專利名稱：抗-a和抗-b抗體經(jīng)耗竭的免疫球蛋白g(igg)濃縮物在用于治療由母體-胎兒關于abo系統(tǒng) ...的制作方法
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本發(fā)明涉及抗-A(AcaA)和抗-B(AcaB)抗體經(jīng)耗竭的免疫球蛋白G(IgG)濃縮物在制備用于治療由母體-胎兒關于ABO系統(tǒng)的不相容性所引起的新生兒黃疸的藥物中的用途。在下面的描述中，括號內([])的參考文獻是指在實施例之后給出的參考文獻列表。
現(xiàn)有技術新生兒溶血性疾病(NHD)是由于母親的抗紅細胞抗體與孩子的紅細胞之間的不相容性所致的胎兒或者新生兒病癥?？辜t細胞抗體引起在子宮內已經(jīng)發(fā)生的溶血，以及根據(jù)臨床表現(xiàn)(clinical picture)的嚴重性(gravity)引起孩子的偶發(fā)性嚴重貧血。膽紅素是在血液中轉運的血紅素(構成血紅蛋白)的降解產物，所述表現(xiàn)范圍可以從兒童的高膽紅素血癥伴有黃疸到非常嚴重的全身性水腫病狀(胎兒水腫)以及分娩出死胎兒童。未經(jīng)治療的高膽紅素血癥可引起新生兒核黃疸。關于所述臨床表現(xiàn)及其診斷探索的知識極其重要，所有目前的有效手段更是如此，其可用于防止NHD (抗-D預防或者1 因子)以及有效的治療、子宮內/出生后交換輸血法(exsanguino-transfusion)、UV 新生兒療法。然而，所有這些方式僅在及時意識到風險時才可能實施，也就是說在懷孕之前 (特別是通過確定母親的血型以及可能地確定父親的血型)，在懷孕開始時(可確認血型及查找同種抗體，包括抗-A/抗B免疫抗體)，或者在懷孕期間(每3-4周檢查效價的變化)。 此外，確定孩子父親的血型可以是非常有用的(具有指標的表型用于得到可能的Mi基因型的結論)，因為這就可以由此推出孩子的可能血型。NHD的真實風險可以根據(jù)母親的血型或者同種抗體的低效價以及推斷出的孩子的血型(從父親的血型來確定)來進行估計。如果母親構成了有風險血型的一部分(例如0 型或者1 D陰性)，無論如何不應放棄對效價變化的檢查。在罕見的情況中，當存在成群的類似風險時，可以指示從絨毛膜活組織檢查中進行孩子血型的生物分子學測定。ABO不相容性通常在母親是0型血而孩子是A或B型血的情況中發(fā)生。存在于自然狀態(tài)的IgM同種型的抗ABO抗體不穿過胎盤屏障。盡管ABO系統(tǒng)在出生時還未完全發(fā)育和表現(xiàn)-在孩子6個月之前不應進行血型的明確確定-在懷孕早期可以在胎兒的紅細胞上檢測出A型或B型。這就是為什么即使在此群體中母親的免疫也相對頻繁。此外，抗-A和抗-B IgG免疫抗體可以由異種蛋白誘導，而不依賴于懷孕或者此前的輸血。然而，在Mi不相容的情況中，抗-A或者抗-B IgG抗體與相似抗體相比幾乎總是具有較低的溶血能力。因此，NHD的改變更審慎(discreet)。
黃疸在70%病例中在出生后對-72小時之間出現(xiàn)。其在所有病例中通過目測或者儀器檢測到，經(jīng)常在臍帶血的結果顯現(xiàn)之前，證明了光療法的成功開始。只要未形成黃疸的診斷，早期獲知血型結果并不導致治療性、預防性或者治愈性的措施。其最多可引起對新生兒顏色的警覺增加。黃疸是迄今為止在新生兒期間觀測到的最常見的癥狀。第一個特征是，與成人中不同，新生兒中的黃疸在絕大多數(shù)的病例中具有間接的膽紅素(BR)。通過在生物體中累積，這種色素將涉及所有器官，但特別是肝臟(其首要的負責這種累積)、血液(其部分地運輸和貯存該色素)、皮膚和腦中，具有持續(xù)的膽紅素腦病的潛在風險，這證明了進行診斷和治療時最大嚴密性(rigour)的合理性。傳統(tǒng)上，通過靜脈內免疫球蛋白(IVIG)和光療法的手段來治療兒童，在最嚴重的情況中通過交換輸血治療。研究已經(jīng)涉及通過高劑量IVIG (靜脈內免疫球蛋白)的手段治療受ABO和/或 Mi不相容性溶血性疾病折磨的新生嬰兒，并顯示出施用IVIG降低了需要交換輸血的兒童的數(shù)目，以及減少了通過光療法治療的持續(xù)時間(Gottstein et al. (2003), Archives of Disease in Childhood；Fetal and Neonatal Edition ;vol. 88, no. 1,p.F6_F10[2])。還顯示出通過強劑量IVIG的手段對患有ABO和/或Rh不相容性溶血性疾病的新生嬰兒進行的治療降低溶血、降低血清中膽紅素水平以及減少對交換輸血療法的需求 (Alplay et al (1999), Acta Paediatrica, International Journal of Paediatrics ； vol. 88，no. 2，p. 216_219[3])。然而，研究表明，向1 和ABO不相容性所引起的同種免疫性溶血性黃疸新生嬰兒施用IVIG，會導致與ABO同種免疫作用的治療相比，Mi同種免疫作用的治療結果明顯更好。 這是因為與通過光療法治療相比，在通過施用IVIG治療結束時，由于Mi不相容性而患有高膽紅素血癥的新生嬰兒對交換輸血的需求降低。另一方面，在具有ABO不相容性的新生嬰兒病例中，光療法和施用IVIG在結果方面未顯示出差異(Nasseri et al. (2006) Saudi Med J. ；27(12) :1827-30[4]) ο此外，必須考慮到施用高劑量的IVIG在一些具有ABO不相容性的患者中是具有風險的治療。這是因為IVIG是源自人血漿的免疫球蛋白的濃縮物，并且在這一點上會包括抗-A抗體和抗-B抗體。許多科技出版物表明，注射通過常規(guī)分級分離技術如用乙醇沉淀或者通過辛酸沉淀(Steinbuch et al. (1969)Rev. Franc. Et. Clin, et Biol.，XIV，1054[5])獲得的免疫球蛋白G(IgG)，在接受治療的患者中可導致意外的溶血，包括一些嚴重溶血。例如可舉證的有 Buchta C. et al,Biologicals. 33,2005,41-48([6])>ffilson J. R. et al,Muscle & Nerve, 29(9)，1997，1142-1145([7])、Copelan E. A. et al, Transfusion,26,1986,410-412 ([8]) 和 Misbah S. A. et al, Drug Safety, 9,1993, 254-262 ([9])等出版物。這些 IgG 對患有溶血患者血液的作用的研究，特別是通過直接Coombs測試(DCT)實施的研究，顯示出紅細胞被針對其表面上存在的A、B或D抗原的免疫球蛋白所覆蓋，由此而導致其溶血。這就是為什么目前可商購獲得的IgG得自經(jīng)選擇的血漿的原因，以避免高效價抗-A或者抗-B的存在。
根據(jù)歐洲藥典(方法2. 6. 20，也稱作間接Coombs測試(ICT)，1997)，在體外間接 Coombs測試(ICT)中，使用初始濃度調節(jié)至30g/l的以1/64稀釋的IgG溶液，IVIG必須不會展示出A或者B紅細胞凝集。換句話說，根據(jù)歐洲藥典的方法2. 6. 20，歐洲藥典允許的最大效價必須低于64 (稀釋度的倒數(shù)(結果作為完整的數(shù)字給出-稀釋分數(shù)的分母部分)，也就是說稀釋至1/64的IVIG組合物必須不會引起紅細胞凝集。ICT測試的陰性結果，也就是在根據(jù)歐洲藥典稀釋度低于1/64的IVIG溶液存在時沒有紅細胞凝集，證明了其所接受的抗-A和抗-B抗體的低水平。然而，即使IgG的濃度產生歐洲藥典所規(guī)定的測試陰性結果，也就是其稀釋度低于1/64的那些濃度，仍不能排除溶血反應的風險_。此外，美國和日本藥典不包括需要控制殘余抗-A和抗-B抗體含量的任何規(guī)定?？?A和抗-B抗體在IgG濃縮物制備期間通過常規(guī)方法部分消除，例如乙醇分級分離方法，但是觀測到殘余含量可能高于歐洲藥典的高標準限值。此外，根據(jù)本申請人開發(fā)并在其專利申請WO 02/092632中的描述的方法制備的濃縮物，含有多于通過乙醇分級分離獲得的那些含量。一些批次的IgG濃縮物可具有高于歐洲藥典對每種所認可的閾值的含量。因此，有必要具有這樣的療法，用于治療由母體-胎兒關于ABO系統(tǒng)不相容性所引起的新生兒黃疸，其可施用于患有ABO不相容性的新生嬰兒，而不用擔心會引起溶血。發(fā)明描述為了此目的，且在深入研究期間，本發(fā)明人令人驚奇地顯示出，根據(jù)在體外的間接 Coombs測試陰性結果具有抗-A和抗-B抗體相應(respective)效價的免疫球蛋白G組合物，可用于治療由母體-胎兒關于ABO系統(tǒng)不相容性所引起的新生兒黃疸或者由ABO不相容性引起的新生兒溶血性疾病，而不引起現(xiàn)有技術的組合物中所發(fā)現(xiàn)的不期望的副作用。因此，本發(fā)明涉及用于治療用途的免疫球蛋白G(IgG)組合物，包含根據(jù)間接 Coombs測試(歐洲藥典的方法2. 6. 20)陰性結果的相應效價的抗A和抗B抗體，其作為藥物用以治療由母體-胎兒關于ABO系統(tǒng)不相容性所引起的新生兒黃疸或者由ABO不相容性所引起的新生兒溶血性疾病?！懊庖咔虻鞍譍”在本發(fā)明中是指多克隆IgG，其可以得自已富集了 IgG的血漿或者血漿級分。用于治療性用途的IgG的組合物或者濃縮物有利地具有通常使用的IgG濃度， 優(yōu)選在50g/l至100g/l之間?！爸委熜杂猛尽痹诒景l(fā)明中是指目的在于改善患者的健康狀態(tài)的用途，例如降低黃疸的毒力，或者使黃疸完全或者部分消失，或者甚至治愈患者?！翱笰和抗B抗體的相應效價”在本發(fā)明中是指歐洲藥典(歐洲藥典2.6.20)所定義的并且通過間接Coombs測試(ICT測試)測量的效價。換句話說，該效價是這樣的稀釋度，從其中根據(jù)歐洲藥典的方法2. 6. 20檢測到凝血(agglutination)。再換句話說，所述效價是從中觀測到溶血Oiaemolysis)的稀釋度。所述ICT測試(歐洲藥典的方法2. 6. 20)包括與本發(fā)明的IgG組合物接觸將的紅細胞懸浮液，針對人IgG單位的抗體(抗球蛋白)溶液。這些抗體被固定在附著于紅細胞上的抗-A或者抗-B抗體上，由此通過IgG之間形成橋(bridges)而使其凝集。通過這種常規(guī)血液血清學測試(間接Coomb測試)直接進行包括查找抗-A或者抗-B抗體的測試。
在本發(fā)明的背景中，歐洲藥典的方法2. 6. 20可以如下方式使用在9g/l氯化鈉溶液R中制備2個等同的本發(fā)明IgG組合物的系列稀釋液。向第一系列的每個稀釋液中加入預先用氯化鈉溶液洗滌3次的等體積的5% V/V紅細胞A懸浮液。向第二系列的每個溶液中加入預先用氯化鈉溶液洗滌3次的等體積的5% V/V紅細胞B懸浮液。將該懸浮液在 37°C溫育30分鐘，然后用氯化鈉溶液洗滌細胞。使每個懸浮液與多功能人抗球蛋白試劑接觸30分鐘。不用離心該混合物，通過顯微鏡檢查來尋找任何凝集。如果在稀釋前的所述 IgG組合物具有高于30g/l的免疫球蛋白含量，必須進行稀釋達到30g/l的這個濃度，以制備用于此測試中的稀釋液。稀釋至1/64不出現(xiàn)任何凝集跡象。當IgG濃縮物中抗-A和抗-B的水平非常低時，ICT測試是陰性的，在歐洲藥典條件下更是如此，考慮到紅細胞凝集反應不再發(fā)生，即使加入人抗-IgG抗體，因為抗-A和抗-B抗體的密度太低以至于不能通過固定于紅細胞的抗-A和抗-B抗體鍵在紅細胞和人抗IgG抗體之間建立橋。歐洲藥典測試方法2. 6. 20或者ICT測試是在監(jiān)管水平認可的唯一測試法，在歐洲上市的所有IVIG必須符合這個測試，也即是說在1/64稀釋度不存在凝集。該藥典允許的最大效價必須(稀釋度的倒數(shù)(結果作為完整數(shù)字給出-稀釋分數(shù)的分母部分))低于 64 ( < 64)。也就是說，根據(jù)歐洲藥典的方法2. 6. 20中的描述，在1/64稀釋度，被測產物不引起凝集?！伴g接Coombs測試的陰性結果”在本發(fā)明中是指，當將紅細胞在多功能人抗球蛋白的存在下與本發(fā)明的IgG組合物接觸時，根據(jù)歐洲藥典的方法2. 6. 20測量不存在紅細胞凝集。本發(fā)明的免疫球蛋白G組合物因此可以有利地根據(jù)體外間接Coombs測試的陰性結果，具有64的相應抗-A和抗-B抗體效價，即稀釋度的倒數(shù)(結果作為完整的數(shù)字給出 (稀釋分數(shù)的分母部分)，也即是說對于稀釋度1/64是陰性的。本發(fā)明的免疫球蛋白G組合物有利地具有在O (不包括O是有利的)至8之間的效價(稀釋度的倒數(shù)(結果作為完整數(shù)字給出(稀釋分數(shù)的分母部分)。在這些抗-A和抗-B抗體效價，本發(fā)明的IgG組合物具有依照ICT的結果，也即是說不存在凝集。也就是說，在0(未稀釋，不包括O是有利的)至1/8之間的稀釋度，根據(jù)歐洲藥典的方法2. 6. 20 中描述，本發(fā)明的IgG組合物不引起凝集。因此，8的效價是指在超過樣品8倍稀釋度(稀釋至1/8)觀測到凝集。O的效價表示即使當樣品未稀釋時也檢測不到凝集。有利地，以完整數(shù)字給出(稀釋分數(shù)的分母部分)的抗-A抗體和抗-B抗體效價低于4，或者低于2。這種IgG組合物當各自稀釋4倍(稀釋至1/4)或者2倍(稀釋至1/2) 時不引起凝集。因此，用于實現(xiàn)本發(fā)明的IgG組合物(或者濃縮物)具有略低于在標準IgG濃縮物中觀測到的抗-A和抗-B效價，也就是通過乙醇分級分離和/或通過使用關聯(lián)了層析而沒有消除所述抗體的附加步驟的純化技術所獲得的那些。此外，所述效價略低于歐洲藥典所接受的閾值，其非常顯著地限制了接受治療的一些接受者中的溶血風險。用本發(fā)明的IgG組合物來實施間接Coombs測試，可以導致陰性結果，即使用的是原樣的IgG樣品未經(jīng)稀釋也是如此。本發(fā)明的IgG濃縮物因而由明顯不存在抗-A和抗-B抗體有效成分所限定，所述抗體有效成分針對紅細胞上存在的表位。本申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所述的IgG組合物特別適于治療由母體-胎兒關于ABO系統(tǒng)的不相容性所引起的新生兒黃疸。有利地，本發(fā)明的免疫球蛋白G組合物因此可有利地具有等于64的相應抗-A和抗-B抗體效價，即稀釋度的倒數(shù)(結果作為完整數(shù)字給出(稀釋分數(shù)的分母部分)，或者在 0-8之間，或者低于4，例如低于2。有利地，在這些情況中，使用初始濃度調節(jié)為30g/l的 IgG溶液實施Coombs測試?！坝赡阁w-胎兒關于ABO系統(tǒng)不相容性所引起的新生兒黃疸^E本發(fā)明中是指由于關于ABO系統(tǒng)不相容性所引起的黃疸伴隨新生兒溶血性疾病(NHD)(也稱作ABO溶血性疾病，ABO不相容性新生兒溶血性疾病或者由于ABO不相容性所致的同種免疫溶血性黃疸)。 這種黃疸是由于膽紅素在一些器官中累積所致，所述膽紅素是在血液中運輸?shù)难t素的降解產物。更特別地，可以施用所述IgG組合物的患者可以是早產的新生嬰兒，或者足月產新生嬰兒，例如從出生直至產后第觀天。這些嬰兒通常由于ABO溶血性疾病而呈現(xiàn)出高膽紅素血癥，對于抗球蛋白新生兒測試(間接Coombs測試)是陽性并且具有高網(wǎng)織紅細胞計數(shù)(高于或等于10% )。這些嬰兒可以是男孩或者女孩。本發(fā)明的組合物因此也可用作藥物用以治療由ABO不相容性引起的新生兒溶血性疾病。如上文定義的IgG組合物、IgG濃縮物可具有非常低的多反應性(polyr6actiVe) IgG含量，其可以例如是在0.01% -0. 之間，特別是在0.7% -0. 之間。在這種背景下，多反應性IgG含量表示為摩爾百分比或者重量百分比。這個含量通過申請人在專利申請EP 1 059 088中描述的方法確定。例如，本發(fā)明的免疫球蛋白G組合物可以有利地具有64的相應抗-A和抗-B抗體效價，即稀釋度的倒數(shù)(結果作為完整數(shù)字給出(稀釋分數(shù)的分母部分)，或者在0-8之間， 或者低于4，例如低于2，使用初始濃度調節(jié)為30g/l的IgG溶液進行Coombs測試，多反應性IgG含量可以例如是在0.01% -0. 之間，特別是在0.7% -0. 之間?！岸喾磻訧gG”在本發(fā)明中是指上述IgG組合物中包含的IgG級分，相應于如下抗體的總和非得自有意的免疫并對于自身抗原表現(xiàn)出可變親和性的天然抗體、抗獨特型抗體(也就是針對其它抗體的可變區(qū))、以及在上述IgG組合物的純化方法的不同步驟期間所接受的治療之后變成多反應性的抗體。有利地，本發(fā)明中使用的IgG組合物通過其幾乎完全不存在多反應性而與可商購的其它IgG組合物不同。然而，本申請人完全出乎意料地發(fā)現(xiàn)，在上述IgG組合物中幾乎完全不存在多反應性，結合這些組合物中非常低的抗-A和抗-B抗體水平，這是治療由母體-胎兒關于ABO系統(tǒng)不相容性所引起的新生兒黃疸或者由 ABO不相容性所引起的新生兒溶血性疾病的一個重要特征。因此，本發(fā)明中使用的IgG組合物作為治療由母體-胎兒關于ABO系統(tǒng)不相容性所引起的新生兒黃疸或者由ABO不相容性所引起的新生兒溶血性疾病的藥物是有效的，同時避免了對于紅細胞的不期望反應(特別是通過抗-A和抗-B抗體消耗)以及減少了多反應性IgG的存在而引起的繼發(fā)反應(特別是發(fā)熱、惡心和頭痛)。本發(fā)明的組合物也可以包含一或多種穩(wěn)定劑。
“穩(wěn)定劑”在本發(fā)明中是指長期保存所述IgG組合物的化合物。所述穩(wěn)定劑可以特別使得所述IgG組合物保存指定的時間。此外，所述穩(wěn)定劑與治療用途有利地相容。所述穩(wěn)定劑可有利地是由申請人在其專利申請WO 2204/091656中所開發(fā)的那些穩(wěn)定劑之一，即醇糖(優(yōu)選甘露糖醇、山梨糖醇或者其異構體)、甘氨酸和非離子去污劑(如 Tween 80、Tween 20、Triton XlOO或者Pluronic F68)的混合物，所有這三種化合物均是藥物水平可接受的化合物。所述IgG組合物中甘露糖醇的最終濃度可以在30g/l至50g/l之間，甘氨酸的濃度在7g/l至10g/l之間。這些化合物的濃度代表IgG組合物中最終濃度。有利地，所述配制物的濃度已經(jīng)由申請人確定，以穩(wěn)定液體和/或凍干的形式。本發(fā)明的組合物可以靜脈內施用或者皮下施用。為此，本發(fā)明的IgG濃縮物必須是經(jīng)病毒防護的，例如通過本領域已知的常規(guī)溶劑/去污劑處理，使用例如TweenTM80/TnBP 或者Trit0nTMX 100/TnBP混合物，和/或進行過濾步驟以在需要時消除通過溶劑/去污劑殺病毒處理未除去的病毒和/或其它大分子，如朊病毒，這是導致播散性海綿狀腦病的物質。本發(fā)明的IgG濃縮物也可以進行納米過濾步驟。本發(fā)明的組合物可以配制為存在合適的穩(wěn)定劑的液體或者凍干形式，或者貯存直至隨后使用。有利地，所述組合物可以靜脈內注射。在此實施方案中，本發(fā)明的組合物可以是用于注射的溶液，例如用于靜脈內注射用途的5g/100ml(5% )正常人免疫球蛋白溶液。有利地，用于注射的溶液劑量可以是lg/100ml(l% )，或者2g/100mK2% )，或者 3g/100ml (3% )，或者 4g/100ml (4% )，或者 5g/100ml (5% )。有利地，所述可注射溶液的IgG劑量可以在lg/100ml至5g/100ml之間，或者在 2g/100ml 至 5g/100ml 之間，在 3g/100ml 至 5g/100ml 之間，或者等于 5g/100ml。用于實現(xiàn)本發(fā)明的組合物可以伴隨光療法施用或者與光療法相繼施用，例如施用量在500mg/kg-2000mg/kg之間。可以從施用500mg/kg開始，然后如果膽紅素水平不降低 (可以通過已知的膽紅素血癥測試來檢測)，則以500mg/kg的劑量逐步增加直至膽紅素水平正常化。施用可以重復進行?？梢允┯糜糜趯崿F(xiàn)本發(fā)明的組合物而不伴隨光療法。施用量可以在500mg/kg至 2000mg/kg之間。可以從施用500mg/kg開始，然后如果膽紅素水平不降低(可以通過已知的膽紅素血癥測試來檢測)，則以500mg/kg的劑量逐步增加直至膽紅素水平正?；?。施用
可以重復進行。適于實施本發(fā)明的組合物可以等同于WO 2007/077365中所描述的組合物。所述IgG組合物可以通過本領域技術人員已知的任何方法獲得。特別地，所述組合物可以通過包括如下步驟的方法獲得a)通過乙醇分級分離和/或通過層析分離制備IgG組合物，包括病毒失活步驟，b)通過將所述IgG組合物在載體混合物上滲濾進行免疫親和性層析，所述載體混合物的基質用與血型A和B抗原性相似的寡糖基團接枝，以及c)大小大于20nm的病毒和/或病毒顆粒的消除過濾。
有利地，這種方法在WO 2007/077365中描述。。這種方法在工業(yè)化規(guī)模實施非常有利。此外，制備IgG組合物的步驟與消除抗-A 和抗-B抗體的特定步驟的結合使得可以獲得用于治療用途的IgG組合物，也優(yōu)選包含相對于總IgG含量低于0. 水平的多反應性IgG。此外，這種組合物包含遠低于歐洲藥典中所述檢測低限值的效價的不希望的AcaA和AcaB，即低于64 (稀釋度的倒數(shù)(結果作為完整數(shù)字給出-稀釋分數(shù)的分母部分))，甚至使用這種未稀釋的樣品通過進行ICT測試而得到陰性結果，即效價等于0。優(yōu)選所述方法的步驟a)自己就可以是獲得IgG濃縮物的方法，如本領域技術人員熟知的那些。其是由 Cohn et al. (Cohn et al. 1946，J. Am. Chem. Soc. 68,459 ；Oncley et al. 1949，J.Am. Chem. Soc. 71, 541 [11])開發(fā)的乙醇分級分離的情況，或者例如在EP O 703 922和WO 99/64462中描述的層析分離方法。特別優(yōu)選由本申請人在專利申請WO 94/29334 和WO 02/0擬632中開發(fā)的方法，特別是在02/092632中描述的方法。在這種情況中，本發(fā)明方法的步驟a)包括從富集IgG的血漿或者血漿級分中沉淀脂質污染物的預純化、在陰離子交換樹脂載體上于堿性PH進行的單次層析，以及通過合適緩沖液于PH4-7在一個步驟中選擇性洗脫IgG?！耙后w污染物，，在本發(fā)明中是指血漿中除了免疫球蛋白之外的組分?！案患疘gG的血漿級分”在本發(fā)明中是指已經(jīng)經(jīng)歷純化步驟以增加此級分中IgG濃度的血漿級分?！皢未螌游觥痹诒景l(fā)明中是指隨后不再重復進行的層析步驟?！霸谝粋€步驟中選擇性洗脫IgG”在本發(fā)明中是指用于洗脫大部分免疫球蛋白G的洗脫步驟。對于本發(fā)明的目的，用于在一個步驟中選擇性洗脫IgG的緩沖液可以是本領域技術人員熟知的任何緩沖液。所述方法的步驟a)包括病毒失活處理，優(yōu)選通過溶劑/去污劑進行，如Horowitz 在專利US 4 764 369中所述的。若需要時，在隨后特別消除這種處理的化學殘余物的層析步驟之前，要特別小心地來實施。然后將這種濃縮物在與血型A和B抗原性相似的基團的兩個接枝載體的混合物上進行免疫親和性層析步驟，優(yōu)選在填充了載體混合物的柱上進行。優(yōu)選地，所述層析載體由瓊脂糖型的交聯(lián)天然聚合物制成的基質所構成，其上接枝間隔基團或者結合臂，接著接枝了寡糖，有利的是對應血型A和B的表位的三糖(寡糖)?！芭c血型A和B抗原性相似的寡糖基團”在本發(fā)明中是指由與識別血型A和B相同的抗體或者相同免疫球蛋白所識別的寡糖基團。特別地，使用這樣的載體會獲得非常好的結果，對應于血型A表位的其三糖具有 N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)-半乳糖(Gal)-巖藻糖(Fuc)結構，以及對應于血型B的表位的那些，具有半乳糖-半乳糖-巖藻糖結構。這種載體非常有利地代表可商購的凝膠或者樹脂，名稱為購自 Glycorex Transplantation AS (Sweden)的 GLYC0S0RB AB0。舉例來說，如果使用這種載體，相應于血型A的表位的三糖具有如下結構
權利要求
1.用于治療用途的免疫球蛋白G(IgG)組合物，包含根據(jù)間接Coombs測試(歐洲藥典的方法2. 6. 20)為陰性結果的相應抗-A和抗-B抗體效價，其作為藥物用以治療由母體-胎兒關于ABO系統(tǒng)不相容性所引起的新生兒黃疸或者由ABO不相容性所引起的新生兒溶血疾病。
2.權利要求1的組合物，所述根據(jù)間接Coombs測試陰性結果的相應抗-A和抗-B抗體效價以稀釋度的倒數(shù)為64。
3.權利要求1的組合物，所述根據(jù)間接Coombs測試陰性結果的相應抗-A和抗-B抗體效價以稀釋度的倒數(shù)在0-8之間。
4.前述任一項權利要求的組合物，所述間接Coombs測試用初始濃度調節(jié)為30g/L的 IgG溶液進行。
5.前述任一項權利要求的組合物，具有相對于總IgG含量在0.01%至0. 之間的殘余多反應性IgG含量。
6.前述權利要求之一的組合物，其進一步包含穩(wěn)定劑。
7.前述權利要求之一的組合物，其中所述穩(wěn)定劑是指醇糖，優(yōu)選甘露糖醇或者山梨糖醇，甘氨酸和非離子去污劑的混合物。
8.前述權利要求之一的組合物，可經(jīng)靜脈內注射。
9.前述任一項權利要求的組合物，可通過包括如下步驟的方法獲得a)通過乙醇分級分離和/或通過層析分離制備IgG濃縮物，包括病毒失活步驟，b)通過將所述IgG濃縮物在載體混合物上滲濾進行免疫親和性層析，所述載體混合物的基質用與血型A和B抗原性相似的寡糖基團接枝，以及c)大小大于20nm的病毒和/或病毒顆粒的消除過濾。
10.權利要求9的組合物，所述方法的步驟a)包括通過用富集IgG的血漿或者血漿級分來沉淀脂質污染物的預純化，在陰離子交換樹脂載體上于堿性PH進行的單次層析，以及使用PH在4-7之間的合適緩沖液在一個步驟中選擇性洗脫IgG。
11.權利要求9或10的組合物，所述方法的寡糖基團是指相應于血型A和B表位的三糖。
12.權利要求8-11之一的組合物，所述方法的病毒失活步驟通過溶劑/去污劑進行。
13.權利要求8-12之一的組合物，每個所述載體中與血型A及與血型B抗原性相似的基團的接枝載體的混合物的各自比例在25/75至75/25 (ν/ν)之間，優(yōu)選50/50 (ν/ν)。
14.權利要求8-13之一的組合物，所述方法包括通過超濾和滅菌過濾的濃縮步驟。
15.權利要求14的組合物，所述滅菌過濾步驟通過納米過濾來進行。
16.權利要求9-15之一的組合物，所述方法包括，在步驟c)之后，向所述IgG濃縮物中加入保存性穩(wěn)定劑的步驟。
17.前述任一項權利要求的組合物在制備要用于治療由母體-胎兒關于ABO系統(tǒng)不相容性所引起的新生兒黃疸的藥物中的用途。
18.治療由母體-胎兒關于ABO系統(tǒng)不相容性所引起的新生兒黃疸或者ABO新生兒溶血性疾病的方法，包括將權利要求1-17任一項的IgG組合物施用于有需要的人。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗-A(AcaA)和抗-B(AcaB)抗體經(jīng)耗竭的免疫球蛋白G(IgG)濃縮物在生產用于治療由母體-胎兒關于ABO系統(tǒng)不相容性所引起的新生兒黃疸的藥物中的用途。
文檔編號A61P43/00GK102316899SQ200980156966
公開日2012年1月11日 申請日期2009年12月16日 優(yōu)先權日2008年12月17日
發(fā)明者M·埃爾扎阿比 申請人:法國分裂暨生物科技實驗室