專利名稱：：一種基因工程免疫刺激因子及其免疫增效的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于DNA重組和藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及編碼一種新的免疫剌激因子(ICEM，ImmuneCo-enhancingMolecule)的DNA序列，用基因工程制備該免疫剌激因子(ICEM)的方法，以及該免疫剌激因子(ICEM)在縮短乙肝疫苗抗體產(chǎn)生時(shí)間和提高抗體效價(jià)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：乙型肝炎病毒感染(h印atitisBVirus,HBV)是全球性的公共衛(wèi)生問題，全世界約有3.5億乙型肝炎病毒感染者，我國也是乙肝高發(fā)區(qū)，約有1.2億乙肝攜帶者。我國預(yù)防乙肝病毒傳染的主要手段是接種乙肝疫苗，但是目前使用的乙肝疫苗存在免疫次數(shù)多，免疫周期長，接種人群約有10%15%對疫苗無反應(yīng)或弱反應(yīng)，急需新的方法提高疫苗的免疫效力。本發(fā)明用基因工程手段將免疫剌激因子(ICEM)基因克隆到原核表達(dá)載體并在大腸桿菌或酵母中表達(dá)純化獲得重組蛋白，與重組酵母乙肝疫苗聯(lián)用可顯著提高抗HBsAg抗體效價(jià)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新的免疫增效分子，作為乙型肝炎病毒疫苗的免疫剌激因子(ICEM)及編碼該免疫剌激因子(ICEM)的基因，并提供表達(dá)該蛋白的方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的乙型肝炎病毒疫苗的免疫剌激因子(ICEM)及其編碼基因，其基因序列和氨基酸序列分別為SEQIDNo.1和SEQIDNo.2。將該免疫剌激因子(ICEM)基因克隆到pBV220原核表達(dá)載體中，在大腸桿菌中進(jìn)行溫度誘導(dǎo)表達(dá)，收集并裂解大腸桿菌，提取包涵體，再用Ni-NATagarose柱親和純化，經(jīng)透析復(fù)性后最終得到目的蛋白。評價(jià)該蛋白對乙肝疫苗免疫效果的影響將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為三組，ICEM:乙肝疫苗=3:l組(摩爾數(shù))，l:l組，乙肝疫苗對照組。以小鼠為例，于免疫后的第15天，27天，39天取血，分離血清。ELISA法測定小鼠體內(nèi)抗HBs抗體的水平。SPSS軟件分析實(shí)驗(yàn)組和對照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白可以明顯增強(qiáng)小鼠體內(nèi)抗HBs抗體的水平。ICEM:乙肝疫苗=3:i組(摩爾比)的抗體效價(jià)明顯高于對照組和i:i組，p<o.oi，說明icem具有上調(diào)小鼠體內(nèi)抗乙肝表面抗原抗體的能力，可以增強(qiáng)乙肝疫苗的免疫效果。由此可見，ICEM可以作為一種乙肝疫苗的佐劑應(yīng)用于乙肝疫苗領(lǐng)域。ICEM與乙肝疫苗聯(lián)用，既能增強(qiáng)乙肝疫苗的免疫效果，又可以減少乙肝疫苗的注射次數(shù)。另一方面，根據(jù)ICEM對抗乙肝表面抗原抗體的特異性增效功能，可將其用于乙型肝炎病毒攜帶者和乙肝病人的治療性乙肝疫苗。圖1ICEM對Balb/c小鼠抗HBs抗體水平的影響，小鼠血清稀釋1000倍后ELISA測定小鼠體內(nèi)抗HBs抗體的水平。具體實(shí)施例方式以pBV-220質(zhì)粒為基礎(chǔ)，構(gòu)建增效劑的原核表達(dá)載體。具體步驟如下設(shè)計(jì)并合成引物P1、P2PI:5'-CCGGAATTCATGGACGTCTGGGGCCAAGGG-3';(SEQIDNo.3)P2:5'-CGCGGATCCTCAATGATGATGATGATGATGTTTACCCGGGGACAGGGAGA-3';(SEQIDNo.4)Pl、P2為擴(kuò)增編碼增效劑基因的引物。PI引入起始密碼子ATG及EcoRI酶切位點(diǎn)GAATTC;P2引入終止子TGA，6XHis及BamHI酶切位點(diǎn)GGATCC。構(gòu)建表達(dá)載體的具體步驟如下以P1、P2為引物，PCR擴(kuò)增ICEM基因編碼序列，產(chǎn)物以EcoRI和BamHI酶切(Takara公司)。以EcoRI和BamHI雙酶切pBV220質(zhì)粒。各酶切片斷瓊脂糖凝膠回收相應(yīng)大小的片段，用T4DNA連接酶連接各片段。所得到的重組質(zhì)粒即ICEM的表達(dá)載體。按常規(guī)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，從氨芐抗性菌落中分離質(zhì)粒，酶切鑒定，測序確認(rèn)。所得的細(xì)菌即為本發(fā)明的工程菌。挑取一個(gè)工程菌菌落于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)并進(jìn)行溫度誘導(dǎo)發(fā)酵首先在37t:培養(yǎng)至0D6。。=0.6，然后升溫至42tH秀導(dǎo)發(fā)酵5小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后離心收集菌體，裂解菌體，提取包涵體，包涵體粗純后用Ni-NATagarose柱親和純化，經(jīng)透析復(fù)性后最終得到目的蛋白。用Western和ELISA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所獲得的蛋白正是所需要的目的蛋白。評價(jià)該蛋白對乙肝疫苗免疫效果以小鼠為例，選取6周齡Balb/c小鼠，雌雄各半，小鼠大腿肌肉注射，免疫方案如下<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>于免疫后的第15天，27天，39天取血，分離血清。ELISA法測定小鼠體內(nèi)抗HBs抗體的水平將HBsAg蛋白包被在ELISA板上，封閉洗板后加入稀釋1000倍的小鼠血清，洗板后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠二抗，最后經(jīng)0PD底物顯色30min，2mo1硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀495nm波長讀數(shù).結(jié)果(見圖1)發(fā)現(xiàn)，ICEM:乙肝疫苗=3:1組(摩爾比)的抗體效價(jià)明顯高于對照組和i:i組，說明該蛋白具有上調(diào)小鼠體內(nèi)抗乙肝表面抗原抗體的能力，可以增強(qiáng)乙肝疫苗的免疫效果。具體應(yīng)用傳統(tǒng)乙肝疫苗的免疫效果在人群中的個(gè)體差異很大，常規(guī)注射三針以后仍有很多個(gè)體不能產(chǎn)生有足夠保護(hù)作用的抗體。本發(fā)明提供的這種新的免疫剌激因子(ICEM)與乙肝疫苗聯(lián)用，能夠增強(qiáng)乙肝疫苗的免疫原性，增加體內(nèi)抗HBs抗體的效價(jià)，從而提高疫苗的免疫效率，并減少乙肝疫苗用量和注射次數(shù)。序列表SEQIDNo.1基因核苷酸，ACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAASEQIDNo.2蛋白氨基酸GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQIDNo.3引物PI5'-CCGGAATTCATGGACGTCTGGGGCCAAGGG-3'5SEQIDNo.4引物P25'-CGCGGATCCTCAATGATGATGATGATGATGTTTACCCGGGGACAGGGAGA-權(quán)利要求一種免疫刺激因子基因，其特征在于具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。2.—種免疫剌激因子蛋白，其特征在于具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。3.如權(quán)利要求2所述的免疫剌激子蛋白或權(quán)利要求1所述的免疫剌激因子作為乙型肝炎疫苗佐劑的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于DNA重組和藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為一種基因工程免疫刺激因子及其免疫增效的應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)生物信息學(xué)及生物大分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系和免疫學(xué)原理，設(shè)計(jì)并合成該免疫刺激因子(ICEM)DNA序列，通過基因工程方法將該基因克隆到原核或真核表達(dá)載體，表達(dá)純化后獲得重組蛋白。ICEM與其他抗原交聯(lián)，可顯著增強(qiáng)這些抗原的免疫效果。ICEM與乙型肝炎病毒疫苗聯(lián)用可顯著提高疫苗的免疫效果，增加抗乙肝表面抗原抗體的產(chǎn)生。ICEM可以用作乙肝疫苗的佐劑。文檔編號A61K39/39GK101792759SQ201010022789公開日2010年8月4日申請日期2010年1月14日優(yōu)先權(quán)日2010年1月14日發(fā)明者朱乃碩,楊超,龔立申請人:復(fù)旦大學(xué)