專利名稱：通過活化富血小板血漿(prp)誘導組織再生的組合物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過用氯化鈣溶液和I型膠原活化富血小板血漿(PRP)誘導組織再生的組合物，以及制備該組合物的方法。更具體地，在本發(fā)明中，所述組合物可以具有含富血小板血漿(PRP)的凝膠型結構(gel-type of formation)，并且可被移植到任何需要組織再生的病區(qū)(lesion)，例如骨缺損治療和傷口愈合(wound healing)，因此，富血小板血漿(PRP)可被活化以誘導來自富血小板血漿(PRP)凝膠的對組織再生有益的生長因子 (growth factor)，從而方便快捷的實現有效的組織再生。所以，所述方法在大大提高將富血小板血漿(PRP)應用到病區(qū)的可靠性并使消費者呈現良好形象方面是極其有用的。
背景技術：
眾所周知，富血小板血漿(PRP)是通過密度梯度離心法從全血中分離出來的自體材料(autologous material)，是相對于少量的血漿濃縮含有大量血小板的無活性物質，并且含有高濃度的白細胞。血管中無活性的血小板循環(huán)通過血管時保持圓形。已知血小板的生命周期大約為 10天，且相對于ImL的血液，含量大約是2-4X 108。通過血管中含有的物質活化富血小板血漿(PRP)中的血小板，然后釋放生長因子(growth factor)和各種活性物質(active substance)。所述活性物質包括膠原、凝血酶、腺苷二磷酸(ADP)以及腎上腺素。特別地，膠原和凝血酶被認為是強力激動劑(strong agonist)。如

圖1所示，已知膠原通過將其特定序列粘合至血小板上來誘導血小板的活化。當活化因子活化血小板時，所述血小板由于其α顆粒(alpha granules)的脫顆粒作用(degranulation)而釋放生長因子(growth factor)。所述因子在傷口愈合(wound healing)初期扮演著重要角色。在此，釋放的生長因子(growth factor)包括血小板衍生生長因子(PDGF-AB)、轉化生長因子-bl(TGF-bl)、血管內皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、類胰島素生長因子(IGF)等。而且，在體外條件下，富血小板血漿(PRP)釋放細胞因子等，由此合成成纖維細胞的DNA。這增加了膠原的產量，從而促使形成膠原結構。但是，在應用時富血小板血漿(PRP)呈液態(tài)，因此很難將所述富血小板血漿(PRP) 注射到傷口中，并且會存在周圍組織流失(loss of surrounding tissues)的問題。因此， 需要開發(fā)伴隨有物理性能的凝塊凝膠化(clottinggelation)。至于凝膠化，近期主要進行了關于使用凝血酶的研究。然而，有報道，在使用凝血酶(主要取自牛(bovine-derived))， 也就是取自動物的蛋白時，觀察到了免疫反應如狼瘡(lupus)。換言之，凝血酶被認為是具有與抗體有關的臨床問題的因子。凝血酶是血小板活化劑中最有效的成分。然而，在使用凝血酶時，還需要凝血酶的抗體、凝血酶原、凝血因子V(fact0r V)以及心磷脂。同時，通過動物研究，發(fā)現存在一些臨床問題，如術后出血和自身免疫綜合征。雖然這些問題很少發(fā)生， 但在研發(fā)過程中不能忽略。凝血酶的使用可能導致受損傷口的擴散、異常的凝膠強度等問題。
此外，由于凝血酶-活化凝膠的高收縮性，使在填充傷口空間的外科手術過程中存在困難。因此，認識到了凝血酶替代材料的重要性。膠原是剛性纖維狀蛋白(rigid fibrous protein)，是哺乳動物結締組織中的主要蛋白成分。它構成了蛋白總量的30%以上。膠原賦予組織外形、強度和彈性(shape， strength and flexibility)，并具有各種功能如組織支架(tissue scaffolding)、細胞粘合、細胞遷移、血管生成(blood vessel production)、組織形態(tài)生成、組織修復等。作為血小板強力激動劑(strong agonist)的膠原活化血小板，并引起血小板聚集(platelet aggregation)。纖維狀的膠原(fibrillar collagen)比可溶性的膠原(soluble collagen) 更強烈的誘導血小板聚集(platelet aggregation)并支持(supporting)更強烈的血小板粘附(platelet adhesion)。雖然產生這種差異的原因還沒有被證實，據設想，存在纖維狀的膠原(fibrillar collagen)與促進活化血小板作用的分子結合的可能性。I型膠原構成哺乳動物結締組織的大部分。同時，作為天然支架(scaffold)，對I 型膠原在再生醫(yī)學和組織工程學領域的研究最為活躍。由于具有這些優(yōu)點，I型膠原通過替代凝血酶扮演著活化血小板的角色，并能保持外形。然而，目前還沒有通過用氯化鈣溶液和I型膠原活化富血小板血漿(PRP Platelet rich plasma)誘導組織再生的組合物。換言之，目前還沒有很好的凝血酶的替代品。因此，盡管存在很多問題，也只采用凝血酶(主要取自牛)，也就是取自動物的蛋白。

發(fā)明內容
因此，鑒于上述問題進行本發(fā)明，并提供通過活化富血小板血漿(PRP)誘導組織再生的組合物及其制備方法。本發(fā)明達到下列目的。第一，當富血小板血漿(PRP)與取自動物的蛋白，也就是凝血酶(主要取自牛)一起使用時，會引起免疫反應和臨床問題，為了改善所述免疫反應和臨床問題，采用I型膠原。第二，為了骨缺損治療或傷口愈合(wound healing)，收集少量的全血，然后從全血中分離富血小板血漿(PRP)并與I型膠原混合注射。換言之，采用作為自體材料和很少引起免疫反應的去端肽膠原(atelocollagen)的富血小板血漿(PRP)，以消除臨床排異(clinical rejection) 0第三，能夠方便快捷地從外科手術部位分離富血小板血漿(PRP)，并將其與氯化鈣溶液和I型膠原混合注射，這樣能夠使嚴重受傷的病人或遭受反復手術的病人獲得有效的組織再生。第四，當根據本發(fā)明收集的富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液和I型膠原混合應用于需要組織再生的部位時，I型膠原活化富血小板血漿(PRP)，誘導來自富血小板血漿(PRP)凝膠(gel)對組織再生有益的生長因子(growth factor)。這樣能夠方便快捷的獲得有效的組織再生。特別地，第五，與以凝血酶作為激動劑和富血小板血漿(PRP)的凝塊(clotting)相比，以I型膠原作為激動劑和富血小板血漿(PRP)的凝塊(clotting)能夠釋放相似或更大量的生長因子(growth factor)(根據生長因子(growth factor)的種類)。這誘導了更有效的組織再生。此外，第六，根據本發(fā)明收集的富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液和I型膠原混合注射到需要骨缺損治療或傷口愈合(wound healing)的所有部位，從而獲得有效的組織再生。最后，第七， 因此，本發(fā)明大大提高了將富血小板血漿(PRP)應用到病區(qū)的可靠性并使消費者呈現良好的形象。根據本發(fā)明的一方面，提供一種通過活化富血小板血漿(PRP)誘導組織再生的組合物的制備方法，該方法包括下列步驟從全血中分離富血小板血漿(PRP)；將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液混合；并將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液的混合物與 I型膠原混合。根據本發(fā)明的另一方面，提供一種通過活化富血小板血漿(PRP)誘導組織再生的組合物，該組合物通過上述方法制備。如上所詳述，當富血小板血漿(PRP)與取自動物的蛋白，也就是凝血酶(主要取自牛)一起使用時，會引起免疫反應和臨床問題，在本發(fā)明中，為了改善所述免疫反應和臨床問題，采用I型膠原。根據上述本發(fā)明的技術方案，為了骨缺損治療或傷口愈合(wound healing)，收集少量的全血，然后從所述全血中分離富血小板血漿(PRP)并與I型膠原混合注射。換言之， 采用作為自體材料和很少引起免疫反應的去端肽膠原的富血小板血漿(PRP)，以消除臨床排異。而且，在本發(fā)明中，能夠方便快捷地從外科手術部位分離富血小板血漿(PRP)，并將其與氯化鈣溶液和I型膠原混合注射，這樣能夠使嚴重受傷的病人或遭受反復手術的病人獲得有效的組織再生。而且，當根據本發(fā)明收集的富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液和I型膠原混合應用于需要組織再生的部位時，I型膠原活化富血小板血漿(PRP)，誘導來自于富血小板血漿 (PRP)凝膠對組織再生有益的生長因子(growth factor)。這樣能夠方便快捷的獲得有效的組織再生。特別地，在本發(fā)明中，與以凝血酶作為激動劑和富血小板血漿(PRP)的凝塊 (clotting)相比，以I型膠原作為激動劑和富血小板血漿(PRP)的凝塊(clotting)能夠釋放相似或更大量的生長因子(growth factor)(根據生長因子(growth factor)的種類)。 這誘導了更有效的組織再生。此外，將根據本發(fā)明收集的富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液和I型膠原混合注射到需要骨缺損治療或傷口愈合(mnmd healing)的所有部位，從而獲得有效的組織再生。最后，因此，本發(fā)明大大提高了將富血小板血漿(PRP)應用到病區(qū)的可靠性并使消費者呈現良好的形象。
以下結合附圖的詳細說明，將使本發(fā)明的上述和其他目的、特征、優(yōu)點變得更加明顯。圖1是通過血小板和內皮下蛋白(Subendothelial proteins)間的相互作用 (interaction)連續(xù)發(fā)生吸附和活化并進行聚集(aggregation)的模示圖；圖2是ImL從全血中分離的富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液和I型膠原的混合物的照片，在圖2(a)中，所述氯化鈣溶液的含量為0.25mg/mL，在圖2(b)中，所述氯化鈣溶液的含量為0. ;3mg/mL，在圖2(c)中，所述氯化鈣溶液的含量為0. 5mg/mL ；以及圖3是常規(guī)凝血酶混合物㈧和本發(fā)明I型膠原混合物⑶培養(yǎng)物的照片。
具體實施方式
下文中，將參照附圖更具體地描述用于實現上述效果的根據本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。根據本發(fā)明，如圖2和3所示的，獲得(configured)通過活化富血小板血漿(PRP) 誘導組織再生的組合物及其制備方法。以下對本發(fā)明的描述中，當確定詳細描述已知功能或結構會使本發(fā)明的主題不清楚時，那么將省略引入本文的已知功能或結構的詳細描述。另外，本發(fā)明中，下文描述的術語是鑒于其功能而設置的，是可以根據操作者的意圖或常規(guī)用途而變化的。因此，應根據本說明書的描述確定其定義。首先，在本發(fā)明中，通過活化富血小板血漿(PRP=Platelet rich plasma)誘導組織再生的組合物通過下列步驟制備從全血中分離富血小板血漿(PRP)；將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液混合；并將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液的混合物與I 型膠原混合。同時，在本發(fā)明中，所述組合物可有多種應用，并可以多種形式制得。而且，應當理解的是本發(fā)明并不限于詳細描述中提到的具體實施方式
，且包括在本發(fā)明所附權利要求的精神和范圍內的修改、添加和替換。在下文中，將對制備如上獲得的通過活化富血小板血漿(PRP)誘導組織再生的組合物的發(fā)明方法的實施效果進行描述。首先，本發(fā)明方法包括從全血中分離富血小板血漿(PRP =Platelet rich plasma) 的步驟。此處，從全血中分離富血小板血漿(PRP)的步驟包括下列步驟收集IOmL動物或病人的全血放入含3. 2%檸檬酸鈉(Sodium citrate)的真空試管中，并先離心所述全 (1750-1900g)3-5 分鐘。然后，經過離心，收集含有血沉棕黃層(軟膜Buffy coat)的上層清液(血漿層)。將收集的含有血沉棕黃層(軟膜Buffy coat)的上層清液(血漿層)通過鈍針 (blunt needle)轉移到新的真空試管中，并再次進行離心(4500_5000g) 4-6分鐘。然后，通過鈍針(blunt needle)收集濃縮于底層(從試管底部到約為ImL的高度)的富血小板血漿(PRP)。此外，本發(fā)明方法包括將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液混合的步驟。此處，將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液混合的步驟中，通過三相連接器 (Connecta)將大約ImL從全血分離富血小板血漿(PRP)步驟中收集的富血小板血漿(PRP) 與濃度為0. 30-0. 55mg/mL的氯化鈣溶液進行一次混合。另外，本發(fā)明方法包括將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液的混合物與I型膠原混合的步驟，由此來制備通過活化富血小板血漿(PRP)誘導組織再生的組合物。此處，將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液的混合物與I型膠原混合的步驟包括將所述I型膠原放置在室溫下的步驟。然后，通過三相連接器(Cormecta)連接將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液的混合物與濃度為20-50mg/mL的不透明的I型膠原混合四次。接下來，將用注射器收取的所述富血小板血漿(PRP)和I型膠原的混合物注射到需要組織再生的所有部位，例如骨缺損治療和傷口愈合(wound healing)。所述I型膠原優(yōu)選具有20-50mg/mL的濃度。此外，所述I型膠原優(yōu)選在室溫下放置15-30分鐘。下面將對本發(fā)明的實施例進行描述。[實施例1]首先，準備用于富血小板血漿(PRP)分離的試劑盒如下。1)含有3. 2%檸檬酸鈉的真空試管2)真空試管夾3)真空試管針4)真空試管(普通型)5) 3mL 注射器6)鈍針(Blunt needle)從上述工具可以推導出富血小板血漿(PRP)的分離方法。首先，1)收集IOmL病人的全血放入含有3. 2%檸檬酸鈉的真空試管中。2)將真空試管中收取的全血離心(1750-1900g)3-5分鐘。此處，將離心機的重力加速度和時間設置成將全血分離為血細胞、血沉棕黃層(軟膜=Buffy coat)和血漿的最適狀態(tài)。3)在打開所述真空試管的蓋之后，用帶有鈍針(Blunt needle)的注射器收集含有血沉棕黃層(軟膜Buffy coat)的上層清液(血漿層)并轉移到新的真空試管(普通型)中。4)將轉移到新真空試管的含有血沉棕黃層(軟膜Buffy coat)的血漿離心 (4500-5000g) 4-6分鐘。此處，將離心機的重力加速度和時間設置成使血漿中的富血小板血漿(PRP)濃縮的最適狀態(tài)。5)在打開所述真空試管的蓋之后，用帶有鈍針(Blunt needle)的注射器收集濃縮于試管底層(從試管底部到約為ImL的高度)的富血小板血漿(PRP)。6)為了確定從IOmL全血中分離ImL血小板的分離效率，使血小板(Platelet)特異性表面標識(Surface maker)(即CD41)和白細胞(Leukocyte)特異性表面標識(Surface maker)(即CD45)進行反應。然后，用流式細胞計數儀(Flow cytometry)測量特定細胞 (expressing cells)的數量。結果，分離的富血小板血漿(PRP)中血小板(Platelet)的數量比基準(Baselines)高5. 8_7. 6倍。在臨床所需建議中，每6mL體積的全血中需要的數量比基準高4. 0-6. 0倍(約1000000個血小板/mL)。因此，所述富血小板血漿(PRP)的分離方法滿足了所述建議。另外，白細胞的數量比基準高2. 8-4. 2倍。因此，在應用所述富血小板血漿(PRP)時，預期能獲得抗病毒(antiviral effect)的效果。另外，如下表所示，將全血離心(第1次1750_1900g，3-5分鐘；第2次 4500-5000g, 4-6分鐘)兩次以分離出ImL的富血小板血漿(PRP)。然后，使血小板 (Platelet)特異性表面標識(Surface maker)(即CD41)和白細胞(Leukocyte)特異性表面標識(Surface maker)(即CD45)進行反應。然后，用流式細胞計數儀(Flow cytometry) 測量特定細胞的數量。結果，分離的富血小板血漿(PRP)中血小板(Platelet)的數量比基準(Baselines)高5. 8-7. 6倍，且白細胞的數量比基準高2. 8-4. 2倍。
表 權利要求
1.一種通過活化富血小板血漿(PRP =Platelet rich plasma)誘導組織再生的組合物的制備方法，該方法包括以下步驟從全血中分離富血小板血漿(PRP)；將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液混合；并且將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液的混合物與I型膠原混合。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述從全血中分離富血小板血漿(PRP)的步驟包括下列步驟收集IOmL動物或病人的全血放入含3. 2%檸檬酸鈉(Sodium citrate)的真空試管中， 并先離心收集的全血(1750-1900g)3-5分鐘；經過所述離心，收集含有血沉棕黃層(軟膜Buffy coat)的上層清液(血漿層)；將收集的含有血沉棕黃層(軟膜Buffy coat)的上層清液(血漿層)通過鈍針(Blunt needle)轉移到新的真空試管中，并再次進行離心(4500_5000g) 4_6分鐘；然后通過鈍針(Blunt needle)收集濃縮于底層(從試管底部到約為ImL的高度)的富血小板血漿(PRP)。
3.根據權利要求1所述的方法，其中，所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液混合的步驟中，通過三相連接器(Cormecta)將大約ImL從全血分離富血小板血漿(PRP)步驟中收集的富血小板血漿(PRP)與濃度為0. 30-0. 55mg/mL的氯化鈣溶液進行一次混合。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液的混合物與I型膠原混合的步驟包括下列步驟將所述I型膠原放置在室溫下；通過三相連接器(Cormecta)連接將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液的混合物與濃度為20-50mg/mL不透明狀態(tài)的I型膠原混合四次；接下來將用注射器收取的所述富血小板血漿(PRP)和I型膠原的混合物注射到需要組織再生的所有部位，例如骨缺損治療和傷口愈合(wound healing)。
5.根據權利要求4所述的方法，其中，所述I型膠原具有20-50mg/mL的濃度。
6.根據權利要求4所述的方法，其中，所述I型膠原在室溫下放置15-30分鐘。
7.一種通過活化富血小板血漿(PRP)誘導組織再生的組合物，其特征在于，該組合物通過權利要求1所述的方法制備。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過用氯化鈣溶液和Ⅰ型膠原的活化富血小板血漿(PRP)誘導組織再生的組合物及其制備方法。該方法包括以下步驟從全血中分離富血小板血漿(PRPPlatelet rich plasma)(下文稱作為“PRP”)；將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液混合；并將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液的混合物與Ⅰ型膠原混合。本發(fā)明公開的組合物可以具有含富血小板血漿(PRP)的凝膠型結構，并且可被移植到任何需要組織再生的病區(qū)，例如骨缺損的治療和傷口愈合(wound healing)，因此，富血小板血漿(PRP)可被活化以誘導來自富血小板血漿(PRP)凝膠中的對組織再生有益的生長因子(growth factor)，從而方便快捷的實現有效的組織再生。所以，本發(fā)明公開的方法在大大提高將富血小板血漿(PRP)應用到病區(qū)的可靠性并使消費者呈現良好形象方面是極其有用的。
文檔編號A61F2/00GK102573943SQ200980162094
公開日2012年7月11日 申請日期2009年11月17日 優(yōu)先權日2009年10月23日
發(fā)明者張在德, 張晶皓, 樸株姬, 樸炫信, 李賽春, 柳志喆, 金勛, 金壯勛 申請人:世元世龍技術株式會社