專利名稱：表皮生長因子受體模擬表位肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及表皮生長因子受體模擬表位肽 及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
表皮生長因子受體(EGFR)是一個(gè)分子量為170KD的酪氨酸激酶受體，它對(duì)于不同 細(xì)胞的增殖和分化起著相當(dāng)重要的作用。細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和EGFR的信號(hào)通路的增強(qiáng)有著 密切的聯(lián)系。EGFR的信號(hào)通路的激活會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的增殖、腫瘤的侵襲、腫瘤內(nèi)部的血管新 生和腫瘤的轉(zhuǎn)移。EGFR在許多上皮源性腫瘤中過表達(dá)，而且過表達(dá)的水平與患者的預(yù)后有 著密切的聯(lián)系。EGFR的過表達(dá)通常是由基因的擴(kuò)增，亦或者是由于表皮生長因子突變引起 的。最常見的EGFR的突變體是表皮生長因子受體III型變異體(EGFRvIII)，它主要缺失了 編碼序列第2外顯子到第7外顯子的801堿基，這直接導(dǎo)致了 EGFR胞外區(qū)267個(gè)氨基酸的 缺失，并在外顯子連接處形成了一個(gè)新的甘氨酸。EGFRvIII在腦膠質(zhì)瘤，乳腺癌，非小細(xì)胞 肺癌和前列腺癌中可被檢測(cè)到，在正常組織中不表達(dá)。由于EGFR在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程有著重要的影響，因此針對(duì)EGFR的治療方法也 在不斷的發(fā)展。mAb806 單克隆抗體(Luwor RB 等，Monoclonalantibody 806 inhibits the growth of tumor xenografts expressing either thede2~7 or amplified epidermal growth factor receptor (EGFR) but notwild-type EGFR. Cancer Res. 2001 ；61(14) 5355-61.)能夠較特異地識(shí)別過表達(dá)的EGFR和EGFRvIII，研究表明mAb806能夠抑制 過表達(dá)EGFR或表達(dá)EGFRvIII的細(xì)胞生長。臨床I期研究表明，mAb806單抗的人鼠嵌 合體CH806能夠特異地靶向腫瘤組織(Scott AM等，A phase I clinical trialwith monoclonal antibody ch806 targeting transitional state and mutantepidermal growth factor receptors. Proc Natl Acad Sci USA. 2007 ；104(10) :4071-6.)。mAb806 單抗識(shí)別 EGFR 上的多肽序列為 287CGAD SYEMEEDGVRKC302 (Johns TG 等，Identification of the epitopefor the epidermal growth factor receptor-specific monoclonal antibody 806reveal s that it preferentially recognizes an untethered form of the receptor. JBiol Chem. 2004 Jul 16 ；279 (29) :30375-84.)。所以這段多肽序列有望 作為疫苗。但是因?yàn)檫@段多肽在正常組織中就存在，如果直接用于人體，可能會(huì)因?yàn)槊庖吣?受難以產(chǎn)生相應(yīng)的單抗，因此需要找到這段多肽的模擬表位肽(mimotope)，用于抗腫瘤疫 苗的研制。本發(fā)明人在前期研究中篩選到了一個(gè)單克隆抗體12H23(國際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/ CN2009/074090)，它能夠識(shí)別EGFRvIII和過表達(dá)的EGFR，并且在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中能夠有效 的抑制HuH7-EGFRvIII人肝癌細(xì)胞及SMMC-7721細(xì)胞的生長。研究發(fā)現(xiàn)該抗體的表位多肽 序列也是 “tGADSYEMEEDGVRKC302。單克隆抗體應(yīng)用于臨床仍舊存在著一些限制，比如高昂的治療費(fèi)用，仍不夠理想 的療效，來自鼠抗或嵌合抗體的副作用以及需要多次免疫才能產(chǎn)生足夠的效價(jià)。如果用抗 體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)模擬多肽來免疫人體，使人體自身產(chǎn)生主動(dòng)免疫，并能夠持續(xù)產(chǎn)生抗體，就有可能解決單克隆抗體所不能解決的問題。模擬表位肽，在結(jié)構(gòu)上同抗體結(jié)合表位類似， 但氨基酸序列有可能是不同的，這樣有利于在人體內(nèi)大量產(chǎn)生針對(duì)該表位的抗體。因此，本 領(lǐng)域迫切需要找到所述表位多肽的模擬表位肽，使其能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生主動(dòng)免疫的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供表皮生長因子受體模擬表位肽及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的還在于提供一種具有免疫原性的物質(zhì)及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的還在于提供含有所述受體模擬表位肽或具有免疫原性的物質(zhì)的藥 物組合物。在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的多肽，所述的多肽是選自如SEQ IDNO 1或 SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽。在本發(fā)明的另一方面，提供一種具有免疫原性的物質(zhì)，所述的物質(zhì)連接有抗原，所 述的抗原含有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列；或者，所述的物質(zhì)能表達(dá) 出抗原，所述的抗原含有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的具有免疫原性的物質(zhì)是連接(偶聯(lián))有抗原的蛋白大分子。在另一優(yōu)選例中，所述的具有免疫原性的物質(zhì)所述的具有免疫原性的物質(zhì)包括 鑰孔戚血藍(lán)素；以及偶聯(lián)于所述鑰孔戚血藍(lán)素的抗原，所述的抗原含有SEQ ID NO :1或SEQID NO :2所
示的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的抗原包括如SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的多肽；以及與所述的多肽相連的連接肽，所述的連接肽具有1-20個(gè)(較佳地4-10個(gè))氨基酸。在另一優(yōu)選例中，所述的連接肽位于SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2所示氨基酸序 列的多肽的羧基端。在另一優(yōu)選例中，所述的連接肽具有SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸編碼所述的多 肽。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于制備誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的的藥物 組合物，所述的抗體識(shí)別表皮生長因子受體。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的多肽用于制備預(yù)防或治療腫瘤的藥物組合物。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的具有免疫原性的物質(zhì)的用途，用于制備誘導(dǎo)抗 體產(chǎn)生的的藥物組合物，所述的抗體識(shí)別表皮生長因子受體。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的具有免疫原性的物質(zhì)用于制備預(yù)防或治療腫瘤或口腔扁 平苔蘚及白斑的藥物組合物。在本發(fā)明的另一方面，提供一種藥物組合物，所述藥物組合物含有有效量的一種或多種O種)所述的多肽，或一種或多種O種)所述的具有免疫 原性的物質(zhì)；和藥學(xué)上可接受的載體。
在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的藥物組合物是疫苗。在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物還含有有效量的免疫佐劑。在本發(fā)明的另一方面，提供一種藥盒，所述的藥盒中含有一種或多種所述的多 肽；或一種或多種所述的具有免疫原性的物質(zhì)；或所述的藥物組合物。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。


圖1顯示了單抗12H23對(duì)富集后的噬菌體克隆的結(jié)合特異性分析。其中，1、2、3為12H23與展示特定多肽序列的M13噬菌體克隆或野生型M 13噬菌 體的結(jié)合情況，4為同型對(duì)照抗體與所述噬菌體克隆的結(jié)合情況，5為BSA與所述噬菌體克 隆的結(jié)合情況。圖2顯示了采用ELISA進(jìn)行噬菌體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析。1為結(jié)合12H23(左)與對(duì)照IgG(右)的噬菌體與G-HCL的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合情況；2為結(jié)合12H23 (左)與對(duì)照IgG (右)的噬菌體與N12-806的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合情況；3為結(jié)合12H23(左)與對(duì)照IgG(右)的噬菌體與Sl-GFP的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合情況；4為結(jié)合12H23(左)與對(duì)照IgG(右)的噬菌體與ccl6的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合情況；5為結(jié)合12H23(左)與對(duì)照IgG(右)的噬菌體與對(duì)照肽的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合情況。圖3顯示了 ELISA分析合成多肽與12H23的結(jié)合效率。其中，1為12H23抗體結(jié)合到合成多肽WHTEILKSYPHE-KLH ；2為12H23抗體結(jié)合到 合成多肽LPAFFVTNQTQD-KLH ；3為12H23抗體結(jié)合到合成多肽對(duì)照肽-KLH ；4為12H23抗體 結(jié)合到KLH。圖4顯示了 Wfestern blot檢測(cè)抗多肽血清與EGFRvIII或EGFR過表達(dá)的細(xì)胞系 的反應(yīng)性。單克隆抗體12H23或模擬表位肽誘導(dǎo)的抗體(鼠血清中)與Huh7-EGFRVIII和 A431細(xì)胞裂解蛋白的結(jié)合情況，EGFRvIII和EGFR分別可在130kDa和170kDa檢測(cè)到(泳 道1，陽性對(duì)照)，由WHTEILKSYPHE-KLH偶聯(lián)物免疫的小鼠血清(泳道2)與細(xì)胞裂解蛋白 在130kDa和170kDa產(chǎn)生條帶，由LPAFFVTNQTQD-KLH偶聯(lián)物免疫的小鼠血清(泳道3)與 細(xì)胞裂解蛋白在130kDa和170kDa產(chǎn)生條帶，由對(duì)照肽-KLH偶聯(lián)物免疫的小鼠血清(泳道 4)或單獨(dú)由KLH免疫的小鼠血清(泳道5)沒有條帶。圖5顯示了免疫熒光結(jié)果，所用血清或抗體分別為A、用WHTEILKSYPHE-KLH免疫 后的小鼠血清；B、用LPAFFVTNQTQD-KLH免疫后的小鼠血清；C、對(duì)照多肽-KLH免疫后的血 清；D、KLH免疫后的小鼠血清；E、12H23單抗。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，首次揭示一種表皮生長因子受體的模擬表位肽。所述 的模擬表位肽能夠競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合抗EGFR的抗體(如12H2!3)，顯示了模擬表位在生物學(xué)及結(jié) 構(gòu)上同自然表位相近。本發(fā)明的模擬表位肽有利于在動(dòng)物體內(nèi)大量產(chǎn)生特異性抗體，克服 了天然肽表位免疫原性低下、不能產(chǎn)生足夠抗體的技術(shù)難題。如本文所用，所述的“模擬表位肽”是指具有SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的多肽(如表1)或其衍生肽，其在生物學(xué)及結(jié)構(gòu)上同表皮生長因子受體的自然表 位287cgadsyemeedgvrkc3°2相近，具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗表皮生長因子受體的抗體的功能。所 述的“模擬表位肽”在文中也簡(jiǎn)稱為“本發(fā)明的表位肽，，或“所述的表位肽”。本發(fā)明中，術(shù) 語“多肽”、“蛋白”可互換使用。表 1
序列SEQ ID NO 1WHTEILKSYPHESEQ ID NO 2LPAFFVTNQTQD如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原 始環(huán)境即是天然環(huán)境)。例如，活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純 化的，但同樣的多聚核苷酸和多肽如果與天然狀態(tài)一起存在的其他物質(zhì)分開，則為分離純 化的。如本文所用，“免疫活性”或“免疫原性”指由天然、重組或合成的疫苗誘導(dǎo)哺乳動(dòng) 物體內(nèi)的特異性體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。如本文所用，“免疫應(yīng)答”包括細(xì)胞性和/或體液性免疫應(yīng)答，它們足以產(chǎn)生特異性 抗表皮生長因子受體的抗體；或防止或抑制由表皮生長因子受體過度表達(dá)所導(dǎo)致的疾病。如本文所用，“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動(dòng)物而無過度不良 副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語“藥學(xué)上 可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑或稀釋劑。如本文所用，“有效量”或“免疫有效量”指以單劑或連續(xù)劑一部分給予個(gè)體的量對(duì) 治療或預(yù)防是有效的。該用量根據(jù)所治療個(gè)體的健康狀況和生理狀況、所治療個(gè)體的類別 (如非人靈長類等)、個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護(hù)程度、疫苗的配制、治療醫(yī) 師對(duì)醫(yī)療狀況的評(píng)估、及其它的相關(guān)因素而定。預(yù)計(jì)該用量將在相對(duì)較寬的范圍內(nèi)，可通過 常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定。本發(fā)明的模擬表位肽及其編碼基因單克隆抗體12H23已經(jīng)被證實(shí)它的表位同國外的單克隆抗體806是基本相同 的，能夠識(shí)別表皮生長因子受體III型變異體(EGFRvIII)和過表達(dá)的表皮生長因子受體 (EGFR)，并且在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中能夠有效地抑制HuH7-EGFRvIII人肝癌細(xì)胞和過表達(dá)EGFR 的A431人肺癌細(xì)胞的增殖。然而單克隆抗體治療在臨床上的應(yīng)用還存在著許多瓶頸，被動(dòng) 抗體免疫需要反復(fù)多次的免疫才能得到有效的效價(jià)解決這些問題的一個(gè)方法就是研發(fā)一 種新的疫苗，通過用能夠被抗體識(shí)別的模擬表位免疫小鼠，激發(fā)小鼠的主動(dòng)免疫，使其自身 產(chǎn)生生物學(xué)性質(zhì)類似于12H23的抗體，從而起到靶向治療的作用。本發(fā)明人用噬菌體文庫 對(duì)單克隆抗體12H23進(jìn)行了篩選，通過酶聯(lián)免疫法驗(yàn)證得到了 2個(gè)模擬表位(序列SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示)均能夠有效的結(jié)合單克隆抗體12H23。然后將這2個(gè)模擬多肽偶 聯(lián)大分子蛋白后免疫小鼠，評(píng)估免疫后小鼠血清中針對(duì)大分子蛋白，模擬表位和EGFRvIII 和過表達(dá)的EGFR的抗體效價(jià)，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明血清中的抗體能夠有效地識(shí)別上述抗原， 以及HuH7-EGFRvIII人肝癌細(xì)胞和過表達(dá)EGFR的A431人肺癌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本發(fā)明 人成功從噬菌體文庫中篩選到模擬表位。本發(fā)明的模擬表位肽擁有自然表位類似的生物學(xué)及化學(xué)性質(zhì)，因此在序列上相近，并且能被抗體識(shí)別。同時(shí)，這些篩選出來的肽段在空間結(jié)構(gòu)上并不需要同自然表位完全 相同，只需要擁有自然表位被抗體識(shí)別的功能。所述的模擬表位肽作為一個(gè)疫苗可解決被 動(dòng)免疫所帶來的問題并且能成為一種治療性或者預(yù)防性的新藥。在得知了本發(fā)明的模擬表位肽的氨基酸序列后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地制備 該表位肽，其可以是合成多肽、重組多肽。本發(fā)明的表位肽可以是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用 重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。本發(fā)明還包括所述模擬表位肽的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片 斷”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的模擬表位肽相同的生物學(xué)功能、結(jié)構(gòu)或 活性的多肽。本發(fā)明的模擬表位肽片斷、衍生物和類似物可以是(1)有一個(gè)或多個(gè)保守或 非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，或( 在一個(gè)或多個(gè)氨基 酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或C3)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長多肽半衰期的 化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(4)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而 形成的多肽(融合蛋白)。所述模擬表位肽本身可作為疫苗免疫動(dòng)物產(chǎn)生識(shí)別表皮生長因子受體的抗體；或 者可與其它蛋白相連接形成融合蛋白，免疫動(dòng)物以產(chǎn)生識(shí)別表皮生長因子受體的抗體；或 者可與大分子相偶聯(lián)構(gòu)成具有免疫原性的物質(zhì)；或者可被表達(dá)或展示在細(xì)胞表面或噬菌體 外殼蛋白表面上，免疫動(dòng)物以產(chǎn)生識(shí)別表皮生長因子受體的抗體。本發(fā)明的模擬表位肽的一種用途是作為藥物預(yù)防或治療表皮生長因子受體過度 表達(dá)相關(guān)疾病。所述的疾病例如是腫瘤。編碼本發(fā)明的表位肽的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是單鏈的 或是雙鏈的。術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼本發(fā)明的表位肽的多核苷酸，也 可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明模擬表位肽有相同的氨基 酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。本發(fā)明所述的多核苷酸通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。 對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì) 引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板， 擴(kuò)增而得有關(guān)序列。所述的重組法通常是將所述多核苷酸克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通 過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外還可以通過人工合成的方法來 合成有關(guān)序列。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明表位肽(或其片段，或其衍 生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(如載 體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。本發(fā)明也涉及包含所述模擬表位肽的多核苷酸的載體，以及所述的載體或模擬表 位肽編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)生產(chǎn)所述模擬表位肽的方法。包含上述的編碼所述的模擬表位肽的多核苷酸以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的 載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。所述的模擬表位肽可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外?？衫闷湮锢淼摹⒒瘜W(xué)的和 其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、 離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效 液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。免疫原性物質(zhì)由于小分子的多肽容易導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受，作為一個(gè)較佳的實(shí)施方式，將所 述的模擬表位肽與大分子相連接。所述的大分子可以是(但不限于)蛋白，有機(jī)物。作為一種優(yōu)選方式，本發(fā)明提供一種具有免疫原性的物質(zhì)，該物質(zhì)包含所述的模 擬表位肽和蛋白大分子。較佳地，所述的蛋白大分子是鑰孔戚血藍(lán)素(KLH，其序列如SEQ ID NO :3)。作為一種免疫載體，KLH是具有高度免疫原性的大分子物質(zhì)，具有將免疫原性傳遞 給偶聯(lián)的半抗原的能力。所述的模擬表位肽與蛋白大分子之間，通過化學(xué)鍵相連或相互偶聯(lián)；所述的化學(xué) 鍵是共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵。作為一種較佳的實(shí)施方式，所述的模擬表位肽與蛋白大分子之間相互偶聯(lián)，一條 蛋白大分子可與至少一條模擬表位肽相偶聯(lián)。作為一種實(shí)施方式，所述的模擬表位肽與蛋白大分子之間通過化學(xué)鍵相連；更佳 的，所述的化學(xué)鍵是肽鍵。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的具有免疫原性的物質(zhì)包括鑰孔戚血藍(lán)素(KLH) 和一條或多條模擬表位肽。在空間結(jié)構(gòu)上，所述的鑰孔戚血藍(lán)素分子的表面上偶聯(lián)模擬表 位肽。所述的模擬表位肽和蛋白大分子之間可以直接相連接(或偶聯(lián))，或者通過多肽 連接子(連接肽)連接。所述的連接子例如包括1-20個(gè)氨基酸；較佳地為4-10個(gè)氨基酸。 連接肽的設(shè)置基本上不影響所述的具有免疫原性的物質(zhì)的免疫原性。較佳的，所述的連接 肽是GGGGSC (SEQ ID NO :4)，通過末端半胱氨酸形成巰基偶聯(lián)，將模擬表位肽連接于KLH。在本發(fā)明的實(shí)施例中，在模擬表位肽的羧基末端偶聯(lián)了連接肽，再與鑰孔戚血藍(lán) 素(KLH)偶聯(lián)(一個(gè)KLH偶聯(lián)有多條模擬表位肽)，用該偶聯(lián)蛋白多次免疫小鼠后，取小鼠 血清后ELISA檢測(cè)效價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清中的抗體不僅針對(duì)KLH，模擬表位，還針對(duì)mN2-806 與EGFRVIII。免疫印跡實(shí)驗(yàn)證明了血清中的抗體能夠結(jié)合表達(dá)EGFRVIII的HuH7-EGFRvIII 人肝癌細(xì)胞和過表達(dá)的EGFR的A431人肺癌細(xì)胞系。本發(fā)明人又做了上述細(xì)胞的免疫 熒光實(shí)驗(yàn)，結(jié)果同免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。雖然在合成多肽結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，合成的多肽 LPAFFVTNQTQD同12H23的親和力較低，但在免疫印跡與免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，它所誘導(dǎo)產(chǎn)生的 抗體的生物學(xué)特性與WHTEILKSYPHE并無不同，提示合成多肽與單克隆抗體12H23的親和力 同小鼠血清中的抗體與EGFRvIII和過表達(dá)的EGFR的親和力并無正向關(guān)系。組合物本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的模擬表位肽或具有免疫原性的物質(zhì)的組合物，特別 是藥物組合物，所述的組合物也包括疫苗。該組合物可用于誘導(dǎo)產(chǎn)生抗表皮生長因子受體 的抗體。該組合物可用于預(yù)防或治療表皮生長因子受體過度表達(dá)相關(guān)疾病，所述疾病包括 (但不限于)腫瘤、口腔扁平苔蘚及白斑。包含本發(fā)明的模擬表位肽或具有免疫原性的物質(zhì)的組合物可以包含按表位肽或 具有免疫原性的物質(zhì)的實(shí)際用途所選用的緩沖劑或佐劑；還可包含適用于預(yù)定用途的其它物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員都善于選擇合適的緩沖劑，本領(lǐng)域已知有多種緩沖劑適用于預(yù)定用 途。在有些實(shí)例中，該組合物可含有藥學(xué)上可接受的賦形劑，本領(lǐng)域已知有多種而無需在 此詳細(xì)討論。藥學(xué)上可接受的各種賦形劑在多種出版物已有詳述，包括如“Remington’ s Pharmaceutical Sciences”(《雷明頓藥物科學(xué)》，第 19 版(1995) Mack Publishing Co·)?？蓪⒈景l(fā)明的組合物制備成各種劑型，如注射劑、粒劑、片劑、丸劑、膠囊、透皮藥 物等。本領(lǐng)域已知的稀釋劑包括水性介質(zhì)、植物性和動(dòng)物性油和脂肪。還可用穩(wěn)定劑、潤濕 劑和乳化劑、改變滲透壓的鹽類或維持合適PH值的各種緩沖劑和皮膚滲透增強(qiáng)劑等作為 輔助性材料。當(dāng)用作疫苗時(shí)，所述的疫苗可采用各種方法進(jìn)行配制。通常，按本領(lǐng)域熟知的各種 方法，用合適的藥用載體和/或運(yùn)載體(vehicle)配制本發(fā)明的疫苗或藥物。合適的載體 是無菌鹽水。為此也可使用其它水性和非水性等滲無菌注射液以及水性和非水性無菌懸浮 液(已知都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的藥學(xué)上可接受的載體)。另外，本發(fā)明的疫苗的配制還可含有其它成分，包括如佐劑、穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié)劑、防 腐劑等。這些成分是疫苗領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。佐劑類包括(但不限制于)弗氏佐劑；鋁 鹽佐劑；皂苷佐劑；Ribi 佐劑(Ribi ImmunoChemResearch In.，Hamilton, MT) ；Montanide ISA佐劑(Seppic,Paris,France) ；Hunter's TiterMax佐劑(CytRx Corp. ,Norcross,GA)； Gerbu 佐劑(GerbuB iotechnik GmbH, Gaiberg, Germany)等。當(dāng)用作疫苗時(shí)，可用已知的方法將本發(fā)明的模擬表位肽或具有免疫原性的物質(zhì)施 用于對(duì)象。通常采用與常規(guī)疫苗相同的施用途徑和/或模擬病原體感染路徑施用這些疫 苗。采用疫苗組合物的形式時(shí)，還可包括藥學(xué)上可接受的載體。此外，這種組合物還可包括 佐劑、矯味劑或穩(wěn)定劑等。給予本發(fā)明組合物的常規(guī)和藥學(xué)上可接受的途徑包括鼻內(nèi)、肌內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、 皮內(nèi)、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)鼻、經(jīng)口服或其它腸胃外給藥途徑。如果需要可以組合給藥途徑，或 按抗原肽或疾病情況進(jìn)行調(diào)節(jié)。疫苗可以單劑量或多劑量給予，且可以包括給予加強(qiáng)劑量 以引發(fā)和/或維持免疫力。應(yīng)以“有效量”給予本發(fā)明的模擬表位肽或具有免疫原性的物質(zhì)，即模擬表位肽或 具有免疫原性的物質(zhì)的量在所選用的給藥路徑中足以引發(fā)免疫應(yīng)答，能有效促使保護(hù)宿主 抵抗表皮生長因子受體過度表達(dá)導(dǎo)致的并發(fā)癥。在各疫苗劑份中所選用的模擬表位肽或具有免疫原性的物質(zhì)的量，是按可引發(fā)免 疫保護(hù)性應(yīng)答而無明顯的副作用的量而定。通常，給予約0. 01 μ g-10mg模擬表位肽或具有 免疫原性的物質(zhì)/kg體重，優(yōu)選0. 1 μ g-lmg模擬表位肽或具有免疫原性的物質(zhì)/kg體重， 更優(yōu)選1 μ g-lmg模擬表位肽或具有免疫原性的物質(zhì)/kg體重。施用佐劑和/或免疫刺激 劑就可提高對(duì)本發(fā)明的模擬表位肽或具有免疫原性的物質(zhì)的免疫應(yīng)答。藥盒本發(fā)明還提供了一種防治表皮生長因子過度表達(dá)導(dǎo)致的疾病的藥盒，其中含有本 發(fā)明的模擬表位肽或具有免疫原性的物質(zhì)、或含有所述模擬表位肽或具有免疫原性的物質(zhì) 的組合物。此外，為了方便給藥，所述的藥盒中還可含有注射用的針，免疫佐劑，和/或藥學(xué) 上可接受的載體，和/或使用說明書。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于
(1)本發(fā)明獲得了表皮生長因子受體的兩個(gè)模擬表位肽，以這兩個(gè)模擬表位肽作 為疫苗免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗體可以識(shí)別表皮生長因子受體。所述的模擬表位肽有利于在動(dòng)物 體內(nèi)大量產(chǎn)生特異性抗體，克服了天然肽表位免疫原性低下、不能產(chǎn)生足夠抗體的技術(shù)難題。(2)被動(dòng)免疫中最主要的問題就是抗體的半衰期短，需要反復(fù)免疫，本發(fā)明克服了 這個(gè)難題，同時(shí)也解決了單克隆鼠抗免疫原性的問題。在將來的癌癥治療中，針對(duì)EGFRVIII 和過表達(dá)的EGFR抗原特異性的主動(dòng)免疫將會(huì)是一個(gè)新的選擇。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。實(shí)施例1、細(xì)胞系的培養(yǎng)及蛋白質(zhì)抽提過表達(dá)EGFR的人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)431 (購自中國科學(xué)院)和經(jīng)轉(zhuǎn)染后表達(dá)EGFRvIII 的人肝癌細(xì)胞系 HuH7-EGFRvIII (參見 Wang H 等，Epidermal growthfactor receptor vlII enhances tumorigenicity and resistance to 5-fluorouraci1 inhuman hepatocellular carcinoma. Cancer Lett. 2009 ；279(1) :30-8.)均用添加了 10%胎牛血 清(ν/ν)和青鏈霉素(ν/ν)的DMEM培養(yǎng)基(GIBC0，Grand Island,USA)進(jìn)行培養(yǎng)。抽提 細(xì)胞蛋白后，蛋白濃度用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(BCA Protein Assay Kit ；Pierce，Rockford， IL)進(jìn)行測(cè)定，抽提后的細(xì)胞蛋白分裝并保存在-80°C。實(shí)施例2、用單克隆抗體12H23淘選PH. D_12噬菌體文庫PH. D-12噬菌體文庫購自NEB生物公司。淘選基本上按照試劑盒所提供的操作手 冊(cè)進(jìn)行，簡(jiǎn)要過程如下用包被緩沖液0. IM NaHCO3 (pH 8. 6)稀釋單克隆抗體12H23，并以終 濃度 ΙΟΟμ g/ml 包被96 孔板，4°C孵育過夜。第二天，用 TBST(50mM Tris, 150mM NaCl，pH7. 5 包含 0. 1% Tween-20 (ν/ν))洗滌 10 次后，加入 300 μ 1 封閉液(0. IM NaHC03pH 8. 6，5mg/ ml BSA)37°C孵育1小時(shí)。1小時(shí)后傾出封閉液，每孔加入10 μ 1噬菌體原液(用TBST稀釋 至100 μ 1，約1. 5X IO11個(gè)噬菌體)，37°C孵育1小時(shí)。1小時(shí)后傾出，用TBST洗滌10次， 結(jié)合上的噬菌體用 0. 2M Glycine-HCl (G-HCL ；pH2. 2)，洗脫，并馬上用 IMTris-HCl (pH9. 1) 中和，梯度稀釋洗脫的噬菌體在含四環(huán)素20 μ g/ml的LB平板上進(jìn)行滴定，第二天觀察克隆 數(shù)。剩余的噬菌體感染50ml OD約為0. 5的ER2738菌株(購自NEB)進(jìn)行擴(kuò)增，37°C劇烈 震搖過夜。第二天用PEG/NaCl沉淀回收備用。噬菌體拯救效率按以下公式進(jìn)行計(jì)算拯救 效率=(洗脫噬菌體/投放噬菌體)X 100%。在第二第三輪的淘選過程中，包被的單克隆抗體12H23的濃度分別為10 μ g/ml和 1 μ g/ml，所用的TBST濃度為0. 2%和0. 5%，其余步驟同上。結(jié)果經(jīng)過3輪的篩選，能夠與單克隆抗體12H23結(jié)合的噬菌體被成功地富集(表 2)。表 權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，其特征在于，所述的多肽是選自如SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2 所示氨基酸序列的多肽。
2.一種具有免疫原性的物質(zhì)，其特征在于，所述的物質(zhì)連接有抗原，所述的抗原含有 SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列；或者，所述的物質(zhì)能表達(dá)出抗原，所述的 抗原含有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的物質(zhì)，其特征在于，所述的具有免疫原性的物質(zhì)包括 鑰孔戚血藍(lán)素；以及偶聯(lián)于所述鑰孔戚血藍(lán)素的抗原，所述的抗原含有SEQ ID NO :1或SEQID NO :2所示的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的物質(zhì)，其特征在于，所述的抗原包括 如SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的多肽；以及 與所述的多肽相連的連接肽，所述的連接肽具有1-20個(gè)氨基酸。
5.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸編碼權(quán)利要求1所述的多肽。
6.權(quán)利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，用于制備誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的的藥物組合 物，所述的抗體識(shí)別表皮生長因子受體。
7.權(quán)利要求2-4任一所述的具有免疫原性的物質(zhì)的用途，其特征在于，用于制備誘導(dǎo) 抗體產(chǎn)生的的藥物組合物，所述的抗體識(shí)別表皮生長因子受體。
8.—種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物含有有效量的一種或多種權(quán)利要求1所述的多肽，或一種或多種權(quán)利要求2-4任一所述的 具有免疫原性的物質(zhì)；和 藥學(xué)上可接受的載體。
9.如權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物還含有有效量的免 疫佐劑。
10.一種藥盒，其特征在于，所述的藥盒中含有權(quán)利要求1所述的一種或多種多肽；或 權(quán)利要求2-4任一所述的一種或多種具有免疫原性的物質(zhì)；或權(quán)利要求8或9所述的藥物 組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及表皮生長因子受體模擬表位肽及其應(yīng)用，所述的模擬表位肽能夠競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合抗EGFR的抗體，顯示了模擬表位在生物學(xué)及結(jié)構(gòu)上同自然表位相近。本發(fā)明的模擬表位肽有利于在動(dòng)物體內(nèi)大量產(chǎn)生特異性抗體，克服了天然肽表位免疫原性低下、不能產(chǎn)生足夠抗體的技術(shù)難題。
文檔編號(hào)A61K38/10GK102127147SQ20101002300
公開日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月20日
發(fā)明者李宗海, 楊麟, 王華茂, 王海, 石必枝, 蔣華 申請(qǐng)人:上海市腫瘤研究所