO 26, SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO 34 和 SEQID NO 35 組成的組的序列。
33.一種方法，包括通過以任意順序向細(xì)胞施用為天青蛋白的截短體的至少一種化學(xué)預(yù)防劑和施用抗雌激素來提高乳腺細(xì)胞中P53的表達(dá)，其中所述截短體包含選自由SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 25組成的組的氨基酸序列的一個或多個。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述抗雌激素選自由他莫昔芬、芬維A胺和芳香酶抑制物組成的組。
35.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述截短體與p53的一個或多個選自由氨基酸 1-17,24-31,80-276和四7_305組成的組的結(jié)合位點結(jié)合。
36.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述截短體與p53的N-末端結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
37.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述截短體與p53的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
38.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述截短體由SEQID NO :2組成。
39.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述截短體包含SEQID NO :2。
40.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述截短體包含選自由SEQIDNO 26, SEQ ID NO 27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO 34 和 SEQ IDNO 35 組成的組的序列。
41.一種方法，包括通過以任意順序向哺乳動物患者施用治療有效劑量的他莫昔芬和向患者施用治療有效劑量的為天青蛋白的截短體的至少一種化學(xué)預(yù)防劑而在不降低其化學(xué)預(yù)防作用的情況下減少他莫昔芬的劑量相關(guān)毒性，其中所述截短體包含選自由SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 25組成的組的氨基酸序列的一個或多個。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中他莫昔芬的劑量和所述截短體的劑量在同時或接近同時施用。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述截短體與p53的一個或多個選自由氨基酸 1-17,24-31,80-276和四7_305組成的組的結(jié)合位點結(jié)合。
44.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述截短體與p53的N-末端結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
45.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述截短體與p53的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
46.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述截短體由SEQID NO 2組成。
47.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述截短體包含SEQID NO :2。
48.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述截短體包含選自由SEQIDNO 26, SEQ ID NO 27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 34 禾口 SEQ IDNO :35 組成的組的序列。
49.一種方法，包括通過以任意順序向哺乳動物細(xì)胞施用為天青蛋白的截短體的至少一種化學(xué)預(yù)防劑和施用抗雌激素來降低哺乳動物細(xì)胞中雌激素受體與P53的結(jié)合，其中所述截短體包含選自由SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :25組成的組的氨基酸序列的一個或多個。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述抗雌激素選自由他莫昔芬、芬維A胺和芳香酶抑制物組成的組。
51.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述截短體與p53的一個或多個選自由氨基酸 1-17,24-31,80-276和四7_305組成的組的結(jié)合位點結(jié)合。
52.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述截短體與p53的N-末端結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
53.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述截短體與p53的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
54.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述截短體由SEQID NO 2組成。
55.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述截短體包含SEQID NO :2。
56.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述截短體包含選自由SEQIDNO 26, SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO 34 和 SEQ IDNO 35 組成的組的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含可為銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物的化學(xué)預(yù)防劑和至少一種其它化學(xué)預(yù)防劑的組合物和方法。具體地，這些組合物可包含來自銅綠假單胞菌的天青蛋白，和/或天青蛋白(p28)的50-77殘基區(qū)域。所述至少一種其它化學(xué)預(yù)防劑可包含諸如他莫昔芬的抗雌激素。本發(fā)明的組合物可用來預(yù)防哺乳動物細(xì)胞、組織和動物中癌前病變的發(fā)展，并從而預(yù)防癌癥。
文檔編號A61K38/00GK102316887SQ200980156850
公開日2012年1月11日 申請日期2009年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月17日
發(fā)明者克雷格·貝蒂, 塔帕斯·達(dá)斯古普塔, 拉杰沙瓦瑞·梅塔, 拉金德拉·G·梅塔 申請人:Cdg醫(yī)療公司