專利名稱：：一種生物相容性納米顆粒及其作為藥物輸送載體的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種生物相容性納米顆粒及其作為藥物輸送載體的應用。
背景技術：
：納米藥物載體的研究是納米生物醫(yī)學研究領域的重要方向之一。大量的研究證明，納米藥物載體可促進藥物在腫瘤組織的富集，用納米藥物載體輸送藥物，在癌癥治療中顯示出良好的效果，具有廣闊的應用前景。由于腫瘤組織的微環(huán)境與正常組織存在顯著的差別，如腫瘤組織的血管是擴張、彎曲的，而且缺乏淋巴回流致使腫瘤組織內部的壓力顯著高于周圍的正常組織，又如腫瘤細胞的大量增殖造成腫瘤組織的厭氧和低pH環(huán)境，這些差別不利于小分子藥物通過血管輸送到腫瘤組織的深部，藥物不容易到達腫瘤細胞和作用的靶位。然而，由于腫瘤新生血管內皮細胞的不連續(xù)性，允許粒徑小于200nm的納米粒子通過血管壁進入組織間隙，因此，將藥物裝載到納米顆粒中可通過滲透和滯留增強效應(enhancedpermeabilityretention，EPR)在腫瘤組織中富集進而實現(xiàn)被動靶向。研究證實將抗癌藥物包載于納米顆粒中可5-10倍提高藥物在腫瘤部位的富集，如進一步在納米顆粒的表面偶聯(lián)腫瘤細胞特異性親合配體，可進一步提高藥物在腫瘤部位的富集(與游離藥物相比)?；谏鲜鲅芯拷Y果，一些抗癌藥物的納米制劑已被開發(fā)并用于臨床上治療各種腫瘤，如2005年批準的紫杉醇白蛋白納米顆粒，臨床用藥表明，上述納米藥物載體促進了化療藥物在腫瘤組織的富集，明顯降低藥物的毒副作用，并改善患者的生存質量，治療效果與游離藥物相比明顯提高。然而，這些納米載體并非對所有實體瘤的治療都具有理想的結果，構建高效低毒、既能實現(xiàn)組織滲透又能實現(xiàn)細胞靶向的納米藥物載體在為腫瘤的臨床治療提供有效手段和策略的同時，仍然面臨嚴峻挑戰(zhàn)。目前國內外用作藥物載體研究的納米材料包括無機納米材料(如碳納米管、硅介孔材料)、脂質體，和有機高分子材料(包括生物相容性的合成高分子和改性天然高分子材料)等。如用單壁碳納米管來運載鉑類藥物，發(fā)現(xiàn)經(jīng)修飾的碳納米管能夠實現(xiàn)對鉑類藥物的緩釋并抑制癌細胞生長。又如通過與熒光量子點鍵合或封存于介孔微球的孔道中，可以將小分子藥物或RNA干擾藥物輸送到腫瘤細胞，并具有抗腫瘤藥物的靶向輸送的潛能。最近還有研究將藥物分子如紫杉醇通過磷酸酯的橋鍵鍵合到金納米顆粒的表面，或是鍵連到磁性納米顆粒表面，顯示良好的藥物輸送性能。盡管碳納米管、介孔材料、磁性納米顆粒等無機納米材料具有良好的細胞穿透性，易于被細胞吞噬，作為藥物輸送的納米載體具有潛力，但其在有機溶劑和水中的溶解性較差，需經(jīng)過復雜的改良修飾，而且生物相容性和難于降解也是不可忽略的問題，這有可能限制其在藥物載體領域的應用。另一類由天然磷脂和膽固醇等制備的脂質體，或者以室溫下為固態(tài)的卵磷脂、三酰甘油等脂質為基質所制備的固體脂質納米粒(solidlipidnanoparticles，SLN)也是較為常見的納米給藥體系，它通過細胞內吞和融合作用可直接將藥物送入細胞內。高分子納米顆粒作為藥物的輸送載體在近些年取得了迅速發(fā)展，它具有結構多樣性，制備相對簡單，質量容易控制，生物相容性好，通過結構控制可使其降解等優(yōu)點，而且能4顯著增強藥物的體內活性，因而備受關注。目前研究的較多的是兩親型高分子材料，它在水溶液中能自發(fā)聚集形成具有獨特結構的納米顆粒，包括膠束和囊泡等，適合輸送親水、疏水等多種藥物。如K.Kataoka等發(fā)展了聚乙二醇_聚天冬氨酸衍生物的嵌段聚合物用于抗癌藥物紫杉醇的輸送，聚乙二醇作為親水段，聚天冬氨酸衍生物為疏水段自組裝成納米顆粒，其中，NK105(聚乙二醇分子量12000，聚天冬氨酸衍生物分子量8000)用于治療胃癌已進入二期臨床。又如D.E.Discher等發(fā)展的基于聚乙二醇_聚乳酸PEG-PLA的納米囊泡，同時包載親水抗癌藥物阿霉素與疏水抗癌藥物紫杉醇，在腫瘤的治療中具有協(xié)同效應?！獋€不可忽視的問題是，兩親性高分子自組裝的納米顆粒的結構強烈依賴于親、疏水性組分的相對比例，而且穩(wěn)定性不高。這樣的自組裝納米顆粒作為藥物載體在被體液或血液稀釋的狀況下容易發(fā)生解離，且它的去組裝往往造成藥物的突釋，這將直接導致納米顆粒到達靶部位之前藥物就已經(jīng)釋放，從而無法通過EPR效應提高藥物的利用度和功效。在現(xiàn)階段的研究中通常采用進一步的化學或物理交聯(lián)，使其結構更加穩(wěn)定，以改善藥物釋放和藥物輸送的性能，其中化學交聯(lián)一般采取先合成帶有可交聯(lián)官能團的兩親性高分子，在其組裝成納米顆粒后，再通過可交聯(lián)官能團的進一步交聯(lián)反應而穩(wěn)定納米顆粒。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種生物相容性納米顆粒及其作為藥物輸送載體的應用,本發(fā)明提供了納米顆粒甲，為如下(a)或(b):(a)式(I)所示化合物為殼層、式(II)所示化合物為內核的納米顆粒；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(b)式(I)所示化合物和式(III)所示化合物為殼層、式(II)所示化合物為內核的納米顆粒；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>n2=2-400(n2具體可為2-120)。所述的納米顆粒甲中，碳元素、氫元素、磷元素和氮元素的質量比可為(40-60):(5-20):(1-10):(O-O.5)，直徑分布范圍可為10-1000nm。(a)所述的納米顆粒甲中，碳元素、氫元素和磷元素的質量比具體可為(44.5-49.29):(7.649-8.509):(1.5-4.21)。(b)所述的納米顆粒甲中，碳元素、氫元素、磷元素和氮元素的質量比具體可為(40.9-46.19):(7.152-8.184):(3.56-3.95):(0.185-0.458)。(a)所述的納米顆粒甲中，式(I)所示化合物與式(II)所示化合物的物質的量的比值可為l:(0.5-5.l)，具體可為1:(0.57-5.01)。(a)所述的納米顆粒甲可采用如下方法制備以異辛酸亞錫為催化劑，用式(I)所示化合物引發(fā)式(II)所示化合物聚合，得到納米顆粒甲。上述制備方法中，所述聚合反應中，式(I)所示化合物、式(II)所示化合物和異辛酸亞錫的物質的量的比值具體可為(0.05-0.1):(0.5-2):(0.025-0.05)，反應條件可為40-8(TC，反應溶劑可為二氧六環(huán)、二甲亞砜或四氫呋喃。(b)所述的納米顆粒甲中，式(I)所示化合物、式(III)所示化合物與式(II)所示化合物的物質的量的比值可為(0.5-0.9):(0.03-0.24):(1.4-2.0)，具體可為(0.5-0.9):(0.039-0.235):(1.436-1.912)。(b)所述的納米顆粒甲可采用如下方法制備以異辛酸亞錫為催化劑，用式(I)所示化合物和式(III)所示化合物引發(fā)式(II)所示化合物聚合，得到納米顆粒甲。上述制備方法中，所述聚合反應中，式(I)所示化合物、式(III)所示化合物、式(II)所示化合物和異辛酸亞錫的物質的量的比值為(o.5-o.9):(o.i-o.5):6:o.5;反應條件為6crc，反應溶劑為二甲亞砜。本發(fā)明還保護將(b)所述納米顆粒甲進行化學修飾得到的納米顆粒乙；所述化學修飾為將所述納米顆粒甲中的式(II)所示化合物的疊氮基(_N3)還原為氨基(_NH2)。本發(fā)明還保護將所述納米顆粒乙進行化學修飾得到的納米顆粒丙；所述化學修飾為將所述納米顆粒乙中的所述氨基與乳糖酸進行化學連接。式(I)所示化合物具體可為mPEG2000-5000。本發(fā)明還保護一種制備納米顆粒的方法，包括如下步驟以式(IV)所示化合物中的至少一種作為引發(fā)劑，以異辛酸亞錫(Sn(Oct)2)為催化劑，引發(fā)式(II)所示化合物聚合，得到納米顆粒；n=2-400(n具體可為2-120);&為-OCH3或-N3。所述聚合反應的反應條件可為40-8(TC，反應溶劑可為二氧六環(huán)、二甲亞砜和四氫呋喃中的至少一種。當聚乙二醇單甲醚為_OCH3的式(IV)所示化合物，mPEG)作為引發(fā)劑時，聚合反應中，式(I)所示化合物、式(II)所示化合物和異辛酸亞錫的物質的量的比值可為(0.05-0.1):(0.5-2):(O.025-0.05)，反應條件可為40-80°C，反應溶劑可為二氧六環(huán)、二甲亞砜或四氫呋喃。當聚乙二醇單甲醚(&為-0CH3的式(IV)所示化合物)和a-羥基-"-疊氮-聚乙二醇為_N3的式(IV)所示化合物，N3PEG)同時作為引發(fā)劑時，聚合反應中，式(I)所示化合物、式(III)所示化合物、式(II)所示化合物和異辛酸亞錫的物質的量的比值為(o.5-o.9):(o.i-o.5):6:o.5;反應條件為6crc，反應溶劑為二甲亞砜。聚乙二醇單甲醚為_OCH3的式(IV)所示化合物，N3PEG)中，n具體可為44(mPEG2000)。所述a-羥基-"-疊氮-聚乙二醇為_N3的式(IV)所示化合物，N3PEG)中，n具體可為76(a-羥基-"-疊氮-PEG3400;N3PEG3400)。本發(fā)明還保護一種藥物輸送載體，它的活性成分為以上任一所述的納米顆粒(納米顆粒甲、納米顆粒乙或納米顆粒丙)。所述藥物輸送載體可用于藥物的包載及輸送。所述藥物可為抗癌藥物和/或核酸類藥物，如阿霉素。本發(fā)明還保護一種納米藥物，它的活性成分為如下復合物以上任一所述的納米顆粒及其負載的藥物組成的復合物。所述藥物可為抗癌藥物和/或核酸類藥物，如阿霉素。式(II)所示化合物即3，6-二氧代辛烷-1，8-二乙撐磷酸酯(TEGDP)。聚磷酸酯是一類以磷酸酯鍵連接的生物可降解高分子材料，已被廣泛用于藥物控制釋放、基因治療和組織工程等生物材料研究領域。本發(fā)明提供的制備納米顆粒的方法非常簡單，所形成的交聯(lián)內核是完全可降解的聚磷酸酯，在不引入任何不可降解成分和其它具有反應性的官能基團的情況下，可獲得交聯(lián)穩(wěn)定的納米顆粒。本發(fā)明得到的納米顆粒具有良好的生物相容性和可生物降解性。由于聚乙二醇殼層的存在，賦予其良好的親水性，將增強載藥納米顆粒在血液中的循環(huán)和穩(wěn)定性，從而將可能增強藥物輸送的功效。同時組成內核的聚磷酸酯是一類由磷酸酯鍵連接的可生物降解高分子材料，使得上述納米顆粒將最終在體內降解而排出體外，具有良好的生物相容性。本發(fā)明的納米顆粒還可以通過改變聚合條件得到不同大小不同組分的納米顆粒，并且其表面容易實現(xiàn)官能化，在構建靶向納米藥物載體方面具有顯著的優(yōu)勢。圖1為TEGDP的合成路線圖。圖2為TEGDP的^NMR譜(A)及13CNMR譜(B)。圖3為mPEG-TEGDP納米顆粒的合成路線圖。圖4為mPEG-TEGDP納米顆粒的^NMR譜(A)、13CNMR譜(B)及31PNMR譜。圖5為mPEG-TEGDP納米顆粒的粒徑分布圖(A)及透射電鏡圖(B)。圖6為mPEG-laPEG-TEGDP納米顆粒的合成路線圖。圖7為mPEG-laPEG-TEGDP納米顆粒^NMR譜。圖8為mPEG-laPEG-TEGDP納米顆粒的粒徑分布圖(A)及透射電鏡圖(B)。圖9為mPEG-TEGDP納米顆粒的生物相容性檢測結果；A:MTT比色法檢驗對A546細胞的毒性結果；B與C:死活染色實驗結果。圖10為MTT比色法檢驗mPEG-laPEG-TEGDP納米顆粒對H印G2細胞的毒性結果。圖11為載藥納米顆粒甲的釋放動力學曲線。圖12為流式細胞計數(shù)(FACS)檢驗H印G2細胞對單獨小分子藥物阿霉素(A)，載藥納米顆粒甲(B)及載藥納米顆粒乙(C)的內吞情況；D為A，B，C的整合圖。圖13為Wistar大鼠原發(fā)性肝癌的治療結果；經(jīng)PBS(A)、單獨小分子藥物阿霉素(B)、包載阿霉素的mPEG-TEGDP(C)及包載阿霉素的mPEG-laPEG-TEGDP(D)治療后肝臟照片(A1-D1)，肝臟組織切片HE染色(A2-D2)以及肝臟表面直徑^3mm的腫瘤結節(jié)數(shù)目(E)。圖14為經(jīng)PBS(1)、單獨小分子藥物阿霉素(2)、載藥納米顆粒甲(3)及載藥納米顆粒乙(4)治療后Wistar大鼠肝臟中的甲胎蛋白(AFP)(A1-A4)，胎盤型谷胱甘肽s_轉移酶(GST-P)(Bl-B4)以及增殖細胞核抗原(PCNA)(Cl-C4)的免疫組織化學染色；轉化生長因子-a(TGF-a)與表皮生長因子受體(EGFR)的Western免疫印跡檢測結果(E);D圖為對10張PCNA免疫組織化學染色照片中的PCNA陽性細胞進行統(tǒng)計，計算其占總體肝細胞的比例。圖15為PBS(A)，單獨小分子藥物阿霉素(B)，載藥納米顆粒甲(C)及載藥納米顆粒乙(D)在Wistar大鼠肝臟組織中的阿霉素分布的共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)照片；阿霉素熒光(Al-Dl)，Alexafluor488、halloidin標記細胞膜(B2-D2)，DAPI標記細胞核(A3-D3)，A4-D4分別是A1_A3，Bl-B3與Dl-D3的疊加圖。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑商店購買得到的。mPEG2000(貨號202509，公司:Aldrich);mPEG5000(貨號:81323，公司Aldrich);N3PEG3400(貨號88276，公司Sigma)。實施例1、相關化合物的合成—、COP的合成通過三氯化磷與乙二醇反應合成2-氯-2-氧-l，3，2-二氧磷雜環(huán)戊烷(2-chloro-2-oxo-l，3，2-dioxaphospholane，C0P)，具體的合成方法如下在1000mL的三口圓底燒瓶中，將三氯化磷(3.0mol)溶解于無水二氯甲烷(500mL)中，通過恒壓滴液漏斗緩慢滴入乙二醇(3.Omol)，待全部滴完后，繼續(xù)反應0.5小時，減壓下蒸去溶劑，連續(xù)減壓蒸餾兩次將產(chǎn)物蒸出(5(TC，200Pa)。將產(chǎn)物溶解在苯中，通入02反應48小時，減壓下蒸出溶劑苯，再于減壓下連續(xù)蒸餾兩次將產(chǎn)物(C0P)蒸出(8889t:，20Pa)，在^氣氛下于-2(TC冰箱中封存。二、雙環(huán)磷酸酯單體(TEGDP)的合成與表征3，6-二氧代辛烷-1，8-二乙撐磷酸酯(TEGDP)的合成路線如圖1所示。詳述操作步驟如下在一個干燥的500mL三口燒瓶中，用注射器依次加入0.32molC0P和200mL四氫呋喃(THF)，將體系冷卻到_51:后，邊攪拌邊用恒壓滴液漏斗緩慢加入三甘醇的四氫呋喃溶液(0.16mol三甘醇溶于100mL四氫呋喃)與三乙胺的四氫呋喃溶液(0.32mol三乙胺溶于lOOmL四氫呋喃)，約1小時滴完，體系在-5t:繼續(xù)反應5小時。將白色的三乙胺鹽酸鹽沉淀物過濾，真空下抽掉溶劑，加入50mL甲苯洗滌兩次，減壓抽干溶劑即得到TEGDP單體。對TEGDP進行核磁共振氫譜CHNMR)及核磁共振碳譜(13CNMR)分析，測定其分子結構，譜圖見圖2。TEGDP中的質子在相對應的NMR圖譜中都能找到其歸屬，并且積分面積與結構式吻合，證明了TEGDP結構的正確。實施例2、mPEG-TEGDP納米顆粒的合成與表征mPEG-TEGDP納米顆粒的合成示意圖如圖3所示。預先在干燥的圓底燒瓶中加入mPEG、TEGDP和Sn(Oct)2，三者的摩爾投料比以及反應體系的參數(shù)見表1。體系反應12小時后用分子量為15000的透析袋在超純水中透析72小時，凍干后得到白色粉末狀產(chǎn)物(mPEG-TEGDP納米顆粒)。表1mPEG-TEGDP納米顆粒的合成條件mPEG-TEGDP納米顆粒反應起始時體系中各物質的濃度(moll/1)溫度(。C)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>使用核磁共振氫譜CHNMR)、核磁共振碳譜(13CNMR)及核磁共振磷譜(31PNMR)進一步對納米顆粒進行結構分析。圖4為表1中納米顆粒A的NMR圖譜。從圖中可以看出納米顆粒A中的質子在相對應的NMR圖譜中都能找到其歸屬，證明了結構的準確性。表1中其余7種mPEG-TEGDP納米顆粒的NMR圖譜都類似，差別在于峰面積不一樣。納米顆粒的粒徑及粒徑分布分別使用動態(tài)光散射(DLS)與透射電鏡(TEM)進行觀察與分析。圖5為mPEG-TEGDP納米顆粒A的DLS及TEM數(shù)據(jù)，從DLS分析結果可以看到納米顆粒粒徑分布均一，從TEM圖中可以看出納米顆粒為球形顆粒，有核殼結構，顆粒大小約為200nm。其余7種mPEG-TEGDP納米顆粒結果與納米顆粒A相似。實施例3、mPEG-laPEG-TEGDP納米顆粒的制備與表征mPEG-laPEG-TEGDP納米顆粒的合成示意圖如圖6所示。—、mPEG-N3PEG_TEGDP納米顆粒的制備將mPEG2000、N3PEG3400、TEGDP及Sn(Oct)2分別加入到干燥的圓底燒瓶(摩爾投料比見表3)。在二甲亞砜中反應12小時后用分子量為15000的透析帶在超純水中透析729小時，凍干后得到表面疊氮基團官能化的納米顆粒mPEG-N3PEG-TEGDP。mPEG-N3PEG_TEGDP納米顆粒的元素比例及各組分比例計算結果列于表3。從表3可以看到，N3PEG在引發(fā)劑總量中的比例從0.9/0.1提高到0.5/0.5，其在納米顆粒中的含量也隨之增加，從0.9/0.039增加到0.5/0.235，這個結果表示可以通過投料比來控制納米顆粒表面的聚乙二醇組成，并由此調整納米顆粒的官能化程度。表3mPEG-N3PEG-TEGDP納米顆粒元素分析<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>二、mPEG-NH2PEG_TEGDP納米顆粒的制備將lOOmgmPEG-N3PEG-TEGDP納米顆粒分散在5mL的THF中，加入10mg三苯基膦(PPh)，室溫攪拌12h，后加入0.5mLH20，繼續(xù)攪拌12h，反應結束直接將反應溶液滴入到lOOmL乙醚中，沉淀出來的mPEG-NH2PEG-TEGDP納米顆粒抽干備用。三、mPEG-laPEG-TEGDP納米顆粒的制備在50mL的MES緩沖液(0.1M，pH=6.5)中溶解0.217gN_羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(sulfo-NHS)、0.198g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDCHC1)與0.0895g乳糖酸(Lactobionicacid，LA)，室溫攪拌15min，后加入lOOmgmPEG-NH2PEG-TEGDP納米顆粒，于fC下反應4h，接著室溫攪拌12h，反應結束后溶液直接透析(截留分子量為12000)2天，將最終得到的mPEG-laPEG-TEGDP納米顆粒凍干備用。使用核磁共振氫譜CHNMR)對mPEG-laPEG-TEGDP納米顆粒進行表征，如圖7所示，納米顆粒中相應質子氫都能在譜圖上找到歸屬，證明了其結構的正確性。動態(tài)光散射(DLS)與透射電鏡(TEM)的數(shù)據(jù)表明，mPEG-laPEG-TEGDP納米顆粒直徑在200nm左右，呈均勻分散狀態(tài)(圖8)。實施例4、納米顆粒作為藥物載體的性能評價—、納米顆粒的生物相容性評價使用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)比色法檢測mPEG-TEGDP納米顆粒對人肺癌細胞A549(購自ATCC，貨號CCL-185)的毒性。步驟如下首先在96孔板上每孔種10000個細胞，每孔中加入100iiLRPMI1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清)，置于0)2培養(yǎng)箱中(371:，0)2濃度為5%)培養(yǎng)24小時后，分別將濃度為1/128、1/64、1/32、1/16、1/8、1/4、1/2、1、5、10g/L的mPEG-TEGDP納米顆粒A與A549細胞共培養(yǎng)72小時后測細胞活力，用同樣濃度的十二烷基磺酸鈉(SDS)作為對照。結果見圖9(A)。由圖可見，當mPEG-TEGDP納米顆粒A濃度為10g/L時，90%的細胞仍存活，證明mPEG-TEGDP納米顆粒A具有良好的生物相容性。用MTT方法檢驗mPEG-laPEG-TEGDP納米顆粒A對人肝癌細胞H印G2(購自ATCC，貨號HB-8065)的毒性，方法同上，以未處理細胞為對照，結果如圖IO所示。從圖中可以看出mPEG-laPEG-TEGDP納米顆粒A對細胞未表現(xiàn)出任何毒性。借助"細胞死活染色"方法(LIVE/DEADViability/CytotoxicityKit)檢驗mPEG-TEGDP納米顆粒的生物相容性將濃度為10g/L的mPEG-TEGDP納米顆粒A與人肺癌細胞A549共培養(yǎng)72小時，以未經(jīng)處理的A549細胞為對照，然后用死活染色的方法測試納米顆粒的生物相容性，結果如圖9(B，C)所示。由圖中可見，mPEG-TEGDP納米顆粒A濃度為10g/L時，對A549細胞未產(chǎn)生毒性，顯示出具有良好的生物相容性。二、納米顆粒對藥物的包載及釋放能力載藥納米顆粒的載藥量及載藥效率通過高效液相色譜(HPLC，Highperformanceliquidchromatography)測定。HPLC由Waters1525雙向泵、Waters2475熒光檢測器、1500柱溫箱及57咖61:"@C18分離柱組成，流動相使用"乙腈與水"混合體系(pH為2.7)，兩者比例為50/50(v/v)，溫度30°C，流速為1.OmLmin—、熒光激發(fā)波長為460nm，發(fā)射波長為570nm。結果通過Breeze軟件進行分析。t與載藥效率用如下公式計算載藥量％=載藥效率％=包載在納米顆粒中的阿霉素的質量用于包載阿霉素的納米顆粒的質量包載在納米顆粒中的阿霉素的質量X100%X100%用于載藥的阿霉素的質量1、載藥納米顆粒對藥物的包載能力將PEG-TEGDP納米顆粒A與阿霉素溶于Milli-Q水中，室溫攪拌兩天，使用G50葡聚糖凝膠柱分離除去未包載的游離阿霉素，凍干后得到載藥納米顆粒甲(包載阿霉素的mPEG-TEGDP納米顆粒)。mPEG-TEGDP納米顆粒A與阿霉素的投料比及最終的載藥量與載藥效率見表4。從表4所列的數(shù)據(jù)中可以看到，在載藥效率高達91.00%的時候，載藥量依然有9.10%，可見納米顆粒對阿霉素具有高效的包載能力。表4mPEG-TEGDP納米顆粒A對阿霉素的載藥量和載藥效率載藥納米顆粒納米顆粒與阿霉素的投料比(g/g)載藥量(％)載藥效率(％)A10/19.10±0.5991.00±5.82B10/528.90±2.6057.79±5.13將mPEG-laPEG-TEGDP納米顆粒A與阿霉素溶于Milli-Q水中，室溫攪拌兩天，使用G50葡聚糖凝膠柱分離除去未包載的游離阿霉素，凍干后得到載藥納米顆粒乙(包載阿霉素的mPEG-laPEG-TEGDP納米顆粒)。mPEG-laPEG-TEGDP納米顆粒A與阿霉素的投料比及最終的載藥量與載藥效率見11表5。表5mPEG-laPEG-TEGDP納米顆粒A對阿霉素的載藥量和載藥效率<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從表中5可見，mPEG-laPEG-TEGDP納米顆粒A具有高效的藥物包載能力。2、載藥納米顆粒對藥物的釋放能力藥物體外釋放實驗在37t:于磷酸緩沖液(PB，O.02M，pH=7.4，鎂離子濃度lOmmolL—0中進行，具體操作如下將表4中的載藥納米顆粒甲用磷酸緩沖液重懸，納米顆粒的終濃度為1.0mgmL—1;取6份3mL的溶液，其中3份直接置于透析管中(Spectra/Por,Float-A-Lyzer，載留分子量25，000)，37t:下置于22mL磷酸鹽緩沖溶液中攪拌，另外3份每份加入磷酸二酯酶(磷酸二酯酶在磷酸緩沖液中的終濃度為5皿itL—"，然后置于透析管中，37t:下置于22mL磷酸鹽緩沖溶液中攪拌。在不同的時間間隔，將透析管的外液(22mL磷酸鹽緩沖溶液)全部取出，并補充以同體積的磷酸鹽緩沖溶液。將取出的磷酸鹽緩沖溶液凍干后通過HPLC測量阿霉素的積累釋放量，結果為三個重復試驗的平均值。釋放動力學曲線結果見圖ll，結果顯示不加磷酸二酯酶時，阿霉素在IO小時內有一個4%的暴釋，而在接下的158個小時時間僅釋放4.4%;而在磷酸二酯酶存在下，10小時內釋放約12%，168小時后共釋放了24.8%(以上百分比指的是釋放的阿霉素占負載阿霉素的質量百分含量)。說明磷酸二酯酶可以特異性地催化磷酸酯內核的降解，并隨后促進阿霉素從納米顆粒中釋放。這種酶促降解的行為將在體內應用時具有積極的意義。納米顆粒在血液中循環(huán)并不會大量釋放藥物，而進入癌細胞后，載藥納米顆粒在各種酶的催化下降解并釋放藥物，達到抑制癌細胞的作用。實施例5、納米顆粒作為藥物載體的應用哺乳動物肝細胞向朝肝竇一側的細胞膜上大量表達去唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)，它是一種專一性識別末端含有半乳糖或乙酰氨基半乳糖的糖蛋白。使用表面帶半乳糖殘基的mPEG-laPEG-TEGDP納米顆粒A作為抗癌藥物阿霉素的輸送載體，用于治療Wistar大鼠體內的原發(fā)性肝癌模型?！?、肝癌細胞H印G2對載藥納米顆粒乙的特異性識別肝癌細胞H印G2高表達去唾液酸糖蛋白受體，可特異性識別表面帶半乳糖殘基的納米顆粒，并介導其內吞。在24孔板中將乳糖酸(終濃度為0、30或60mM)、小分子藥物阿霉素、載藥納米顆粒甲(包載阿霉素的mPEG-TEGDP納米顆粒)和載藥納米顆粒乙(包載阿霉素的mPEG-laPEG-TEGDP納米顆粒)與H印G2細胞預先在fC下培養(yǎng)2h(阿霉素的濃度均為20iig/mL，每孔lmLRPMI1640培養(yǎng)基)，讓納米顆粒與細胞充分結合，然后用PBS緩沖液清洗，繼續(xù)在37t:下培養(yǎng)lh。使用流式細胞計數(shù)(FACS)方法分析了上述三者對H印G2細胞的內在化情況，結果如圖12所示。結果顯示，H印G2細胞內吞載藥納米顆粒乙的量要明顯多于載藥納米顆粒甲，由此可見H印G2細胞能特異性與載藥納米顆粒乙結合，并隨后介導內吞行為，證明了載藥納米顆粒乙表面糖基配體對肝細胞的靶向效果。此外，載藥納米顆粒乙進入細胞具有小分子抑制劑乳糖酸(lactobionicacid)的濃度依賴性，而這種現(xiàn)象并未在小分子藥物阿霉素以及載藥納米顆粒甲中發(fā)現(xiàn)，更充分證明了載藥納米顆粒乙進入細胞是由于去唾液酸糖蛋白受體介導的內吞機制所導致。二、載藥納米顆粒乙對大鼠原發(fā)性肝癌的治療1、大鼠原發(fā)性肝癌模型的構建使用化學致癌藥物二乙基亞硝胺(DEN)誘導Wistar大鼠(購白中國科學院上海實驗動物中心)生成原發(fā)性肝癌。具體方法為在Wistar大鼠的飲水中加入100ppm的DEN，持續(xù)時間為8周。2、載藥納米顆粒乙對大鼠原發(fā)性肝癌的治療隨機將大鼠分為四組，每組10只，進行如下給藥處理第一組(mPEG-TEGDP納米顆粒)尾靜脈注射載藥納米顆粒甲；第二組(mPEG-laPEG-TEGDP納米顆粒)尾靜脈注射載藥納米顆粒乙；第三組(阿霉素)尾靜脈注射小分子藥物阿霉素；第四組(PBS緩沖液)尾靜脈注射PBS緩沖液。每月給藥8次，第一組至第三組處理中，單次給藥劑量為liig/g阿霉素?！獋€月后，治療結果如圖13所示。從圖中可以看出，在給藥一個月后，第二組的肝癌的惡化程度要明顯好于其它三個實驗組(圖13A1，B1，C1，D1)，肝組織切片同樣證實了觀察的結果(圖13A2，B2，C2，D2)。對整個肝臟組織表面的直徑大于3mm的腫瘤結節(jié)進行計數(shù)，結果顯示第二組與其它三組都存在著統(tǒng)計學上的顯著差異性(圖13E)，體現(xiàn)了這種靶向性納米顆粒對肝癌具有明顯的抑制效果。進一步在蛋白分子水平上檢驗肝癌的治療效果，結果如圖14所示。肝臟組織中的甲胎蛋白(AFP)，胎盤型谷胱甘肽s-轉移酶(GST-P)以及增殖細胞核抗原(PCNA)的表達量通過免疫組織化學染色方法進行檢測(圖14A，14B，14C)，轉化生長因子-a(TGF-a)與表皮生長因子受體(EGFR)則通過Western免疫印跡進行定量檢測(圖14E)。結果表明經(jīng)載藥納米顆粒乙治療的大鼠，其肝臟中這些腫瘤相關蛋白的表達量都明顯低于其它三組，顯示了較好的肝功能及優(yōu)越的腫瘤抑制效果。進一步觀察單獨小分子藥物阿霉素、載藥納米顆粒甲及載藥納米顆粒乙這三個實驗組的阿霉素在肝組織中的定位。圖15為肝臟組織的共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)照片，從照片中可以看到三者的阿霉素分布具有明顯的差異性，單獨阿霉素實驗組的熒光較弱(圖15Bl)，載藥納米顆粒甲及載藥納米顆粒乙在肝實質細胞與kupffer細胞中都有分布，但載藥納米顆粒乙整體呈均勻分散狀態(tài)，并且在肝實質細胞中分布的比例要顯著高于載藥納米顆粒甲(圖15C1，15D1)。這種在肝臟組織中藥物分布模式的差異性解釋了三者在抑制肝原發(fā)性腫瘤發(fā)展中起的功效的不同。單獨阿霉素在體內代謝過快，在較低的阿霉素給藥劑量下，到達肝組織的有效藥量比較低，不能達到抑制與治療的效果。載藥納米顆粒甲與肝實質細胞的接觸未能高效地進入肝實質細胞，大部分被kupffer細胞吞噬。載藥納米顆粒乙由于表面帶有與肝實質細胞特異性結合的半乳糖配體基團，在長循環(huán)的過程中，能不斷與肝細胞進行接觸，最終在去唾液酸糖蛋白受體的介導下通過內吞途徑進入肝實質細胞，所以載藥納米顆粒乙對肝細胞的靶向性在降低體內毒性的同時，并且增加了對癌變細胞的殺傷能力，故此能起到抑制新腫瘤的生成或者已有腫瘤的生長。權利要求納米顆粒甲，為如下(a)或(b)(a)式(I)所示化合物為殼層、式(II)所示化合物為內核的納米顆粒；式(I)；n1＝2-400；式(II)；(b)式(I)所示化合物和式(III)所示化合物為殼層、式(II)所示化合物為內核的納米顆粒；式(III)；n2＝2-400。F2010100018083C00011.tif,F2010100018083C00012.tif,F2010100018083C00013.tif2.如權利要求1所述的納米顆粒甲，其特征在于nl=2-120;n2=2-120。3.如權利要求1或2所述的納米顆粒甲，其特征在于(a)所述的納米顆粒甲中，式(I)所示化合物與式(II)所示化合物的物質的量的比值為1:(0.5-5.1);(b)所述的納米顆粒甲中，式(I)所示化合物、式(III)所示化合物與式(II)所示化合物的物質的量的比值為(0.5-0.9):(0.03-0.24):(1.4-2.0)。4.如權利要求1至3中任一所述的納米顆粒甲，其特征在于(a)所述的納米顆粒甲采用如下方法制備以異辛酸亞錫為催化劑，用式(I)所示化合物引發(fā)式(II)所示化合物聚合，得到納米顆粒甲；(b)所述的納米顆粒甲采用如下方法制備以異辛酸亞錫為催化劑，用式(I)所示化合物和式(III)所示化合物引發(fā)式(II)所示化合物聚合，得到納米顆粒甲。5.如權利要求4所述的納米顆粒甲，其特征在于(a)所述的納米顆粒甲的制備方法中所述聚合反應中，式(I)所示化合物、式(II)所示化合物和異辛酸亞錫的物質的量的比值為(0.05-0.1):(0.5-2):(0.025-0.05)，反應條件為40-8(TC，反應溶劑為二氧六環(huán)、二甲亞砜或四氫呋喃；(b)所述的納米顆粒甲的制備方法中所述聚合反應中，式(I)所示化合物、式(III)所示化合物、式(II)所示化合物和異辛酸亞錫的物質的量的比值為(o.5-o.9):(o.i-o.5):6:o.5;反應條件為6crc，反應溶劑為二甲亞砜。6.將權利要求1至5中的(b)所述納米顆粒進行化學修飾得到的納米顆粒乙；所述化學修飾為將所述納米顆粒甲中的式(II)所示化合物的疊氮基還原為氨基。7.將權利要求6所述納米顆粒乙進行化學修飾得到的納米顆粒丙；所述化學修飾為將所述納米顆粒乙中的所述氨基與乳糖酸進行化學連接。8.—種制備納米顆粒的方法，包括如下步驟以式(IV)所示化合物中的至少一種作為引發(fā)劑，以異辛酸亞錫為催化劑，引發(fā)式(II)所示化合物聚合，得到納米顆粒；OH式(IV)n=2-400為-0CH3或_N3。9.一種藥物輸送載體，它的活性成分為權利要求1至7中任一所述的納米顆粒'10.—種納米藥物，它的活性成分為如下復合物權利要求1至7中任一所述的納米顆粒及其負載的藥物組成的復合物。全文摘要本發(fā)明公開了一種生物相容性納米顆粒及其作為藥物輸送載體的應用。本發(fā)明提供的納米顆粒為如下(a)或(b)(a)式(I)所示化合物為殼層、式(II)所示化合物為內核的納米顆粒，n1＝2-400；(b)式(I)所示化合物和式(III)所示化合物為殼層、式(II)所示化合物為內核的納米顆粒，n2＝2-400。本發(fā)明還提供了所述納米顆粒的制備方法，應用以及將所述納米顆粒進行修飾得到的修飾后納米顆粒。本發(fā)明得到的納米顆粒具有良好的生物相容性及可生物降解性，方便進行進一步的配體修飾，用于藥物的靶向輸送。經(jīng)乳糖修飾的納米顆粒能攜載阿霉素更有效進入肝癌組織的病變細胞，具有優(yōu)于阿霉素的治療效果。該納米顆?？蓮V泛適用于藥物輸送的納米載體領域。式(I)；式(II)；式(III)。文檔編號A61P35/00GK101732721SQ201010001808公開日2010年6月16日申請日期2010年1月5日優(yōu)先權日2009年1月15日發(fā)明者吳卷,熊夢華,王均申請人:中國科學技術大學