專(zhuān)利名稱(chēng)：小干擾核酸和藥物組合物及其制藥應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于抑制乙型肝炎病毒基因表達(dá)的小干擾核酸和含有該小干擾 核酸作為活性成分的藥物組合物以及所述小干擾核酸在制備用于預(yù)防和/或治療乙型肝 炎的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乙型病毒性肝炎簡(jiǎn)稱(chēng)乙型肝炎，是一種由乙型肝炎病毒(h印atitis Bvirus,HBV) 引起的傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)，全球乙肝病毒攜帶者超過(guò)了 20億人，其中3. 6 億乙肝慢性患者的病情正在惡化，每年約有100萬(wàn)人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和 原發(fā)性肝細(xì)胞癌。中國(guó)是世界范圍內(nèi)感染HBV人數(shù)最多的國(guó)家，乙型肝炎病毒(HBV)感染率 高達(dá)57. 63%。全國(guó)現(xiàn)有慢性乙肝病人2000萬(wàn)，每年乙肝新發(fā)病人數(shù)約50萬(wàn)，每年有23. 7 萬(wàn)人死于乙型肝炎相關(guān)的疾病，其中有15. 6萬(wàn)人死于肝癌。據(jù)中國(guó)肝炎防治基金會(huì)2006 年報(bào)道，我國(guó)每年用于治療慢性肝炎、肝硬化、肝癌的直接醫(yī)療耗費(fèi)約300億元人民幣，HBV 造成的直接經(jīng)濟(jì)損失約為3600億元/年。每人年均醫(yī)療花費(fèi)高達(dá)觀864. 89元人民幣，是 我國(guó)2005年人均⑶P的2. 12倍。由此可見(jiàn)，乙型肝炎不僅嚴(yán)重危害我國(guó)人民的健康，而且 還為國(guó)家?guī)?lái)嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。治療乙肝的方法主要包括抗病毒復(fù)制、提高機(jī)體免疫功能、保護(hù)肝細(xì)胞、促進(jìn)肝細(xì) 胞再生以及中醫(yī)藥治療、基礎(chǔ)治療及心理治療等綜合治療。全球公認(rèn)的防治乙型肝炎的藥 物主要可分為干擾素、核苷類(lèi)似物2大類(lèi)。干擾素作為乙肝治療藥物已使用了較長(zhǎng)時(shí)間，其 治療終末應(yīng)答率只有30%，即使和其他抗病毒藥物聯(lián)合使用或增加劑量后，其治療終末應(yīng) 答率也只有50%，且停藥、減量或減少注射次數(shù)后易復(fù)發(fā)，不良反應(yīng)明顯增加。另外，長(zhǎng)期使 用會(huì)誘發(fā)干擾素抗體，失去藥效。核苷類(lèi)似物起效快，但終末應(yīng)答率也不高，且核苷類(lèi)似物 只抑制肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的病毒，對(duì)肝細(xì)胞核內(nèi)的CCC-DNA沒(méi)有作用，需要長(zhǎng)期維持用藥。長(zhǎng)期用 藥面臨的最主要問(wèn)題是病毒變異而引發(fā)的耐藥性，以及停藥后也易出現(xiàn)病毒反彈、復(fù)發(fā)率 高。更為嚴(yán)重的是少數(shù)病人停藥后出現(xiàn)肝功能急劇惡化，甚至死亡。從基因水平抑制HBV 的生成和復(fù)制來(lái)降低病毒代謝和對(duì)肝細(xì)胞的侵染無(wú)疑將是乙肝最為理想的治療手段。RNA 干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈 RNA (double-strandedRNA，dsRNA) 分子在mRNA水平關(guān)閉同源基因的表達(dá)或使該基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。但由于小干擾核酸 (siRNA)的穩(wěn)定性較差，在體內(nèi)容易被核酸酶降解，因此人們對(duì)合成的siRNA進(jìn)行化學(xué)修 飾，以增加siRNA的血清穩(wěn)定性，從而有效地抑制目的基因的表達(dá)。目前，由于人們對(duì)小干擾核酸在血清中的降解過(guò)程和機(jī)制缺乏足夠的了解，雖然 通過(guò)修飾在一定程度上提高了小干擾核酸的穩(wěn)定性，但由于引入了過(guò)量的修飾，導(dǎo)致修飾 后的小干擾核酸的產(chǎn)生了潛在的細(xì)胞毒性，且修飾后的小干擾核酸的生物學(xué)活性也受到很 大的影響。因此，開(kāi)發(fā)出一種血清穩(wěn)定的、具有良好生物活性的且細(xì)胞毒性較低的抑制乙型 肝炎病毒基因表達(dá)的小干擾核酸成為迫切需要解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有的用于抑制乙型肝炎病毒基因表達(dá)的小干擾 核酸存在的細(xì)胞毒性高且生物活性差的缺點(diǎn)，提供一種具有血清穩(wěn)定、良好生物活性的且 較低的細(xì)胞毒性特性的、用于抑制乙型肝炎病毒基因表達(dá)的小干擾核酸。乙型肝炎病毒(HBV)屬嗜肝DNA病毒科(h印adnaviridae)，基因組長(zhǎng)約3. 2kb，為 部分雙鏈環(huán)狀DNA;乙型肝炎病毒基因組含有4個(gè)開(kāi)放讀碼框(0RF，S基因區(qū)、C基因區(qū)、P 基因區(qū)和X基因區(qū))。S基因區(qū)包括S基因、前Sl基因和前S2基因，它們分別編碼S蛋白、M蛋白和L蛋 白；其中，S蛋白和M蛋白與乙型肝炎病毒的嗜肝性、基因免疫及轉(zhuǎn)錄激活密切相關(guān)。C基因區(qū)包括前C基因和C基因，它們分別編碼核殼蛋白HBeAg和BcAg，該核殼 HBeAg和HBcAg是組成乙型肝炎病毒核心部分的重要組成部分，是病毒復(fù)制的主體。P基因區(qū)包括P基因，編碼P蛋白，P蛋白含816個(gè)氨基酸，具有4個(gè)功能結(jié)構(gòu)域， 包括具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的DNA聚合酶、RNA酶H等，參與HBV復(fù)制的全過(guò)程。X基因區(qū)包括X基因，是HBV病毒基因組中最小的開(kāi)放性讀碼框，編碼長(zhǎng)度為IM 個(gè)氨基酸的蛋白，該蛋白能夠直接或間接地對(duì)病毒自身的復(fù)制與增殖產(chǎn)生影響，并且能夠 對(duì)宿主細(xì)胞中被感染的細(xì)胞的調(diào)亡和癌變過(guò)程產(chǎn)生影響。所述X、P、S、C基因的保守區(qū)在HBV基因組(Genbank登記號(hào)為U95551)相對(duì)位置 分別為 1376-1840bp,2309-3182bp 和 l-1625bpU57-837bpU816bp-2454bp0本發(fā)明提供了一種小干擾核酸，其中，該小干擾核酸的序列為正義鏈5，-CCUUGAGGCAUACUUCAAAdTdT-3，反義鏈5，-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGdTdT-3，；并且該小干擾核酸具有A1-A5之一所示方式的修飾Al)正義鏈中的胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修飾； 反義鏈中的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修飾；A2)正義鏈中的胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修飾；反義 鏈中的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修飾；A3)正義鏈中5’ -3’方向的第1、9和16位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被 氧甲基修飾，第4和11位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修飾，第5位的鳥(niǎo)嘌 呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修飾，以及第12和17位的腺嘌呤核苷酸的戊糖的 2’ -OH位被氧甲基修飾；反義鏈中5’ -3’方向的第2位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位 被氧甲基修飾，第8位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修飾，第15位的胞嘧啶核苷 酸的戊糖的2’ -OH位被氟修飾，第16位的腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修飾；A4)正義鏈中的胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修飾； 反義鏈中5’-3’方向的第2位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修飾，第1、3、8、 10和14位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修飾；A5)正義鏈中5’ -3’方向的胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被 氧甲基修飾；反義鏈中5’ -3’方向的第2位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修 飾，第8和14位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-0H位被氟修飾，第15位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修飾。本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防和/或治療乙型肝炎的藥物組合物，其中，該藥物 組合物含有本發(fā)明提供的小干擾核酸作為活性成分。此外，本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述的小干擾核酸在制備用于預(yù)防和/或治療乙型 肝炎的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的小干擾核酸通過(guò)特異性的修飾，從而在僅引入少量修飾的情況下， 即可達(dá)到增加修飾后的小干擾核酸的血清穩(wěn)定性的目的，從而降低了修飾后的小干擾核酸 分子的潛在的細(xì)胞毒性，以及修飾對(duì)小干擾核酸的生物學(xué)活性的影響，從而提供了一種能 夠有效抑制乙型肝炎病毒基因表達(dá)的小干擾核酸。


圖1顯示了本發(fā)明實(shí)施例中的小干擾核酸與對(duì)比例中的參比小干擾核酸的血清 穩(wěn)定性的檢測(cè)結(jié)果。圖2顯示了本發(fā)明實(shí)施例中的小干擾核酸與對(duì)比例中的參比小干擾核酸對(duì)乙型 肝炎病毒mRNA表達(dá)抑制活性的檢測(cè)結(jié)果。圖3顯示了本發(fā)明實(shí)施例中的小干擾核酸與對(duì)比例中的參比小干擾核酸對(duì)乙型 肝炎病毒的HBV的S抗原和E抗原表達(dá)的抑制率。圖4顯示了本發(fā)明實(shí)施例中的小干擾核酸與對(duì)比例中的參比小干擾核酸對(duì)小鼠 血清中ALT (丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、AST (谷草轉(zhuǎn)氨酶)、LT (血清總蛋白)和LDH (乳酸脫氫 酶)的血液生化指標(biāo)的影響。圖5顯示了本發(fā)明實(shí)施例中的小干擾核酸與對(duì)比例中的參比小干擾核酸對(duì)HBV轉(zhuǎn) 基因小鼠血清中HBsAg含量的影響。圖6顯示了本發(fā)明實(shí)施例中的小干擾核酸與對(duì)比例中的參比小干擾核酸對(duì)HBV轉(zhuǎn) 基因小鼠肝組織中乙型肝炎病毒的mRNA含量的抑制。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種小干擾核酸，其中，該小干擾核酸的序列為正義鏈5，-CCUUGAGGCAUACUUCAAAdTdT-3，反義鏈5，-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGdTdT-3，；并且該小干擾核酸具有A1-A5之一所示方式的修飾Al)正義鏈中的胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修飾； 反義鏈中的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修飾；A2)正義鏈中的胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修飾；反義 鏈中的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修飾；A3)正義鏈中5’ -3’方向的第1、9和16位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被 氧甲基修飾，第4和11位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修飾，第5位的鳥(niǎo)嘌 呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修飾，以及第12和17位的腺嘌呤核苷酸的戊糖的 2’ -OH位被氧甲基修飾；反義鏈中5’ -3’方向的第2位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位 被氧甲基修飾，第8位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修飾，第15位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修飾，第16位的腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修飾；A4)正義鏈中的胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修飾； 反義鏈中5’-3’方向的第2位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修飾，第1、3、8、 10和14位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修飾；A5)正義鏈中5’ -3’方向的胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被 氧甲基修飾；反義鏈中5’ -3’方向的第2位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修 飾，第8和14位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-0H位被氟修飾，第15位的胞嘧啶核苷酸的戊 糖的2’ -OH位被氟修飾。本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)用于抑制乙型肝炎病毒基因表達(dá)的小干擾核酸及其修飾方式 進(jìn)行了細(xì)致的研究，發(fā)現(xiàn)，具有上述A1-A5之一所示修飾方式的小干擾核酸不但血清穩(wěn)定 性好，并且由于引入修飾的量很少，因而降低了修飾后的小干擾核酸分子的潛在的細(xì)胞毒 性，并且小干擾核酸的生物活性所受到的影響也非常小。本發(fā)明提供的小干擾核酸的攻擊 靶位點(diǎn)序列具有SEQ IDNO :2所示的核苷酸序列，該核苷酸序列是指與如SEQ ID N0:1所示 乙型肝炎病毒基因組(Genbank登記號(hào)為U95551)的1696-1714位相對(duì)應(yīng)的乙型肝炎病毒 的mRNA序列。所述氧甲基修飾是指在核苷酸的戊糖2’ -OH的氫被甲基所取代(如式I所示)。 2，-OH是RNA與DNA的主要區(qū)別，RNA水解時(shí)，在RNA酶催化下，2，-OH首先進(jìn)攻磷酸基，在 斷開(kāi)磷酸酯鍵的同時(shí)形成環(huán)狀磷酸二酯，再在堿的作用下形成水解產(chǎn)物。在核苷酸的戊糖 2’ -OH位置引入氧甲基，能夠使小干擾核酸具有更強(qiáng)的抵抗核酸酶水解的能力。
權(quán)利要求
1.一種小干擾核酸，其特征在于，該小干擾核酸的序列為正義鏈5，-CCUUGAGGCAUACUUCAAAdTdT-3，反義鏈5，-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGdTdT-3，；并且該小干擾核酸具有A1-A5之一所示方式的修飾Al)正義鏈中的胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修飾；反義 鏈中的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修飾；A2)正義鏈中的胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修飾；反義鏈中 的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修飾；A3)正義鏈中5’ -3’方向的第1、9和16位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲 基修飾，第4和11位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修飾，第5位的鳥(niǎo)嘌呤核 苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修飾，以及第12和17位的腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH 位被氧甲基修飾；反義鏈中5’ -3’方向的第2位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲 基修飾，第8位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修飾，第15位的胞嘧啶核苷酸的戊 糖的2’ -OH位被氟修飾，第16位的腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修飾；A4)正義鏈中的胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修飾；反義 鏈中5’ -3’方向的第2位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修飾，第1、3、8、10 和14位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修飾；A5)正義鏈中5’ -3’方向的胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲 基修飾；反義鏈中5’ -3’方向的第2位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修飾， 第8和14位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修飾，第15位的胞嘧啶核苷酸的戊糖 的2，-OH位被氟修飾。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小干擾核酸，其中，該小干擾核酸具有A1、A4或A5所示方式 的修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小干擾核酸，其中，該小干擾核酸的正義鏈和反義鏈的_3’末 端dTdT之間的磷酸二酯鍵被硫代磷酸修飾。
4.一種用于預(yù)防和/或治療乙型肝炎的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物含有 權(quán)利要求1-3中的任意一項(xiàng)所述的小干擾核酸作為活性成分。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物為注射液，所述注射液還 含有藥學(xué)上可接受的載體，相對(duì)于100重量份的小干擾核酸，所述藥學(xué)上可接受的載體的 含量為100-10000000重量份。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其中，所述藥學(xué)上可接受的載體為PH值為 4. 0-9. 0的磷酸緩沖液、pH值為7. 5-8. 5的三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽緩沖液、生理鹽水或pH 為5. 5-8. 5的磷酸鹽緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其中，所述注射液還含有保護(hù)劑和/或滲透壓調(diào) 節(jié)劑；以所述注射液的總重量為基準(zhǔn)，所述保護(hù)劑的含量為0. 01-30重量％，所述保護(hù)劑選 自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一種或幾種；所述滲透壓調(diào)節(jié)劑的含量使所述注射液的滲透壓 為200-700毫滲摩爾/千克，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑為氯化鈉和/或氯化鉀。
8.權(quán)利要求1-3中的任意一項(xiàng)所述的小干擾核酸在制備用于預(yù)防和/或治療乙型肝炎 的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種小干擾核酸，該小干擾核酸的序列為正義鏈5’-CCUUGAGGCAUACUUCAAAdTdT-3’；反義鏈5’-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGdTdT-3’；該小干擾核酸具有A1-A5之一所示方式的修飾。本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防和/或治療乙型肝炎的藥物組合物，該藥物組合物含有本發(fā)明提供的小干擾核酸作為活性成分。本發(fā)明還提供了所述小干擾核酸在制備用于預(yù)防和/或治療乙型肝炎的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中通過(guò)特異性的修飾，在僅引入少量修飾的情況下，即可達(dá)到增加小干擾核酸的血清穩(wěn)定性的目的，從而降低了修飾后的小干擾核酸分子的潛在的細(xì)胞毒性，以及對(duì)生物學(xué)活性的影響。
文檔編號(hào)A61P31/20GK102140461SQ201010107338
公開(kāi)日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2010年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日
發(fā)明者張鴻雁, 梁子才 申請(qǐng)人:蘇州瑞博生物技術(shù)有限公司