專利名稱：應(yīng)用生物反應(yīng)器制備高純度乙型腦炎純化疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)的用旋轉(zhuǎn)瓶單層培養(yǎng)細胞制備疫苗的方法，有占用潔凈空間大，所用操作人 員多，易污染微生物等缺點，而常規(guī)方法制備的乙型腦炎疫苗純度不夠，殘余宿主蛋白和宿 主DNA等不容易達到較低水平；而本發(fā)明涉及的應(yīng)用生物反應(yīng)器制備乙型腦炎純化疫苗的 方法，達到了較高純度。
背景技術(shù)：
由于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶單細胞層培養(yǎng)有著占用空間大，勞動量大，所需瓶數(shù)量多，容易污 染微生物，耗能大，產(chǎn)生污物多等缺點，而常規(guī)方法制備的乙型腦炎疫苗純度不夠，殘余宿 主蛋白和宿主DNA等不容易達到較低水平；而本發(fā)明涉及的應(yīng)用生物反應(yīng)器制備乙型腦炎 純化疫苗的方法，達到了較高純度。

發(fā)明內(nèi)容
一種應(yīng)用生物反應(yīng)器培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)乙型腦炎病毒，經(jīng)濃縮，滅活，純化后制備高 純度乙型腦炎純化疫苗的方法。應(yīng)用微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)細胞制備病毒，可用濃度為10 25g/L球狀微載體， 也可應(yīng)用濃度為10 60g/L片狀微載體。病毒收獲期可達到5 15天，所收獲的病毒液 為病毒收獲液。病毒收獲液先經(jīng)過30 100倍超濾濃縮后制備成病毒濃縮液，再加入滅 活劑滅活后制備后制備成滅活病毒濃縮液。滅活病毒濃縮液，經(jīng)加入終濃度最高可為大于 2. Omg/ml至小于等于4. Omg/ml的硫酸魚精蛋白處理后lOOOOg離心5 lOmin收集病毒上 清液。病毒上清液，應(yīng)用區(qū)帶轉(zhuǎn)頭，蔗糖密度梯度，28001 35000rpm區(qū)帶離心4 8h，經(jīng) 紫外檢測儀檢測280nm紫外吸收值，收集抗原蛋白峰?？乖鞍追逦挥?0% 46%的蔗糖 濃度范圍，且和雜蛋白峰分開良好。所收集的抗原蛋白峰的蔗糖溶液經(jīng)超濾除糖后，配制成 高純度的乙型腦炎純化疫苗。根據(jù)本制備高純度乙型腦炎純化疫苗的方法，制備的高純度的乙型腦炎純化疫 苗，其宿主DNA殘留量達到不高于10pg/劑，總蛋白含量可達到0. 5 3 y g/劑，宿主蛋白 含量可達到20 50ng/劑。并且在整個制備工藝中不添加任何的防腐劑，抗生素，佐劑。


圖1應(yīng)用生物反應(yīng)器制備高純度乙型腦炎純化疫苗的工藝圖 具體實施方案本發(fā)明為一種應(yīng)用生物反應(yīng)器培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)乙型腦炎病毒，經(jīng)濃縮，滅活，純化 后制備高純度乙型腦炎純化疫苗的方法。應(yīng)用微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)細胞制備病毒，可用濃度為10 25g/L球狀微載體， 也可應(yīng)用濃度為10 60g/L片狀微載體。病毒收獲期可達到5 15天，所收獲的病毒液為病毒收獲液。病毒收獲液先經(jīng)過30 100倍超濾濃縮后制備成病毒濃縮液，再加入滅 活劑滅活后制備后制備成滅活病毒濃縮液。滅活病毒濃縮液，經(jīng)加入終濃度最高可為大于 2. Omg/ml至小于等于4. Omg/ml的硫酸魚精蛋白處理后lOOOOg離心5 lOmin收集病毒上 清液。病毒上清液，應(yīng)用區(qū)帶轉(zhuǎn)頭，蔗糖密度梯度，28001 35000rpm區(qū)帶離心4 8h，經(jīng) 紫外檢測儀檢測280nm紫外吸收值，收集抗原蛋白峰?？乖鞍追逦挥?0% 46%的蔗糖 濃度范圍，且和雜蛋白峰分開良好。所收集的抗原蛋白峰的蔗糖溶液經(jīng)超濾除糖后，配制成 高純度的乙型腦炎純化疫苗。
根據(jù)本制備高純度乙型腦炎純化疫苗的方法，制備的高純度的乙型腦炎純化疫 苗，其宿主DNA殘留量達到不高于10pg/劑，總蛋白含量可達到0. 5 3 y g/劑，宿主蛋白 含量可達到20 50ng/劑。并且在整個制備工藝中不添加任何的防腐劑，抗生素，佐劑。
權(quán)利要求
一種應(yīng)用生物反應(yīng)器培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)乙型腦炎病毒，經(jīng)濃縮，滅活，純化方法高度純化乙型腦炎純化疫苗的方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備高純度乙型腦炎純化疫苗的方法，其所用的微載體可為 濃度為10 30g/L球狀微載體，也可為濃度為10 60g/L片狀微載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備高純度乙型腦炎純化疫苗的方法，其病毒收獲期可達到 5 15天，所收獲的病毒液為病毒收獲液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備高純度乙型腦炎純化疫苗的方法，其病毒收獲液先經(jīng)過 30 100倍超濾濃縮后制備成病毒濃縮液，再加入滅活劑滅活后制備成滅活病毒濃縮液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備高純度乙型腦炎純化疫苗的方法，其滅活病毒濃縮液， 經(jīng)加入終濃度可為大于2. Omg/ml至小于等于4. Omg/ml的硫酸魚精蛋白處理后lOOOOg離 心5min收集病毒上清液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5述的制備高純度乙型腦炎純化疫苗的方法，其病毒上清液，應(yīng)用區(qū) 帶轉(zhuǎn)頭，鋪設(shè)30% 36%和50% 60%兩個蔗糖密度梯度，28001 35000rpm區(qū)帶離心 4 8h，經(jīng)紫外檢測儀檢測280nm紫外吸收值，收集抗原蛋白峰?？乖鞍追逦挥?0% 46 %的蔗糖濃度范圍，且和雜蛋白峰分開良好。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備高純度乙型腦炎純化疫苗的方法，所收集的抗原蛋白峰 的蔗糖溶液經(jīng)超濾除糖后，配制成高純度的乙型腦炎純化疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7中任意一項所述的制備高純度乙型腦炎純化疫苗的方法，制備 的高純度的乙型腦炎純化疫苗，其宿主DNA殘留量達到不高于10pg/劑，總蛋白含量可達到 0. 5 3 ii g/劑，宿主蛋白含量可達到20 50ng/劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 7中任意一項所述的制備高純度乙型腦炎純化疫苗的方法，在整 個制備工藝中不添加任何的防腐劑，抗生素和佐劑。
全文摘要
應(yīng)用生物反應(yīng)器制備高純度乙型腦炎疫苗。應(yīng)用微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)細胞制備病毒，連續(xù)收獲5～15天，病毒收獲液先經(jīng)過30～100倍超濾濃縮，滅活，加入硫酸魚精蛋白處理后10000g離心5min，上清液再用兩個蔗糖密度梯度，28001～35000rpm超速區(qū)帶離心4～8h，收集抗原蛋白峰，經(jīng)超濾除糖后，配制成高純度的乙型腦炎純化疫苗。本方法制備的高純度的乙型腦炎純化疫苗，其宿主DNA殘留量達到≤10pg/劑，總蛋白含量可達到0.5～3μg/劑，宿主蛋白含量可達到20～50ng/劑。并且在整個制備工藝中不添加任何的防腐劑，抗生素和佐劑。
文檔編號A61K39/12GK101804201SQ20101010258
公開日2010年8月18日 申請日期2010年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日
發(fā)明者楊國松 申請人:福爾生物制藥股份有限公司