專利名稱：全人TNFa單克隆抗體及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及TNFa結(jié)合蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自身免疫性疾病是繼癌癥和心血管疾病的第三大類疾病。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA) 是最常見的自身免疫病之一，我國(guó)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患病率約為0. 32-0. 36%，在60歲以上人 群發(fā)病率高達(dá)30 % 40 %。面對(duì)每人每年幾十萬元的進(jìn)口藥物治療費(fèi)用，患者往往只能長(zhǎng) 期忍受痛苦的化學(xué)治療，卻又收效甚微。RA的患病人群多，用藥量大，使其治療性藥物的市場(chǎng)巨大，2005年全球市場(chǎng)達(dá)到 60億美元。目前臨床治療RA的方案很多，首選用大劑量非留體抗炎藥可控制癥狀，如無效， 則臨床首選氨甲蝶呤等免疫抑制藥治療。約四分之一的患者首次發(fā)病后經(jīng)及時(shí)治療可終生 不再?gòu)?fù)發(fā)，約二分之一的患者經(jīng)治療后癥狀暫時(shí)得以緩解，但仍會(huì)反復(fù)發(fā)作，部分最終發(fā)展 為關(guān)節(jié)功能障礙；約四分之一的患者對(duì)目前所有的常規(guī)治療均無效。腫瘤壞死因子- α (TNF-α)是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病變過程中起主要作用的細(xì)胞因 子，實(shí)驗(yàn)和臨床結(jié)果均證實(shí)TNF是治療該病的適合靶點(diǎn)。國(guó)外對(duì)RA的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行了充 分的研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor alpha, TNF-α )在該疾病的病理 進(jìn)程中起十分關(guān)鍵的作用，患者或動(dòng)物模型病變關(guān)節(jié)腔內(nèi)的TNF水平異常升高。TNFa和 TNF^是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的一類同源分泌型蛋白質(zhì)，它們相互之間具有很高的同源性，二者 都可以對(duì)許多細(xì)胞類型造成多方面的影響。這兩種蛋白都可以通過與細(xì)胞膜上的受體作用 而影響細(xì)胞的生物學(xué)功能。腫瘤壞死因子TNF α能夠引起腫瘤組織出血壞死并具有多方面 功能。成熟分子由157個(gè)氨基酸組成，含有兩個(gè)二硫鍵，沒有糖基化位點(diǎn)。其前體為233個(gè) 氨基酸組成的多肽，N-端76個(gè)氨基酸組成的多肽不是信號(hào)肽，它可以把前體固定在細(xì)胞膜 上，使成熟的分泌型保留在細(xì)胞膜上。前體的成熟mRNA長(zhǎng)度為1.71Λ。在體內(nèi)主要由單核 巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。針對(duì)TNF-α的抑制劑成為迄今為止最為成功的RA治療藥物。代表藥物 如 Wyeth/Amgen 公 司 Enbrel(etanercept)， Johnson & Johnson, Schering Plough/ Centocor 公 司 Remicade(infliximab), Cambridge Antibody Technology/Abbott 的 Humira(adalimumab)。Enbrel為Amgen公司開發(fā)的制劑，是TNF-α受體和Fc的融合蛋白， 不僅對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有非常不錯(cuò)的療效，且對(duì)牛皮癬及牛皮癬型關(guān)節(jié)炎也有明顯的治療作 用，同時(shí)在促進(jìn)脊椎炎愈合的研究上，Enbrel也進(jìn)入了二期臨床。2004年銷售額是25億美 元，預(yù)計(jì)2008年可達(dá)34億美元。Remicade是一種人鼠嵌合性的抗TNF-α單克隆抗體，可 特異性結(jié)合可溶性及膜結(jié)合型TNF-α，其適應(yīng)癥包括Crohn’病，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，重癥 強(qiáng)直性脊柱炎(AQ。在2003年和2004年全球銷售額分別是22. 7億和28. 9億美元，是生 物醫(yī)藥領(lǐng)域的“重磅炸彈”。2002年12月Abbott公司的Humira成為第一個(gè)獲準(zhǔn)用于減輕 成人中到重度活動(dòng)期RA的病征和癥狀及抑制關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)損傷進(jìn)展的全人單克隆抗體。由于 是全人抗體，避免了 Remicade會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)的缺點(diǎn)。Humira與Remicade及Enbrel相比的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是給藥方法的便利上。Humira每月只需注射兩次，而Remicade和Enbrel必 須每周注射兩次。Humira市場(chǎng)占有率正逐年提高，2003年和2004年的銷售額分別是2. 8 億和8. 5億美元。2006年，全球三大抗TNF- α拮抗劑Humira與Remicade及Enbrel 3個(gè) 藥物已近 80 億美元，2008 年 Enbrel (64. 9)、Remicade (53. 3)、Humira (45. 2)、Cimzia 合計(jì) 為163億美元。這三個(gè)代表藥物的療效均比較確定，并且隨著大規(guī)模臨床試驗(yàn)的不斷開展，除RA 以外的克隆氏病、強(qiáng)直性脊柱炎、銀屑病等其他自身免疫病也相繼成為新的適應(yīng)癥，使其 市場(chǎng)更加龐大。這些生物產(chǎn)品的特異性高，靶向性好使其副作用較其他同類藥物明顯降 低，逐漸地與甲氨蝶呤合用作為RA的一線用藥，并增強(qiáng)它們對(duì)目前中至重度的風(fēng)濕性疾 病等其他自身免疫病市場(chǎng)的滲透。目前處于開發(fā)末期階段的新藥主要有UCB/Celltech 公司的⑶P-870(PEG化人源化抗TNF抗體Fab片段)和⑶P571 (人源化抗TNF單抗)， Bristol-Myers Squibb 公司的 CTLA41g(Abatac印t)，Roche 公司的 Rituxan 和 MRA 等。其 中進(jìn)展最迅速的是⑶P-870，目前已經(jīng)進(jìn)入臨床III期，⑶P-870于2006年底進(jìn)入市場(chǎng)， ⑶P-870應(yīng)用大腸桿菌進(jìn)行生產(chǎn)，使其成本降低至其他TNF抑制劑藥物的四分之一。雖然現(xiàn)有的TNF抗體類藥物被認(rèn)為較其它任何藥物的效果都好，但它們也存在很 大的缺點(diǎn)。第一，它們均來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)和純化，由于表達(dá)水平較低和生產(chǎn)能力有 限遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需求，即便是Amgen斥資5億美金創(chuàng)建了全球最大的20，000升細(xì) 胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器，這一問題依然存在(據(jù)2004年美國(guó)biopharma報(bào)告)；第二，這些抗體 的高昂成本使很大一部分患者被拒之門外，據(jù)估計(jì)，常規(guī)應(yīng)用Enbrel、Remicade和Humira 治療RA —年的費(fèi)用分別是11400、14200和16776美金，且需反復(fù)使用(據(jù)2004年美國(guó) biopharma報(bào)告)；第三，這些抗體所攜帶的Fc段具有結(jié)合補(bǔ)體和ADCC等活性，體內(nèi)應(yīng)用 會(huì)導(dǎo)致表達(dá)TNF的細(xì)胞的凋亡，會(huì)產(chǎn)生一系列副作用；第四，Remicade是人鼠嵌合性單抗， 含有1/3的鼠源蛋白成分，連續(xù)注射可以在10%以上的病人中激發(fā)人抗鼠源蛋白抗體反應(yīng) 或人抗嵌合蛋白抗體反應(yīng)，影響治療效果并可能導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)。即將上市的CDP870 是PEG化人源化抗TNF抗體Fab段[17]，其鼠源蛋白成分下降到10%，但仍然有免疫原性。 而Humir的可變區(qū)的氨基酸序列和相應(yīng)的DNA序列來自于CAT公司開發(fā)的人源抗體庫(kù)，其 Fc片段的編碼區(qū)來自人的IgGl。由此可見，該產(chǎn)品的可變區(qū)序列并非直接來自人，而是來 自起源于人B細(xì)胞的抗體庫(kù)。此外，雖然人類免疫系統(tǒng)能夠產(chǎn)生種類極其龐大的抗體，但是人或全人抗體技術(shù) 卻遇到了瓶頸人體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體的前體細(xì)胞豐度很低，即使在抗體陽(yáng)性的個(gè)體中，能 夠產(chǎn)生特異性抗體的前體細(xì)胞也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于人雜交瘤技術(shù)所需要的能夠產(chǎn)生特異性抗體細(xì) 胞數(shù)量。因此，分離、純化和富集特異性分泌抗體的B細(xì)胞成為建立全人抗體平臺(tái)的關(guān)鍵技 術(shù)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明用全人抗體技術(shù)從類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人體的B細(xì)胞中獲得抗人TNFa單克隆 抗體，發(fā)酵、純化后，采用聚乙二醇化(PEG化)方法體外改造和修飾，在保持其抗TNF活性 的同時(shí)，使之更適合體內(nèi)應(yīng)用。本發(fā)明第一方面公開了一種抗人TM^a單克隆抗體，包括重鏈與輕鏈，其輕鏈具有SEQ IDNO 3的氨基酸序列，其重鏈具有SEQ ID NO :4或SEQ ID NO 6的氨基酸序列。進(jìn)一步的，所述抗人TNFa單克隆抗體經(jīng)PEG化修飾。本發(fā)明第二方面公開了一種多核苷酸，該多核苷酸含有編碼前述抗人TM^a單克 隆抗體的重鏈和/或輕鏈的多核苷酸序列。進(jìn)一步的，編碼前述抗人TNi^a單克隆抗體的輕鏈的多核苷酸的序列為SEQ ID NO 1，編碼前述抗人TNiia單克隆抗體的重鏈的多核苷酸的序列為SEQ I0 NO :2或SEQ ID NO 5，編碼抗人TNFa單克隆全長(zhǎng)抗體的重鏈和輕鏈的多核苷酸的序列同時(shí)含有SEQ ID NO=I 與 SEQ IDNO 2 或者同時(shí)含有 SEQ ID NO :1 與 SEQ ID NO :5。本發(fā)明第三方面公開了一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，它被含有編碼前述抗人 TM^a單克隆抗體的重鏈和輕鏈的多核苷酸的載體所轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)。任何適用于對(duì)表達(dá)盒 進(jìn)行表達(dá)的細(xì)胞都可以作為宿主細(xì)胞。例如，酵母、昆蟲、植物等的細(xì)胞。優(yōu)選的，所述宿 主細(xì)胞為真核細(xì)胞，可采用不會(huì)產(chǎn)生抗體的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系，具體可以是中國(guó)倉(cāng)鼠 的卵巢細(xì)胞CH0;幼倉(cāng)鼠的腎臟細(xì)胞(BHK, ATCC CCL 10)；幼鼠的塞爾托利細(xì)胞(Sertoli cells) (TM4, Mather, Biol. R印rod. 23 :243-251(1980))；猴的腎臟細(xì)胞(COS 細(xì)胞)；通過 SV40 (C0S-7,ATCC CRL 165 1)轉(zhuǎn)化的猴的腎臟CVI細(xì)胞；人的胚腎細(xì)胞(HEK-293, Graham et al. J. GenVirol.36 :59(1977))；猴腎臟細(xì)胞(CVI ATCC CCL 70)；非洲綠猴的腎臟細(xì)胞 (VER0-76,ATCCCRL-1587)；人的子宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCC CCL 2)等。其他細(xì)胞系在本學(xué) 科領(lǐng)域的文獻(xiàn)中也比較常見。從美國(guó)模式菌種收集中心(ATCC)可以獲得多種細(xì)胞系。把核酸導(dǎo)入細(xì)胞的方法有許多種。比較常用的方法包括電穿孔技術(shù)、粒子槍技術(shù)、 磷酸鈣沉淀、直接顯微注射等等。具體方法的選擇一般取決于被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞類型，以及進(jìn)行 轉(zhuǎn)化所處的具體環(huán)境。在某些情況下，可以采用多陰離子轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體和鈣離子調(diào)節(jié)的細(xì)胞 質(zhì)基因轉(zhuǎn)化技術(shù)。本發(fā)明第四方面公開了抗人TM^a單克隆抗體的制備方法，包括下列步驟1)在適 合表達(dá)抗人TM^a單克隆抗體的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；幻分離純化獲得所述單克隆抗 體。在獲得編碼本發(fā)明的抗體的核酸序列后，可按照以下方法制備生產(chǎn)目的抗體。例 如將含有編碼目標(biāo)抗體的核酸的載體直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞，細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行培養(yǎng)， 從而誘導(dǎo)出被編碼抗體的表達(dá)。一旦獲得本發(fā)明所說的單克隆抗體，就可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的常規(guī)方法 對(duì)抗體分子進(jìn)行純化。具體純化方法包括色譜法，比如，離子交換，親和層析，尤其與蛋白質(zhì) A的特定抗原進(jìn)行親和層析，以及尺寸柱層析、離心過濾法、差異溶解度等。在很多情況下， 細(xì)胞分泌的抗體進(jìn)入培養(yǎng)液，并在培養(yǎng)液中收獲。本發(fā)明第四方面對(duì)抗人TNFa單克隆抗體通過體外活性測(cè)定和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究了該 抗體在動(dòng)物體內(nèi)的治療有效性，進(jìn)一步公開了上述抗人TM^a單克隆抗體的制藥用途?？谷?TM^a單克隆抗體可用于制備治療與TM^a相關(guān)的炎癥的藥物，如制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 的藥物。將本發(fā)明的抗人TNFa抗體用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等與TNFa相關(guān)的炎癥時(shí)的用 法用量，可參照現(xiàn)有的TNFa抗體的常規(guī)用法用量。本發(fā)明第五方面，還提供了一種醫(yī)藥組合物，其包含治療有效量的本發(fā)明的單克 隆抗體以及醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體。可作為醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體及其組分的物質(zhì)包括糖類；纖維素及其衍生物；麥芽；明膠；滑石；固體潤(rùn)滑劑；多元醇；海藻酸；乳化劑；潤(rùn)濕劑； 著色劑；調(diào)味劑；壓片劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；磷酸鹽緩沖液等。藥 物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水 或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組 合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制 造。活性成分的給藥量是治療有效量。本發(fā)明有益效果本發(fā)明采用了全人抗體技術(shù)，獲得了抗人TNFa全人抗體，對(duì)該抗體的理化及生物 活性的初步分析表明，該抗體與TNF有較好的親和力，體外能有效中和TNF對(duì)細(xì)胞的 殺傷。一方面，由于其全部氨基酸序列均與人抗體完全一致，使其對(duì)人體的免疫原性降低到 最低。其次，采用PEG化表面改性技術(shù)，以減小其被內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬的概率，延長(zhǎng)在血液循環(huán) 系統(tǒng)中的時(shí)間，同時(shí)又實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)緩釋的目的，避免了小分子抗體半衰期短的缺點(diǎn)，在保持 其抗TM^aS性的同時(shí)，使之更適合體內(nèi)應(yīng)用。與現(xiàn)有的單抗藥物相比，可以大大降低用藥 頻率。這不但進(jìn)一步降低了病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且大大減少了病人注射的痛苦，減少了勞動(dòng) 力損失。
具體實(shí)施例方式以下列舉具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，實(shí)施例并非用于限制本發(fā)明的 保護(hù)范圍。實(shí)施例1抗人TNFa抗體基因的獲得取活動(dòng)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人外周血5毫升，用淋巴細(xì)胞分離液分離白細(xì)胞，進(jìn)行 培養(yǎng)，根據(jù)ELISA結(jié)果鑒定陽(yáng)性克隆。1.選擇血樣為了獲得分泌抗人TNFa的人B細(xì)胞，首先用人TNFa (購(gòu)自深圳晶美公司)常規(guī)包 被96孔板，每孔用該蛋白250ng，包被過夜。然后，用5%脫脂奶粉室溫封閉2小時(shí)，奶粉用 pH7. 2PBS配制。洗滌后，加入不同病人血清100微升，室溫溫育1小時(shí)。然后加入過氧化 物酶標(biāo)記的羊抗人IgG，室溫放置1小時(shí)。洗滌至少5遍后，加入含TMD或其他顯色劑，室 溫或37度處理20分鐘。最后，加入終止液。加入的過氧化物顯色底物加入10分鐘后，用 50 μ IlN的硫酸終止反應(yīng)，讀取450nm光密度值。選取陽(yáng)性且OD值高的血清作為獲選血樣。2.分離并富集分泌抗TNF抗體的人B-細(xì)胞3.在適當(dāng)條件下對(duì)分泌抗TNF抗體的人B-細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)4.抗體-反應(yīng)ELISA篩選用ELISA檢測(cè)抗TNFa IgG的分泌。對(duì)人B細(xì)胞培養(yǎng)液上清的樣品進(jìn)行篩選。其 中，選擇出具有最好的結(jié)合能力的兩個(gè)陽(yáng)性克隆，且為IgGl。取陽(yáng)性克隆細(xì)胞各5000-10000個(gè)，分別用Trizol (GIBCO)分離總RNA，用MMLV反 轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司產(chǎn)品)以獲取cDNA。上述操作均按照廠家說明書進(jìn)行。用下述引物 和條件進(jìn)行PCR，所用擴(kuò)增酶為ClonTech的Pfu以確保擴(kuò)增過程中減少可能的突變。輕鏈上游引物GAAATTGTGCTCACACAGTC(SEQID NO 7)輕鏈下游引物CTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC(SEQID NO 8)
重鏈上游引物GAAGTCCAGCTGGTCGAGAG(SEQ ID NO 9)重鏈下游引物GTGAGTTTTGTCACAAGATTTGGGCTC(SEQ ID NO :10) PCR條件a)反應(yīng)體系的組成
權(quán)利要求
1.一種抗人TNi^a單克隆抗體，包括重鏈與輕鏈，其輕鏈具有SEQ ID NO 3的氨基酸序 列，其重鏈具有SEQ ID NO :4或SEQ ID NO 6的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述抗人TNFa單克隆抗體，其特征在于，所述抗人TNFa單克隆抗體經(jīng) PEG化修飾。
3.一種多核苷酸，該多核苷酸含有編碼權(quán)利要求1所述抗人TM^a單克隆抗體的重鏈和 /或輕鏈的多核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述多核苷酸，其特征在于，所述編碼抗人TNFa單克隆抗體的輕鏈 的多核苷酸序列為SEQ ID NO :1，編碼抗人TM^a單克隆抗體的重鏈的多核苷酸序列為SEQ IDNO :2或SEQ ID NO :5，編碼抗人TNFa單克隆抗體的重鏈和輕鏈的多核苷酸序列同時(shí)含有 SEQ ID NO 1 與 SEQ ID NO 2 或者同時(shí)含有 SEQ ID NO 1 與 SEQ ID NO :5。
5.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，它被含有編碼權(quán)利要求1所述抗人TM^a單克隆抗體的 重鏈和輕鏈的多核苷酸的載體所轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)。
6.如權(quán)利要求5所述遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述編碼抗人TNFa單克隆 抗體的重鏈和輕鏈的多核苷酸的序列同時(shí)含有SEQ ID NO :1與SEQ ID NO :2或者同時(shí)含有 SEQ ID NO :1 與 SEQ ID NO :5。
7.如權(quán)利要求5或6所述遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述真核細(xì)胞為CHO細(xì)胞。
9.一種抗人TM^a單克隆抗體的制備方法，包括下列步驟1)在適合表達(dá)抗人TM^a單 克隆抗體的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求5-8任一權(quán)利要求所述宿主細(xì)胞；2)分離純化獲得所述單 克隆抗體。
10.如權(quán)利要求1或2所述抗人TNFa單克隆抗體的用途，為用于制備治療與TNFa相關(guān) 的炎癥的藥物。
11.如權(quán)利要求10所述抗人TNFa單克隆抗體的用途，其特征在于，所述治療與TNFa相 關(guān)的炎癥的藥物為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物。
12.一種醫(yī)藥組合物，其包含權(quán)利要求1或2所述抗人TNFa單克隆抗體以及醫(yī)藥學(xué)上 可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種全人TNFa單克隆抗體及其制備與應(yīng)用。本發(fā)明采用了全人抗體技術(shù)，獲得了抗人TNFa全人抗體，對(duì)該抗體的理化及生物活性的初步分析表明，該抗體與TNF有較好的親和力，體外能有效中和TNF對(duì)L929細(xì)胞的殺傷。本發(fā)明的全人TNFa單克隆抗體對(duì)人體的免疫原性降低到最低。采用PEG化表面改性技術(shù)，避免了小分子抗體半衰期短的缺點(diǎn)，在保持其抗TNFa活性的同時(shí)，使之更適合體內(nèi)應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102127167SQ20101002284
公開日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月15日
發(fā)明者倪健 申請(qǐng)人:蘇州工業(yè)園區(qū)晨健抗體組藥物開發(fā)有限公司