專利名稱：損傷后神經(jīng)組織的再生和修復(fù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于神經(jīng)學(xué)損傷的基于細(xì)胞的治療或再生治療領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提供使用細(xì)胞再生或修復(fù)神經(jīng)組織的藥物組合物、試劑盒和方法。
背景技術(shù)：
各種專利和其它出版物在整個(gè)本說明書提及。這些出版物中的每一個(gè)都在此整體引入作為參考。神經(jīng)學(xué)疾病以及中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的其它障礙是個(gè)體可以遭受的最使人虛弱的情況之一，這不僅是因?yàn)樗鼈兊纳眢w影響，而且是因?yàn)樗鼈兊某志眯?。在過去，患有腦或脊髓損傷、或中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)變性狀況諸如帕金森氏病、阿爾茨海默氏病或多發(fā)性硬化(僅舉幾個(gè)例子)的患者恢復(fù)或治愈的希望很小。神經(jīng)學(xué)損害和神經(jīng)變性疾病被長期認(rèn)為是不可逆的，這是因?yàn)樯窠?jīng)元和神經(jīng)系統(tǒng)的其它細(xì)胞不能在成體中生長。然而，成體哺乳動(dòng)物腦保留一些能力用于可塑性和損傷后的神經(jīng)元再生。(參見，Kolb, B, Can J Exp Psycho, 1999; 53:62-76; Stroemer, RP,等 k ,Stroke, 1998; 29:2381-93; Walter, DH, ^ A ,Circulation, 2002; 105(25):3017-24; Plate, KH, J Neuropathol Exp Neurol, 1999; 58 (4):313-20; Szpak, GM,等 k ,Folia Neuropathol37(4) :264-8; Jin, K,等人， Natl Acad Sci USA, 2001; 98(8) :4710-5; Parent, JM,等)κ ,Ann Neurol, 2QQ2·, 52(6) :802-13; Stroemer, RP,等 k, Stroke, 1995; 26(11) :2135-44; Keyvani, K,等 k, J Neuropathol Exp Neurol，2WYl\ 61(10) :831-40; Lois, C,等人，1996; 271 (5251) :978-81;和 Dutton, R,等)κ ,Dev Neurosci，2·.，22 (1-2) :96-105)。例如， 室下區(qū)(SVZ)包含能夠經(jīng)歷分化成為各種細(xì)胞類型，包括神經(jīng)元的細(xì)胞群(參見，Chen, J,等 k, Stroke, 2001; 32:1005-1011; Evers, BM,等)κ, J Am Coll Surg, 2003; 197:458-478; Seyfried, D,等k ,J Neurosurg, 2006; 104:313-318)并且缺血性損傷和外傷性腦損傷(TBI)的實(shí)驗(yàn)提示該區(qū)域中的細(xì)胞參與恢復(fù)過程。臨床研究和動(dòng)物模型都提示有幾個(gè)機(jī)制與顱內(nèi)出血(ICH)后的細(xì)胞損傷有關(guān)。這些包括外傷或機(jī)械組分、缺血組分和血凝塊的直接毒性作用。(參見，Gong, C,Neurosurgery, 2001; 48:875-883; Gong, C,等)κ,Brain Res, 2000; 871:57-65; Hua, Y,等k,J Cereb Blood Flow Metab, 2002; 22:55—61; Matsushita, K,等)κ ,J Cereb Blood Flow Metab, 2000; 20:396-404; Xi, G,等Jk ,Stroke, 2001; 32:2932-2938;和 Seyfried, D,等人，/ Neurosurg, 2004; 101:104-107)。在臨床上，ICH緊密接近室系統(tǒng)發(fā)生，且因此，ICH后的損傷恢復(fù)可牽涉SVZ。另外，用于組織修復(fù)和再生的基于干細(xì)胞的療法的最近出現(xiàn)提供了用于許多神經(jīng)變性病理學(xué)和其它神經(jīng)學(xué)障礙的有希望的治療。干細(xì)胞能夠自我更新并分化以產(chǎn)生多種成熟的神經(jīng)細(xì)胞譜系。可以將這種細(xì)胞的移植用作臨床工具用于重構(gòu)靶組織，從而恢復(fù)生理學(xué)和解剖學(xué)功能性。干細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用是廣泛的，包括組織工程改造、基因治療遞送、和細(xì)胞治療，即，通過外源提供的產(chǎn)生或包含這些試劑的活細(xì)胞或細(xì)胞組分將生物治療劑遞送到靶位置。已從成體組織中分離了具有神經(jīng)潛能的干細(xì)胞。例如，神經(jīng)干細(xì)胞在發(fā)育中的腦和在成體神經(jīng)系統(tǒng)中存在。這些細(xì)胞可以經(jīng)歷擴(kuò)增并且可以分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。然而，成體神經(jīng)干細(xì)胞是稀有的，以及僅可通過侵入性程序得到，并且可具有比胚胎干細(xì)胞更有限的在培養(yǎng)中擴(kuò)增的能力。其它成體組織也可產(chǎn)生用于基于細(xì)胞的神經(jīng)治療的祖細(xì)胞。例如，最近已報(bào)道，來源于骨髓和皮膚的成體干細(xì)胞可以在培養(yǎng)中擴(kuò)增并且產(chǎn)生多個(gè)譜系，包括一些神經(jīng)譜系。產(chǎn)后組織諸如臍帶已作為干細(xì)胞的可選來源引起興趣。例如，已描述了用于通過灌注胎盤或從臍帶血或組織收集而回收干細(xì)胞的方法。從這些方法獲得干細(xì)胞的限制一直是得到的臍帶血體積或細(xì)胞量不足，以及從那些來源得到的細(xì)胞群的異質(zhì)性或缺乏表征。另外，腦缺血后間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)引起的神經(jīng)再生與生長因子諸如定位于損傷區(qū)域的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)升高的水平相關(guān)。在圍繞實(shí)驗(yàn)性梗死的腦區(qū)域中，已顯示存在增加的微血管(microvessel)形成和細(xì)胞沿微血管遷移的證據(jù)，尤其是來自SVZ的細(xì)胞。(參見，Evers，BM, ,J Am Coll Surg, 2003; 197:458-478)。另外，已顯示出，MSC與增加的突觸發(fā)生相關(guān)，因而新形成的或恢復(fù)中的細(xì)胞展現(xiàn)更多的連接，這與改進(jìn)的功能恢復(fù)的觀察一致。(參見，Seyfried，D,等人，/ Neurosurg, 2006; 104:313-318)。細(xì)胞恢復(fù)過程可受到碎片去除和/或生長因子分泌的幫助，從而產(chǎn)生可誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞再生的環(huán)境。已知神經(jīng)學(xué)損傷的虛弱性質(zhì)，需要開發(fā)細(xì)胞再生療法來幫助恢復(fù)。發(fā)明概述
本發(fā)明提供可應(yīng)用于針對神經(jīng)學(xué)損傷的基于細(xì)胞的再生治療的組合物、試劑盒和方法。具體而言，本發(fā)明的特征在于使用產(chǎn)后組織來源的細(xì)胞再生或修復(fù)神經(jīng)組織的藥物組合物、設(shè)備和方法。本發(fā)明的一方面的特征在于治療患有神經(jīng)學(xué)損傷的患者的方法，所述方法包括以有效治療神經(jīng)變性狀況的量給患者施用臍帶組織-來源的細(xì)胞(UTC)。在某些實(shí)施方案中， 神經(jīng)學(xué)損傷是腦缺血、急性缺血后再灌注、圍產(chǎn)期缺氧-缺血性損傷、心跳停止、顱內(nèi)出血、 顱內(nèi)損害、頸椎挫傷或驚嚇?gòu)雰壕C合征(whiplash or shaken infant syndrome)。本發(fā)明的另一方面特征在于刺激患者SVZ再生能力的方法，所述方法包括以有效增加SVZ中神經(jīng)發(fā)生、血管發(fā)生或突觸發(fā)生的量給患者施用臍帶組織-來源的細(xì)胞。本發(fā)明的另一方面特征在于減少患者腦的損害或損傷部分中的凋亡的方法，所述方法包括以有效減少患者腦的損害或損傷部分中的凋亡細(xì)胞數(shù)目的量給患者施用臍帶組織-來源的細(xì)胞。本發(fā)明的另一方面特征在于改進(jìn)患有神經(jīng)學(xué)損傷的患者的神經(jīng)學(xué)功能的方法，所述方法包括以有效改進(jìn)神經(jīng)學(xué)功能的量給患者施用臍帶組織-來源的細(xì)胞。本發(fā)明的另一方面特征在于用于治療患有神經(jīng)學(xué)損傷的患者的藥物組合物，所述組合物包含藥學(xué)上可接受的載體和臍帶組織-來源的細(xì)胞。待治療的神經(jīng)學(xué)損傷可為腦缺血、急性缺血后再灌注、圍產(chǎn)期缺氧-缺血性損傷、心跳停止、顱內(nèi)出血、顱內(nèi)損害、頸椎挫傷或驚嚇?gòu)雰壕C合征。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含在組合物配制前已被體外誘導(dǎo)以分化成神經(jīng)細(xì)胞或其它譜系的細(xì)胞，或已被基因工程改造以產(chǎn)生促進(jìn)神經(jīng)學(xué)損傷治療的基因產(chǎn)物的細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含至少一種其它細(xì)胞類型，諸如星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)祖先、神經(jīng)干細(xì)胞或其它多能(multipotent)或多潛能 (pluripotent)干細(xì)胞。在這些或其它實(shí)施方案中，藥物組合物包含至少一種其它試劑，諸如用于神經(jīng)治療的藥物，或另一有益的附加試劑，諸如抗炎藥、抗凋亡劑、抗氧化劑或生長因子。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物被配制用于通過注射或輸注施用?？蛇x地，其可包含其中被囊化有細(xì)胞的可植入設(shè)備、或含有細(xì)胞的基質(zhì)或支架。根據(jù)本發(fā)明的再另一方面，提供了用于治療患有神經(jīng)學(xué)損傷的患者的試劑盒。該試劑盒包含藥學(xué)上可接受的載體、臍帶組織-來源的細(xì)胞群和在治療患者的方法中使用試劑盒的說明書。該試劑盒可進(jìn)一步包含至少一種試劑和用于培養(yǎng)臍帶組織-來源的細(xì)胞的說明書。其也可包含至少一種其它細(xì)胞類型的群體、或用于治療神經(jīng)學(xué)損傷的至少一種其它試劑。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于治療患有神經(jīng)學(xué)損傷的患者的方法，所述方法包括給患者施用由臍帶組織-來源的細(xì)胞制成的制劑。這種制劑可包括臍帶組織-來源的細(xì)胞的細(xì)胞裂解物(或其級分)、臍帶組織-來源的細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)、或臍帶組織-來源的細(xì)胞在其中生長的條件培養(yǎng)基。在另一方面，本發(fā)明特征在于包含藥學(xué)上可接受的載體和由臍帶組織-來源的細(xì)胞制成的制劑的藥物組合物，所述制劑可為臍帶組織-來源的細(xì)胞的細(xì)胞裂解物(或其級分)、臍帶組織-來源的細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)、或臍帶組織-來源的細(xì)胞在其中生長的條件培養(yǎng)基。也提供用于實(shí)施本發(fā)明該方面的試劑盒。它們可包含藥學(xué)上可接受的載體或其它劑或試劑中的一種或多種，來自臍帶組織-來源的細(xì)胞的細(xì)胞裂解物或其級分、細(xì)胞外基質(zhì)或條件培養(yǎng)基中的一種或多種，以及試劑盒組分的使用說明書。在各種實(shí)施方案中，臍帶組織-來源的細(xì)胞在施用前被體外誘導(dǎo)以分化成神經(jīng)細(xì)胞或其它譜系。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞被基因工程改造以產(chǎn)生促進(jìn)神經(jīng)學(xué)損傷治療、改進(jìn)神經(jīng)學(xué)功能和/或促進(jìn)再生能力的基因產(chǎn)物。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，將臍帶組織-來源的細(xì)胞連同至少一種其它細(xì)胞類型施用，諸如星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)祖先、神經(jīng)干細(xì)胞或其它多能或多潛能干細(xì)胞。在這些實(shí)施方案中，其它細(xì)胞類型可以與臍帶組織-來源的細(xì)胞同時(shí)、在臍帶組織-來源的細(xì)胞之前或在臍帶組織-來源的細(xì)胞之后施用。同樣地，在這些或其它實(shí)施方案中，將細(xì)胞連同至少一種其它試劑，諸如用于神經(jīng)治療的藥物，或另一有益的附加試劑諸如抗炎藥、抗凋亡劑、抗氧化劑或生長因子施用。在這些實(shí)施方案中，其它試劑可以與臍帶組織-來源的細(xì)胞同時(shí)、在臍帶組織-來源的細(xì)胞之前或在臍帶組織-來源的細(xì)胞之后施用。在一些實(shí)施方案中，將細(xì)胞施用在患者的中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)中的預(yù)定位點(diǎn)。可以將它們通過注射或輸注、或被囊化在可植入設(shè)備中、或通過植入含有細(xì)胞的基質(zhì)或支架而施用。在某些實(shí)施方案中，將細(xì)胞在神經(jīng)學(xué)損傷后不同的時(shí)間點(diǎn)施用。例如，可在范圍為損傷后約M小時(shí)至約168小時(shí)(約1天至約7天)的時(shí)間施用細(xì)胞。根據(jù)下面的詳述和實(shí)施例，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見的。附圖簡述


圖1示出在損傷后M小時(shí)或72小時(shí)用PBS或3X IOfiUTC治療大鼠(n=8)中的損傷后 1天、4天、7天、14天、21天和28天的改良的神經(jīng)學(xué)嚴(yán)重性分?jǐn)?shù)，如在0至18的評分等級上通過運(yùn)動(dòng)、感覺、平衡和反射測試所測定的，0是正常分?jǐn)?shù)，并且18是最大缺陷。圖2示出在損傷后M小時(shí)或72小時(shí)用PBS或3X IO6UTC治療大鼠(n=8)中的損傷后1天、4天、7天、14天、21天和28天的墻角測試分?jǐn)?shù)。圖3示出在損傷并隨后在損傷后72小時(shí)用PBS治療(圖3A)、在損傷后72小時(shí)用3X IOfiUTC治療(圖3B)、在損傷后M小時(shí)用PBS治療(圖3C)、和在損傷后M小時(shí)用 3 X IOfiUTC治療(圖3D)之后，大鼠中SVZ的細(xì)胞中的BrdU摻入；圖3E示出在損傷并隨后在損傷后72小時(shí)用PBS或3X IO6UTC治療之后，大鼠SVZ中BrdU陽性細(xì)胞的平均數(shù)目(n=8)， 以及圖3F示出在損傷后M小時(shí)應(yīng)用PBS ^ 3 X IO6UTC的平均數(shù)目(n=8)。圖4示出在損傷并隨后在損傷后M小時(shí)用PBS治療(圖4A)、在損傷后M小時(shí)用3X IOfiUTC治療(圖4B)、在損傷后72小時(shí)用PBS治療(圖4C)、和在損傷后72小時(shí)用 3X IO6UTC治療(圖4D)之后，大鼠腦損害區(qū)域中血管中的VWF表達(dá)；圖4E示出在損傷并隨后在損傷后M小時(shí)用PBS或3 X IO6UTC治療之后，大鼠腦損害區(qū)域中血管的平均直徑(μ m) (n=8)；以及圖4F示出在損傷后72小時(shí)應(yīng)用PBS或3X IOfiUTC的平均直徑(μ m) (n=8)。圖5A示出在損傷之后，大鼠腦損害區(qū)域中的血管內(nèi)皮細(xì)胞中的BrdU摻入。圖5B 示出在損傷之后，大鼠腦損害區(qū)域中的血管中的VWF表達(dá)。圖5C示出在損傷之后，在大鼠腦損害區(qū)域中的血管中，與VWF表達(dá)組織共定位的內(nèi)皮細(xì)胞中的BrdU摻入。圖6示出在損傷并隨后在損傷后M小時(shí)用PBS治療(圖6A)、在損傷后對小時(shí)用3X IOfiUTC治療(圖6B)、在損傷后72小時(shí)用PBS治療(圖6C)、在損傷后72小時(shí)用 3X IO6UTC治療(圖6D)之后，大鼠腦的SVZ中的雙皮層蛋白(DCX)表達(dá)；圖6E示出在損傷并隨后在損傷后M小時(shí)用PBS或SXlOfiUTC治療之后，對雙皮層蛋白(DCX)表達(dá)呈陽性的大鼠腦SVZ的平均面積百分比(n=8)，并且圖6F示出在損傷后72小時(shí)應(yīng)用PBS或 3X IO6UTC,對雙皮層蛋白(DCX)表達(dá)呈陽性的平均面積百分比(ri=8)。圖7示出在損傷并隨后在損傷后M小時(shí)用PBS治療(圖7A)、在損傷后M小時(shí)用3X IO6UTC治療(圖7B)、在損傷后72小時(shí)用PBS治療(圖7C)、和在損傷后72小時(shí)用 3X IO6UTC治療(圖7D)之后，大鼠腦的SVZ中的TUJl表達(dá)；圖7E示出在損傷并隨后在損傷后M小時(shí)用PBS或3X IOfiUTC治療之后，對TUJl表達(dá)呈陽性的大鼠腦SVZ的平均面積百分比(n=8)，并且圖7F示出在損傷后72小時(shí)應(yīng)用PBS或3X IO6UTC,對TUJl表達(dá)呈陽性的平均面積百分比(n=8)。圖8示出在損傷并隨后在損傷后M小時(shí)用PBS治療(圖8A)、在損傷后M小時(shí)用3X IOfiUTC治療(圖8B)、在損傷后72小時(shí)用PBS治療(圖8C)、和在損傷后72小時(shí)用 3X IO6UTC治療(圖8D)之后，大鼠腦的血腫界面區(qū)中的突觸小泡蛋白表達(dá)；圖8E示出在損傷并隨后在損傷后M小時(shí)用PBS或3X IO6UTC治療之后，對突觸小泡蛋白表達(dá)呈陽性的大鼠腦的血腫界面區(qū)的平均面積百分比(ri=8)，并且圖8F示出在損傷后72小時(shí)應(yīng)用PBS或 3X IO6UTC,對突觸小泡蛋白表達(dá)呈陽性的平均面積百分比(n=8)。圖9示出在損傷并隨后在損傷后M小時(shí)用PBS治療(圖9A)、在損傷后M小時(shí)用3X IO6UTC治療(圖9B)、在損傷后72小時(shí)用PBS治療(圖9C)、和在損傷后72小時(shí)用 3 X IOfiUTC治療(圖9D)之后，大鼠腦的損害區(qū)域中凋亡細(xì)胞的TUNEL染色；圖9E示出在損傷并隨后在損傷后M小時(shí)用PBS或3X IOfiUTC治療之后，大鼠腦的損害區(qū)域中每個(gè)載玻片的凋亡細(xì)胞平均數(shù)目(n=8)，并且圖9F示出在損傷后72小時(shí)應(yīng)用PBS或3X IO6UTC的平均數(shù)目(闊)。圖10示出在損傷并隨后在損傷后M小時(shí)應(yīng)用PBS或3X IOfiUTC治療(n=8)(圖 10A)、和在損害后72小時(shí)應(yīng)用PBS或3X IO6UTC治療(n=8)(圖10B)之后，大鼠腦中紋狀體丟失的平均百分比。圖11示出在損傷后7天應(yīng)用PBS或3X IO6UTC治療(n=10)(圖11A)、以及在損傷后3天應(yīng)用PBS或SXlOfiUTC治療(n=10)(圖11B)大鼠中的損傷后1天、4天、7天、14 天、21天、28天、31天和35天的mNSS。圖12示出在損傷后7天應(yīng)用PBS或3X IO6UTC治療(n=10)(圖12A)、以及在損傷后3天應(yīng)用PBS或SXlOfiUTC治療(n=10)(圖12B)大鼠中的損傷后1天、4天、7天、14 天、21天、28天、31天和35天的墻角測試分?jǐn)?shù)。圖13示出在損傷后7天應(yīng)用PBS或3X IO6UTC治療(n=10)(圖13A)、以及在損傷后3天應(yīng)用PBS或SXlOfiUTC治療(n=10)(圖13B)大鼠中的損傷后1天、4天、7天、14 天、21天、28天、31天和35天的圓筒測試分?jǐn)?shù)。圖14示出在損傷后7天應(yīng)用PBS或3X IO6UTC治療(n=10)(圖14A)、以及在損傷后3天應(yīng)用PBS或SXlOfiUTC治療(n=10)(圖14B)大鼠中的損傷后1天、4天、7天、14 天、21天、28天、31天和35天的粘合劑測試分?jǐn)?shù)。圖15示出在損傷并隨后在損傷后72小時(shí)用PBS治療(圖15A)、在損傷后72小時(shí)用3X IOfiUTC治療(圖15B)、在損傷后7天用PBS治療(圖15C)、和在損傷后7天用 3 X IOfiUTC治療(圖15D)之后，大鼠SVZ的細(xì)胞中的BrdU摻入；圖15E示出在損傷并隨后在損傷后72小時(shí)用PBS或3X IO6UTC治療之后，大鼠SVZ中BrdU陽性細(xì)胞的平均數(shù)目(n=8)， 并且圖15F示出在損傷后7天應(yīng)用PBS或3X IOfiUTC的平均數(shù)目(n=8)。圖16示出在損傷并隨后在損傷后7天用PBS治療(圖16A)、在損傷后7天用 3 X IO6UTC治療(圖16B)、在損傷后72小時(shí)用PBS治療(圖16C)、和在損傷后72小時(shí)用 SXlOfiUTC治療(圖16D)之后，大鼠腦的損害區(qū)域中的血管中VWF表達(dá)；圖16E示出在損傷并隨后在損傷后7天用PBS或3X IOfiUTC治療之后，大鼠腦的損害區(qū)域中的血管平均直徑(μ m) (n=10)，以及圖16F示出在損傷后72小時(shí)應(yīng)用PBS或3X IO6UTC的平均直徑(μ m) (n=10)。圖17A示出在損傷并隨后在損傷后3天用SXlOfiUTC治療之后，大鼠腦的損害區(qū)域中血管內(nèi)皮細(xì)胞中的BrdU摻入(n=10)，并且圖17B示出在損傷后7天應(yīng)用3X IO6UTC的內(nèi)皮細(xì)胞中的BrdU摻入(n=10)。圖17C示出在損傷并隨后在損傷后3天用SXlOfiUTC治療之后，大鼠腦的損害區(qū)域中的血管中VWF表達(dá)(n=10)，并且圖17D示出在損傷后3天應(yīng)用3 X IO6UTC的血管中VWF表達(dá)(n=10)。圖17E示出在損傷并隨后在損傷后3天用3 X IOfiUTC 治療之后，大鼠腦的損害區(qū)域中與血管中的VWF表達(dá)組織共定位的內(nèi)皮細(xì)胞中的BrdU摻入 (n=10)，并且圖17F示出在損傷后7天應(yīng)用3 X IO6UTC的內(nèi)皮細(xì)胞中的BrdU摻入(n=10)。圖18示出在損傷并隨后在損傷后7天用PBS治療(圖18A)、在損傷后7天用 3 X IO6UTC治療(圖18B)、在損傷后3天用PBS治療(圖18C)、在損傷后3天用3 X IOfiUTC 治療(圖18D)之后，大鼠腦的SVZ中的TUJl表達(dá)；圖18E示出在損傷并隨后在損傷后7 天用PBS或3X IO6UTC治療之后，對TUJl表達(dá)呈陽性的大鼠腦的SVZ的平均面積百分比 (n=10)，并且圖18F示出在損傷后72小時(shí)應(yīng)用PBS或3X IOfiUTC,對TUJl表達(dá)呈陽性的平均面積百分比(n=10)。圖19示出在損傷并隨后在損傷后72小時(shí)用PBS治療(圖19A)、在損傷后72 小時(shí)用SXlOfiUTC治療(圖19B)、在損傷后7天用PBS治療(圖19C)、在損傷后7天用 3 X IOfiUTC治療(圖19D)之后，大鼠腦的血腫界面區(qū)中的突觸小泡蛋白表達(dá)；圖19E示出在損傷并隨后在損傷后72小時(shí)用PBS或3X IO6UTC治療之后，對突觸小泡蛋白表達(dá)呈陽性的大鼠腦的血腫界面區(qū)的平均面積百分比(ri=10)，并且圖19F示出在損傷后7天應(yīng)用PBS或 3X IO6UTC,對突觸小泡蛋白表達(dá)呈陽性的平均面積百分比。圖20示出在損傷并隨后在損傷后7天用PBS治療(圖20A)、在損傷后7天用 3X IO6UTC治療(圖20B)、在損傷后72小時(shí)用PBS治療(圖20C)、在損傷后72小時(shí)用 SXlOfiUTC治療(圖20D)之后，大鼠腦的損害區(qū)域中凋亡細(xì)胞的TUNEL染色；圖20E示出在損傷并隨后在損傷后7天用PBS或3X IOfiUTC治療之后，大鼠腦的損害區(qū)域中每個(gè)載玻片的凋亡細(xì)胞平均數(shù)目(n=10)，并且圖20F示出在損傷后72小時(shí)應(yīng)用PBS或3 X IO6UTC的平均數(shù)目(n=10)。圖21A示出在損傷并隨后在損傷后7天用PBS或3X IO6UTC治療之后，大鼠腦中紋狀體丟失的平均百分比(n=10)，并且圖21B示出在損傷后72小時(shí)應(yīng)用PBS或3X IO6UTC 的平均百分比(n=10)。圖22示出在損傷后M小時(shí)用PBS或4X IO6UTC或MSC治療大鼠中的損傷后1天、 4天、7天、14天、21天、觀天和35天的改良的神經(jīng)學(xué)嚴(yán)重性分?jǐn)?shù)(n=8)。圖23示出在損傷后M小時(shí)用PBS或4X IOfiUTC或MSC治療大鼠中(n=8)的損傷后31天、32天、33天、34天和35天的Morris水迷宮分?jǐn)?shù)。圖M示出在損傷后M小時(shí)用PBS或4X IOfiUTC或MSC治療大鼠中(n=8)的損傷后作為腦半球的百分比的損害體積。圖25A示出在損傷后M小時(shí)用PBS或4X IO6UTC或MSC治療大鼠中(n=8)的損傷后35天的E5204抗體染色以鑒定UTC。利用PBS對照沒有發(fā)現(xiàn)陽性染色的細(xì)胞。圖25B示出在損傷后M小時(shí)用PBS或4X IO6UTC或MSC治療大鼠中(n=8)的損傷后35天的E5204 抗體染色以鑒定MSC。圖2隊(duì)示出在損傷后M小時(shí)用PBS或4X IO6UTC或MSC治療大鼠中的損傷后35 天的BrdU陽性UTC細(xì)胞。圖^B示出在損傷后M小時(shí)用PBS或4X IO6UTC或MSC治療大鼠中的損傷后35 天的BrdU陽性MSC細(xì)胞。圖27示出在損傷后M小時(shí)用PBS或4X IOfiUTC或MSC治療大鼠中(n=8)的損傷后35天損害界面區(qū)中每Him2BrdU陽性細(xì)胞的數(shù)目。圖28示出在損傷后M小時(shí)用PBS或4X IOfiUTC或MSC治療大鼠中(n=8)的損傷后35天齒狀回中每Him2BrdU陽性細(xì)胞的數(shù)目。圖^A示出在損傷后24小時(shí)用4X IO6UTC治療大鼠中的損傷后35天的vWF染
色血管。圖^B示出在損傷后24小時(shí)用4X IOfiMSC治療大鼠中的損傷后35天的vWF染
色血管。圖30示出在損傷后M小時(shí)用PBS或4X IOfiUTC或MSC治療大鼠中(n=8)的損傷后35天損害界面區(qū)中vWF陽性血管的數(shù)目。圖31示出在損傷后M小時(shí)用PBS或4X IOfiUTC或MSC治療大鼠中(n=8)的損傷后35天齒狀回中vWF陽性血管的數(shù)目。圖32A示出損害界面區(qū)中BrdU和Map_2陽性雙重染色的細(xì)胞和僅BrdU陽性染色的細(xì)胞。圖32B示出齒狀回中BrdU和Map-2陽性雙重染色的細(xì)胞以及僅BrdU陽性染色的細(xì)胞。發(fā)明詳述
在下面的說明性實(shí)施方案詳述中，對構(gòu)成其一部分的附圖進(jìn)行參考。這些實(shí)施方案被足夠詳細(xì)地描述，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵺`本發(fā)明，并且理解的是，可以利用其它實(shí)施方案并且可以在不背離本發(fā)明的精神或范圍的情況下進(jìn)行合理的結(jié)構(gòu)、機(jī)械、電和化學(xué)改變。為了避免使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵺`本文描述的實(shí)施方案所不需要的細(xì)節(jié)，該描述可省略本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的某些信息。因此，下面的詳述不以限制性意義采用。對貫穿說明書和權(quán)利要求書中應(yīng)用的各種術(shù)語進(jìn)行定義，如下文所列出。如本文使用的術(shù)語“個(gè)體"、“患者“或“受試者“通常指任何形式的動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物，諸如人和猴，其用藥物或治療組合物或根據(jù)所描述的方法進(jìn)行治療。"干細(xì)胞"是未分化的細(xì)胞，其由單細(xì)胞自我更新和分化以產(chǎn)生后代細(xì)胞的能力所限定，包括自我更新祖先、非更新祖先和終末分化細(xì)胞。干細(xì)胞的特征也在于它們的下列能力在體外分化成來自多胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的各種細(xì)胞譜系的功能細(xì)胞， 以及在移植后產(chǎn)生多胚層的組織，和在注射到胚泡中之后基本上有助于大多數(shù)組織，如果不是所有組織的話。干細(xì)胞根據(jù)它們的發(fā)育潛能被分類為(1)全能的；(2)多潛能的 (pluripotent) ； (3)多能的(multipotent) ； (4)寡能的；和(5)單能的?！叭堋奔?xì)胞能夠產(chǎn)生全部胚胎和胚外細(xì)胞類型?！岸酀撃堋奔?xì)胞能夠產(chǎn)生全部胚胎細(xì)胞類型?！岸嗄堋奔?xì)胞包括能夠產(chǎn)生細(xì)胞譜系亞群，但全部在特定組織、器官或生理學(xué)系統(tǒng)中的那些(例如，造血干細(xì)胞(HSC)可以產(chǎn)生包括HSC (自我更新)、血細(xì)胞-限制性寡能祖先及為血液正常組分的全部細(xì)胞類型和元件(例如，血小板)的后代)。“寡能”細(xì)胞可以產(chǎn)生比多能干細(xì)胞更加受限的細(xì)胞譜系亞群，且“單能”細(xì)胞能夠產(chǎn)生單細(xì)胞譜系(例如，生精干細(xì)胞)。干細(xì)胞也基于可獲得它們的來源進(jìn)行分類?！俺审w干細(xì)胞“通常是在包含多個(gè)分化的細(xì)胞類型的組織中發(fā)現(xiàn)的多能的未分化細(xì)胞。成體干細(xì)胞可以自我更新。在正常情況下，其也可以分化以產(chǎn)生其從中起源的組織并且有可能地其它組織類型的特化的細(xì)胞類型。"胚胎干細(xì)胞"是來自胚泡期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的多潛能細(xì)胞。“胎兒”干細(xì)胞是起源自胎兒組織或胎膜的干細(xì)胞?！爱a(chǎn)后干細(xì)胞“是基本上起源于出生后可得的胚外組織，即臍帶和胎盤的多能或多潛能細(xì)胞。已發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞擁有多潛能干細(xì)胞特有的特征，包括快速增殖和分化成許多細(xì)胞譜系的潛能。產(chǎn)后干細(xì)胞可為血液來源的(例如，如得自臍帶血的那些)或非血液來源的(例如，如得自臍帶和胎盤的非血液組織)。各種術(shù)語用于描述培養(yǎng)中的細(xì)胞?！凹?xì)胞培養(yǎng)“通常指細(xì)胞從活生物取得并在受控條件下生長(“在培養(yǎng)中“或“被培養(yǎng)的“)。“原代細(xì)胞培養(yǎng)“是在第一傳代培養(yǎng)之前從生物(一個(gè)或多個(gè))直接取得的細(xì)胞、組織或器官的培養(yǎng)。當(dāng)在促進(jìn)細(xì)胞生長和/或分裂的條件下將細(xì)胞置于生長培養(yǎng)基中時(shí)，細(xì)胞在培養(yǎng)中“擴(kuò)增"，從而導(dǎo)致產(chǎn)生較大的細(xì)胞群。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)中擴(kuò)增時(shí)，細(xì)胞增殖速度有時(shí)通過細(xì)胞數(shù)目加倍所需的時(shí)間量測量。這被稱為“倍增時(shí)間“。術(shù)語“間充質(zhì)干細(xì)胞”(MSCs)指來自未成熟的胚胎結(jié)締組織的細(xì)胞。許多細(xì)胞類型來自間充質(zhì)干細(xì)胞，包括產(chǎn)生軟骨的軟骨細(xì)胞。術(shù)語“室下區(qū)”(SVZ)指位于整個(gè)側(cè)室側(cè)壁的成對腦結(jié)構(gòu)。側(cè)室是腦的室系統(tǒng)的部分。側(cè)室被分類為端腦的部分，它們是室中最大的。側(cè)室通過Monro的室間孔與中央第三腦室連接。室下區(qū)連同齒狀回的顆粒下區(qū)(subgranular zone)充當(dāng)成體神經(jīng)發(fā)生過程中神經(jīng)干細(xì)胞的來源。如本文使用的術(shù)語〃標(biāo)準(zhǔn)生長條件〃指在37°C、在包含5% CO2的標(biāo)準(zhǔn)氣氛和維持在約100%的相對濕度中培養(yǎng)細(xì)胞。雖然前述條件對于培養(yǎng)是有用的，但要理解的是，將認(rèn)識到本領(lǐng)域中可用于培養(yǎng)細(xì)胞的選項(xiàng)的技術(shù)人員能夠改變該條件。本發(fā)明中使用的細(xì)胞通常被稱為“產(chǎn)后細(xì)胞“或“產(chǎn)后-來源的細(xì)胞“(PPDC)“。 該細(xì)胞更具體地為“臍-來源的細(xì)胞“或"臍帶-來源的細(xì)胞“(UDC)，或“臍帶組織來源的細(xì)胞"(UTC)。此外，該細(xì)胞可被描述為干細(xì)胞或祖細(xì)胞，后一術(shù)語被廣義地使用。術(shù)語" 來源的"用于指示，細(xì)胞已得自它們的生物學(xué)來源并生長或另外地在體外操作(例如，在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)以擴(kuò)增群體和/或產(chǎn)生細(xì)胞系)。本發(fā)明臍干細(xì)胞的體外操作和臍-來源的細(xì)胞的獨(dú)特特征在下文詳細(xì)描述。"分化"是下列過程，通過該過程，非特化的("未定型的“)或特化較差的細(xì)胞獲得特化細(xì)胞的特征，例如，諸如神經(jīng)細(xì)胞或肌細(xì)胞?！胺只摹凹?xì)胞是已占據(jù)細(xì)胞譜系中更加特化的(“定型的“)位置的細(xì)胞。當(dāng)用于分化過程時(shí)，術(shù)語“定型的“指已在分化途徑中行進(jìn)到一點(diǎn)的細(xì)胞，在該點(diǎn)，在正常情況下，其將繼續(xù)分化成特定細(xì)胞類型或細(xì)胞類型亞型，并且在正常情況下不能分化成不同細(xì)胞類型或回復(fù)成分化較差的細(xì)胞類型。“去分化“ 指下列過程，通過該過程，細(xì)胞回復(fù)到細(xì)胞譜系中特化(或定型)較差的位置。如本文所用的，細(xì)胞的"譜系“限定細(xì)胞的遺傳，即，其來自哪些細(xì)胞和其可以產(chǎn)生什么細(xì)胞。細(xì)胞譜系將細(xì)胞置于發(fā)育和分化的遺傳安排中。廣義地，"祖細(xì)胞“是具有產(chǎn)生比其本身更加分化的后代的能力、并且仍然保持補(bǔ)充祖先庫的能力的細(xì)胞。通過該定義，干細(xì)胞本身也是祖細(xì)胞，終末分化細(xì)胞的更直接前體也如此。當(dāng)提及本發(fā)明的細(xì)胞時(shí)，如下文更詳細(xì)地描述的，祖細(xì)胞的該寬泛定義可被使用。 較狹義地，祖細(xì)胞常常被限定為在分化途徑中間的細(xì)胞，即，其起自干細(xì)胞并在成熟細(xì)胞類型或細(xì)胞類型亞型產(chǎn)生的中間。該類型的祖細(xì)胞通常不能自我更新。因此，如果該類型的細(xì)胞在本文中提及，其將被稱為“非更新祖細(xì)胞“或稱為“中間祖細(xì)胞或前體細(xì)胞“。
如本文所用的，短語“分化成神經(jīng)譜系或表型”指變得部分或完全定型到CNS或 PNS的特定神經(jīng)表型的細(xì)胞，即，神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞種類非限制性地包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、施旺細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。術(shù)語“細(xì)胞系“通常指由原代細(xì)胞培養(yǎng)物的一次或多次轉(zhuǎn)種形成的細(xì)胞群。每輪傳代培養(yǎng)被稱為傳代。當(dāng)細(xì)胞被傳代培養(yǎng)時(shí)，它們被稱為已被"傳代"。具體的細(xì)胞群或細(xì)胞系有時(shí)通過其被傳代的次數(shù)進(jìn)行提及或表征。例如，已傳代10次的培養(yǎng)的細(xì)胞群可被稱為PlO培養(yǎng)物。原代培養(yǎng)物，即，細(xì)胞從組織分離后的第一培養(yǎng)物被指定為P0。第一傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞被描述為第二培養(yǎng)物(Pl或傳代1)。第二傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞變?yōu)榈谌囵B(yǎng)物(P2 或傳代幻等等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，在傳代時(shí)間段期間可有許多群體倍增；因此，培養(yǎng)物的群體倍增數(shù)目大于傳代數(shù)目。在傳代之間的時(shí)間段期間，細(xì)胞的擴(kuò)增(即，群體倍增數(shù)目)取決于許多因素，包括但不限于，接種密度、基質(zhì)、培養(yǎng)基、生長條件和傳代之間的時(shí)間。如本文使用的，術(shù)語“生長培養(yǎng)基“通常指足以培養(yǎng)臍帶組織來源的細(xì)胞的培養(yǎng)基。具體地，用于培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)胞的一種培養(yǎng)基包括Dulbecco’ s改良必需培養(yǎng)基 (DMEM)。特別優(yōu)選的是DMEM-低葡萄糖(DMEM-LG) (Invitrogen, Carlsbad, Ca.) DMEM-LG 優(yōu)選地補(bǔ)加有血清，最優(yōu)選地胎牛血清或人血清。一般地，加入15% (ν/ν)胎牛血清(例如，確定成分胎牛血清，Hyclone，Logan UT)連同抗生素/抗真菌劑(優(yōu)選地100單位/毫升青霉素，100毫克/毫升鏈霉素和0.25微克/毫升兩性霉素B; Invitrogen, Carlsbad, Ca.)和0.001% (ν/ν) 2-巰基乙醇(Sigma, St. Louis Mo.)。在一些情況下，使用不同的生長培養(yǎng)基或提供不同的補(bǔ)充，并且這些正常在文中指示為生長培養(yǎng)基的補(bǔ)充。在某些化學(xué)成分確知培養(yǎng)基中，細(xì)胞可在根本不存在血清的情況下生長。在這種情況下，細(xì)胞可需要某些生長因子，其可以加入培養(yǎng)基以支持和維持細(xì)胞。待加入用于在無血清培養(yǎng)基中生長的目前優(yōu)選的因子包括bFGF、EGF、IGF-I和PDGF中的一種或多種。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，將因子中的兩種、三種或全部四種加入無血清或化學(xué)成分確知培養(yǎng)基中。在其它實(shí)施方案中，將LIF加入無血清培養(yǎng)基以支持或改進(jìn)細(xì)胞的生長。“條件培養(yǎng)基“是其中特定細(xì)胞或細(xì)胞群已被培養(yǎng)并且然后被取出的培養(yǎng)基。 當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，它們可分泌可以對其它細(xì)胞提供營養(yǎng)支持的細(xì)胞因子。這種營養(yǎng)因子包括但不限于激素、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、蛋白質(zhì)、小泡、抗體和顆粒 (granule)。包含該細(xì)胞因子的培養(yǎng)基是條件培養(yǎng)基。通常地，“營養(yǎng)因子”被定義為促進(jìn)細(xì)胞存活、生長、增殖和/或成熟，或刺激細(xì)胞的增加的活性的物質(zhì)。當(dāng)提及培養(yǎng)的脊椎動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，術(shù)語“衰老”(也稱“復(fù)制衰老”或“細(xì)胞衰老”) 指可歸因于有限細(xì)胞培養(yǎng)的性質(zhì)，即，它們不能生長超過有限的群體倍增數(shù)目(有時(shí)稱為 Hayflick's極限)。盡管細(xì)胞衰老首先使用成纖維細(xì)胞_樣細(xì)胞進(jìn)行描述，但可以在培養(yǎng)中成功生長的大多數(shù)正常人細(xì)胞類型經(jīng)歷細(xì)胞衰老。不同細(xì)胞類型的體外壽命不同，但最大壽命一般少于100次群體倍增(這是所有細(xì)胞在培養(yǎng)中變得衰老并且因而使得培養(yǎng)物不能分裂的倍增數(shù)目)。衰老不取決于按時(shí)間發(fā)生順序的時(shí)間，而是通過培養(yǎng)物已經(jīng)歷的細(xì)胞分裂或群體倍增的數(shù)目來測量。因而，通過去除必需生長因子而休眠的細(xì)胞在重新引入生長因子時(shí)能夠恢復(fù)生長和分裂，并在之后完成與連續(xù)生長的等價(jià)細(xì)胞相同的倍增數(shù)目。類似地，當(dāng)將細(xì)胞在各種數(shù)目的群體倍增之后在液氮中冷凍并隨后解凍和培養(yǎng)時(shí)，它們經(jīng)歷與在培養(yǎng)物中維持未冷凍的細(xì)胞基本上相同的倍增數(shù)目。衰老細(xì)胞不是死亡或垂死的細(xì)胞，它們實(shí)際上抵抗程序性細(xì)胞死亡(凋亡)并已維持在其不分裂狀態(tài)長達(dá)3年。這些細(xì)胞非?；钴S并且是代謝上有活性的，但它們不分裂。尚未發(fā)現(xiàn)衰老細(xì)胞的不分裂狀態(tài)可通過任何生物學(xué)、化學(xué)或病毒試劑逆轉(zhuǎn)。術(shù)語“神經(jīng)學(xué)損傷”是包含性術(shù)語，其包括與神經(jīng)元細(xì)胞死亡或損害有關(guān)的狀況， 包括腦血管機(jī)能不全、局灶性或彌散性腦外傷、彌散性腦損害和外傷性神經(jīng)病(包括但不限于壓迫、壓榨、撕裂和節(jié)段神經(jīng)病)。神經(jīng)學(xué)損傷的實(shí)例是腦缺血或梗死，包括栓塞性阻塞和血栓性阻塞；急性缺血后再灌注；圍產(chǎn)期缺氧-缺血性損傷；心跳停止；任何類型的顱內(nèi)出血(諸如硬膜外、硬膜下、蛛網(wǎng)膜下和大腦內(nèi))；顱內(nèi)和脊椎內(nèi)損害(諸如挫傷、 穿透、剪切、壓迫和撕裂)；頸椎挫傷或驚嚇?gòu)雰壕C合征(whiplash and shaken infant syndrome)。其它神經(jīng)學(xué)損傷包括腫瘤和侵襲CNS和PNS的其它瘤形成狀況。盡管基礎(chǔ)疾病被考慮為增殖性的(而不是損傷)，但周圍組織可被損害。另外，可利用細(xì)胞療法將凋亡或其它抗瘤分子遞送到腫瘤位點(diǎn)，例如，通過遞送產(chǎn)生這種試劑的基因修飾細(xì)胞。術(shù)語“治療神經(jīng)學(xué)損傷(或神經(jīng)學(xué)損傷的治療)，，指改善如本文定義的神經(jīng)學(xué)損傷的影響，或延遲、停止或逆轉(zhuǎn)如本文定義的神經(jīng)學(xué)損傷的發(fā)展，或延遲或防止如本文定義的神經(jīng)學(xué)損傷的發(fā)病。術(shù)語刺激“SVZ的再生能力”指增加室下區(qū)再形成或重制外圍組織包括神經(jīng)學(xué)和內(nèi)皮組織的能力。術(shù)語改進(jìn)“神經(jīng)學(xué)功能”指使功能更好，所述功能諸如例如，肌肉強(qiáng)度、反射性反應(yīng)或感覺知覺。神經(jīng)學(xué)功能已得到改進(jìn)的確定是通過各種行為測試以及運(yùn)動(dòng)、感覺、反射和平衡測試評估的。術(shù)語“減少患者腦的損害或損傷部分中的凋亡”指降低已遭受一些其它損傷或損害的患者腦的一部分中經(jīng)歷凋亡或程序性細(xì)胞死亡的細(xì)胞的數(shù)目。凋亡可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行確定，包括但不限于基于流式細(xì)胞術(shù)的凋亡檢測方法、免疫組織化學(xué)方法、DNA斷裂測定、胱天蛋白酶活性測定等。凋亡也可以通過本領(lǐng)域已知的模擬或預(yù)測體內(nèi)反應(yīng)的體外測定進(jìn)行確定。術(shù)語“有效量“指如本文所描述的化合物、材料或組合物的濃度或量，其有效實(shí)現(xiàn)特定的生物學(xué)結(jié)果。這種結(jié)果包括但不限于體外或體內(nèi)細(xì)胞生長和/或分化，以及如本文所描述的神經(jīng)學(xué)損傷的治療。關(guān)于生長因子，有效量可為約1納克/ml至約1微克/ml的范圍。關(guān)于體內(nèi)施用給患者的UTC，有效量可為少至幾百或更少至多至幾百萬或更多的范圍。 在具體實(shí)施方案中，有效量可為約IO3至約IO11細(xì)胞的范圍、更具體地至少約IO4細(xì)胞。將認(rèn)識到，待施用的細(xì)胞數(shù)目將取決于待治療的神經(jīng)學(xué)損傷的細(xì)節(jié)而變化，所述細(xì)節(jié)包括但不限于待治療的尺寸或總體積/表面積，以及施用位點(diǎn)對待治療區(qū)域位置的接近度，和醫(yī)學(xué)生物學(xué)家熟悉的其它因素。術(shù)語“有效期“、“有效時(shí)間段“或“有效條件“通常指時(shí)間段或其它可控條件 (例如，對于體外方法的溫度、濕度)，其對于試劑或藥物組合物實(shí)現(xiàn)其預(yù)期結(jié)果是必要的或優(yōu)選的。
可與術(shù)語“生物相容性載體“或“生物相容性介質(zhì)“互換使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體“或“藥學(xué)上可接受的介質(zhì)“指試劑、細(xì)胞、化合物、材料、組合物和/或劑型， 其不僅與待治療性施用的細(xì)胞和其它試劑相容，而且也適于與人類和動(dòng)物的組織接觸使用，而沒有過度的毒性、刺激、變態(tài)反應(yīng)或與合理的利益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱的其它并發(fā)癥。如本文更詳細(xì)地描述的，適于在本發(fā)明中使用的藥學(xué)上可接受的載體包括液體、半固體(例如， 凝膠)和固體材料(例如，細(xì)胞支架和基質(zhì)、管、片和如本領(lǐng)域已知的和本文更詳細(xì)地描述的其它這種材料)。這些半固體和固體材料可進(jìn)行設(shè)計(jì)以抵抗體內(nèi)降解(非-生物可降解的)或它們可進(jìn)行設(shè)計(jì)以在體內(nèi)降解(生物可降解的，生物可侵蝕的)。生物可降解材料可進(jìn)一步為生物可再吸收的或生物可吸收的，即，它可溶解和吸收到體液中(水溶性植入物是一個(gè)例子)，或降解并最終從身體消除，或是通過轉(zhuǎn)化成其它材料或是通過天然途徑破壞和消除。幾個(gè)術(shù)語在本文中關(guān)于細(xì)胞或組織移植或細(xì)胞置換療法使用。術(shù)語"自體轉(zhuǎn)移"、 “自體移植"、"同體移植"等指其中細(xì)胞或移植供體也是細(xì)胞或移植受者的治療。術(shù)語“ 同種異體轉(zhuǎn)移"、“同種異體移植"、“同種異體移植物“等指其中細(xì)胞或移植供體與受者是相同物種但不是相同個(gè)體的治療。其中供體的細(xì)胞已與受者進(jìn)行組織相容性匹配的細(xì)胞轉(zhuǎn)移有時(shí)被稱為“同系轉(zhuǎn)移“。術(shù)語“異種轉(zhuǎn)移"、“異種移植"、“異種移植物“等指其中細(xì)胞或移植供體與受者是不同物種的治療。如本文使用的術(shù)語“分離“通常指已從其天然環(huán)境中分離的細(xì)胞。該術(shù)語包括從其天然環(huán)境中總的物理分離，例如，從供體動(dòng)物取出。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的細(xì)胞在組織中不存在，即，細(xì)胞從與其正常接觸的鄰近細(xì)胞中分離或解離。優(yōu)選地，細(xì)胞作為細(xì)胞懸浮液施用。如本文使用的，短語“細(xì)胞懸浮液“包含與培養(yǎng)基接觸和已例如通過使一片組織接受輕柔研磨被解離的細(xì)胞。如本文使用的術(shù)語“基質(zhì)“通常指連同細(xì)胞施用給患者的生物可降解的和/或生物可再吸收的材料?；|(zhì)可充當(dāng)臨時(shí)支架，直至被新生長的細(xì)胞取代。在一些實(shí)施方案中， 基質(zhì)可提供因子或與細(xì)胞結(jié)合使用的其它試劑的持續(xù)釋放，并且可提供用于發(fā)展患者中組織生長的結(jié)構(gòu)。在其它實(shí)施方案中，基質(zhì)僅提供用于發(fā)展組織的臨時(shí)支架?；|(zhì)可以是顆粒形式(直徑大于10微米的大顆?；蛑睆叫∮?0微米的微粒)，或其可以是結(jié)構(gòu)上穩(wěn)定的三維植入物形式(例如，支架)?；|(zhì)可以是漿液、水凝膠或可選地三維結(jié)構(gòu)諸如立方體、圓柱體、管、塊、薄膜、片或適當(dāng)?shù)慕馄市问?。如本文使用的術(shù)語“支架“通常指三維多孔結(jié)構(gòu)，其提供用于細(xì)胞生長的模板。支架由在體內(nèi)隨時(shí)間過去降解的生物可降解的和/或生物可再吸收的材料制成。支架降解花費(fèi)的時(shí)間長度可取決于材料的分子量。因而，較高分子量材料可產(chǎn)生較長時(shí)間段保持它們的結(jié)構(gòu)完整性的聚合物支架；而較低分子量導(dǎo)致較慢的釋放和較短的支架壽命。支架可由本領(lǐng)域已知的任何方式制成。可以用于形成支架的聚合物的例子包括天然和合成聚合物。描述
包括與神經(jīng)元細(xì)胞死亡或損害有關(guān)的狀況，包括腦血管機(jī)能不全、局灶性或彌散性腦外傷、彌散性腦損害和外傷性神經(jīng)病的神經(jīng)學(xué)損傷具有作為共同特征的神經(jīng)細(xì)胞的特定或易損組的功能障礙或丟失。該共性使得能夠開發(fā)類似的治療方法用于易損或損害的神經(jīng)組織的修復(fù)和再生，其中之一是基于細(xì)胞的療法。在本文描述的其各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于神經(jīng)修復(fù)和再生的方法和藥物組合物，其利用來源于產(chǎn)后組織的祖細(xì)胞和細(xì)胞群。本發(fā)明適用于任何神經(jīng)學(xué)損傷，但預(yù)期其尤其適于許多損傷，所述損害非限制性地包括，腦缺血或梗死，包括栓塞性阻塞和血栓性阻塞，急性缺血后再灌注，圍產(chǎn)期缺氧-缺血性損傷，心跳停止，以及任何類型的顱內(nèi)出血(諸如硬膜外、硬膜下、蛛網(wǎng)膜下和大腦內(nèi))， 以及顱內(nèi)和脊椎內(nèi)損害(諸如挫傷、穿透、剪切、壓迫和撕裂)，也包括頸椎挫傷或驚嚇?gòu)雰壕C合征。如上文概述的，本發(fā)明在其一方面總的來說涉及應(yīng)用分離的臍帶組織-來源的細(xì)胞(UTC)治療神經(jīng)學(xué)損傷的方法，所述細(xì)胞來源于已使其基本上不含血液的臍帶組織。UTC 能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，并且具有分化成神經(jīng)表型細(xì)胞的潛能。某些實(shí)施方案的特征在于包含這種細(xì)胞的群、包含該細(xì)胞或其組分或產(chǎn)物的藥物組合物、和應(yīng)用該藥物組合物治療患有神經(jīng)學(xué)損傷的患者的方法。臍帶組織-來源的細(xì)胞已通過它們在培養(yǎng)中的生長性質(zhì)、通過它們的細(xì)胞表面標(biāo)記、通過它們的基因表達(dá)、通過它們產(chǎn)生某些生物化學(xué)營養(yǎng)因子的能力和通過它們的免疫性性質(zhì)進(jìn)行表征。根據(jù)本文描述的方法，對哺乳動(dòng)物臍帶組織進(jìn)行消化并優(yōu)選地在無菌環(huán)境中分離 UTC0在分離UTC之前，優(yōu)選地從產(chǎn)后組織除去血液和碎片。例如，可用緩沖溶液洗滌產(chǎn)后組織，例如但不限于磷酸緩沖鹽水。洗滌緩沖液也可包含一種或多種抗真菌和/或抗生素試劑，例如但不限于青霉素、鏈霉素、兩性霉素B、慶大霉素和制霉菌素。可通過機(jī)械力(切碎或剪切力)解聚全部組織或其片段或部分。在目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離程序也利用酶促消化過程。已知許多酶在本領(lǐng)域中用于從復(fù)合組織基質(zhì)分離個(gè)別細(xì)胞以促進(jìn)在培養(yǎng)物中生長。范圍為弱消化(例如，脫氧核糖核酸酶和中性蛋白酶， 分散酶)至強(qiáng)消化(例如木瓜蛋白酶和胰蛋白酶)的這種酶是可購得的。這種酶的一個(gè)非窮盡性列舉包括粘液溶解酶活性、金屬蛋白酶、中性蛋白酶、絲氨酸蛋白酶(諸如，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或彈性蛋白酶)和脫氧核糖核酸酶。目前優(yōu)選的是選自金屬蛋白酶、中性蛋白酶和粘液溶解活性的酶活性。例如，已知膠原酶對于從組織分離各種細(xì)胞是有用的。脫氧核糖核酸酶可以消化單鏈DNA并且可以最小化分離期間的細(xì)胞-團(tuán)塊化。優(yōu)選的方法涉及用膠原酶和分散酶，或膠原酶、分散酶和透明質(zhì)酸酶的酶促處理。技術(shù)人員將認(rèn)識到，在本領(lǐng)域已知許多這種酶處理用于從各種組織來源分離細(xì)胞，并且被充分裝備以評估新的或另外的酶或酶組合在分離本發(fā)明的細(xì)胞中的效用。優(yōu)選的酶處理可以是約0. 5至2小時(shí)長或更長。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，在解離步驟的酶處理過程中，于約37°C溫育組織。分離的細(xì)胞可用于起始或接種細(xì)胞培養(yǎng)物。將分離的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到未包被或包被有細(xì)胞外基質(zhì)或配體諸如層粘連蛋白、膠原(天然的、變性的或交聯(lián)的)、明膠、纖連蛋白和其它細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的無菌組織培養(yǎng)容器。細(xì)胞在能夠維持細(xì)胞生長的任何培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 諸如但不限于，DMEM (高或低葡萄糖)、高級DMEM、DMEM/MCDB 201、Eagle's基礎(chǔ)培養(yǎng)基、 Ham's FlO 培養(yǎng)基(FlO) ,Ham's F-12 培養(yǎng)基(F12) ,Iscove's 改良 Dulbecco，s 培養(yǎng)基、 間充質(zhì)干細(xì)胞生長培養(yǎng)基(MSCGM)、DMEM/F12、RPMI 1640和CELL-GR0-FREE。培養(yǎng)基可補(bǔ)加有一種或多種組分，包括例如，胎牛血清(FBS)，優(yōu)選地約2-15% (ν/ν)；馬血清(ES) ’人血清(HS) ； β-巰基乙醇(BME或2-ΜΕ)，優(yōu)選地約0.001% (ν/ν)；一種或多種生長因子，例如，血小板衍生生長因子(PDGF)，表皮生長因子(EGF)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，胰島素樣生長因子-1 (IGF-I)，白細(xì)胞抑制因子(LIF)和促紅細(xì)胞生成素；氨基酸，包括L-纈氨酸；和一種或多種抗生素和/或抗真菌劑以控制微生物污染， 諸如青霉素G、硫酸鏈霉素、兩性霉素B、慶大霉素和制霉菌素，單獨(dú)的或組合的。培養(yǎng)基優(yōu)選地包括生長培養(yǎng)基(例如DMEM-低葡萄糖、血清、BME和抗生素試劑)。以允許細(xì)胞生長的密度將細(xì)胞接種在培養(yǎng)容器中。優(yōu)選地，以約0至約5體積％的空氣中的ω2和約2至約25體積％的空氣中的O2，優(yōu)選地約5%至約20%的空氣中的A培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞優(yōu)選地在約25°C至約40°C培養(yǎng)和更優(yōu)選地在37°C培養(yǎng)。細(xì)胞優(yōu)選地在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基可以是靜態(tài)的或攪動(dòng)的，例如，使用生物反應(yīng)器。UTC優(yōu)選在低氧化應(yīng)激(例如，添加谷胱苷肽、維生素C、過氧化氫酶、維生素E、N-乙酰半胱氨酸)下生長。如本文使用的“低氧化應(yīng)激“指對培養(yǎng)的細(xì)胞沒有或具有最小自由基損害的條件。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可將UTC傳代或移動(dòng)至分開的培養(yǎng)容器中，所述分開的培養(yǎng)容器含有與最初使用的相同或不同類型的新鮮培養(yǎng)基，在所述分開的培養(yǎng)容器中細(xì)胞群可進(jìn)行有絲分裂擴(kuò)增。本發(fā)明的方法中使用的細(xì)胞可在介于傳代0和衰老之間的任何點(diǎn)使用。優(yōu)選將細(xì)胞傳代約3至約25次，更優(yōu)選傳代約4至約12次，并優(yōu)選傳代10或 11次?？蛇M(jìn)行克隆和/或亞克隆以證實(shí)已經(jīng)分離到細(xì)胞克隆群。此外，可將產(chǎn)后組織中存在的不同細(xì)胞類型分級分離為亞群，從所述亞群中可以分離UTC。這可使用用于細(xì)胞分離的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來完成，包括，但不限于，酶促處理以將產(chǎn)后組織解離成其組分細(xì)胞，然后是具體細(xì)胞類型的克隆和選擇，包括但不限于基于形態(tài)學(xué)和 /或生物化學(xué)標(biāo)記的選擇；希望的細(xì)胞的選擇性生長(陽性選擇)；不需要的細(xì)胞的選擇性破壞(陰性選擇)；基于在混合群中有差別的細(xì)胞可凝集性的分離，例如，采用大豆凝集素； 凍融程序；在混合群中有差別的細(xì)胞粘附性質(zhì)；過濾；常規(guī)的和區(qū)帶離心；離心淘析(逆流(counter-Streaming)離心)；單位重力分離；逆流分布；電泳；和熒光激活細(xì)胞分選術(shù) (FACS)。按需要改變培養(yǎng)基。繼續(xù)溫育，直至足夠數(shù)目或密度的細(xì)胞在皿中積累。其后，可除去存在的任何原始的外植組織部分，并且通過胰蛋白酶消化使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或通過使用細(xì)胞刮棒從皿中分離剩余的細(xì)胞。胰蛋白酶消化之后，收集細(xì)胞，移動(dòng)到新鮮培養(yǎng)基和如上溫育。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基在胰蛋白酶消化后大約M小時(shí)至少更換1次，以除去任何漂浮細(xì)胞。認(rèn)為在培養(yǎng)物中剩余的細(xì)胞是UTC。UTC可被冷藏。因此，用于自體轉(zhuǎn)移(對于母親或孩子)的UTC可來源自孩子出生后的適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)后組織，然后進(jìn)行冷藏以便在隨后需要它們用于移植的情況下是可用的。UTC可通過下列進(jìn)行表征，例如，通過生長特征(例如，群體倍增能力、倍增時(shí)間、 傳代至衰老)、核型分析(例如，正常核型、母源譜系或新生兒譜系)、流式細(xì)胞術(shù)(例如， FACS分析)、免疫組織化學(xué)和/或免疫細(xì)胞化學(xué)(例如，用于檢測表位)、基因表達(dá)概況(例如，基因芯片陣列、聚合酶鏈反應(yīng)(例如，逆轉(zhuǎn)錄酶PCR、實(shí)時(shí)PCR和常規(guī)PCR))、蛋白質(zhì)陣列、蛋白質(zhì)分泌(例如，通過血漿凝固測定或UTC條件培養(yǎng)基的分析，例如通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA))、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(例如，作為PBMCs的刺激的測量)，和/或本領(lǐng)域已知的其它方法。臍組織來源的細(xì)胞的例子于2004年6月10日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)并指定為如下 ATCC 登記號(1)株名稱 UMB 022803 (P7)指定為登記號PTA-6067 ；和O)株名稱UMB 022803 (P 17)指定為登記號PTA-6068。本發(fā)明的方法中有用的UTC可擁有下列生長特征中的一個(gè)或更多(1)它們在培養(yǎng)物中需要L-纈氨酸用于生長；(2)它們能夠在含約5%至約20%的氧的氣氛中生長；(3) 它們在達(dá)到衰老之前具有在培養(yǎng)物中至少倍增約40次的潛能；和它們在未包被或包被明膠、層粘連蛋白、膠原、聚鳥氨酸、玻連蛋白或纖連蛋白的組織培養(yǎng)容器上貼壁和擴(kuò)增。另外，本發(fā)明的方法中有用的UTC可擁有正常核型，所述核型隨著細(xì)胞傳代保持。 用于核型分析的方法是可用的并且是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。同樣，本發(fā)明的方法中有用的UTC可通過某些蛋白質(zhì)的產(chǎn)生表征，包括(1)組織因子、波形蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白中至少一種的產(chǎn)生；和O)⑶10、⑶13、⑶44、⑶73、 ⑶90、PDGFr-α、PD-L2和HLA-A、B、C細(xì)胞表面標(biāo)記中至少一種的產(chǎn)生，如通過流式細(xì)胞術(shù)檢測的。此外，本發(fā)明的方法中有用的UTC可通過缺乏下列至少一種的產(chǎn)生表征⑶31、 CD34、CD45、CD80、CD86、CDl 17、CD141、CD178、Β7-Η2、HLA-G 和 HLA-DR、DP、DQ 細(xì)胞表面標(biāo)記，如通過流式細(xì)胞術(shù)檢測的。本發(fā)明的方法中有用的UTC可產(chǎn)生組織因子、波形蛋白和 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白中至少兩種；或蛋白質(zhì)組織因子、波形蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白中所有三種。此外，本發(fā)明的方法中有用的UTC可通過基因表達(dá)表征，所述基因表達(dá)相對于作為成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞的人細(xì)胞，對于編碼白細(xì)胞介素8、漿膜蛋白 (reticulon) 1、趨化因子(C-X-C基序)配體1 (黑色素瘤(melonoma)生長刺激活性，α )、 趨化因子(C-X-C基序)配體6 (粒細(xì)胞趨化蛋白2)、趨化因子(C-X-C基序)配體3、腫瘤壞死因子、α -誘導(dǎo)的蛋白3、C-型凝集素超家族成員2、Wilms瘤1、醛脫氫酶1家族成員 A2、腎素、氧化的低密度脂蛋白受體1、智人Qtomo sapiens)克隆IMAGE:4179671、蛋白激酶 C ζ、假設(shè)的蛋白質(zhì)DKFZp564F013、卵巢癌中下調(diào)的1和來自克隆DKFZpM^dll3的智人基因中至少一種的基因增加。同樣，本發(fā)明的方法中有用的UTC可通過基因表達(dá)表征，所述基因表達(dá)相對于作為成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞的人細(xì)胞，對于編碼下列中至少一種的基因降低身材矮小癥同源框2、熱休克27 kDa蛋白2、趨化因子(C-X-C基序)配體12 (基質(zhì)細(xì)胞來源的因子1)、彈性蛋白(主動(dòng)脈瓣上狹窄，Williams-Beuren綜合征)、智人mRNA、 cDNA DKFZp586M2022 (來自克隆KFZp586M2022)、間充質(zhì)同源框2 (生長停滯特異的同源框)、Sine oculis同源框同源物1 (果蠅屬⑵rosoMih))、晶體蛋白α B、形態(tài)發(fā)生的散亂相關(guān)活化劑2、DKFZP586BM20蛋白、類似于neuralin 1、四連蛋白(纖溶酶原結(jié)合蛋白)、src同源三(Sro)和富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域、膽固醇25-羥化酶、runt-相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子 3、白細(xì)胞介素11受體α、前膠原C-內(nèi)肽酶增強(qiáng)子、frizzled同源物7 (果蠅屬)、假設(shè)的基因BC008967、類型VIII α 1膠原、生腱蛋白C (hexabrachion)、易洛魁族人同源框蛋白 5、h印haestin、整聯(lián)蛋白β 8、突觸小泡糖蛋白2、成神經(jīng)細(xì)胞瘤致瘤性的抑制1、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2(36kDa)、智人cDNA FLJ12280 f is克隆MAMMA1001744、細(xì)胞因子受體樣因子1、鉀中間的/小的電導(dǎo)鈣-活化通道亞家族N成員4、整聯(lián)蛋白β 7、含PDZ-結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄輔激活物(TAZ)、sine oculis同源框同源物2 (果蠅屬)、KIAA1034蛋白、突觸小泡相關(guān)膜蛋白5 (myobrevin)、含EGF的纖蛋白(fibulin)-樣細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1、早期生長應(yīng)答3、遠(yuǎn)端較小的(distal-less)同源框5、假設(shè)的蛋白FLJ20373、醛酮還原酶家族1成員C3 (3-α羥基類固醇脫氫酶類型II)、雙糖鏈蛋白聚糖、含PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄輔激活物(ΤΑΖ)、纖連蛋白1、腦啡肽原、整聯(lián)蛋白樣1 (含EGF-樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域)、智人mRNA 全長插入片段cDNA克隆EUR0IMAGE 1968422、EphA3、KIAA0367蛋白、利尿鈉肽受體C/鳥苷酸環(huán)化酶C (心房鈉尿肽受體C)、假設(shè)的蛋白FLJ140M、智人mRNA、cDNA DKFZp564B222 (來自克隆KFZp564B222)、BCL2/腺病毒ElB 19kDa相互作用蛋白3-樣、AE結(jié)合蛋白1和細(xì)胞色素c氧化酶亞基VIIa多肽1 (肌肉)。另外，本發(fā)明的方法中有用的UTC可通過下列至少一種的分泌表征MCP_1、IL-6、 IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF, BDNF, TPO、MlPla、RANTES 和 TIMPl。此外，本發(fā)明的方法中有用的UTC可通過下列至少一種的分泌的缺乏表征JGF-β 2、ANG2、PDGFbb、MIPlb、 1309、MDC和VEGF，如通過ELISA檢測的。本發(fā)明的方法中有用的UTC優(yōu)選地包括上文列出的生長、蛋白質(zhì)/表面標(biāo)記產(chǎn)生、 基因表達(dá)或物質(zhì)分泌特征中的兩種或更多種。本發(fā)明的方法中有用的UTC可包括三、四、 五、六、七、八或更多種所述特征。本發(fā)明的方法中有用的UTC還可包括所有上述特征。在其幾個(gè)方面中本發(fā)明的方法中有用的UTC中的是，具有上述特征的UTC，且更特別的是那些細(xì)胞，其中細(xì)胞具有正常核型并隨著傳代保持正常核型，并且此外，其中細(xì)胞表達(dá)標(biāo)記 CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr- α 和 HLA-A、B、C 中的每一種，其中細(xì)胞產(chǎn)生免疫可檢測的蛋白，所述蛋白對應(yīng)于所列的標(biāo)記。本發(fā)明的方法中有用的UTC還可包括除前述外不產(chǎn)生對應(yīng)于標(biāo)記⑶31、⑶；34、⑶45、⑶117、⑶141或HLA-DR、DP、DQ中任一種的蛋白質(zhì)的細(xì)胞，如通過流式細(xì)胞術(shù)檢測的。具有沿著導(dǎo)致各種表型的系分化的潛能的某些細(xì)胞是不穩(wěn)定的，并且因而可以自發(fā)地分化。本發(fā)明的方法中有用的UTC是不自發(fā)分化的細(xì)胞，例如沿著神經(jīng)系。本發(fā)明的方法中有用的UTC，當(dāng)在生長培養(yǎng)基中生長時(shí)，就在它們表面上產(chǎn)生的細(xì)胞標(biāo)記以及就各種基因的表達(dá)模式而言，基本是穩(wěn)定的，例如使用AfTymetrix GENECHIP測定的。所述細(xì)胞例如在傳代期間和經(jīng)過多個(gè)群體倍增在它們的表面標(biāo)記特征方面基本保持恒定。然而，本發(fā)明方法中有用的UTC的一個(gè)特征是，通過使它們經(jīng)受分化-誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)條件，可將它們故意地誘導(dǎo)以分化成神經(jīng)譜系表型。這可通過本領(lǐng)域已知的一種或多種方法完成。例如，如本文所例示的，可將UTC鋪平板在瓶上，所述瓶包被以在包含B27 (B27 補(bǔ)充物，hvitrogen)、L-谷氨酰胺和青霉素/鏈霉素的神經(jīng)基礎(chǔ)(NeurcAasal)-A培養(yǎng)基 (Invitrogen, Carlsbad, Ca.)中的層粘連蛋白，其組合在本文中稱為神經(jīng)祖先擴(kuò)增(NPE) 培養(yǎng)基。NPE培養(yǎng)基可進(jìn)一步補(bǔ)充以bFGF和/或EGF?？蛇x地，本發(fā)明方法中有用的UTC 可通過下列進(jìn)行體外誘導(dǎo)以分化(1)共培養(yǎng)UTC與神經(jīng)祖細(xì)胞，或O)使UTC在神經(jīng)祖細(xì)胞-條件培養(yǎng)基中生長。UTC的分化可通過具有延長突起的雙極細(xì)胞形態(tài)學(xué)來證明。誘導(dǎo)的細(xì)胞群可對巢蛋白的存在染色陽性。分化的UTC可通過巢蛋白、TuJl (Bill微管蛋白)、GFAP、酪氨酸羥化酶、GABA、04和/或MBP的檢測進(jìn)行評估。另外，本發(fā)明方法中有用的UTC可展示形成三維體(three-dimensional bodies)的能力，所述三維體是神經(jīng)球(neurosphere)的神經(jīng)元干細(xì)胞形成特有的。本發(fā)明的方法中有用的UTC可包括異質(zhì)的細(xì)胞群。本發(fā)明的方法中有用的異質(zhì)細(xì)胞群可包含至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的如上所述的UTC。本發(fā)明的方法中有用的異質(zhì)細(xì)胞群可進(jìn)一步包含干細(xì)胞或其它祖細(xì)胞，例如神經(jīng)祖細(xì)胞， 或其可進(jìn)一步包含完全分化的神經(jīng)細(xì)胞。此外，群體可基本上是同質(zhì)的，即，包含基本上僅僅UTC(如至少約96%、97%、98%、99%或更多的UTC)。本發(fā)明的方法中有用的同質(zhì)細(xì)胞群可包含臍或胎盤-來源的細(xì)胞。臍-來源的細(xì)胞的同質(zhì)群優(yōu)選地不含母源譜系的細(xì)胞。胎盤-來源的細(xì)胞的同質(zhì)群可以是新生兒或母源譜系的。細(xì)胞群的同質(zhì)性可通過本領(lǐng)域已知的任何方法實(shí)現(xiàn)，例如，根據(jù)已知方法通過細(xì)胞分選(例如，流式細(xì)胞術(shù))或通過克隆擴(kuò)增。 因而，本發(fā)明的方法中有用的同質(zhì)UTC群可包含臍帶組織來源的細(xì)胞的克隆細(xì)胞系。這種群體在具有高度希望的功能性的細(xì)胞克隆被分離時(shí)是特別有用的。另外，本發(fā)明方法中有用的UTC可包括在一種或多種因子存在下或在刺激干細(xì)胞沿神經(jīng)原性途徑分化的條件下溫育的細(xì)胞群。這種因子是本領(lǐng)域已知的，并且技術(shù)人員將認(rèn)識到，用于分化的合適條件的確定可以用常規(guī)實(shí)驗(yàn)完成。這種條件的最優(yōu)化可以通過統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析完成，例如反應(yīng)表面方法學(xué)允許同時(shí)最優(yōu)化多個(gè)變量，例如在生物學(xué)培養(yǎng)中。示范性因素包括但不限于因子諸如生長或營養(yǎng)因子、脫甲基化劑、與神經(jīng)譜系細(xì)胞共培養(yǎng)或在神經(jīng)譜系細(xì)胞-條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)、以及本領(lǐng)域已知的刺激干細(xì)胞沿神經(jīng)原性途徑或譜系分化的其它條件。(參見，例如，Lang，KJD,等人，7； Neurosci. Res., 2004; 76:184-192; Johe, KK,等k ,Genes Devel. , 1996; 10:3129-3140; Gottleib, Y),Ann. Rev. Neurosci. , 2002; 25:381—407)。也可將本發(fā)明方法中有用的UTC進(jìn)行基因修飾，例如，以產(chǎn)生神經(jīng)治療上有用的基因產(chǎn)物，或產(chǎn)生抗瘤劑用于治療腫瘤。遺傳修飾可用多種載體中的任一種完成，包括但不限于整合病毒載體，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或腺伴隨病毒載體；非整合復(fù)制載體，例如，乳頭瘤病毒載體、SV40載體、腺病毒載體；或復(fù)制-缺陷型病毒載體。將DNA引入細(xì)胞中的其它方法包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、基因槍或通過直接DNA注射。宿主細(xì)胞可用DNA和選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，所述DNA由一種或多種適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制元件控制或與所述控制元件操作性結(jié)合，控制元件諸如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、聚腺苷酸化位點(diǎn)等。任何啟動(dòng)子都可用于驅(qū)動(dòng)插入的基因的表達(dá)。例如，病毒啟動(dòng)子包括但不限于CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、SV 40、乳頭瘤病毒、EB病毒或彈性蛋白基因啟動(dòng)子。此夕卜，用于控制目的基因表達(dá)的控制元件可以允許基因的調(diào)節(jié)的表達(dá)以便只在體內(nèi)需要時(shí)才合成產(chǎn)物。如果瞬時(shí)表達(dá)是希望的，那么可在非-整合和/或復(fù)制-缺陷型載體中使用組成型啟動(dòng)子。可選地，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可用于在需要時(shí)驅(qū)動(dòng)插入的基因的表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括但不限于與金屬硫蛋白和熱休克蛋白相關(guān)的那些。引入外來DNA后，可允許工程改造的細(xì)胞生長在富集培養(yǎng)基中并然后切換到選擇性培養(yǎng)基。外來DNA中的選擇標(biāo)記賦予對選擇的抗性并允許細(xì)胞穩(wěn)定地將例如質(zhì)粒上的外來DNA整合到它們的染色體中并生長以形成轉(zhuǎn)化灶，其進(jìn)而可以克隆和擴(kuò)增為細(xì)胞系。該方法可以有利地用于工程改造表達(dá)基因產(chǎn)物的細(xì)胞系。本發(fā)明的方法中有用的UTC可被基因工程改造以“敲除“或“擊倒“促進(jìn)植入位點(diǎn)處的炎癥或排斥的因子的表達(dá)。用于減少靶基因表達(dá)水平或靶基因產(chǎn)物活性水平的負(fù)調(diào)節(jié)技術(shù)在下文中討論。如本文使用的“負(fù)調(diào)節(jié)“指靶基因產(chǎn)物的水平和/或活性相對于缺乏調(diào)節(jié)治療情況下靶基因產(chǎn)物的水平和/或活性的減少。對神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞為天然的基因的表達(dá)可以被降低或敲除，其中使用許多技術(shù)，包括例如，通過使用同源重組技術(shù)滅活基因抑制表達(dá)。一般地，編碼蛋白質(zhì)的重要區(qū)域的外顯子(或該區(qū)域5’的外顯子)被陽性選擇標(biāo)記例如neo打斷，從而防止正常mRNA從靶基因的產(chǎn)生并導(dǎo)致該基因的失活。基因也可通過在部分基因中產(chǎn)生缺失，或通過缺失整個(gè)基因而滅活。通過使用帶有與靶基因具有同源性的在基因組中相距很遠(yuǎn)的兩個(gè)區(qū)域的構(gòu)建體，插入這兩個(gè)區(qū)域的序列可以被缺失。(Mombaerts 等人，Proc. Nat. Acad. Sci U. S. Α. , 1991; 88:3084)。反義、DNA 核酶、核酶、小干擾RNA (siRNA)和抑制靶基因表達(dá)的其它這種分子也可以用于降低靶基因活性水平。例如，抑制主要組織相容性基因復(fù)合體(HLA)表達(dá)的反義RNA分子已顯示就免疫應(yīng)答而言最通用。又進(jìn)一步地，三股螺旋分子可以在降低靶基因活性水平中使用。這些技術(shù)由 Davis, L. G.等人，(eds), Basic Methods in Molecular Biology, 2nd ed. , 1994, Appleton & Lange, Norwalk, Ct.詳細(xì)描述。另外，提供了從UTC、或包含UTC的異質(zhì)或同質(zhì)細(xì)胞群、以及已被基因修飾或已被刺激以沿神經(jīng)原性途徑分化的UTC或其群體制備的細(xì)胞裂解物和細(xì)胞可溶性級分，它們在本發(fā)明方法中是有用的。UTC裂解物可溶級分(S卩，基本上不含膜)的體內(nèi)使用，例如，允許有益的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境在患者中同種異體使用，而不引入最有可能觸發(fā)排斥或其它不利的免疫應(yīng)答的可觀量的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。裂解細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域公知的并包括機(jī)械破裂、酶促破裂或化學(xué)破裂或其組合的各種方式。這種細(xì)胞裂解物可在它們的生長培養(yǎng)基中從細(xì)胞直接制備，并且因而包含分泌的生長因子等，或它們可從例如，在PBS或其它溶液中洗滌而不含培養(yǎng)基的細(xì)胞制備。如果優(yōu)選，那么洗滌的細(xì)胞可在大于原始群密度的濃度重懸浮?？芍苽浒l(fā)明的方法中有用的UTC的全細(xì)胞裂解物，例如，通過破裂細(xì)胞而不隨后分離細(xì)胞級分?？蛇x地，可通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法從細(xì)胞可溶級分分離細(xì)胞膜級分，例如，離心、過濾或類似方法。從本發(fā)明的方法中有用的臍帶組織來源的細(xì)胞群制備的細(xì)胞裂解物或細(xì)胞可溶級分可照原樣使用，通過例如超濾或凍干進(jìn)一步濃縮，或甚至干燥、部分純化、與本領(lǐng)域已知的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合、或與其它化合物諸如生物制品例如藥學(xué)上有用的蛋白質(zhì)組合物組合。細(xì)胞裂解物或其級分可在體外或體內(nèi)使用，單獨(dú)或例如連同自體或同系活細(xì)胞。裂解物如果體內(nèi)引入，則可在治療位點(diǎn)局部引入或遠(yuǎn)距離引入，以向患者提供例如所需的細(xì)胞生長因子。另外，本發(fā)明的方法中有用的UTC可以體外培養(yǎng)以高得率地產(chǎn)生生物學(xué)產(chǎn)物。例如，可以使用本文描述的培養(yǎng)技術(shù)克隆擴(kuò)增天然產(chǎn)生特定的目標(biāo)生物學(xué)產(chǎn)物(例如，營養(yǎng)因子)或已被基因工程改造以產(chǎn)生生物學(xué)產(chǎn)物的這種細(xì)胞?？蛇x地，可在誘導(dǎo)分化為神經(jīng)譜系或其他譜系的培養(yǎng)基中擴(kuò)增細(xì)胞。在任一情況下，可以使用標(biāo)準(zhǔn)分離技術(shù)容易地從條件培養(yǎng)基分離細(xì)胞產(chǎn)生和分泌到培養(yǎng)基中的生物學(xué)產(chǎn)物，例如，諸如示差蛋白質(zhì)沉淀、離子交換層析、凝膠過濾層析、電泳和HPLC，僅舉幾個(gè)例子?！吧锓磻?yīng)器“可用于利用流動(dòng)方法進(jìn)行進(jìn)料，例如，體外三維培養(yǎng)?；旧希S著新鮮培養(yǎng)基通過三維培養(yǎng)物，生物學(xué)產(chǎn)物被洗出培養(yǎng)物并且可然后從流出物中分離，如上述。可選地，目標(biāo)生物學(xué)產(chǎn)物可保留在細(xì)胞內(nèi)，并且因而其收集可需要細(xì)胞被裂解，如上文所述。生物學(xué)產(chǎn)物可然后使用上文列出的技術(shù)中的任何一種或多種進(jìn)行純化。另外，來自本發(fā)明的方法中有用的培養(yǎng)的UTC的條件培養(yǎng)基可在體外和體內(nèi)使用，如下文所述。UTC的細(xì)胞條件培養(yǎng)基的應(yīng)用允許UTC分泌的有益的營養(yǎng)因子在患者中同種異體地使用，而不引入可觸發(fā)排斥或其它不利的免疫應(yīng)答的完整細(xì)胞。條件培養(yǎng)基通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，然后從培養(yǎng)基取出細(xì)胞制備。從本發(fā)明的方法中有用的UTC群制備的條件培養(yǎng)基可照原樣使用，通過例如超濾或凍干進(jìn)一步濃縮，或甚至干燥、部分純化、與本領(lǐng)域已知的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合、或與其它化合物諸如生物制品例如藥學(xué)上有用的蛋白質(zhì)組合物組合。條件培養(yǎng)基可在體外或體內(nèi)使用，例如單獨(dú)或與自體或同系活細(xì)胞一起。條件培養(yǎng)基如果體內(nèi)引入，則可在治療位點(diǎn)局部引入或遠(yuǎn)距離引入，以向患者提供例如所需的細(xì)胞生長或營養(yǎng)因子。另外，可以制備、收集且使用由在液體、固體或半固體基質(zhì)上培養(yǎng)本發(fā)明的方法中有用的UTC產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，作為將活細(xì)胞植入需要組織修復(fù)或置換的受試者中的替代方案。在需要量的ECM在框架上分泌的條件下，在如本文其它處描述的三維框架上體外培養(yǎng)UTC。取出構(gòu)成新組織的細(xì)胞，并處理ECM用于進(jìn)一步使用，例如，作為可注射制齊U。為了完成這一點(diǎn)，殺死框架上的細(xì)胞并從框架除去任何細(xì)胞碎片。該過程可以許多不同方式執(zhí)行。例如，可以在液氮中瞬間凍結(jié)活組織，而不冷藏，或可以在無菌蒸餾水中浸入組織以使細(xì)胞響應(yīng)于滲透壓裂解。一旦細(xì)胞已被殺死，就可破裂細(xì)胞膜并通過用溫和去污劑漂洗諸如EDTA、CHAPS 或兩性離子去污劑處理除去細(xì)胞碎片?？蛇x地，可以對組織進(jìn)行酶促消化和/或用破壞細(xì)胞膜和允許去除細(xì)胞內(nèi)容物的試劑提取。這種酶的例子包括但不限于，透明質(zhì)酸酶、分散酶、蛋白酶和核酸酶。去污劑的例子包括非離子去污劑諸如，例如，烷基芳基聚醚醇(TRITON X-100)、辛基苯氧基聚乙氧基-乙醇(Rohm and Haas, Philadelphia, Pa.)、BRIJ-35、聚乙氧基乙醇十二烷基醚(Atlas Chemical Co. , San Diego, Ca.)、聚山梨醇酯20 (TWEEN 20)、聚乙氧基乙醇失水山梨糖醇單月桂酸酯(Rohm and Haas)、聚乙烯十二烷基醚(Rohm and Haas)；和離子去污劑諸如十二烷基硫酸鈉、硫酸化高級脂族醇、包含7至22個(gè)碳原子的支鏈或非支鏈磺化烷和磺化烷基芳烴。ECM的收集可以以多種方式完成，這例如取決于新組織是否已在生物可降解的或非生物可降解的三維框架上形成。例如，如果框架是非生物可降解的，那么ECM可以通過使框架接受超聲處理、高壓水噴射、機(jī)械刮擦或用去污劑或酶溫和處理或上述任何組合取出。如果框架是生物可降解的，那么ECM可以例如通過允許框架降解或在溶液中溶解收集。可選地，如果生物可降解的框架由本身可以連同ECM注射的材料組成，那么框架和 ECM可以整體(in toto)加工用于隨后注射。可選地，ECM可以通過上文描述的用于從非生物可降解的框架收集ECM的方法中的任一種從生物可降解的框架取出。所有收集過程優(yōu)選地進(jìn)行設(shè)計(jì)以便不變性ECM。已收集后，可對ECM進(jìn)一步地進(jìn)行加工。例如，可以使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)，諸如通過超聲處理將ECM同質(zhì)化為細(xì)粒，以便使其可以通過外科手術(shù)針。如果需要，那么可以通過Y照射交聯(lián)ECM的組分。例如，可以在0. 25至2百萬拉德之間照射ECM以對ECM滅菌和交聯(lián)。使用毒性試劑，諸如戊二醛的化學(xué)交聯(lián)是可能的，但通常不是優(yōu)選的。通過混合本發(fā)明的方法中有用的UTC產(chǎn)生的ECM與一種或多種其它細(xì)胞類型的 ECM,可調(diào)整蛋白質(zhì)諸如ECM中存在的各種類型的膠原的量和/或比。此外，生物活性物質(zhì)諸如蛋白質(zhì)、生長因子和/或藥物可以摻入ECM。示范性的生物活性物質(zhì)包括組織生長因子， 諸如TGF-β等，其在注射位點(diǎn)促進(jìn)愈合和組織修復(fù)。這種另外的試劑可連同例如UTC產(chǎn)生的全細(xì)胞裂解物、可溶細(xì)胞級分或進(jìn)一步純化的組分和產(chǎn)物使用。在另一方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其在用于治療神經(jīng)學(xué)損傷、改進(jìn)神經(jīng)學(xué)功能、刺激SVZ再生能力或減少SVZ中凋亡的各種方法中利用UTC、UTC群、UTC組分和產(chǎn)物。 一些藥物組合物包括活細(xì)胞(單獨(dú)的UTC或與其它細(xì)胞類型混合)。其它藥物組合物包括 UTC細(xì)胞組分(例如，細(xì)胞裂解物、可溶性細(xì)胞級分、條件培養(yǎng)基、ECM或前述任一種的組分) 或產(chǎn)物(例如，UTC天然產(chǎn)生或通過遺傳修飾產(chǎn)生的營養(yǎng)和其它生物學(xué)因子，來自UTC培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基)。在任何情況下，藥物組合物可進(jìn)一步包括其它活性劑，諸如抗炎藥、抗凋亡劑、抗氧化劑、生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子或神經(jīng)再生或神經(jīng)保護(hù)藥物，如本領(lǐng)域已知的?？杉尤險(xiǎn)TC藥物組合物的其它組分的實(shí)例包括但不限于(1)其它神經(jīng)保護(hù)或神經(jīng)有益藥物；( 選擇的細(xì)胞外基質(zhì)組分，諸如一種或多種類型的本領(lǐng)域已知的膠原，和/ 或生長因子，富血小板血漿和藥物(可選地，UTC可被基因工程改造以表達(dá)和產(chǎn)生生長因子)；(3)抗凋亡劑(例如，促紅細(xì)胞生成素(EPO)、ΕΡ0模擬體(mimetibody)、血小板生成素、胰島素樣生長因子(IGF)-I、IGF- II、肝細(xì)胞生長因子、胱天蛋白酶抑制劑)；(4)抗炎化合物(例如，p38 MAP激酶抑制劑、TGF-β抑制劑、抑制素、IL-6和IL-I抑制劑、吡嘧司特(PEMIR0LAST)、曲尼司特(TRANILAST)、REMICADE、西羅莫司(SIR0LIMUS)和非類固醇消炎藥(NSAIDS)(諸如替波沙林(TEP0XALIN)、托美汀(T0LMETIN)和 SUPR0FEN ;(5)免疫抑制或免疫調(diào)諧劑，諸如鈣依賴磷酸酶抑制劑、mTOR抑制劑、抗增殖劑、皮質(zhì)類固醇和各種抗體；(6)抗氧化劑諸如丙丁酚(probucol)、維生素C和E、輔酶Q-10、谷胱苷肽、L-半胱氨酸和N-乙?；腚装彼?；和(7)局部麻醉劑，僅舉幾個(gè)例子。本發(fā)明包含的藥物組合物包括用藥學(xué)上可接受的載體或介質(zhì)配制的UTC或其組分或產(chǎn)物。合適的藥學(xué)上可接受的載體包括水，鹽溶液(諸如林格液)，醇，油，明膠，和碳水化合物諸如乳糖、直鏈淀粉或淀粉，脂肪酸酯，羥甲基纖維素，和聚乙烯基吡咯烷。這種制劑可以是滅菌的，并且如果需要，則與輔助劑諸如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、和用于影響滲透壓的鹽、緩沖液和著色劑混合。適于在本發(fā)明中使用的藥物載體是本領(lǐng)域已知的禾口在例如 Pharmaceutical Sciences (17th Ed. , Mack Pub. Co. , Easton, Pa.)禾口 WO 96/05309中描述的。一般地但不是排他地，將包含UTC組分或產(chǎn)物而不是活細(xì)胞的藥物組合物配制為液體(或在口服遞送適當(dāng)時(shí)配制為固體片劑、膠囊等)。可將這些配制用于通過本領(lǐng)域已知的任何可接受途徑施用，以實(shí)現(xiàn)藥物和生物分子向靶神經(jīng)組織的遞送，包括但不限于，口、 鼻、眼和腸胃外，包括靜脈內(nèi)。腸胃外施用的具體途徑包括但不限于肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)、心室內(nèi)、腦室內(nèi)、鞘內(nèi)、腦池內(nèi)、脊柱內(nèi)和/或脊柱旁施用途徑，其通過經(jīng)顱內(nèi)或脊椎內(nèi)針和/或?qū)Ч軒в谢虿粠в斜迷O(shè)備遞送實(shí)施。一般地，包含活UTC細(xì)胞的藥物組合物配制為液體、半固體(例如，凝膠)或固體 (例如，基質(zhì)、支架等，適當(dāng)?shù)赜糜谏窠?jīng)組織工程改造)。液體組合物被配制用于通過本領(lǐng)域已知的任何可接受的途徑施用，以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞向靶神經(jīng)組織的遞送。一般地，這些包括注射或輸注到CNS或PNS中，其或是以擴(kuò)散方式或是靶向神經(jīng)學(xué)損傷或痛苦位點(diǎn)，通過包括但不限于下列的施用途徑實(shí)施眼內(nèi)、大腦內(nèi)、心室內(nèi)、腦室內(nèi)、鞘內(nèi)、腦池內(nèi)、脊柱內(nèi)和/或脊柱旁施用途徑，通過經(jīng)顱內(nèi)或脊椎內(nèi)針和/或?qū)Ч軒в谢虿粠в斜迷O(shè)備遞送。包含半固體或固體載體中的活細(xì)胞的藥物組合物一般地配制用于在神經(jīng)學(xué)損傷或痛苦位點(diǎn)外科手術(shù)植入。將認(rèn)識到，液體組合物也可通過外科手術(shù)程序施用。此外，半固體或固體藥物組合物可包括半透凝膠、格柵、細(xì)胞支架等，其可為非生物可降解的或生物可降解的。例如，可希望或適于將外源細(xì)胞與它們的環(huán)境隔絕，而使得細(xì)胞能夠分泌和遞送生物分子(例如，神經(jīng)營養(yǎng)因子)以包繞神經(jīng)細(xì)胞。因此，細(xì)胞可配制為包含活UTC或含UTC 的細(xì)胞群的自主植入物，所述細(xì)胞或細(xì)胞群被物理上分開移植的細(xì)胞與宿主組織的非可降解的選擇性可滲透屏障包繞。這種植入物有時(shí)被稱為"免疫保護(hù)的"，這是因?yàn)樗鼈兙哂性诓淮嬖谒幬镎T導(dǎo)的免疫抑制下防止免疫細(xì)胞和大分子殺死移植的細(xì)胞的能力。可選地，不同種類的可降解凝膠和網(wǎng)絡(luò)用于本發(fā)明藥物組合物。例如，特別適合于持續(xù)釋放制劑的可降解材料包括生物相容性聚合物，諸如聚(乳酸)、乳酸-乙醇酸共聚物、 甲基纖維素、透明質(zhì)酸、膠原等。另外，可希望或適于將將細(xì)胞遞送在生物可降解的，優(yōu)選地生物可再吸收的或生物可吸收的支架或基質(zhì)之上或之中。一般地，這些三維生物材料包含附著于支架、在支架中分散或摻入在支架中截留的細(xì)胞外基質(zhì)中的活細(xì)胞。一旦植入到身體的靶區(qū)域，這些植入物就變得與宿主組織整合，其中移植的細(xì)胞逐漸確立。(參見，例如，Tresco，PA，等 A ,Adv. Drug Delivery Rev. , 2000; 42:3-27;也參見 Hutmacher, W, J. Biomater. Sci. Polymer Edn. , 2001; 12:107—174)?？稍诒景l(fā)明中應(yīng)用的支架或基質(zhì)(有時(shí)統(tǒng)稱為“框架”)材料的實(shí)例包括非編織的墊、多孔泡沫或自裝配肽。非編織的墊可例如使用包含乙醇酸和乳酸的合成可吸收共聚物 (PGA/PLA)的纖維形成，其在商標(biāo)VICRYL下出售(Ethicon, Inc. , Somerville, N. J·)。也可利用由諸如冷凍-干燥或凍干方法形成的、由例如聚(ε-己內(nèi)酯)/聚(乙醇酸)(PCL/ PGA)共聚物組成的泡沫，如美國專利號6，355，699中論述的。也可應(yīng)用水凝膠諸如自裝配肽(例如，RAD16)。原位形成可降解網(wǎng)絡(luò)也適于在本發(fā)明中應(yīng)用(參見，例如，Anseth, KS,等人，7； Controlled Release, 2002; 78:199-209; Wang, D,等k,Biomaterials, 2003; 24:3969-3980;美國專利公開2002/002^76)。將這些材料配制為適于注射的流體， 然后可通過多種方式(例如溫度、PH變化和暴露于光)誘導(dǎo)它們以在原位或體內(nèi)形成可降解的水凝膠網(wǎng)絡(luò)。同樣，框架可以是氈，它可由從生物可吸收的材料制成的復(fù)絲紗(multifilament yarn)組成。所述生物可吸收的材料例如PGA、PLA、PCL共聚物或摻合物或透明質(zhì)酸。使用標(biāo)準(zhǔn)的紡織工藝技術(shù)將所述紗制成氈，所述技術(shù)由卷曲、切割、梳理和針刺組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將細(xì)胞接種于泡沫支架上，所述支架可為復(fù)合結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步地，可將框架模壓成有用的形狀，例如諸如具有用于神經(jīng)束修復(fù)的分離柱(segregated column)的脊髓的男|3禾中(Friedman, JA, ^ A ,Neurosurgery, 2002; 51:742-51).另外，將認(rèn)識到，可在預(yù)先形成的非可降解外科手術(shù)或可植入設(shè)備上培養(yǎng) UTC，例如，如以相當(dāng)于用于制備含成纖維細(xì)胞的GDC血管內(nèi)線圈的方式(Marx，WF,等 X ,Am. J. Neuroradiol. , 2001; 22:323-333)。可在接種細(xì)胞之前處理基質(zhì)、支架或設(shè)備以增強(qiáng)細(xì)胞附著。例如，在接種之前，可以用0. 1摩爾乙酸處理尼龍基質(zhì)并將其在聚賴氨酸、PBS和/或膠原中溫育以包被尼龍。 可以應(yīng)用硫酸類似地處理聚苯乙烯。也可對框架的外表面進(jìn)行修飾以改進(jìn)細(xì)胞的附著或生長以及組織的分化，諸如通過框架的血漿包被或一種或多種蛋白(例如，膠原、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維)，糖蛋白，糖胺聚糖(例如，硫酸肝素、軟骨素-4-硫酸鹽、軟骨素-6-硫酸鹽、硫酸皮膚素、硫酸角蛋白)，細(xì)胞基質(zhì)和/或其它材料諸如但不限于明膠、藻酸鹽、瓊脂、瓊脂糖和植物樹膠等的添加。含UTC框架是根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行制備的。例如，可以使細(xì)胞在培養(yǎng)容器中自由生長至亞匯合或匯合，從培養(yǎng)物中取出并接種在框架上?？稍诮臃N細(xì)胞以觸發(fā)分化和組織形成之前、期間或之后將生長因子加入培養(yǎng)基，如果需要的話?？蛇x地，可對框架本身進(jìn)行修飾以便其上的細(xì)胞生長得以增強(qiáng)，或以便植入物的排斥風(fēng)險(xiǎn)得以降低。因而，可將一種或多種生物活性化合物，包括但不限于抗炎藥、免疫抑制劑或生長因子加入框架用于局部釋放。可以多種方式應(yīng)用UTC、或包含UTC的細(xì)胞群、或UTC產(chǎn)生的組分或產(chǎn)物，以支持和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞和組織的修復(fù)和再生。這種效用包括體外、先體外后體內(nèi)和體內(nèi)方法。體外和先體外后體內(nèi)方法
可將UTC在體外使用以針對藥物試劑、生長因子、調(diào)節(jié)因子等的有效性和細(xì)胞毒性篩選多種化合物。例如，這種篩選可在基本上同質(zhì)的UTC群中進(jìn)行以評估與UTC配制或共施用來治療神經(jīng)學(xué)損傷的候選化合物的功效或毒性?？蛇x地，這種篩選可在已被刺激以分化成神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞的UTC上進(jìn)行，用于評價(jià)新的藥物候選物的功效。在此實(shí)施方案中，將UTC在體外維持并暴露于待測試化合物。潛在的細(xì)胞毒性化合物的活性可以通過其損害或殺死培養(yǎng)物中的細(xì)胞的能力測量。這可通過活體染色技術(shù)容易地評估。生長或調(diào)節(jié)因子的作用可通過分析與未暴露于所述因子的細(xì)胞相比培養(yǎng)的細(xì)胞的數(shù)目或強(qiáng)壯性 (robustness)進(jìn)行評估。這可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞學(xué)和/或組織學(xué)技術(shù)完成，包括利用限定類型特異性細(xì)胞抗原的抗體的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用。另外，如上文論述的，可以在體外培養(yǎng)UTC以產(chǎn)生生物學(xué)產(chǎn)物，所述產(chǎn)物或是細(xì)胞天然產(chǎn)生的，或是由細(xì)胞在誘導(dǎo)以分化成神經(jīng)或其它譜系時(shí)產(chǎn)生的，或是由細(xì)胞通過遺傳修飾產(chǎn)生的。例如，發(fā)現(xiàn) TIMPl、TPO、KGF、HGF、FGF、HBEGF、BDNF、MIPlb、MCPl、RANTES、1309、 TARC、MDC和IL-8從在生長培養(yǎng)基中生長的UTC分泌。這些營養(yǎng)因子中的一些，諸如BDNF 和IL-6，在神經(jīng)再生中具有重要作用。如尚未檢測到或尚未檢查到的在神經(jīng)修復(fù)和再生中有用的其它營養(yǎng)因子有可能由UTC產(chǎn)生并可能分泌到培養(yǎng)基中。 同樣，可將UTC用于條件培養(yǎng)基的產(chǎn)生，其或是從未分化的UTC或是從在刺激分化成神經(jīng)或其它譜系的條件下溫育的UTC產(chǎn)生。例如，這種條件培養(yǎng)基預(yù)期應(yīng)用于神經(jīng)原性前體細(xì)胞的體外或先體外后體內(nèi)培養(yǎng)中，或在體內(nèi)應(yīng)用以支持包含UTC同質(zhì)群或含UTC和神經(jīng)祖先的異質(zhì)群的移植的細(xì)胞。另外，可將UTC裂解物、其可溶性細(xì)胞級分或組分、或ECM或其組分用于多種目的。 如上文所指出的，可將這些組分中的一些用在藥物組合物中。另外，可將細(xì)胞裂解物或ECM 用于包被或以另外的方式處理待外科手術(shù)應(yīng)用或用于植入或用于先體外后體內(nèi)目的的物質(zhì)或設(shè)備，以促進(jìn)在這種治療過程中接觸的細(xì)胞或組織的愈合或存活。進(jìn)一步地，可將UTC用于體外共培養(yǎng)中以對其它細(xì)胞，具體而言神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)祖先提供營養(yǎng)支持。對于共培養(yǎng)，可需要UTC和需要的其它細(xì)胞在其中兩種細(xì)胞類型接觸的條件下共培養(yǎng)。例如，這可以通過將作為異質(zhì)細(xì)胞群的細(xì)胞接種在培養(yǎng)基中或接種在合適的培養(yǎng)基質(zhì)上而實(shí)現(xiàn)。可選地，可以首先使UTC生長至匯合，并且然后將其充當(dāng)用于培養(yǎng)物中的第二所需細(xì)胞類型的基質(zhì)。另外，可對細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步物理分離，例如，通過膜或類似設(shè)備，以便在共培養(yǎng)時(shí)間段后其它細(xì)胞類型可被取出并單獨(dú)應(yīng)用。UTC在共培養(yǎng)物中促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞類型擴(kuò)增和分化的應(yīng)用可在研究和在臨床/治療領(lǐng)域中具有可用性。例如，可利用UTC共培養(yǎng)來促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞在培養(yǎng)物中的生長和分化，例如，用于基礎(chǔ)研究目的或在藥物篩選測定中應(yīng)用。也可利用UTC共培養(yǎng)進(jìn)行神經(jīng)祖先的先體外后體內(nèi)擴(kuò)增，用于針對治療目的的隨后施用。例如，可將神經(jīng)祖細(xì)胞從個(gè)體收獲，在與UTC的共培養(yǎng)物中先體外后體內(nèi)擴(kuò)增，然后返回到該個(gè)體(自體轉(zhuǎn)移)或另一個(gè)體(同系或同種異體轉(zhuǎn)移)中。先體外后體內(nèi)擴(kuò)增之后，可將包含UTC和神經(jīng)祖先的混合細(xì)胞群施用給需要治療的患者。可選地，在其中自體轉(zhuǎn)移是適當(dāng)?shù)幕蛐枰那闆r下，可將共培養(yǎng)的細(xì)胞群在培養(yǎng)物中物理分離， 從而使得能夠移動(dòng)自體神經(jīng)祖先用于給患者施用。體內(nèi)方法
如實(shí)施例2-10列出的，UTC已顯示出有效移植到體內(nèi)，并且在對于其在人中的功效的可預(yù)測性公認(rèn)的動(dòng)物模型中提供丟失的神經(jīng)功能。一旦移植到體內(nèi)的靶向的神經(jīng)位置，UTC 本身就可分化成一種或多種神經(jīng)表型，或它們可原位提供對神經(jīng)祖先和神經(jīng)細(xì)胞的營養(yǎng)支持，或它們可以這兩種方式施加有益作用，以及其它?？蓪TC單獨(dú)施用(例如，作為基本上同質(zhì)群)或作為與其它細(xì)胞的混合物施用。 如上所述，可將UTC如在與基質(zhì)或支架或與常規(guī)藥學(xué)上可接受的載體的藥物制劑中配制的而施用。在將UTC連同其它細(xì)胞施用的情況下，它們可與其它細(xì)胞同時(shí)或順序施用(或是在其它細(xì)胞之前或是在其它細(xì)胞之后)?？膳cUTC —起施用的細(xì)胞包括但不限于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)祖細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和/或其它多能或多潛能干細(xì)胞?？稍谑┯们傲⒓椿虿痪脤⒉煌愋偷募?xì)胞與UTC混合，或可在施用前將它們一起共培養(yǎng)一段時(shí)間?？蓪TC連同其它神經(jīng)-有益藥物或生物分子、或其它活性劑施用，諸如抗炎藥、 抗凋亡劑、抗氧化劑、生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子或神經(jīng)再生或神經(jīng)保護(hù)藥物，如本領(lǐng)域已知的。當(dāng)將UTC連同其它試劑施用時(shí)，可將它們在單一藥物組合物中一起施用，或在分開的藥物組合物中與其它試劑同時(shí)或順序施用(在其它試劑施用之前或之后)?？蛇B同UTC施用的其它組分的實(shí)例包括但不限于(1)其它神經(jīng)保護(hù)或神經(jīng)有益藥物；O)選擇的細(xì)胞外基質(zhì)組分，諸如一種或多種類型的本領(lǐng)域已知的膠原，和/或生長因子，富血小板血漿和藥物(可選地，UTC可被基因工程改造以表達(dá)和產(chǎn)生生長因子)；(3) 抗凋亡劑(例如，促紅細(xì)胞生成素(ΕΡ0)、ΕΡ0模擬體、血小板生成素、胰島素樣生長因子 (IGF)-I.IGF- II、肝細(xì)胞生長因子、胱天蛋白酶抑制劑)；(4)抗炎化合物(例如，p38 MAP 激酶抑制劑、TGF-β抑制劑、抑制素、IL-6和IL-I抑制劑、吡嘧司特(PEMIR0LAST)、曲尼司特(TRANILAST)、REMICADE、西羅莫司(SIR0LIMUS)和非類固醇消炎藥(NSAIDS)(諸如替波沙林(TEP0XALIN)、托美汀(T0LMETIN)和SUPR0FEN) ； (5)免疫抑制或免疫調(diào)諧劑，諸如鈣依賴磷酸酶抑制劑、mTOR抑制劑、抗增殖劑、皮質(zhì)類固醇和各種抗體；(6)抗氧化劑諸如丙丁酚、維生素C和E、輔酶Q-10、谷胱苷肽、L-半胱氨酸和N-乙?；腚装彼幔缓?7)局部麻醉劑，僅舉幾個(gè)例子。例如，可將UTC作為未分化細(xì)胞施用，S卩，如在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。可選地，可將UTC在在培養(yǎng)物中暴露于刺激向所需神經(jīng)表型分化的條件之后施用，所述所需神經(jīng)表型例如星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元，和更具體地，5-羥色胺能、多巴胺能、膽堿能、 Y -氨基丁酸-能或谷氨酸能神經(jīng)元(參見，例如，Isacson, Q, Lancet Neurology, 2003; 2 (7) 417-424，或支持神經(jīng)再生或修復(fù)的其它譜系。可將UTC外科手術(shù)植入、注射、遞送(例如，通過導(dǎo)管或注射器的方式)或以其它方式直接或間接地施用到神經(jīng)學(xué)損害或痛苦位點(diǎn)。UTC或其組合物的施用途徑包括但不限于，靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、大腦內(nèi)、心室內(nèi)、腦室內(nèi)、鞘內(nèi)、腦池內(nèi)、脊柱內(nèi)和/或脊柱旁施用途徑，其通過經(jīng)顱內(nèi)或脊椎內(nèi)針和/或?qū)Ч軒в谢虿粠в斜迷O(shè)備遞送實(shí)施。當(dāng)將細(xì)胞在半固體或固體設(shè)備中施用時(shí)，外科手術(shù)植入到體內(nèi)精確位置一般是合適的施用方式。然而，可將液體或流體藥物組合物施用到CNS或PNS中的更全面位置(例如，遍及彌散性受侵襲區(qū)域，例如，諸如在彌散性缺血損害中的情況)，因?yàn)樯窠?jīng)祖細(xì)胞已顯示能夠從向神經(jīng)系統(tǒng)的進(jìn)入點(diǎn)廣泛遷移到具體位置，例如，通過跟隨放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或通過響應(yīng)于化學(xué)信號。神經(jīng)干細(xì)胞的該遷移能力已打開了用于惡性腦腫瘤治療的新途徑，S卩，應(yīng)用祖細(xì)胞遞送治療性基因/基因產(chǎn)物用于這些遷移性腫瘤的治療。例如，已報(bào)道，神經(jīng)干細(xì)胞在植入成體嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)顱內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤時(shí)自身快速并且廣泛地通過腫瘤床分布并與擴(kuò)增和前進(jìn)中的腫瘤細(xì)胞并列遷移，同時(shí)持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)外來基因(Aboody，K,等人， Natl. Acad. Sci. USA, 2000 ； 97:12846-12851) 也預(yù)期 UTC 適于這種類型的應(yīng)用， 艮口，可將基因修飾以產(chǎn)生凋亡或其它抗瘤劑，例如IL-12 (Ehtesham, M,等k, Cancer Research, 2002; 62 5657-5663)或腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡-誘導(dǎo)配體(Ehtesham, M,等 k, Cancer Research, 2002; 62:7170-7174)的UTC注射或以其它方式施用到惡性腫瘤 (例如，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)的全面位點(diǎn)，然后UTC可以遷移到腫瘤細(xì)胞用于治療性試劑的局部遞送。通過分化成一種或多種神經(jīng)表型或通過對神經(jīng)祖先和神經(jīng)細(xì)胞提供營養(yǎng)支持，UTC也可以促進(jìn)腫瘤治療后的神經(jīng)學(xué)修復(fù)，如上所述。另外，本發(fā)明提供了通過施用包含UTC細(xì)胞組分(例如，細(xì)胞裂解物或其組分)或產(chǎn)物(例如，UTC天然產(chǎn)生或通過遺傳修飾產(chǎn)生的營養(yǎng)和其它生物學(xué)因子，來自UTC培養(yǎng)的條件培養(yǎng)基)的藥物組合物治療神經(jīng)學(xué)損傷的方法。再次地，這些方法可進(jìn)一步包括施用其它活性劑，諸如生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子或神經(jīng)再生或神經(jīng)保護(hù)藥物，如本領(lǐng)域已知的。用于施用UTC或本文描述的任何其它藥物組合物的劑型和方案依照醫(yī)學(xué)規(guī)范 (good medical practice)考慮個(gè)別患者的狀況開發(fā)，例如，神經(jīng)變性狀況的性質(zhì)和程度、 年齡、性別、體重和一般醫(yī)學(xué)狀況、和醫(yī)學(xué)專業(yè)人員已知的其它因素。因而，待施用給患者的藥物組合物的有效量通過本領(lǐng)域已知的這些考慮確定。由于CNS是有些免疫特權(quán)的(immunoprivileged)組織，所以在起始應(yīng)用UTC的細(xì)胞治療之前可不必需或希望免疫抑制患者。以前已顯示，UTC不刺激混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中的同種異體PBMCs。(參見美國專利申請?zhí)?0/877,269)。因此，用同種異體或甚至異種UTC 移植在一些情況下可耐受。在其它情況下，在起始細(xì)胞治療之前，可希望或適于藥學(xué)地免疫抑制患者。這可通過使用全身或局部免疫抑制劑完成，或其可通過在被囊化設(shè)備中遞送細(xì)胞完成，如上文所述。用于降低或消除對移植的細(xì)胞的免疫應(yīng)答的這些和其它方式是本領(lǐng)域已知的。作為替代，UTC可被基因修飾以降低它們的免疫原性，如上所述。
移植的UTC在活患者中的存活可以通過使用多種掃描技術(shù)測定，例如，計(jì)算機(jī)控制軸向X線斷層攝影術(shù)(CAT或CT)掃描、磁共振成像(MRI)或正電子發(fā)射橫體層攝影術(shù) (PET)掃描。移植物存活的測定也可以在死后通過取出神經(jīng)組織、并視覺或通過顯微鏡檢測它進(jìn)行?？蛇x地，細(xì)胞可以用特異于神經(jīng)細(xì)胞或其產(chǎn)物如神經(jīng)遞質(zhì)的染料處理。移植的細(xì)胞也可以通過在先摻入示蹤染料進(jìn)行鑒定，諸如羅丹明或熒光素標(biāo)記的小球體、堅(jiān)牢藍(lán)、高鐵微粒、雙苯甲酰胺或遺傳引入的報(bào)道基因產(chǎn)物諸如半乳糖苷酶或葡糖醛酸糖苷酶。移植的UTC向受試者神經(jīng)組織中的功能整合可以通過檢查損害或患病的神經(jīng)功能的恢復(fù)進(jìn)行評估。根據(jù)神經(jīng)生物學(xué)家和醫(yī)師公知的程序，這種功能包括但不限于運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知、感覺和內(nèi)分泌功能?？梢詫⑸窠?jīng)功能通過UTC的這種恢復(fù)用在神經(jīng)學(xué)損傷后改進(jìn)患者中神經(jīng)學(xué)功能的方法中。另外，可將UTC用在刺激患者中SVZ的再生能力的方法中。例如，SVZ的再生能力可通過顯示存在神經(jīng)發(fā)生、血管發(fā)生或突觸發(fā)生方面的增加得到刺激。神經(jīng)發(fā)生方面的增加指示SVZ中的祖細(xì)胞在制劑中增殖以取代損傷或損害的神經(jīng)細(xì)胞，并且存在新形成的成神經(jīng)細(xì)胞和其它未成熟的神經(jīng)元。血管發(fā)生方面的增加指示在損傷或損害區(qū)域發(fā)生新血管形成以對損傷或損害組織或?qū)φ谛纬梢匀〈鷵p傷或損害組織的組織提供氧供應(yīng)。突觸發(fā)生方面的增加指示新突觸正在形成，這最有可能是響應(yīng)于引起已存在的功能突觸的數(shù)目方面的減少的一些刺激物。UTC引起神經(jīng)發(fā)生、血管發(fā)生和突觸發(fā)生方面增加的能力在實(shí)施例 3-10中列出。進(jìn)一步地，UTC可減少腦的損傷或損害部分中凋亡細(xì)胞的數(shù)目。凋亡可為外傷性腦損傷后繼發(fā)性腦損傷的原因，并且高凋亡速度可與外傷性腦損傷后較差的預(yù)后相關(guān)。(參 Himmhres 等)κ, Journal of Neurotrauma, 2008; 25(6) :581-591).因此，經(jīng)歷損傷或損害的腦區(qū)域中凋亡的減少可增加存活、改進(jìn)神經(jīng)學(xué)功能和從損傷中恢復(fù)，并且可充當(dāng)其它治療的輔助，諸如刺激損傷后患者中SVZ的再生能力。實(shí)施例7和9證明UTC減少腦組織的損害部分中凋亡的能力。另一方面，本發(fā)明提供在如上述用于神經(jīng)再生和修復(fù)的各種方法中利用UTC、UTC 群、UTC的組分和產(chǎn)物的試劑盒。在用于神經(jīng)學(xué)損傷的治療或其它預(yù)定治療的情況下，試劑盒可包含一種或多種細(xì)胞群，其包含至少UTC和藥學(xué)上可接受的載體(液體、半固體或固體)。試劑盒也任選地可包含施用細(xì)胞的工具，例如通過注射。試劑盒還可包含細(xì)胞的使用說明書。制備用于野戰(zhàn)醫(yī)院應(yīng)用，諸如用于軍事應(yīng)用的試劑盒可包含全部程序供應(yīng)，包含組織支架、外科手術(shù)縫線等，其中將細(xì)胞與急性損傷的修復(fù)一起使用。用于如本文描述的測定和體外方法的試劑盒可包含下列中的一種或多種(1) UTC或UTC的組分或產(chǎn)物，(2)用于實(shí)踐體外方法的試劑，(3)適當(dāng)?shù)兀渌?xì)胞或細(xì)胞群，和用于進(jìn)行體外方法的說明書。提供下列實(shí)施例以更詳細(xì)地描述本發(fā)明。它們意圖舉例說明而不是限制本發(fā)明。下列縮寫可在實(shí)施例以及說明書和權(quán)利要求書中的其它處出現(xiàn) AM72 (或Aj 松)表示促血管生成素2
^ 1表示抗原呈遞細(xì)胞
廠表示腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子bFGF表示堿性成纖維細(xì)胞生長因子
bid (BID)表示“bis in die” (每日 2 次)
07S表示細(xì)胞角蛋白18
表示中樞神經(jīng)系統(tǒng) CXC歡體J表示趨化因子受體配體3 DMEM散示Dulbecco，s極限必需培養(yǎng)基 DMEM:lg、WLDMEM:Lg，DMEMLG)表示帶有低葡萄糖的 DMEM 徹7 表示乙二胺四乙酸 EGF (SJcE)表示表皮生長因子 FACS表示熒光激活細(xì)胞分選術(shù) / 表示胎牛血清
FGF (或F)表示成纖維細(xì)胞生長因子 GCF-J 表示粒細(xì)胞趨化蛋白-2
示膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白 HB-EGF^mm -結(jié)合表皮生長因子 HCAEC表示人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞
表示肝細(xì)胞生長因子 MST表示人間充質(zhì)干細(xì)胞
HNF-I α表示肝細(xì)胞-特異性轉(zhuǎn)錄因子Ια ；表示人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞
1309表示趨化因子和CCR8受體的配體
IGF-I表示胰島素樣生長因子1
7Ζ-6表示白細(xì)胞介素-6 ；TZ-S表示白細(xì)胞介素8
Λ7沒表示角蛋白19 ；M表示角蛋白8
於^表示角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子
ZTF表示白血病抑制因子
MP表示髓鞘堿性蛋白
iCF-7表示單核細(xì)胞趨化蛋白1
表示巨噬細(xì)胞-來源的趨化因子 MIPla表示巨噬細(xì)胞炎性蛋白1 α MIPn表示巨噬細(xì)胞炎性蛋白1 β 表示基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP) 表示間充質(zhì)干細(xì)胞 NHDF表示正常人皮膚成纖維細(xì)胞 NPE表示神經(jīng)祖先擴(kuò)增培養(yǎng)基 04表示少突膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)記04 /^JC表示外周血單核細(xì)胞 / 表示磷酸緩沖鹽水 PDGFbb表示血小板/WS表示外周神經(jīng)系統(tǒng)
Rantes ( iRANTES)表示調(diào)節(jié)活化、正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌
表示重組人生長和分化因子5 SC表示皮下地
SDF-I α表示基質(zhì)衍生因子1 α
表不 sonic hedgehog 5KF表示標(biāo)準(zhǔn)操作程序 7 ^表示胸腺和活化-調(diào)節(jié)的趨化因子
表示組織培養(yǎng)塑料 TCPS表示組織培養(yǎng)聚苯乙烯 TiFAJ 表示轉(zhuǎn)化生長因子β 2 TiFA-J表示轉(zhuǎn)化生長因子β-3 TIMPl表示組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1 TPO表示血小板生成素 71/刀表示BIII微管蛋白防表示血管內(nèi)皮生長因子 rfF 表不 von Willebrand 因子 σ所表示甲胎蛋白。另外，如下列實(shí)施例和說明書中其它處所用的，可根據(jù)美國專利申請?zhí)?10/877，269的公開內(nèi)容對本發(fā)明方法中有用的UTC進(jìn)行分離和表征，所述申請?jiān)谄渖婕?UTC的描述、分離和表征的情況下整體引入作為參考。實(shí)施例1 細(xì)胞的長期神經(jīng)分化
對臍-來源的細(xì)胞經(jīng)歷向神經(jīng)譜系細(xì)胞長期分化的能力進(jìn)行了評價(jià)。如實(shí)施例13-15 中描述地對UTC進(jìn)行分離和擴(kuò)增。將先前在生長培養(yǎng)基中生長的UTC(臍(02280 Pll ； (042203)P11 ； (071003) P12)的冷凍等分試樣解凍并以5，000細(xì)胞/cm2鋪平板在T-75瓶中，所述瓶包被以含有B27 (B27補(bǔ)充物，InVitr0gen)、L-谷氨酰胺G mM)和青霉素/鏈霉素(10毫升)的神經(jīng)基礎(chǔ)-A 培養(yǎng)基 Gnvitrogen, Carlsbad, Ca.)中的層粘連蛋白(BD, Franklin Lakes, N.J·)，其組合在本文中稱為神經(jīng)祖先擴(kuò)增(NPE)培養(yǎng)基。將NPE培養(yǎng)基進(jìn)一步補(bǔ)充以bFGF QO ng/ ml, Peprotech, Rocky Hill, N. J.)禾口 EGF (20 ng/ml, Peprotech, Rocky Hill, N. J.)， 其在本文中稱為NPE + bFGF + EGF。另外，將成體人皮膚成纖維細(xì)胞(Pll，Cambrex, ffalkersville, MD)和間充質(zhì)干細(xì)胞(P5，Cambrex)解凍并以相同細(xì)胞接種密度在層粘連蛋白-包被的T-75瓶中鋪平板在NPE + bFGF + EGF中。作為進(jìn)一步的對照，將成纖維細(xì)胞、臍和胎盤-來源的細(xì)胞生長在生長培養(yǎng)基中，對所有培養(yǎng)物進(jìn)行指定的時(shí)間段。每周1次將來自所有培養(yǎng)物的培養(yǎng)基替換以新鮮培養(yǎng)基，并觀察細(xì)胞擴(kuò)增。一般地，每一培養(yǎng)物在1個(gè)月時(shí)間段內(nèi)傳代1次，這是因?yàn)樵贜PE + bFGF + EGF中的有限生長。1個(gè)月時(shí)間段后，于室溫將所有瓶用冷4% (w/v)低聚甲醛(Sigma)固定10分鐘。應(yīng)用針對iTuJl (Bill微管蛋白；1:500; Sigma, St. Louis, Mo.)和GFAP(膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白；1:2000; DakoCytomation, Carpinteria, Ca.)的抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)。簡言之，將培養(yǎng)物用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌并將其暴露于含PBS、4% (ν/ν)山羊血清(Chemicon, Temecula, Ca.)和 0. 3% (v/v) Triton (Triton X-IOO ； Sigma)的蛋白封閉溶液中進(jìn)行30分鐘以接近細(xì)胞內(nèi)抗原。然后將在封閉溶液中稀釋的第一抗體應(yīng)用到培養(yǎng)物中，在室溫進(jìn)行1小時(shí)時(shí)間段。然后，除去第一抗體溶液，并在應(yīng)用含有連同山羊抗-小鼠 IgG - Texas Red (1 250,Molecular Probes,Eugene,OR)禾口山羊抗-兔 IgG - Alexa 488 (1:250,Molecular Probes) 一起的封閉的第二抗體溶液(在室溫1小時(shí))之前，將培養(yǎng)物用PBS洗滌。然后洗滌培養(yǎng)物，并應(yīng)用10微摩爾DAPI (Molecular Probes)進(jìn)行10 分鐘以使細(xì)胞核可見。在免疫染色后，使用適當(dāng)?shù)臒晒鉃V光片在Olympus倒置表面熒光顯微鏡 (Olympus, Melville, N. Y.)上顯現(xiàn)熒光。在所有情況下，陽性染色代表高于對照染色的熒光信號，在對照染色中遵循上文概述的整個(gè)程序，除了應(yīng)用第一抗體溶液外。代表性圖像是使用數(shù)字彩色攝影機(jī)和ImagePro軟件(Media Cybernetics, Carlsbad, Ca.)捕獲的。對三重染色的樣品而言，每一張圖像均是使用一次僅一個(gè)發(fā)射濾光片采集的。然后使用Adobe Photoshop軟件(Adobe, San Jose, Ca.)制備分層的蒙太奇。表1-1. 應(yīng)用的第一抗體的概述
權(quán)利要求
1.治療患有神經(jīng)學(xué)損傷的患者的方法，包括以有效治療所述神經(jīng)學(xué)損傷的量給所述患者施用分離的臍帶組織-來源的細(xì)胞，其中所述臍帶組織-來源的細(xì)胞來源于基本上不含血液的人臍帶組織，其中所述細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，并具有分化成至少神經(jīng)表型的細(xì)胞的潛能；并且其中所述細(xì)胞不表達(dá)CD117。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述神經(jīng)學(xué)損傷是腦缺血、急性缺血后再灌注、圍產(chǎn)期缺氧-缺血性損傷、心跳停止、顱內(nèi)出血、顱內(nèi)損害、頸椎挫傷或驚嚇?gòu)雰壕C合征。
3.權(quán)利要求1的方法，其中將所述細(xì)胞基因工程改造以產(chǎn)生促進(jìn)所述神經(jīng)學(xué)損傷治療的基因產(chǎn)物。
4.權(quán)利要求1的方法，其中將所述細(xì)胞連同至少一種其它細(xì)胞類型施用。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述其它細(xì)胞類型是星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)祖先、神經(jīng)干細(xì)胞或其它多能或多潛能干細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1的方法，其中將所述細(xì)胞在所述患者中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)中的預(yù)定位點(diǎn)施用。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述臍帶組織-來源的細(xì)胞不表達(dá)hTERT或端粒酶。
8.權(quán)利要求1的方法，其中將所述細(xì)胞通過注射或輸注施用。
9.刺激患者室下區(qū)(SVZ)的再生能力的方法，包括以有效增加神經(jīng)發(fā)生、血管發(fā)生或突觸發(fā)生的量給所述患者施用分離的臍帶組織-來源的細(xì)胞，其中所述臍帶組織-來源的細(xì)胞來源于基本上不含血液的人臍帶組織，其中所述細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增， 并具有分化成至少神經(jīng)表型的細(xì)胞的潛能；并且其中所述細(xì)胞不表達(dá)CD117。
10.權(quán)利要求9的方法，其中將所述細(xì)胞基因工程改造以產(chǎn)生促進(jìn)所述室下區(qū)的再生能力的基因產(chǎn)物。
11.權(quán)利要求9的方法，其中將所述細(xì)胞連同至少一種其它細(xì)胞類型施用。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述其它細(xì)胞類型是星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)祖先、神經(jīng)干細(xì)胞或其它多能或多潛能干細(xì)胞。
13.權(quán)利要求9的方法，其中將所述細(xì)胞在所述患者中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)中的預(yù)定位點(diǎn)施用。
14.權(quán)利要求9的方法，其中將所述細(xì)胞通過注射或輸注施用。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞需要L-纈氨酸用于生長并且可以在至少約5% 氧中生長。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞表達(dá)⑶10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶90、PDGFr-a和 HLA-A、B、C中的一種或多種。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞表達(dá)⑶10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶90、PDGFr-a和 HLA-A、B、C中的每一種。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞不表達(dá)⑶31、⑶34、⑶45、⑶141和HLA-DR、DP、 DQ中的一種或多種。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞不表達(dá)⑶31、⑶34、⑶45、⑶141和HLA-DR、DP、 DQ中的任一種。
20.權(quán)利要求9的方法，其中所述細(xì)胞需要L-纈氨酸用于生長并且可以在至少約5% 氧中生長。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞表達(dá)⑶10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶90、PDGFr-a和 HLA-A、B、C中的一種或多種。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞表達(dá)⑶10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶90、PDGFr-a和 HLA-A、B、C中的每一種。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞不表達(dá)⑶31、⑶34、⑶45、⑶141和HLA-DR、DP、 DQ中的一種或多種。
24.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞不表達(dá)⑶31、⑶34、⑶45、⑶141和HLA-DR、DP、 DQ中的任一種。
25.用于治療患有神經(jīng)學(xué)損傷的患者的藥物組合物，包含藥學(xué)上可接受的載體和有效治療所述神經(jīng)學(xué)損傷的量的分離的臍帶組織-來源的細(xì)胞，其中所述臍帶組織-來源的細(xì)胞來源于基本上不含血液的人臍帶組織，其中所述細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，并具有分化成至少神經(jīng)表型的細(xì)胞的潛能；并且其中所述細(xì)胞不表達(dá)CD117。
26.權(quán)利要求25的藥物組合物，其中所述細(xì)胞表達(dá)CD10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶90、 PDGFr- α禾口 HLA-A、B、C中的一種或多種。
27.權(quán)利要求25的藥物組合物，其中所述細(xì)胞表達(dá)CD10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶90、 PDGFr- α 禾口 HLA-A、B、C 中的每一種。
28.權(quán)利要求25的藥物組合物，其中所述細(xì)胞不表達(dá)⑶31、⑶34、⑶45、⑶141和 HLA-DR、DP、DQ中的一種或多種。
29.權(quán)利要求25的藥物組合物，其中所述細(xì)胞不表達(dá)⑶31、⑶34、⑶45、⑶141和 HLA-DR、DP、DQ 中的任一種。
30.用于治療患有神經(jīng)學(xué)損傷的患者的試劑盒，所述試劑盒包含藥學(xué)上可接受的載體、 分離的臍帶組織-來源的細(xì)胞的群和在治療所述患者的方法中應(yīng)用所述試劑盒的說明書， 其中所述臍帶組織-來源的細(xì)胞來源于基本上不含血液的人臍帶組織，其中所述細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，并具有分化成至少神經(jīng)表型的細(xì)胞的潛能；并且其中所述細(xì)胞不表達(dá)CD117。
31.權(quán)利要求30的試劑盒，其還包含至少一種其它細(xì)胞類型的群。
32.權(quán)利要求30的試劑盒，其中所述細(xì)胞表達(dá)⑶10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶90、PDGFr-a 和HLA-A、B、C中的一種或多種。
33.權(quán)利要求30的試劑盒，其中所述細(xì)胞表達(dá)⑶10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶90、PDGFr-a 和HLA-A、B、C中的每一種。
34.權(quán)利要求30的試劑盒，其中所述不表達(dá)CD31、CD;34、CD45、CD141和HLA_DR、DP、DQ 中的一種或多種。
35.權(quán)利要求30的試劑盒，其中所述細(xì)胞不表達(dá)⑶31、⑶34、⑶45、⑶141和HLA-DR、 DP、DQ中的任一種。
全文摘要
公開了用于在損傷后再生或修復(fù)神經(jīng)組織、減少凋亡和改進(jìn)神經(jīng)學(xué)功能的方法、藥物組合物和試劑盒。
文檔編號A61P25/00GK102458425SQ200980157008
公開日2012年5月16日 申請日期2009年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者戈謝夫斯卡 A., 賽達(dá) A. 申請人:伊西康公司