專利名稱：一種用于治療老年癡呆癥的細胞因子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于治療老年癡呆癥的細胞因子，具體涉及一種用于治療老年癡
呆癥的粒細胞集落剌激因子及其在制備藥物中的用途。
背景技術：
老年癡呆癥，又稱阿爾茨海默病(Alzheimer' s disease, AD)，是發(fā)生在老年 期及老年前期的一種原發(fā)性退行性腦病，是指一種持續(xù)性高級神經功能活動障礙，即在 沒有意識障礙的狀態(tài)下，記憶、思維、分析判斷、視空間辨認、情緒等方面的障礙。其特征 性病理變化為大腦皮層萎縮，并伴有P-淀粉樣蛋白(13-amyloid, A13)沉積，神經原 纖維纏結(neurofibrillary tangles, NFT)，大量記憶性神經元數目減少，以及老年斑 (senil印l卿e， SP)的形成。 目前已經進入臨床試驗或者臨床應用的治療老年癡呆癥的方法很多?；旧蟻?說，能降低腦中AP沉積/水平的方法都可以提高認知功能。比如用不同形式的AP片 段對轉基因動物進行主動和被動免疫，不僅降低了腦中的水平，而且也提高了動物 的認知會g力(F. Bard et al， Peripherallyadministered antibodies against amyloid beta—p印tide enter the central nervoussystem and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease, Nat Med6 (2000) ， pp. 916-919)。還有臨床正在使用的多種 乙酰膽堿酯酶抑制劑，從天然植物中提取的小分子化合物，如姜黃素，或者能夠抑制A13合 成的小分子抑制劑。但這些方法都有各種不足，或者副作用太大，如乙酰膽堿酯酶抑制劑， 或者臨床效果不明顯，或者價格過于昂貴。 粒細胞集落剌激因子(G-CSF)是一種造血生長因子，其主要作用在于促進中性粒 細胞系造血細胞的增殖、分化和活化；另外，它還具有剌激成熟中性粒細胞從骨髓中釋放并 激活中性粒細胞的功能。G-CSF由上皮細胞，巨噬細胞和其他一些免疫細胞分泌。曾有報 道發(fā)現海馬神經再生區(qū)域的神經元和神經前體細胞表達G-CSF和它的受體(A. Schneider et al， Thehematopoietic factor G—CSF is a neuronal ligand that counteracts programmedcel1 death and drives neurogenesis, J Clin Invest 115(2005)， pp. 2083-2098)。雖然G-CSF主要用作各種白細胞減少癥的治療，因為它可以使干細胞和前 體細胞從骨髓轉移，并且用于治療由于各種化學療法引起的粒細胞減少癥，但是早在2003 年的動物實驗結果就表明G-CSF還可以減少中風帶來的腦部損傷(W.R.Schabitz et al， Neuroprotective effect of gra皿locytecolony—stimulating factor afler focal cerebral ischemia,Stroke 34(2003)，pp. 745-751 ;1.Six et al，Beneficial efffect of pharmacological mobilization ofbone marrow in experimental cerebral ischemia, Eur J Pharmacol 458(2003) ，pp. 327-328 ;1.Solaroglu et al，Neuroprotective effect of granulocyte-colonystimulating factor, Front Biosci 12 (2007)， pp.712-724)。 G-CSF除了對粒細胞分化和干細胞遷移有一定的調節(jié)作用外，還可能有神經保護作用(如 抗凋亡禾口神經營養(yǎng)作用)(W. R. Schabitz et al， Neuroprotective effect ofgra皿locytecolony-stimulating factor after focal cerebral ischemia, Stroke 34(2003)， pp. 745—751 ;C丄Gibson et al， G—CSF suppresses edema formationand reduces interleukin—lbeta expression after cerebral ischemia in mice, JNeuropathol Exp Neurol 64 (2005)， pp. 763-769 ;Solaroglu， T. et al， Anti-apoptotic effect of gra皿locyte—colony stimulating factor after focalcerebral ischemia in the rat， Neuroscience 143(2006) ， pp.965-974)。 雖然粒細胞集落剌激因子用于臨床已有近20年的時間，在治療粒細胞減少癥方 面作用顯著，但是由于其半衰期短，需要每天靜脈或皮下注射，周期長達兩周，降低了病人 的耐受性，也增加了對醫(yī)務工作者的需求。而聚乙二醇修飾很大程度上減少了粒細胞集 落剌激因子通過腎臟的清除(粒細胞集落剌激因子的體內清除機制主要有中性粒細胞 集落剌激因子受體介導的清除和腎臟清除)，因此聚乙二醇修飾的粒細胞集落剌激因子 (PEG-GCSF)的半衰期大大延長(約為粒細胞集落剌激因子的10倍左右)，從而減少了注射 頻率，同時也提高了病人對藥物的耐受性。但是臨床研究進一步表明，盡管PEG修飾可以延 長G-CSF的半衰期，但是卻往往導致其治療活性降低，限制了 PEG-GCSF的應用范圍和效果。
J. SANCHEZ-RAMOS等人(J.SANCHEZ-RAMOS et al， Granulocytecolony stimulating factor decreases brainamyloid burden and reversescognitive impairment in Alzheimer's mice,Neuroscience 163 (2009) ，pp. 55—72)矛艮道了 G—CSF具 有降低APPPS1老鼠(老年癡呆轉基因老鼠模型)大腦中AP沉積和AP水平的作用，具有 降低腦淀粉樣沉積和逆轉認知障礙的作用。但是研究表明G-CSF治療老年癡呆癥的療效有 待于進一步提高，而且其在連續(xù)使用中還會產生一定的副作用。
發(fā)明內容
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種更有效地用于預防和/或治療老年癡呆癥且副 作用更低的藥物。 用于實現上述目的的技術方案如下 聚乙二醇修飾的粒細胞集落剌激因子(PEG-GCSF)在制備預防和/或治療哺乳動 物老年癡呆癥的藥物中的用途。 聚乙二醇修飾的粒細胞集落剌激因子在制備降低哺乳動物大腦皮層和/或海馬 中淀粉樣蛋白沉積的藥物中的用途。 聚乙二醇修飾的粒細胞集落剌激因子在制備逆轉哺乳動物認知障礙的藥物中的 用途。 在上述用途中，所述聚乙二醇可以選自單甲氧基聚乙二醇5000，單甲氧基聚乙二 醇10000，單甲氧基聚乙二醇20000和單甲氧基聚乙二醇40000中的一種或多種，優(yōu)選為單 甲氧基聚乙二醇20000。更優(yōu)選地，上述聚乙二醇修飾的粒細胞集落剌激因子為C端經聚乙 二醇修飾的粒細胞集落剌激因子。 在上述用途中，所述粒細胞集落剌激因子為天然粒細胞集落剌激因子和/或重組 粒細胞集落剌激因子。 在上述用途中，所述藥物可以為注射劑。本發(fā)明出人預料地發(fā)現，相對于G-CSF而言，PEG修飾的G-CSF在預防和/或治
4療老年癡呆癥的活性方面有了顯著的提高，PEG-GCSF能夠更明顯地降低淀粉樣斑塊的形 成，降低AP的含量，并逆轉記憶損傷。實驗表明對老年癡呆老鼠模型(APPPSl轉基因老 鼠)皮下注射G-CSF和PEG-GCSF均能夠逆轉認知損傷。短短三周治療之后，注射GCSF或 PEG-G-CSF的轉基因老鼠的大腦皮層和海馬區(qū)域的斑塊均明顯降低，病理學特征減少。然而 在注射劑量相同的條件下，PEG-GCSF在逆轉記憶損傷和減少淀粉樣斑塊(淀粉樣斑塊與認 知能力的下降有明顯關系)方面的效果都明顯好于G-CSF。究其原因就在于AP的累積會 破壞神經回路，并且間接影響整體突觸的功能，PEG-GCSF更有效地減少或清除A13斑塊，促 進神經元功能的恢復。 此外，G-CSF是一個19.6KDa的糖蛋白，已被用于治療粒細胞減少癥等，其受體 G-CSFR( 140KDa)在多種組織包括腦中都有表達，重組人粒細胞集落剌激因子也已廣泛 應用于臨床。但由于G-CSF的生物利用度通常受其血漿半衰期的限制，并且對蛋白酶敏感， 所以未經修飾的G-CSF在臨床上治療白細胞減少狀態(tài)的持續(xù)期間通常需要一天給藥一次 以上，給病人帶來很大痛苦。增加蛋白循環(huán)半衰期的一個有效途徑就是降低蛋白的清除率， 尤其是降低腎臟的清除率和受體介導的清除率。本發(fā)明將PEG與蛋白藥物G-CSF相結合降 低了其免疫原性并延長了半衰期。例如，將PEG的C端經20KD的單甲氧基聚乙二醇(Mpeg) 化學修飾，修飾的蛋白被人體內蛋白酶接觸和酶解的機會減少，血漿清除率減小，半衰期明 顯延長達46 62小時，還具有使用方便，不良反應少等優(yōu)點。 需要特別強調的是，本發(fā)明驚喜地發(fā)現與G-CSF相比，PEG-GCSF在預防和/或治 療老年癡呆癥方面的療效有顯著的提高，這是根據已有技術無法預期的，甚至是與已有技 術的啟示截然相反的。根據本發(fā)明，采用PEG-GCSF治療老年癡呆癥不但能夠更有效地預防 和/或治療老年癡呆癥，同時還具有活性蛋白的半衰期長，使用方便，不良反應少等優(yōu)點。
圖1顯示了給予G-CSF或PEG-GCSF的轉基因老鼠在水迷宮實驗中到達平臺的錯 誤數。 圖2顯示了給予G-CSF或PEG-GCSF的轉基因老鼠在水迷宮實驗中到達平臺的潛 伏期。 圖3顯示了給予G-CSF或PEG-GCSF減少了轉基因老鼠大腦皮層中的淀粉樣斑塊 的數量(Thiof lavin-S染色)。 圖4顯示了給予G-CSF和PEG-G-CSF減少了轉基因老鼠海馬中的淀粉樣斑塊的數 量(Thiof lavin-S染色)。
具體實施例方式
下面結合具體實施方式
對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
1、GSF禾口PEG-GCSF : G-CSF :購自杭州九源基因工程有限公司，商品名為吉粒芬。即通過人的G-CSF基 因在大腸桿菌中表達，并對表達產物進行純化得到的非糖基化蛋白質，其由175個氨基酸 殘基組成，具有與天然G-CSF相同的生物學特性。本品為無色透明無菌溶液，可供皮下(SC)或靜脈(IV)注射用； PEG-GCSF :在G-CSF的C端進行單甲氧基聚乙二醇20000修飾并純化得到。具體 修飾和純化方法參見"聚乙二醇定點修飾重組人類粒細胞集落剌激因子突變體的研究"，黃 巖山、金榮等，生物工程學報，2007年第23巻5期。
2、試驗方法 動物模型APPPS1轉基因老鼠；年齡7-9個月。本發(fā)明中使用的APPPS1老鼠 在5-6個月的時候其大腦皮層和海馬就有明顯的13 -淀粉樣斑塊，而這些斑塊與認知障 石尋之間有著密切的聯系(J. R. Cracchiolo， et al， Enhanced cognitive activity over and above social or physical activity-isrequired to protect Alzheimer' s mice against cognitive impairment, reduceAbeta deposition, and increase synaptic i匪noreactivity， Neurobiol LearnMem 88 (2007)，卯.277-294)。因此，本發(fā)明使用的動 物為7個月的該種老鼠，可以代表人老年癡呆中期的記憶損傷情況。
試劑葡聚糖(dextran) ， G-CSF， PEG-GCSF。
用量與注射頻率200ii g/kg ;隔天注射一次，注射兩周。 實驗模型本發(fā)明中所使用的水迷宮實驗是非常常用的檢測短期記憶的一種方法 (G. W. 20)。水迷宮試驗是近二十幾年建立起來的判斷動物學習記憶的重要實驗方法，正成 為神經藥理學、神經生理學、神經心理學、老年病學等的常用研究手段。通過動物找到水池 中央平臺的時間和錯誤率來判斷其記憶損傷的程度。 Thioflavin-S顯色Thiof lavin-S是最常用的鑒定淀粉樣斑塊的方法。 Thiof lavin-S通過特異性與P -片層結構結合而顯色(激發(fā)波長488nm)。
3、實驗過程及實驗結果 l)G-CSF和PEG-GCSF顯著提高了轉基因老鼠水迷宮實驗的成績，如圖l所示。測量 參數是老鼠到達平臺的錯誤數。比較的是在注射葡聚糖，G-CSF或者PEG-GCSF之前一天和 注射一周之后的老鼠到達平臺的錯誤數。注射葡聚糖的老鼠在注射前后沒有明顯的變化， 而注射G-CSF或者PEG-G-CSF的老鼠的水迷宮測試成績則有明顯的提高。其中注射G-CSF 的錯誤數減少了 35%，而PEG-GCSF減少了約49%。每組實驗動物5只。*代表？<0.05， 林代表P < 0. 01。 2)G-CSF和PEG-GCSF顯著提高了轉基因老鼠水迷宮實驗的成績，如圖2所示。測量 參數是老鼠到達平臺的潛伏期。比較的是在注射葡聚糖，G-CSF或者PEG-GCSF之前一天和 注射一周之后的老鼠到達平臺的潛伏期。注射葡聚糖的老鼠在注射前后沒有明顯的變化， 而注射G-CSF或者PEG-G-CSF的老鼠的水迷宮測試成績則有明顯的提高。其中注射G-CSF 的潛伏期縮短了 30X，而PEG-GCSF注射組的老鼠的潛伏期則減少了 55%。每組實驗動物 5只。氺代表P < 0. 05，林代表P < 0. 01。 3)G-CSF和PEG-GCSF減少了轉基因老鼠大腦皮層中的淀粉樣斑塊的數量，如圖3 所示。Thioflavin-S是一種最為常用的檢測淀粉樣斑塊的方法。水迷宮實驗之后，老鼠用 PBS灌注，然后用多聚甲醛固定。切片后進行Thioflavin-S染色。與注射葡聚糖的老鼠相 比，經過G-CSF和PEG-GCSF治療的老鼠不僅斑塊的數量減少，而且平均尺寸也降低了很多。
4) G-CSF和PEG-GCSF減少了轉基因老鼠海馬中的淀粉樣斑塊的數量，如圖4所示。 Thioflavin-S是一種最為常用的檢測淀粉樣斑塊的方法。水迷宮實驗之后，老鼠用PBS灌注，然后用多聚甲醛固定。切片后進行Thioflavin-S染色。與注射葡聚糖的老鼠相比，經 過G-CSF和PEG-G-CSF治療的老鼠不僅斑塊的數量減少，而且平均尺寸也降低了很多。
權利要求
聚乙二醇修飾的粒細胞集落刺激因子在制備預防和/或治療哺乳動物老年癡呆癥的藥物中的用途。
2. 聚乙二醇修飾的粒細胞集落剌激因子在制備降低哺乳類動物大腦皮層和/或海馬 中淀粉樣蛋白沉積的藥物中的用途。
3. 聚乙二醇修飾的粒細胞集落剌激因子在制備逆轉哺乳類動物認知障礙的藥物中的 用途。
4. 根據權利要求1至3中任一項所述的用途，其特征在于，所述聚乙二醇選自單甲氧 基聚乙二醇5000，單甲氧基聚乙二醇10000，單甲氧基聚乙二醇20000和單甲氧基聚乙二醇 40000中的一種或多種。
5. 根據權利要求1至4中任一項所述的用途，其特征在于，所述聚乙二醇為單甲氧基聚 乙二醇20000。
6. 根據權利要求1至5中任一項所述的用途，其特征在于，所述聚乙二醇修飾的粒細胞 集落剌激因子為C端經聚乙二醇修飾的粒細胞集落剌激因子。
7. 根據權利要求1至6中任一項所述的用途，其特征在于，所述粒細胞集落剌激因子為 天然粒細胞集落剌激因子和/或重組粒細胞集落剌激因子。
8. 根據權利要求1至7中任一項所述的用途，其特征在于，所述藥物為注射劑。
9. 根據權利要求1至8中任一項所述的用途，其特征在于，所述哺乳動物為人。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于治療老年性癡呆癥的細胞因子，即聚乙二醇修飾的粒細胞集落刺激因子(PEG-GCSF)在制備預防和/或治療老年癡呆癥的藥物中的用途。本發(fā)明發(fā)現與G-CSF相比，PEG-GCSF在預防和/或治療老年癡呆癥方面的療效有顯著的提高。采用PEG-GCSF治療老年癡呆癥不但能夠更有效地預防和/或治療老年癡呆癥，同時還具有活性蛋白的半衰期長，使用方便，不良反應少等優(yōu)點。
文檔編號A61P25/28GK101745118SQ20101000227
公開日2010年6月23日 申請日期2010年1月18日 優(yōu)先權日2010年1月18日
發(fā)明者張莉尼, 胡曉燕 申請人:胡曉燕;張莉尼