專利名稱：用于軟骨組織修復(fù)的組合物及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于軟骨組織修復(fù)的組合物及其制造方法，更具體地，混合生物材料如膠原蛋白和纖維蛋白，以對受損軟骨組織進(jìn)行修復(fù)，從而達(dá)到允許在組織上進(jìn)行移植的狀態(tài)，并且誘導(dǎo)有效的再生。因此在誘導(dǎo)相對快速而有效的軟骨修復(fù)和再生的同時，使得減少人和動物的手術(shù)相關(guān)的壓力成為可能，并且，結(jié)果是，能夠大大地提高產(chǎn)品的質(zhì)量和可信度，并給患者留下好印象。
背景技術(shù)：
在很多關(guān)節(jié)的表面上發(fā)現(xiàn)的關(guān)節(jié)軟骨，是一種非常光滑并且光亮的材料，它們的功能是減少關(guān)節(jié)運(yùn)動過程中的關(guān)節(jié)摩擦和磨損。當(dāng)關(guān)節(jié)軟骨受到損傷時關(guān)節(jié)軟骨間的摩擦就增加了，關(guān)節(jié)軟骨將受到磨損和侵蝕，并且會發(fā)生疼痛和功能失調(diào)，而且關(guān)節(jié)的軟骨損傷會轉(zhuǎn)變成骨關(guān)節(jié)炎。關(guān)節(jié)損傷的原因是外傷如跌倒、直擊或者扭傷，或者疾病如關(guān)節(jié)炎、骨壞死、炎癥性關(guān)節(jié)炎或者剝脫性骨軟骨炎，其癥狀是疼痛、浮腫和具有傳染性。近幾十年來開展了很多關(guān)于關(guān)節(jié)軟骨的生理性再生的研究，來治療關(guān)節(jié)軟骨損傷，并且有一些治療方法已經(jīng)應(yīng)用。然而，據(jù)報道，直到現(xiàn)在，由于關(guān)節(jié)軟骨組織不能再生，對于關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療使用常規(guī)的治療例如物理治療或者藥物治療。使用手術(shù)或者非手術(shù)治療。冷熱敷和藥物如NSAID，和類固醇的關(guān)節(jié)內(nèi)注射是非手術(shù)治療的例子，僅能減輕癥狀但是不能削弱疾病。補(bǔ)償性過程如擴(kuò)創(chuàng)(debriment)、微觀斷裂、鉆孔/磨損關(guān)節(jié)成形術(shù)，自體骨軟骨移植 (autologous osteochondroal and transplantation)，軟骨細(xì)胞移植和關(guān)節(jié)軟骨替換是手術(shù)治療。最近，有一些手術(shù)治療的嘗試，那就是，將生物材料施用到軟骨受損區(qū)域。生物材料和人的身體相合，不會顯示任何的排斥。這些生物材料能夠代替受損組織和器官或者使其再生，成為正常的組織和器官。因此，增加了對于這些能夠用來代替或者再生受損組織和器官的生物材料的關(guān)注。人的身體排斥身體內(nèi)的外來物質(zhì)。因此，用其他材料來代替一部分人體器官是很難的。由于生物材料和人的身體有生物親和性所以能夠用于醫(yī)療手術(shù)過程。有兩種類型的生物材料，合成的和天然的生物材料，可以用于生產(chǎn)診斷用途和治療用途的植入式醫(yī)療設(shè)備。金屬、無機(jī)材料、陶制品、合成聚合物屬于合成生物材料，沒有顯示排斥但是也沒有活性。天然的生物材料如纖維蛋白、膠原蛋白、透明質(zhì)酸和殼聚糖是經(jīng)過研發(fā)并且商品化的材料。組成人體和支撐生命的物質(zhì)是生物聚合物和細(xì)胞。人體中發(fā)現(xiàn)的多糖和蛋白是代表性的例子。如果他們沒有免疫排斥反應(yīng)，他們將會處于類似于天然的狀態(tài)，并被期望用于具有生長功能的人體器官的再生。天然組織能夠用作醫(yī)療生物材料，其賦予無機(jī)和合成的聚合物材料以生物功能。天然組織可以構(gòu)建周圍組織和移植到人體內(nèi)的無機(jī)生物材料間的生物適應(yīng)性，并且進(jìn)一步，天然組織能夠賦予無機(jī)生物材料以生物功能。生物相合的和生物降解的纖維蛋白能夠用作天然的粘合劑和抗出血劑。纖維蛋白在傷口愈合過程中在幾周內(nèi)被吸收。據(jù)報道，纖維蛋白沒有諸如炎癥、免疫應(yīng)答、實(shí)質(zhì)性壞死和纖維增生等副作用。具有成纖維細(xì)胞的天然支持者構(gòu)造的纖維蛋白在傷口愈合中有重要作用。纖維蛋白產(chǎn)品的構(gòu)想在20世紀(jì)70年代提出，在1982年歐洲銷售了首批工業(yè)化的纖維蛋白產(chǎn)品，并且一直銷售至今。最近的研究證明纖維蛋白可以用作組織工程的支撐者， 在一些醫(yī)療領(lǐng)域如整形外科、牙科、和神經(jīng)外科進(jìn)行了最優(yōu)化。膠原蛋白是一組蛋白，在真皮層、肌鍵/韌帶、血管、骨頭和軟骨上被發(fā)現(xiàn)。哺乳動物總蛋白的1/3是膠原蛋白。目前已經(jīng)報道了超過20種不同類型的膠原蛋白，其中，在皮膚，肌腱/韌帶和骨頭中發(fā)現(xiàn)的I型的膠原蛋白的數(shù)量大約為總膠原蛋白數(shù)量的90%。膠原蛋白由三倍螺旋結(jié)構(gòu)組成，其分子量為300，000道爾頓(每個螺旋為100，000 道爾頓)。最小的氨基酸甘氨酸在膠原蛋白分子的每個第三位上(_GXY-;X和Y是任何的氨基酸)被發(fā)現(xiàn)。因此，膠原蛋白中的甘氨酸總量為氨基酸總量的三分之一。膠原蛋白有羥脯氨酸，并且羥脯氨酸的含量為氨基酸總量的10%。羥脯氨酸可以用于膠原蛋白的定量分析。膠原蛋白已經(jīng)在一些醫(yī)藥領(lǐng)域中使用，如用作止血劑、創(chuàng)傷敷料，人造血管和改善皮膚褶皺的試劑。第一個膠原蛋白止血藥Aviten是在1974年研發(fā)出來的，是從牛皮膚中提取出的粉末，一直延用至今。將膠原蛋白作為原料使用有三種途徑。使用純膠原蛋白、通過組織的脫細(xì)胞/去細(xì)胞過程處理得到的處理的膠原蛋白和變構(gòu)膠原蛋白。純膠原蛋白抗張強(qiáng)度小，因此盡管它有很高的穩(wěn)定性和純度，但是不推薦用于縫合。膠原蛋白比其他的聚合物的抗張強(qiáng)度和抗扯強(qiáng)度低，因此將其他材料如GAG或者生物適合的合成聚合物(PGA/PLA)加入到膠原蛋白中來提高他們的強(qiáng)度。膠原蛋白有很多優(yōu)點(diǎn)，如低抗原性、高生物適應(yīng)性和生物吸收性、細(xì)胞的粘附性、 細(xì)胞生長、細(xì)胞誘導(dǎo)分化、血液凝結(jié)、止血作用及與其他聚合物的生物適應(yīng)性。然而，用于維持物理性質(zhì)和體積的特性是差的，并且純膠原蛋白很昂貴。纖維蛋白在量、彈性和粘附性方面有中等性質(zhì)，并且也具有止血作用。因此，纖維蛋白是用于軟骨組織修復(fù)和再生的有效生物材料。不像其他的間質(zhì)組織，關(guān)節(jié)軟骨沒有血管和神經(jīng)組織，其自我愈合能力非常有限。 因此，本發(fā)明的一個目的是提供通過添加用于軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分來用于軟骨組織再生的營養(yǎng)物。關(guān)節(jié)的軟骨組織一旦被破壞，它在體內(nèi)不能正常再生?；颊邘е鴦⊥慈淌苡邢薜娜粘Ｉ?，并且當(dāng)它變成慢性的，將會引起致命的骨關(guān)節(jié)炎，而使得患者不可能正常生活。 在美國和歐洲分別進(jìn)行了超過500，000例的關(guān)節(jié)造型術(shù)和整體的關(guān)節(jié)置換手術(shù)。因此，需要一個用于軟骨受損區(qū)域治療的簡單的程序，所述治療通過使用或者移植生物材料如膠原蛋白和纖維蛋白進(jìn)行。在軟骨損傷的早期，這些軟骨受損區(qū)域的治療方法是非常有效的。并且當(dāng)在軟骨損傷的早期實(shí)行這樣的治療時，需要膝蓋置換手術(shù)的患者的數(shù)量將會減少。通過這種預(yù)防性治療，患骨關(guān)節(jié)炎的患者數(shù)量也會減少。在過去沒有報道，通過使用生物材料如膠原蛋白和纖維蛋白膠來進(jìn)行軟骨組織修復(fù)的組合物和使用它們用于治療的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。本發(fā)明的第一個目的是提供一種由纖維蛋白原和抗蛋白酶肽溶液、凝血酶和一種穩(wěn)定溶液、以及膠原蛋白溶液組成的用于軟骨修復(fù)的組合物。第二個目的是通過一種由生物材料如膠原蛋白和纖維蛋白組成的可移植結(jié)構(gòu)來進(jìn)行受損軟骨組織的有效再生。這種治療減輕了手術(shù)的負(fù)擔(dān)，并誘導(dǎo)了軟骨受損區(qū)域的再生和復(fù)原。第三個目的是這個方法使得軟骨受損區(qū)域的簡單處理成為可能。第四個目的是通過軟骨受損區(qū)域的早期治療降低了需要進(jìn)行關(guān)節(jié)手術(shù)的患者的數(shù)量。第五個目的是通過預(yù)防性治療減少需要進(jìn)行關(guān)節(jié)手術(shù)的患者的數(shù)量。第六個目的是提供一種用于軟骨組織修復(fù)的組合物和制備該組合物的方法，使得提高了質(zhì)量和可信度的產(chǎn)品給患者留下好印象。為了實(shí)現(xiàn)這些目的，本發(fā)明提供了一種制備用于軟骨組織修復(fù)的組合物的方法， 包括步驟(a)在一種抗蛋白酶肽溶液中溶解凍干的纖維蛋白原；(b)在一種穩(wěn)定溶液中溶解凍干的凝血酶；(c)將濃縮的膠原蛋白溶液與凝血酶和所述穩(wěn)定溶液進(jìn)行混合；并將纖維蛋白原溶液(a)放置在雙試劑盒(dual kit)的一邊，并將含有膠原蛋白溶液的溶液(c) 放置在另一邊，然后混合(a)和(c)，然后注射到受損軟骨組織中。本發(fā)明還提供了使用上述方法制備的用于軟骨組織修復(fù)的組合物。如上所述，本發(fā)明提供了一種由纖維蛋白原和抗蛋白酶肽溶液、凝血酶和一種穩(wěn)定溶液、以及膠原蛋白溶液組成的用于軟骨修復(fù)的組合物。本發(fā)明提供了通過由生物材料如膠原蛋白和纖維蛋白原組成的可移植結(jié)構(gòu)來對受損軟骨組織進(jìn)行有效再生的方法，該方法減輕了手術(shù)的負(fù)擔(dān)，誘導(dǎo)了軟骨受損區(qū)域的快速有效的再生和復(fù)原。本發(fā)明提供了治療軟骨受損區(qū)域的簡單方法。本發(fā)明通過對于軟骨受損區(qū)域的早期治療減少了需要進(jìn)行關(guān)節(jié)手術(shù)的患者的數(shù)量。進(jìn)一步地，本發(fā)明通過預(yù)防性治療減少了需要進(jìn)行關(guān)節(jié)手術(shù)的患者的數(shù)量。本發(fā)明提高了產(chǎn)品的質(zhì)量和可信度，給患者留下了好印象。


圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的用于軟骨組織修復(fù)的組合物的生產(chǎn)方法。圖2顯示了含有根據(jù)本發(fā)明的用于軟骨組織修復(fù)的組合物的雙試劑盒的應(yīng)用照片。圖3顯示了將根據(jù)本發(fā)明的用于軟骨組織修復(fù)的組合物應(yīng)用于動物(豬)的軟骨受損區(qū)域的照片。圖4顯示了將根據(jù)本發(fā)明的用于軟骨組織修復(fù)的組合物應(yīng)用于動物(兔子)的軟骨受損區(qū)域的實(shí)驗結(jié)果的視覺觀察的照片。
圖5顯示了將根據(jù)本發(fā)明的用于軟骨組織修復(fù)的組合物應(yīng)用于動物(兔子)的軟骨受損區(qū)域的實(shí)驗結(jié)果的組織病理學(xué)觀察的照片。
具體實(shí)施例方式下文中，將會結(jié)合附圖對本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。圖1-5中顯示了根據(jù)本發(fā)明的用于軟骨組織修復(fù)的組合物和該組合物的制備方法，以及它們的應(yīng)用。當(dāng)關(guān)于相關(guān)已知技術(shù)和技術(shù)構(gòu)造的詳細(xì)說明不必要的干擾了本發(fā)明的主旨時，我們對于該詳細(xì)說明進(jìn)行了省略。并且本發(fā)明中的定義由本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行解釋，這是因為術(shù)語可能通過制造廠商或者消費(fèi)者的意圖進(jìn)行解釋。首先，本發(fā)明提供了使用生物材料如膠原蛋白和纖維蛋白原的固體材料，還提供了為軟骨再生的環(huán)境提供營養(yǎng)的穩(wěn)定溶液的制造方法和應(yīng)用，并且提供了一種用于軟骨組織修復(fù)的組合物，所述組合物通過以下幾個步驟制備。具體地，制備用于軟骨組織修復(fù)的組合物的步驟由以下組成(a)在抗蛋白酶肽溶液中溶解凍干的纖維蛋白原；(b)在一種穩(wěn)定溶液中溶解凍干的凝血酶；(c)將濃縮的膠原蛋白溶液與凝血酶和所述穩(wěn)定溶液進(jìn)行混合；并將纖維蛋白原溶液(a)放置在雙試劑盒的一邊，含有所述膠原蛋白的溶液(C) 放置在另一邊，然后混合(a)和(c)，并注射到受損軟骨組織中。纖維蛋白原的濃度為35-55mg/mL，抗蛋白酶肽的濃度為1，500KIU/mL，凝血酶的濃度為29. 41IU/mL，穩(wěn)定溶液的濃度為0. 65mg/mL，膠原蛋白的濃度為13. 23mg/mL。在穩(wěn)定溶液中含有0. 26mg/mL的氯化鈣。氯化鈣加強(qiáng)的穩(wěn)定溶液是通過將氯化鈣加入到用于軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的DMEM培養(yǎng)基中制備的，并且DMEM培養(yǎng)基含有鹽，氨基酸和維生素。在穩(wěn)定溶液中氯化鈣的終濃度為0. 1-0. 5mg/mL。并且在用于軟骨組織修復(fù)的組合物中氯化鈣的終濃度為2. 78-3. l^iig/mL。濃度小于5mg/mL的膠原蛋白通過0. 22um的過濾裝置滅菌，然后膠原蛋白在無菌操作下濃縮。膠原蛋白的濃度為5-100mg/mL。本發(fā)明中的穩(wěn)定溶液的制備詳細(xì)解釋如下。-將氯化鈣加入到用于軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的DMEM培養(yǎng)基中以制備穩(wěn)定溶液。DMEM培養(yǎng)基含有鹽、氨基酸和維生素。氯化鈣的濃度為0. 2-6mg/mL。-在膠原蛋白和穩(wěn)定溶液中氯化鈣的終濃度為0.1-0. 5mg/mL。-在穩(wěn)定溶液中的氯化鈣的濃度是由凝膠化時間和最大壓力范圍決定。凝膠化時間為3分鐘，最大壓力在ION以上。-穩(wěn)定溶液的最小范圍是用于培養(yǎng)條件的最小范圍，經(jīng)證實(shí)穩(wěn)定溶液中氯化鈣的最大量為0. 5mg/mL。在商業(yè)用纖維蛋白膠中的氯化鈣的終濃度為2. 78-3. 12mg/mL，能對細(xì)胞起作用。
制備濃縮的膠原蛋白采取如下步驟優(yōu)選使用高度濃縮的膠原蛋白。膠原蛋白(5mg/mL以下)通過0. 22um過濾裝置滅菌，然后在無菌操作下濃縮。膠原蛋白的分子量大約為300，000道爾頓，并且膠原蛋白分子長度大約為300nm， 使得當(dāng)膠原蛋白的濃度高于5mg/mL時很難過濾。膠原蛋白濃縮后為5-100mg/mL。膠原蛋白起始濃度為5mg/mL，濃度能夠持續(xù)到100mg/mL(可溶并且可測量的濃度)。膠原蛋白使用透析和滲濾濃縮，或者采用在特定的pH和溫度下進(jìn)行離心的方法濃縮。濃縮后的膠原蛋白置于注射器中備用。膠原蛋白、纖維蛋白原和穩(wěn)定溶液的混合在圖2中顯示。-將纖維蛋白膠產(chǎn)品中含有的凍干的纖維蛋白原溶解在2cc抗蛋白酶肽溶液中， 然后將溶液置于注射器中。-在2cc穩(wěn)定溶液中溶解凍干的凝血酶，然后將該溶液置于0.4cc的注射器中。-濃縮的膠原蛋白(3%，3CC)溶液和凝血酶溶液混合，然后將溶液置于2cc的注射器中。-纖維蛋白原/抗蛋白酶肽溶液和膠原蛋白/凝血酶溶液置于雙試劑盒中，然后應(yīng)用于軟骨受損區(qū)域。-在許多國家中銷售有各種纖維蛋白原(纖維蛋白膠)產(chǎn)品，在韓國使用的產(chǎn)品列于表1。表 權(quán)利要求
1.一種用于軟骨組織修復(fù)的組合物的生產(chǎn)方法，包含以下步驟(a)在抗蛋白酶肽溶液中溶解凍干的纖維蛋白原；(b)在穩(wěn)定溶液中溶解凍干的凝血酶；(c)將濃縮的膠原蛋白溶液與凝血酶和穩(wěn)定溶液進(jìn)行混合；將纖維蛋白原溶液(a)加入到雙試劑盒的一邊，將包含膠原蛋白的溶液(c)加到另一邊，然后混合溶液(a)和(c)，并注入到受損的軟骨組織中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，纖維蛋白原的濃度為35-55mg/L，抗蛋白酶肽溶液的濃度為1，500KIU/mL,凝血酶的濃度為29. 41IU/mL,穩(wěn)定溶液的濃度為0. 65mg/mL,膠原蛋白的濃度為13. 23mg/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述穩(wěn)定溶液進(jìn)一步含有含有0.^mg/niL的氯化鈣的溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述穩(wěn)定溶液通過將氯化鈣加入到用于軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的DMEM培養(yǎng)基中制備得到，而且DMEM培養(yǎng)基含有鹽、氨基酸和維生素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述穩(wěn)定溶液中的氯化鈣的濃度為0.1-0. 5mg/mLo
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，用于軟骨組織修復(fù)的組合物中的氯化鈣的終濃度為 2. 78-3. 12mg/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，濃度小于5mg/mL的膠原蛋白通過使用0.22um的過濾裝置滅菌，然后在無菌操作下濃縮所述膠原蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，濃縮的膠原蛋白的濃度為5-100mg/mL。
9.一種由權(quán)利要求1所述的方法制備的用于軟骨組織修復(fù)的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于軟骨組織修復(fù)的組合物和其制造方法。為了實(shí)現(xiàn)這個目的，本發(fā)明包含如下步驟(a)在抗蛋白酶肽溶液中溶解凍干的纖維蛋白原；(b)在穩(wěn)定溶液中溶解凍干的凝血酶；(c)將濃縮的膠原蛋白溶液與凝血酶和穩(wěn)定溶液進(jìn)行混合；將纖維蛋白原溶液(a)加入到雙試劑盒的一邊，將包含膠原蛋白的溶液(c)加到另一邊，然后混合并注射到受損的軟骨組織中。在本發(fā)明中，組成如上所述，混合生物材料如膠原蛋白和纖維蛋白以使受損軟骨組織修復(fù)到允許在組織上進(jìn)行移植的狀態(tài)，并且誘導(dǎo)了有效的再生，因而在誘導(dǎo)相對快速和有效的軟骨修復(fù)和再生的同時使得減少人和動物的手術(shù)相關(guān)的壓力成為可能，并且，結(jié)果是，能夠大大提高產(chǎn)品質(zhì)量和可信度，給使用它的患者留下好印象。
文檔編號A61L27/24GK102573942SQ200980162095
公開日2012年7月11日 申請日期2009年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月23日
發(fā)明者呂世根, 張在德, 張晶皓, 樸株姬, 樸炫信, 李賽春, 柳志喆, 金炫助, 金碩中 申請人:世元世龍技術(shù)株式會社