專利名稱：可靜脈給藥的肝腫瘤基因治療系統(tǒng)的構建方法及應用的制作方法
可靜脈給藥的肝腫瘤基因治療系統(tǒng)的構建方法及應用本發(fā)明屬于生物技術發(fā)明領域。本發(fā)明描述了一種應用于腫瘤的基因治療的方 法。該基因藥物以血清型8型的腺相關病毒(AAV8)為載體，攜帶了受microRNA靶序列調(diào)控 的殺傷性治療基因。該基因藥物治療肝臟腫瘤的原理是，利用腫瘤細胞的內(nèi)源性microRNA 來調(diào)控由該基因藥物攜帶的殺傷性治療基因(外源基因，如自殺基因TK基因等)的表達， 即利用腫瘤細胞的內(nèi)源性microRNA來調(diào)控外源由AAV8導入的殺傷性治療基因的表達。在 非癌組織和細胞內(nèi)，因內(nèi)源性microRNA調(diào)控，細胞不表達該殺傷性治療基因。當該殺傷性 治療基因為TK基因時，TK基因的表達產(chǎn)物能將與其相對應的化學藥物底物作用成為對肝 癌細胞有殺傷作用的藥物，進而造成肝癌組織、細胞的被殺傷；而非癌組織和非癌細胞因為 不表達該殺傷性治療基因，所以不會被殺傷，從而保護了非癌組織和非癌細胞。這樣，該基 因藥物就可以經(jīng)外周靜脈內(nèi)給藥，該藥物也能靶向性地到達肝臟內(nèi)的肝癌組織、細胞內(nèi)，且 在肝癌組織內(nèi)表達殺傷性治療基因，從而最終達到系統(tǒng)性治療肝癌的作用。背景基因治療是指利用基因分子生物學和細胞學技術，將外源基因轉移到體內(nèi)，通過 導入基因的作用來糾正體內(nèi)某些基因結構變異或表達異常，從而達到治療目的的一種方法。腫瘤的基因治療可利用腫瘤細胞與正常細胞分子水平的差異，高效選擇性殺傷腫 瘤細胞或抑制腫瘤細胞的生長。該方法是腫瘤治療除外科手術、放療、化療外的一種新的治 療模式。肝細胞癌(HCC)是嚴重危害人類生命健康的重大疾病之一。傳統(tǒng)的外科切除和新 興的微創(chuàng)外科處理是目前主要的治療手段。但是腫瘤體積過大與位置不佳、肝功能貯備差 或門脈高壓常常限制了外科治療的適應癥，而術后高復發(fā)率則往往導致成功的手術前功盡 棄。由于供體器官的短缺，肝移植不可能被普遍施行，受益者非常有限。肝癌對化療又不敏 感或容易產(chǎn)生賴藥性。因此，原發(fā)性肝細胞癌(HCC)綜合治療方案仍然需要補充新療法，其 中基因治療是有前途的研究方向。各種抗腫瘤基因，如抗腫瘤血管生成基因、殺傷性治療基因、自殺基因、抑癌基因 和免疫調(diào)節(jié)基因等已被用于肝癌的基因治療，并取得了令人鼓舞的治療效果。但是，目前大 多數(shù)的肝癌基因治療仍然處于實驗階段，有以下幾個關鍵性的問題需要更深入地研究1)腫瘤靶向性的問題目前腫瘤基因治療的發(fā)展方向是提高治療基因對靶細胞 的特異性，尤其是在使用腫瘤殺傷性治療基因的基因療法，要求目的基因選擇性表達在腫 瘤細胞內(nèi)，方能準確地殺傷腫瘤細胞，保護正常組織，減少毒副作用。2)肝臟靶向性的問題靜脈內(nèi)注射是最方便的外源基因導入途徑，但多數(shù)載體具 有廣泛宿主范圍組織或細胞特異性缺乏，難以專一靶向至肝臟；因此，多采用瘤體內(nèi)注射、 經(jīng)肝動脈注射、經(jīng)門靜脈注射等方法，給臨床應用帶來不便，且全身副反應較大。3)治療基因的長期表達和調(diào)控的問題肝癌易于復發(fā)的特性嚴重影響了現(xiàn)有治 療手段對肝癌的療效及預后。因此，肝癌基因治療應以防止復發(fā)(或再生)與轉移為目標， 在綜合治療中發(fā)揮獨特作用。這需要長期表達治療基因，并且最好能進行調(diào)控。
4)機體針對病毒載體免疫反應的問題如人群中存在的病毒衣殼的中和抗體可 能會導致基因治療的失敗。miRNA是一類長度約18 25個核苷酸左右的內(nèi)源性非編碼的單鏈小分子RNA，能 夠通過與靶mRNA的3 ‘ UTR特異性的堿基配對引起靶mRNA的降解或者抑制其翻譯，從而對 基因進行轉錄后表達的調(diào)控。miRNA在進化上高度保守。miRNA由基因組DNA編碼，在RNA聚合酶II的作用下被 轉錄產(chǎn)生。這些miRNA通過RNA誘導的沉默復合體(RNA_inducedsilencing complex,RISC) 靶向到達mRNA，進而產(chǎn)生miRNA阻遏翻譯或引導miRNA對mRNA進行酶切的功能。miRNA具 有轉錄后基因調(diào)控功能，從而控制基因表達及細胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡等。有研究人員 發(fā)現(xiàn)線蟲體內(nèi)的異時性基因lin-4編碼的miRNA與lin-14反義互補。據(jù)估計，脊椎動物 基因組編碼多達1000種不同的miRNA，研究人員推測，這些miRNA可能調(diào)控至少30%的基 因的表達。盡管研究人員目前已在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)超過700多種miRNA，但仍需進一步研究以 了解這些分子的確切的細胞學功能，及其在疾病發(fā)生中所扮演的角色。有研究報道，miRNA 具有腫瘤抑制因子及癌基因的作用。那些在癌癥發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用的miRNA被稱作 oncogenic miRNA，即oncomiR。oncomiR的失調(diào)與基因突變或表觀遺傳變異有關，這些變異 包括缺失突變、擴增突變、點突變及DNA異常甲基化等。Lu等人采用串珠流式細胞miRNA表達譜分析技術對來自人惡性腫瘤組織的miRNA 進行系統(tǒng)表達分析，其中包括結腸癌、肝癌、胰腺癌和胃癌。miRNA表達譜成功對低分化腫瘤 進行了分類。研究揭示了 miRNA表達水平在癌癥診斷中的重要作用[Lu J，Getz G，Miska EA，et al. (2005). Nature. 435，834-838]。Bottoni 等人則采用芯片技術及 RT-PCR 分析了 垂體腺瘤和正常垂體樣本中的全部miRNA，結果發(fā)現(xiàn)miRNA表達水平可以區(qū)分垂體微腺瘤 和垂體巨腺瘤，還有一些miRNA參與細胞增殖與凋亡的過程。miRNA可以作為有效的診斷 標志，提高對垂體腺瘤的分類水平[Bottoni A, Zatelli MC, Ferracin M, et al. (2007). J Cell Physiol. 210,370-377. ]。Lee 等人采用原位 RT-PCR 技術，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn) miR221、 miR301和miR376a的異常表達只在胰腺癌細胞中出現(xiàn)，而沒有在良性胰腺腫瘤及正常間質(zhì) 和導管處出現(xiàn)。miRNA的異常表達可以作為胰腺腫瘤發(fā)生的研究線索，同時也可能為胰腺癌 診斷提供新的生物學標志[Lee EJ, Gusev Y，Jiang J，et al. (2007). Int J Cancer. 120， 1046-1054.]。microRNA在癌癥預后判斷中的作用Takamizawa等人報道指出，let_7miRNA的 表達往往在人肺癌中缺失，而let-7miRNA表達的減少與術后生存期的減短顯著相關。此 外，let-7miRNA在A549肺腺癌細胞株中的過表達可在體外抑制肺癌細胞的生長。他們的 研究結果表明了 let_7miRNA表達水平的改變具有潛在臨床和生物學作用[Takamizawa J， Konishi H,Yanagisawa K, et al. (2004). Cancer Res. 64，3753-3756. ]。Yanaihara 等人的 研究可以區(qū)分肺癌組織和非惡性腫瘤組織的miRNA表達模式。前體miRNA hsa-miR155的 高表達和hSa-let-7a-2的低表達與肺腺癌的低生存率相關。他們的研究表明，miRNA不僅 可以作為肺癌的診斷學標志，還可以作為預后預測的標志[Yanaihara N, Caplen N, Bowman Ε, et al. (2006). CancerCell. 9，189-198]。Roldo 等人則發(fā)現(xiàn)，miR21 在胰腺腫瘤中的過 表達與高Ki67增殖指數(shù)及出現(xiàn)肝轉移高度相關。他們的研究結果表明，miRNA表達水平 的改變與惡性腫瘤的進展狀態(tài)相關[Roldo C，Missiaglia E，Hagan JP, et al. (2006).J ClinOncol. 24,4677-4684.]。此外，Bloomston等人將胰腺癌細胞中的miRNA的表達水 平與正常胰腺和慢性胰腺炎組織細胞的miRNA進行比較，結果發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細胞中miRNA 表達水平與后兩者不同，可以有效區(qū)分開來。miR196a-2的高表達可以用于預測不良預后 [Bloomston M, Frankel WL, Petrocca F, et al. (2007) · JAMA.四7，1901-1908.]。某些miRNA表達狀態(tài)受到癌細胞中表觀遺傳學改變的控制，比如DNA甲基化和組 蛋白修飾。采用染色質(zhì)修飾藥物激活腫瘤抑制性miRNA可以靶向調(diào)節(jié)癌基因，這一策略也 許能在不久的將來成為癌癥的新型治療方法。miRNA可以與基因組學、蛋白質(zhì)組學中的生物 學標志相結合，成為癌癥診斷和判斷預后的參考指標[Cho WC. (2007). Mol Cancer. 6, 25.； Cho WC, Cheng CH. (2007). Expert Rev Proteomics. 4，401-410.]。盡管每個 miRNA 可以 調(diào)控成百個靶向基因，但在癌癥研究中鑒別出miRNA的準確靶點仍然是一大難題。此外， 由于干細胞可以分化發(fā)育成為多種類型的細胞，因而成為研究者們矚目的焦點。已有研究 指出miRNA通路在干細胞分化中起調(diào)控作用，而其機制是否可用于癌癥的預防與治療還需 要進一步石if究[Cho WC. Afuture of cancer prevention and cures :highlights of the Centennial Meeting of theAmerican Association for Cancer Research. (2007). Ann Oncol. ]。miRNA在多種病理過程中的功能的發(fā)現(xiàn)，使得對疾病進行分子水平的診斷和預后 預測成為可能，對于癌癥尤其如此。Andrew Fire和Craig Mello因發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象——雙鏈RNA誘導的基因沉默 而獲2006年度諾貝爾獎。自從在一些生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)相互作用的反義RNA具有調(diào)控功能以 來，轉錄后的基因調(diào)節(jié)便躋身于主要基因調(diào)控機制的行列。miRNA通過堿基互補誘導RNA 干擾路徑，從而抑制靶向mRNA。數(shù)以百計的miRNA的發(fā)現(xiàn)使我們對于RNA干擾現(xiàn)象在生物 醫(yī)學上的意義有了全新的認識。研究者的目光開始集中于利用反義寡核苷酸抑制miRNA功 能，或者采用小干擾RNA類技術研究miRNA?？茖W家們致力于揭開miRNA生物學的神秘面 紗，挖掘其在疾病治療方面的應用潛力。對患者進行的有關oncomiR的大型高通量研究，可 以對癌癥進行新的分類，并對患者預后做出更為準確的預測。miR-122為肝臟特異性表達的microRNA，占已發(fā)現(xiàn)的肝臟所有microRNA表達量 的72%，具有調(diào)節(jié)肝臟脂類代謝的功能。研究表明，與正常肝臟相比約70%的肝細胞癌和 各種肝癌細胞系的miR-122表達明顯下降。由于正常細胞和肝癌細胞miR-122表達的差 異，提示miR-122可以作為肝癌基因治療的很好的靶點。[Lagos-Quintana M，Rauhut R， et al. (2002). “ Identification of tissue-specificmicroRNAs from mouse. " . Curr Bio/12 (9) :735-9οSempere LF,Freemantle S,etal. (2004). " Expression profiling of mammalian microRNAs uncovers a subset ofbrain-expressed microRNAs with possible roles in murine and human neuronaldifferentiation. " . Genome Bio/5 (3) :R13。Esau C,Davis S,et al. (2006). " miR_122regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. " . Cell Metab3(2) :87-98.]miR-133在人類的肌肉組織細胞中特異性地高表達，而在非肌肉組織細胞中的 表達受到抑制。在人類的基因組中，常見三種miR-133亞型，miR-133a-l、miR-133a-2、 miR-133b。這三種miR-133亞型分別被發(fā)現(xiàn)于人的第18、20、6條染色體。[lvey KN, Muth A, Arnold J, et al(March 2008). “ MicroRNA regulation ofcell lineages in mouse and human embryonic stem cells" . Cell Stem Cell 2(3) :219-29.]
TK基因，是單純皰疹病毒(HSV病毒)基因組中的TK基因，是一種“自殺基因”，也 稱藥物敏感基因。此基因與丙氧鳥苷(GCV)可構成一個系統(tǒng)，稱為單純皰疹病毒胸腺嘧啶 激酶/丙氧鳥苷(HSV-TK/GCV)系統(tǒng)。該系統(tǒng)原理是單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶將無毒性 的藥物前體(丙氧鳥苷)轉變?yōu)槎拘晕镔|(zhì)，從而發(fā)揮殺細胞作用。TK作為治療基因，需要 表達成胸腺嘧啶激酶，該酶作用前藥GCV能發(fā)揮治療作用，停用CGV則可以終止治療。這 個系統(tǒng)對肝癌的作用機制即是這種病毒介導的酶與前體藥物治療，這些基因編碼的特異 性酶可以將無毒性的藥物前體轉變?yōu)槎拘晕镔|(zhì)，從而達到治療肝癌的目的。單純皰疹病 毒胸腺嘧啶激酶/丙氧鳥苷(HSV-TK/GCV)系統(tǒng)不僅可以殺死轉染了 HSV-TK基因的肝癌 細胞，還可通過旁觀者效應殺死周圍未轉染的肝癌細胞。停用GCV后，不產(chǎn)生殺傷作用。 [Brown DG, Visse R， et al. (October 1995). “ Crystal structures of the thymidine kinase fromherpes simplex virus type-1 in complex with deoxythymidine and ganciclovir" .Nat. Struct. Biol. 2 (10) :876-81.]CAG啟動子序列中包含了巨細胞病毒的增強子和雞的β-肌動蛋白內(nèi)含 子。該啟動子可使外源基因在肝臟中能長期穩(wěn)定地表達。Bhiratori Y. Kmai F， et al. (1998May) ·，，Gene therapy for hepatic micrometastasis of murine colon carcinoma. ” ； JHepato 1. 28(5) :886-95.]病毒載體的導入途徑包括外周靜脈內(nèi)注射、門靜脈注射、瘤體內(nèi)注射、肝動脈內(nèi)注 射、脾內(nèi)注射、膽管內(nèi)導入等。外周靜脈內(nèi)注射是最有效、方便及具有良好依從性的系統(tǒng)給 藥方式。利用AAV8載體外周靜脈注射易于富集于肝臟，我們設計由外周靜脈給藥途徑將治 療基因導入肝臟。腺相關病毒(AAV)為目前腫瘤基因治療理想的載體之一。主要優(yōu)點包括幾乎不 引起人類疾病、定點整合避免隨機整合造成宿主細胞突變的危險、免疫原性低、能轉導分裂 細胞和非分裂細胞、具有廣泛的趨向性、攜帶的外源基因可長期穩(wěn)定表達。AAV2是最廣泛 使用的載體，可轉染神經(jīng)、肌肉、肝臟、肺以及其他組織，但轉導肝臟的效率較低難以滿足需 要，而新近發(fā)現(xiàn)的AAV8載體靜脈注射易富集于肝臟，其轉導肝臟的效率比AAV2高10 100 倍。此外，與AAV2的人群中抗體陽性率達30 80%相比，人群中抗AAV8抗體陽性率只有 6%，從而極大降低了由于機體針對AAV載體的先存免疫所導致的治療失敗。多個研究報告 證實AAV8是有潛力的高效感染肝臟的基因治療載體。腺相關病毒(adeno-associated virus, AAV)因在腺病毒制品中發(fā)現(xiàn)而得名。腺 伴隨病毒(adeno-associated virus, AAV)是微小病毒科(parvovirus)成員，其基因組為 4682個核苷酸組成的單鏈DNA。AAV是依賴性病毒，需要其它病毒如腺病毒或單純皰疹病 毒，或輔助因素提供輔助功能才能復制。在沒有輔助病毒存在時，AAV感染細胞后其基因組 將整合到細胞染色體中成為潛伏狀態(tài)，而不產(chǎn)生子代病毒。最早分離到的AAV病毒是血清型2型AAV(AAV2)。AAV2基因組長約4. 71Λ，基因 組兩端為長度I^bp的“反向末端重復序列”(ITR)，呈回紋-發(fā)卡結構?；蚪M中有兩個 大開放閱讀框(ORF)，分別編碼r印和cap基因。AAV-2的全長基因組已克隆至大腸桿菌質(zhì) 粒中。其中含有2個各145bp長的倒轉末端重復序列(Inverted terminal repeat, ITR) 它們是AAV基因組的復制起點，并與AAV復制、整合或包裝等功能有關。其基因組其余部分 可分為2個功能區(qū)，r印基因區(qū)和cap基因區(qū)。R印蛋白對于AAV病毒的復制、整合、拯救和包裝都具有重要作用。腺相關病毒(AAV)能以較高滴度感染多種包括人在內(nèi)的哺乳動物細胞或組織 (Kotin, R. M. ， et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2211-2215,1990) (Samulski, R. J.， et al. , EMBO J. 10 :3941_3950，1991)，從而既實現(xiàn)了治療基因的長期穩(wěn)定表達，又降低了 隨機插入帶來的使染色體基因突變的風險。而且，AAV至今未發(fā)現(xiàn)與任何人類疾病相關，也 未發(fā)現(xiàn)任何由于整合而引起的生物性狀的改變，因此安全性明顯好于逆轉錄病毒載體和腺 病毒載體，后者分別于人類的癌癥和呼吸道疾病相關。目前通用的AAV病毒載體都是基于 血清型2，即AAV2，對它的研究已有近30年的歷史。實驗證明重組AAV2(rAAV2)在多種組 織中都是很好的基因轉移載體(Monahan，P and R. Samulski, 2000, Gene Ther. 7 :24-30)， 但隨著其體內(nèi)實驗的增加，rAAV2載體的局限也越來越明顯(Bartlett，J. S.，R. Wilcher, and R. J. Samulski. 2000. J. Virol. 74 :2777-2785. ) (Davidson, B. ， C. Stein, J. Heth, et al. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :3428-3432.) :AAV2 在某些組織中感染效率很高， 而在另一些組織中的感染效率卻很低；另外，人體對AAV的感染會產(chǎn)生中和抗體，在正常人 群中有85%存在針對各種AAV、主要是針對AAV2的抗體。近幾年人們將目光集中在對各 種血清型的AAV病毒載體的組織特異性的研究上，利用AAV各血清型的天然感染特性，可 以獲得對各種組織具有不同轉導效率的AAV病毒載體。(Chao，H.，Y. Liu, J. Rabinowitz, C. Li, R. J. Samulski, et al. 2000. Mol. Ther. 2 :619-623.) (Chiorini, J.，L. Yang, Y. Liu, B.Safer, and R. Kotin. 1999. J. Virol. 73 1309-1319.)(Chiorini, J. A. , B. Zimmermann, L. Yang, R. et al. 1998. Mol. Cell. Biol. 18 :5921-5929.)AAV病毒及基因組結構AAV病毒是一類體積小、無包膜的病毒，內(nèi)含單鏈DNA，其 中正鏈和負鏈的數(shù)量基本相等。AAV病毒屬于微小病毒屬(Parvoviridae)，它的復制需要 輔助病毒的存在。(Kotin，RM. 1994. Hum. Gene Ther. 5 :793-801)目前文獻報道的靈長類 AAV 病毒有六種血清型，分別被命名為 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6。(Baclunann PA, MD. Hoggan, JL. Melnick,1975, Parvoviridae, Intervirology 5 :83-92)(Bantel-Schaal U. , and H. zur Hausen. 1998. Virology 134 :52-63)(Rutledge. EA. , CL.Halbert, and DW. Russell. 1998. J. Virol. 72 :309-319)到目前為止，AAV1、2、3、4、5、6 的全序列都已經(jīng)清 楚,各種血清型基因組的同源性在52-82%之間。(BanteUchaal U. ,and H. zur Hausen. J.Virol. 1999,73:939-947)各種天然血清型AAV病毒的同源性比較文獻報道的靈長類AAV病毒共有六種血清型，分別被命名為血清型1、2、3、4、5、6， 其后，又增加了血清型7、8。其中只有AAV5最初是從人體中分離出來的(Bantel-khaal， and H. zur Hausen. 1984. Virology 134 :52-6 ，其余 5 種血清型的 AAV 病毒都是在 石if究腺病毒時發(fā)現(xiàn)的(Ursula Bantel-Schaal, Hajo Deliusand Harald zur Hausen. J.Virol. 1999,73 :939-947)。到目前為止，全部6種血清型的AAV病毒的全序列都已經(jīng) 清楚，(John Chiorini, Frank Kim, Linda Yang, andRobert Kotin. J. Virol. 1999,73 1309-1319)，除AAV5外，AAV1、2、3、4、6血清型基因組的同源性普遍較高，特別是ITR和R印 區(qū)域，其中Rep在AAV1、2、3、4、6中的同源性高達89-93%，因此AAV1、2、3、4、6血清型之間 R印可以識別來自另一血清型的ITR，并支持其包裝。(Chiorini J,L. Yang, Y. Liu, B. Safer, and M. Kotin. 1997. J. Virol. 71 :6823-6833) (Muramatsu, S. ， H. Mizukami, N. Young, andK. Brown. 1996. Virology 221 :208-217)。而 AAV5 與其它 AAV 血清型的 Rep 的同源性只有 67% (U rsula Bantel-Schaal, Hajo Delius and Harald zurHausen. J. Virol. 1999,73 939-947)(John Chiorini, Frank Kim, Linda Yang, andRobert Kotin. J. Virol. 1999,73 1309-1319)，因此AAV5的R印不能識別其它血清型AAV的ITR。AAV病毒的細胞受體與R印相比，AAV各血清型的Cap的同源性較低，AAVU AAV2、AAV3、AAV5、AAV4、 AAV6的Cap的氨基酸同源性在45 80%之間，其中AAVl與AAV6之間的同源性最高，AAV5 與其它血清型的 Cap 的同源性最低。(UrsulaBanteUchaal，Hajo Delius and Harald zur Hausen. J.Virol. 1999,73 :939-947)。這是各血清型具有不同宿主范圍和細胞特異性 的基礎。AAV病毒的宿主范圍和細胞特異性是由其感染的細胞上相應受體的種類和多少決 定的。目前受體研究較清楚的是AAV2、AAV3、AAV4、AAV5等血清型。AAV2、AAV3血清型的 細胞受體是硫酸肝素糖蛋白O^paran sulfate proteoglycan)，其受體結合位點位于AAV2 的VP3蛋白上。其共受體(corec印tor，功能是幫助AAV病毒進入細胞)是人成纖維生長因 子受體 1 (fibroblast growth factor receptor 1)禾口整合素 ανβ5。 (Qing，K. ，C. Mah, J. Hansen, S.Zhou, V.Dwarki, and A. Srivastava. 1999. Nat. Med. 5 :71-77) (Summerford, C.，J. S. Bartlett,and R. J. Samulski. 1999. Nat. Med. 5 :78-82)。AAV4、AAV5 的細胞受體是 唾液酸(sialic acid) (Walters Rff, Yi SM, Keshavjee S, Brown KE, et al. J Biol Chem 2001，276 :20610-6)，沒有硫酸肝素結合位點，因此AAV5的細胞特異性與AAV2等有很大區(qū) 別，尤其表現(xiàn)在AAV5在動物和人的神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸道上皮的感染效率比AAV2高得多(AAV4 不感染呼吸道上皮)。AAV7和AAV8是美國賓西法尼亞大學James M. Wilson實驗室的高光坪博士首次 報道的(11854-11859_PNAS_S印tember 3，2002_vol. 99_no. 18)。作者在該論文中強調(diào)了 AAV7和AAV8作為載體將在基因治療中具有價值。有趣的是，這兩種病毒的基因和序列并不 是通過傳統(tǒng)的病毒分離方法獲得病毒得到的，而是依據(jù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的各種AAV病毒序列的同 源性設計引物采用PCR方法從恒河猴組織中擴增出來的。AAV7和AAV8的全長序列登錄在 GenBank(accession numbers :AAV7，AF513851 ；and AAV8,AF513852)中。隨著對 AAV2/8 載 體的研究和應用的深入，科學家們發(fā)現(xiàn)AAV2/8載體在肝臟、肌肉、視網(wǎng)膜、神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺 等組織中都具有良好的組織嗜性和轉導效率。尤其是發(fā)現(xiàn)隨著劑量的增大，AAV2/8載體能 夠轉染幾乎100%的肝細胞。AAV8載體的這些特點使得它具有廣泛的應用潛力。發(fā)明_既述本發(fā)明要解決的關鍵問題是提供一種可由外周靜脈給藥的殺傷性治療基因治療 系統(tǒng)用于治療肝細胞癌和肝轉移癌。我們選擇TK基因作為其中一種備選的治療基因，其表達產(chǎn)物胸腺嘧啶激酶聯(lián)合 丙氧鳥苷可以殺死轉染了 TK基因的腫瘤細胞。通過停用GCV，可以停止基因治療，從而達到 有效控制基因治療。本發(fā)明中，利用了細胞中相對應的內(nèi)源性miRNAGn :miR-122、miR-133)可以與導 入DNA的mirT (如miR-122T、miR-133T)結合，即與導入的AAV8中的mirT結合。MmirT 又進一步調(diào)節(jié)TK基因的表達。發(fā)明詳述
8中，利用了細胞中相對應的內(nèi)源性miRNAGn :miR-122、miR-133)可以與導 入DNA中所編碼的mirT (如miR-122T、miR_133T)結合，即與導入的AAV8中的mirT結合。 而mirT又與miRNA相互作用，進一步調(diào)節(jié)TK基因(及其他殺傷性治療基因)的表達。TK 基因的表達產(chǎn)物胸腺嘧啶激酶將無毒性的前體藥物丙氧鳥苷(GCV)轉化為對細胞有毒性 的藥物，進而可以殺死轉染了 TK基因的腫瘤細胞。通過停用GCV，可以停止基因治療，從而 達到有效控制基因治療。為了解決可由外周靜脈系統(tǒng)給藥、對肝細胞癌和肝轉移癌的靶向 性治療，我們還使用了系統(tǒng)給藥時主要感染肝臟的AAV8，并在AAV8所包裝的治療基因表達 單元中使用CAG啟動子。具體詳述如下。肝臟和肝癌導向性和特異性主要通過AAV8載體層面和miR調(diào)節(jié)層面等2個層面 來設計解決。在肝癌組織與非肝癌組織、肌肉組織等選擇性表達TK基因的層面上，我們設 計了導入DNA的mirT (如miR-122T、miR_133T)。為了能在肝癌組織里高表達TK基因，我 們使用CAG啟動子，該啟動子能解決CMV啟動子在肝癌組織里產(chǎn)生基因沉默的問題。為解決特異性殺傷腫瘤而避免肝毒性的問題，我們利用肝細胞癌和肝臟轉移癌低 表達或不表達miR-122，而正常肝細胞高表達miR-122的特點，通過在TK基因的3’ UTR引 入miR-122的靶序列(mirT)。正常肝臟高表達的miR-122與miR-122的靶序列特異性結 合，即正常肝細胞中的miR-122將會與位于TK基因的3’UTR的miR-122的靶序列特異性結 合，從而抑制自殺基因(TK基因)的表達，這樣就可以避免正常肝細胞被殺傷。而在肝細胞 癌和肝臟轉移癌等肝癌組織、腫瘤細胞中，miR-122是低表達或不表達的，不能對自殺基因 產(chǎn)生抑制作用，即，位于TK基因的3’ UTR的miR-122的靶序列就不會起作用，因而受其調(diào) 控的下游的TK基因就會得到表達，從而達到特異性殺傷肝癌腫瘤細胞的作用。這樣就能實 現(xiàn)特異性殺傷腫瘤且避免肝毒性。本研究利用miR-122調(diào)控自殺基因的表達，可能提高肝 癌基因治療的靶向性、高效性和安全性，從而為原發(fā)性肝細胞癌的綜合治療方案補充新療 法，并可能為預防肝癌的復發(fā)提供了有效辦法。此外，利用其它組織特異性microRNA調(diào)控 可以抑制自殺基因在特定組織的表達，避免治療系統(tǒng)的副作用。比如在自殺性治療基因的 3’UTR引入肌肉組織特異性表達的miR-133的靶序列，抑制自殺基因在肌肉的表達，避免損 傷肌肉組織。為解決由外周靜脈給藥將治療基因導入肝臟的問題，我們選用了 AAV8作為載體。 AAV8載體外周靜脈注射易于富集于肝臟。AAV8系統(tǒng)給藥主要感染肝臟，但也感染其他器官，主要是肌肉組織，造成肌肉組織 損傷的副作用，我們選用組織特異性的microRNA抑制TK基因在特定組織的表達。如在TK 基因的3’ UTR引入肌肉特異性miR-133的靶序列(miR_133T)，從而避免TK基因轉染肌肉 造成副作用。運用本發(fā)明的原理，也可以采用除TK基因以外的其它殺傷性治療基因來做為治 療基因，如FASL基因、TNF-α基因、TRAIL基因、金黃色葡萄球菌外毒素、p53基因等可以 導致腫瘤細胞被殺傷的其它基因，這些基因可替代TK基因做為治療基因，即在重組AAV8病 毒(rAAV8-TK-miR-122T)的治療基因(TK基因)的位置使用上述FASL基因、TNF-α基因、 TRAIL基因、金黃色葡萄球菌外毒素、ρ53基因等。概括表述本發(fā)明中的核心內(nèi)容是一種可由外周靜脈給藥、用于治療肝細胞癌和 肝轉移癌的、使用殺傷性治療基因的重組病毒系統(tǒng)的構建方法及其應用，該系統(tǒng)中的重組AAV的結構是“rsCAAV8-治療基因-miRNA調(diào)控靶序列”。該系統(tǒng)中的重組AAV的結構中， 治療基因是TK基因，也可以是除TK基因以外的其它基因來做為治療基因，如FASL基因、 TNF-α基因、TRAIL基因、金黃色葡萄球菌外毒素、p53基因等；miRNA調(diào)控靶序列可以有 兩種模式miR-122T單調(diào)控模式和miR-122T和miR_133T共同調(diào)控模式。該系統(tǒng)的構建和應用包括以下步驟或環(huán)節(jié)1、構建含miR-122和/或miR-133靶序列的HSV-TK自殺基因重組質(zhì)粒 pscAAV-TK-miR-122T、pscAAV-TK-miR-122T-miR-133T 和不含 miR-122 和 miR-133 靶序列 的對照質(zhì)粒以及EGFP、Firefly Luciferase(Luc)的報告基因質(zhì)粒。2、體外研究microRNA對報告基因和自殺基因的調(diào)控作用。3、動物體內(nèi)研究microRNA對報告基因和自殺基因的調(diào)控作用。4、重組AAV8病毒rAAV8-TK_miR-122T和對照重組病毒以及重組報告基因病毒的 包裝和制備。5、動物實驗研究，上述重組AAV8病毒rAAV8-TK_miR-122T和對照重組病毒以及重 組報告基因病毒的使用中，使用GCV對肝癌動物模型的作用。6、構建含miR-122和miR-133靶序列的TK自殺基因重組質(zhì)粒載體 pscAAV-TK-miR-122T-miR-133T。為后續(xù)的工作打基礎。


圖1構建含miR-122的EGFP、Luc告基因的質(zhì)粒和TK自殺基因的重組質(zhì)粒的 表達單元的結構示意圖。見實施例1。圖中ITR代表AAV病毒基因組的反向末端重復序 列；CAG promoter是CAG啟動子，其序列中包含了巨細胞病毒的增強子和雞的β -肌動 蛋白內(nèi)含子；PolyA是多聚腺嘌呤加尾信號序列；Iuc是熒光素酶基因；miR-122targetS 是4個mirl22靶序列定向串聯(lián)后得到的序列，圖中標示為緊鄰的4個miR122T。圖1 的 B、D、F 分別為pscAAV2-EGFP、pscAAV2_Luc 和 pscAAV2_TK。圖 1 的 A、C、L· 分別為 pscAAV2-EGFP-miR-122T、pscAAV2-Luc_miR-122T 和 pscAAV-TK_miR-122T。圖aiiiR-122對報告基因的調(diào)控的體外研究。見實施例2。圖中顯示，與對照組相 比，在表達miR-122的Huh7細胞中，pscAAV2-EGFP_miR-122T質(zhì)粒轉染組的EGFP表達明顯 抑制；而在不表達miR-122的Hela細胞中，pscAAV2-EGFP-miR-122T質(zhì)粒轉染組的EGFP表 達無變化。圖3miR-122對報告基因的調(diào)控的體外研究。見實施例2。圖中顯示，因miR-122T的 作用的影響，在表達miR-122的Huh7細胞Luc的活性被抑制達4. 5倍，而在不表達miR-122 的Hela細胞則無抑制。圖細11 -122調(diào)控抑制自殺基因對細胞的殺傷的體外研究。見實施例3。圖中顯 示，與對照相比，轉染pscAAV2-TK-miR-122T的Huh7細胞存活率明顯增高，Hela細胞實驗 組與對照組無差異。圖5小鼠肝臟內(nèi)miR-122調(diào)控Luc基因的表達。見實施例4。圖中顯示，在小鼠肝 臟內(nèi)，因miR-122調(diào)控作用，與對照組相比，pscAAV2-Luc-miR-122T組的Luc基因的表達被 抑制了四倍。圖6利用miR-122調(diào)控避免自殺基因對小鼠正常肝臟的殺傷。見實施例5。圖中 顯示，pscAAV2-TK組出現(xiàn)明顯肝臟損傷，ALT明顯升高，在注射后6、10和14天，分別升高5. 9,27. 1和26. 6倍。而pscAAV2-TK-miR-122T組與生理鹽水對照組相比，未發(fā)現(xiàn)異常。圖7利用miR-122調(diào)控避免自殺基因對小鼠正常肝臟的殺傷。見實施例5。圖中 顯示，pscAAV2-TK組出現(xiàn)明顯肝臟損傷，連續(xù)14天檢測小鼠體重，體重明顯下降，并且出現(xiàn) 1只小鼠死亡。而pscAAV2-TK-miR-122T組與生理鹽水對照組相比，未發(fā)現(xiàn)異常。圖8利用miR-122調(diào)控避免自殺基因對小鼠正常肝臟的殺傷。見實施例5。圖中 顯示，pscAAV2-TK組出現(xiàn)明顯肝臟損傷，肝臟病理切片顯示細胞水腫、壞死和炎癥細胞浸 潤。而pSCAAV2-TK-miR-122T組與生理鹽水對照組相比，未發(fā)現(xiàn)異常。圖9重組病毒rscAAV8-TK-miR-122T對小鼠肝癌模型的治療作用和安全性。見實 施例7。結果顯示，rscAAV8-TK-miR-122T明顯抑制了腫瘤的生長。圖10重組病毒rscAAV8-TK-miR-122T對小鼠肝癌模型的治療作用和安全性。見 實施例7。結果顯示，ALT檢測無明顯異常，各組間無明顯差異。圖11重組病毒rscAAV8-TK-miR-122T對小鼠肝癌模型的治療作用和安全性。見 實施例7。病理結果顯示，與對照組相比rscAAV8-TK-miR-122T不損傷正常肝組織圖12受miR-122調(diào)控的重組病毒rscAAV8-EGFP_miR-122T的報告基因表達的體 外研究。見實施例8。結果顯示，與對照組相比，在表達miR-122的Huh7細胞中，實驗組 rscAAV8-EGFP-miR-122T的EGFP表達明顯受到抑制，而在不表達miR-122的Hela細胞中， 實驗組的EGFP表達無變化。圖 13pscAAV2-EGFP-miR-122T 的質(zhì)粒圖譜。見實施例 1。圖 14pscAAV2-Luc-miR_122T 的質(zhì)粒圖譜。見實施例 1。圖15pscAAV-TK-miR_122T的質(zhì)粒圖譜。見實施例1。圖 16pscAAV-TK-miR-122T-miR-133T 的質(zhì)粒圖譜。見實施例 9。以下實施例對本發(fā)明作了詳細說明，但并不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。實施例1構建含miR-122的EGFP、Luc等報告基因的質(zhì)粒和TK自殺基因的重組 質(zhì)粒將EGFP、Luc和TK基因分別插入自身互補型AAV載體pscAAV2的多克隆位點Nhe I禾口 Kpn I中，獲得重組質(zhì)粒pscAAV2-EGFP、pscAAV2_Luc和pscAAV2_TK，這3種重組質(zhì)粒 所插入的EGFP、Luc和TK等基因所構成的基因表達單元的結構示意圖見附圖1的B、D、F。合成兩端含有EcoR I和Bgl II酶切位點的miR-122靶序列的Oligo DNA0該序 列包含4個拷貝的miR-122靶序列。該Oligo DNA包含了不完全互補的上游序列和下游序 列。miR-122 靶序列的 Oligo DNA 的上游序列(miR_122T f)5，aattccaaacaccattgtcacactccaagaccaaacaccattgtcacactccagtcgaccaaacacc attgtcacactccaagaccaaacaccattgtcacactccaa 3，miR-122 靴序列的 Oligo DNA 的下游序列(miR_122T r)5，gatcttggagtgtgacaatggtgtttggtcttggagtgtgacaatggtgtttggtcgactggagtgt gacaatggtgtttggtcttggagtgtgacaatggtgtttggaatt 3，將這對(上游序列和下游序列)Oligo DNA退火。將pscAAV2-EGFP、pscAAV2_Luc 和pscAAV2-TK用Kpn I和Bgl II雙酶切，在EGFP、Luc和TK基因的3，-UTR插入退火 后的 miR-122 靶序列，得到質(zhì)粒載體 pscAAV2-EGFP_miR-122T、pscAAV2-Luc_miR-122T 和，這3種重組質(zhì)粒所插入的EGFP、Luc和TK基因所構成的基因表達單 元的結構示意圖見附圖1的A、C、E和附圖13、14、15。實施例2miR_122對報告基因的調(diào)控的體外研究將pscAAV2-EGFP-miR_122T質(zhì)粒以及對照質(zhì)粒pscAAV2_EGFP轉染至Hela細胞和 Huh7細胞中。轉染24h后，于熒光顯微鏡下，觀察Hela細胞和Huh7細胞內(nèi)綠色熒光表達，結 果(見附圖2)顯示與對照組相比，pscAAV2-EGFP-miR-122T質(zhì)粒轉染組在表達miR-122的 Huh7細胞中EGFP表達明顯抑制，而在不表達miR-122的Hela細胞中，EGFP表達無變化。Hela細胞和Huh7細胞轉染pscAAV2-Luc-miR_122T質(zhì)粒(說明書附圖中簡寫 為pLuc-122T)及其對照質(zhì)粒pSCAAV2-LUC (說明書附圖中簡寫為pLuc)，轉染24h后，裂 解每孔細胞，在細胞裂解液中加入Iuciferase分析試劑盒中的底物50ul，用發(fā)光檢測儀 (ModulusTM Luminometer)測定其相對光強度單位(RLU，relativelight unit)。結果(見 附圖幻顯示在Huh7細胞Luc的活性被抑制達4. 5倍，在Hela細胞無抑制。實施例3miR_122調(diào)控抑制自殺基因對細胞的殺傷的體外研究用pscAAV2-TK-miR-122T質(zhì)粒(說明書附圖中簡寫為pTK_122T)以及對照 pscAAV2-TK質(zhì)粒(說明書附圖中簡寫為ρΤΚ)轉染至Hela細胞和Huh7細胞中。同時給予 不同濃度的GCV處理，5天后，用MTT法檢測細胞存活情況。結果(見附圖4)顯示，與對照 相比，轉染pscAAV2-TK-miR-122T的Huh7細胞存活率明顯增高，Hela細胞實驗組與對照組 無差異。實施例4小鼠肝臟內(nèi)miR-122調(diào)控Luc基因的表達采用水動力注射法，將1. 6ml含質(zhì)粒DNA的生理鹽水在5至7秒鐘內(nèi)經(jīng)小 鼠尾靜脈注射至體重16 17g的BALB/c小鼠體內(nèi)。每組6只小鼠，分別注射質(zhì)粒 pscAAV2-Luc-miR-122T(說明書附圖中簡寫為pLuc_122T)和對照質(zhì)粒pscAAV2_Luc (說 明書附圖中簡寫為PLuc)，每種質(zhì)粒各注射1 μ g。在注射后M小時，每只小鼠腹腔內(nèi)注射 D-熒光素(150mg/kg)，10min后，CXD系統(tǒng)收集光子5秒鐘。結果(見附圖5)顯示，與對照 相比，Luc基因的表達被抑制了四倍。實施例5利用miR-122調(diào)控避免自殺基因對小鼠正常肝臟的殺傷采用水動力注射法，將1. 6ml含質(zhì)粒DNA的生理鹽水在5至6秒鐘內(nèi)經(jīng)小鼠尾靜 脈注射至體重16 17g的BALB/c小鼠體內(nèi)，不含質(zhì)粒的生理鹽水對照組也采取相同方法 處理。試驗分3組，每組6只小鼠。3組分別注射l)pscAAV2_TK(說明書附圖中簡寫為ρΤΚ)；2)pscAAV2-TK-miR-122T(說明書附圖中簡寫為 ρΤΚ-122Τ)；3)不含質(zhì)粒的生理鹽水(說明書附圖中簡寫為NS)。注射后，每天腹腔注射GCV (注射劑量50mg/kg體重)，共14天。檢測指標1)每天檢測體重；2)注射后6、10和14天，采集血清，檢測ALT ；3)注射14天后，取肝臟病理。結果(圖6、7、8)顯示，pscAAV2-TK組出現(xiàn)明顯肝臟損傷，這些變化包括1)小鼠體重明顯下降，并且出現(xiàn)1只小鼠死亡；
12
2) ALT明顯升高，在注射后6、10和14天，分別升高5. 9,27. 1和26. 6倍；3)肝臟病理切片顯示細胞水腫、壞死和炎癥細胞浸潤。而pscAAV2-TK-miR-122T組與生理鹽水對照組相比，體重、ALT水平和肝臟病理均 未發(fā)現(xiàn)異常。實施例6重組病毒rscAAV8-TK-miR_122T病毒的制備重組病毒rscAAV8-TK-miR-122T 病毒(簡稱 AAV8-TK_miR-122T)的制備，按文獻 方法(伍志堅，吳小兵等，一種高效的重組腺伴隨病毒生產(chǎn)系統(tǒng)，中國科學(C輯)37(5) 423-430)制備重組AAV8病毒；用“氯仿處理-PEG/NaCl-氯仿抽提”方法(吳小兵等，一種 快速和高效分離和純化重組腺病毒伴隨病毒載體的方法，科學通報45 (19) =2070-2075)純 化獲得粗提液；進一步用分子量截流原理以膜包法純化獲得AAV8病毒精純液。實施例7重組病毒rscAAV8-TK-miR-122T對小鼠肝癌模型的治療作用和安全性制備人肝癌H印G2細胞裸鼠肝臟移植瘤模型，通過尾靜脈注射待檢測藥物。分為 3組，每組6只植瘤模型裸鼠。3組分別為1)重組病毒rscAAV8-TK-miR-122T治療組(說明書附圖中簡寫為TK_miR-122T)；2)重組病毒rscAAV8-EGFP-miR-122T對照組(說明書附圖中簡寫為 EGFP-miR-122T)；3)正常對照組注射生理鹽水(說明書附圖中簡寫為NS)。重組病毒的注射劑量為lX1012vg/只；注射后，每天腹腔內(nèi)注射GCV(注射劑量 50mg/kg體重)，共10天。檢測指標1)注射后5和10天，采集血清，檢測ALT ；2)注射10天后，觀察腫瘤大小。結果顯示rscAAV8-TK-miR-122T明顯抑制了腫瘤的生長，而重組病毒 rscAAV8-EGFP-miR-122T對照組和注射生理鹽水正常對照組的腫瘤均大幅度生長(見附 圖9) ；ALT檢測指標上，各組間無明顯差異(見附圖10)；病理結果顯示，與對照組相比 rscAAV8-TK-miR-122T不損傷正常肝組織(圖11)。實施例8受miR-122調(diào)控的重組病毒rscAAV8-EGFP_miR-122T的報告基因表達的 體外研究將重組病毒rscAAV8-EGFP-miR-122T (實驗組)及重組病毒rscAAV8_EGFP (對照 組)分別感染Hela細胞和Huh7細胞。感染24h后，于熒光顯微鏡下，觀察Hela細胞和Huh7 細胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達。結果顯示，與對照組相比，在表達miR-122的Huh7細胞中，實 驗組的EGFP表達明顯受到抑制，而在不表達miR-122的Hela細胞中，實驗組的EGFP表達 無變化(見附圖12)。實施例9構建含miR-122和miR-133靶序列的TK自殺基因重組質(zhì)粒合成兩端有Kpn I和EcoR I酶切位點的miR-133靶序列的Oligo DNA0該序列包 含3個拷貝的miR-133靶序列。該Oligo DNA包含了不完全互補的上游序列和下游序列。miR-133 靶序列的 Oligo DNA 的上游序列(miR_133T f)5' cacagctggttgaaggggaccaaagacacagctggttgaaggggaccaaagacacagctggttgaag gggaccaaag3'
miR-133 靶序列的 Oligo DNA 的下游序列(miR_133T r)5' aattctttggtccccttcaaccagctgtgtctttggtccccttcaaccagctgtgtctttggtcccc ttcaaccagctgtggtac3，并將每對Oligo DNA 退火。將 pscAAV2-TK-miR-122T 用 Kpn I 禾Π EcoR I 酶切，插 入退火后的miR-133靶序列，得到質(zhì)粒載體pscAAV-TK-miR-122T-miR-133T(見附圖16)。名詞解釋1、AAV 病毒adeno-associated virus,腺病毒相關病毒。2、ITR :inverted terminal r印eat，倒轉末端重復，是AAV病毒基因組的反向末端 重復序列。翻譯習慣上，inverted翻譯成倒轉或反向都可以。3、微小RNA(miRNA)是一種存在于動植物體內(nèi)的，長度為22nt左右的非編碼RNA。 它通過降解靶mRNA或抑制其翻譯調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的基因表達，在細胞的生長、分裂、分化和凋 亡以及某些疾病(如癌癥)的發(fā)生和進程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。4、miR-122T :miRNA 122的靶序列。是研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的各種miRNA中的一種miRNA 的靶序列。miRNA的靶序列的通用簡寫為mirT。5,CAG promoter :CAG啟動子，其序列中包含了巨細胞病毒的增強子和雞的β -肌 動蛋白內(nèi)含子。6, polyA 多聚腺嘌呤加尾信號序列。7、RLU-Relative Light Unit {|。8、TK :胸腺嘧啶激酶，及其編碼基因，為單純皰疹病毒(HSV病毒)基因組中的TK 基因。9、ALT 丙氨酸氨基轉移酶。10、GCV Ganciclovir，丙氧鳥苷。ll、rscAAV 自身互補型AAV載體。12, EGFP 增強型綠色熒光蛋白，及其編碼基因。13、HepG2 人肝癌 H印G2 細胞。14、Huh7 人肝癌 Huh7 細胞。15、3，UTR :3，非編碼區(qū)。序列表<110>中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所<120>—種可經(jīng)外周靜脈內(nèi)給藥的肝臟腫瘤自殺基因治療系統(tǒng)的構建方法和應用<160>4<210>1<211>108<212>DNA<213>人工序列<220><223>miR-122T f<400>1aattccaaacaccattgtcacactccaagaccaaacaccattgtcacactccagtcgaccaaacacc
attgtcacactccaagaccaaacaccattgtcacactccaa 108
<210>2
<211>112
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>miR-122T r
<400>2
gatcttggagtgtgacaatggtgtttggtcttggagtgtgacaatggtgtttggtcgactggagtgtgacaatg
gtgtttggtcttggagtgtgacaatggtgtttggaatt 112
<210>3
<211>77
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>miR-133T f
<400>3
cacagctggttgaaggggaccaaagacacagctggttgaaggggaccaaagacacagctggttgaag
gggaccaaag 77
<210>4
<211>85
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>miR-133T r
<400>4
aattctttggtccccttcaaccagctgtgtctttggtccccttcaaccagctgtgtctttggtcccct
tcaaccagc tgtggtac8權利要求
1.一種可由外周靜脈給藥、用于治療肝細胞癌和肝轉移癌的、使用殺傷性治療基因的 重組病毒系統(tǒng)“rscAAV8-治療基因-miRNA調(diào)控靶序列”的構建方法及其應用。
2.根據(jù)權利要求l，“rscAAV8-治療基因-miRNA調(diào)控靶序列”中，治療基因是TK基因。
3.根據(jù)權利要求1，“rscAAVS-治療基因-miRNA調(diào)控靶序列”中，治療基因是除TK基 因以外的其它治療基因，如FASL基因、TNF-α基因、TRAIL基因、金黃色葡萄球菌外毒素、 p53基因等。
4.根據(jù)權利要求1，"rscAAV8-治療基因-miRNA調(diào)控靶序列”中，miRNA調(diào)控靶序列是 miR-122T, S卩，治療基因受miR_122T調(diào)控。
5.根據(jù)權利要求1，"rscAAV8-治療基因-miRNA調(diào)控靶序列”中，miRNA調(diào)控靶序列是 miR-122T和miR_133T，即，治療基因受miR_122T和miR_133T共同調(diào)控。
6.根據(jù)權利要求2和4，"rscAAV8-治療基因-miRNA調(diào)控靶序列”中，治療基因是TK 基因，miRNA調(diào)控靶序列是miR-122T，S卩，重組病毒是rscAAV8-TK_miR-122T，TK基因受 miR-122T 調(diào)控。
7.根據(jù)權利要求2和5，"rscAAV8-治療基因-miRNA調(diào)控靶序列”中，治 療基因是TK基因，miRNA調(diào)控靶序列是miR-122T和miR_133T，S卩，重組病毒是 rscAAV8-TK-miR-122T-miR-133T, TK 基因受 miR_122T 和 miR_133T 共同調(diào)控。
8.根據(jù)權利要求3和4，“rscAAV8-治療基因-miRNA調(diào)控靶序列”中，治療基因是除TK 基因以外的其它治療基因，如FASL基因、TNF-α基因、TRAIL基因、金黃色葡萄球菌外毒素、 p53基因等，miRNA調(diào)控靶序列是miR_122T。
9.根據(jù)權利要求3和5，“rscAAV8-治療基因-miRNA調(diào)控靶序列”中，治療基因是除TK 基因以外的其它治療基因，如FASL基因、TNF-α基因、TRAIL基因、金黃色葡萄球菌外毒素、 p53基因等，miRNA調(diào)控靶序列是miR-122T和miR_133T。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種應用于腫瘤的基因治療的方法。該基因藥物以血清型8型的腺相關病毒(AAV8)為載體，攜帶了受microRNA靶序列調(diào)控的殺傷性治療基因(包括自殺基因)。該基因藥物治療肝臟腫瘤的原理是，利用腫瘤細胞的內(nèi)源性microRNA來調(diào)控由該基因藥物攜帶的殺傷性治療基因(自殺基因)的表達，即利用腫瘤細胞的內(nèi)源性microRNA來調(diào)控外源由AAV8導入的殺傷性治療基因的表達。在非癌組織和細胞內(nèi)，因內(nèi)源性microRNA調(diào)控，細胞不表達該殺傷性治療基因。當該殺傷性治療基因為TK基因時，該基因的表達產(chǎn)物能將與其相對應的化學藥物底物作用成為對肝癌細胞有殺傷作用的藥物，進而造成肝癌組織、細胞的被殺傷；非癌組織和細胞因為不表達該自殺基因，所以不會被殺傷，從而保護了非癌組織和細胞。這樣，該基因藥物就可以經(jīng)外周靜脈內(nèi)給藥，該藥物也能靶向性地到達肝臟內(nèi)的肝癌組織、細胞內(nèi)，且在肝癌組織內(nèi)表達殺傷性治療基因，從而最終達到系統(tǒng)性治療肝癌的作用。
文檔編號A61P1/16GK102115733SQ20101000004
公開日2011年7月6日 申請日期2010年1月5日 優(yōu)先權日2010年1月5日
發(fā)明者吳小兵, 王剛, 董小巖 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所, 北京五加和分子醫(yī)學研究所有限公司