專利名稱：：含有復(fù)合佐劑的結(jié)核亞單位疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本申請涉及一種結(jié)核亞單位疫苗，該結(jié)核疫苗以Ag85b、ESAT6、CFP10和HspX蛋白為抗原成份，以Al(OH)3和BCG-CpG-DNA(來源于BCG的DNA提取物)為復(fù)合佐劑。
背景技術(shù)：
：結(jié)核病是一種古老卻依然嚴重影響人類健康的傳染病，近年來，全球結(jié)核病死灰復(fù)燃，再次成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題和社會問題。世界衛(wèi)生組織重新將結(jié)核病作為重點控制的傳染病，并指出，結(jié)核病巻土重來的主要原因是大量的結(jié)核耐藥菌株的出現(xiàn)、艾滋病的流行和結(jié)核病在全球公共衛(wèi)生政策中被忽視。我國是世界第二大結(jié)核病高負擔(dān)國家，人口的大量流動是我國結(jié)核病高發(fā)的主要因素之一，每年因結(jié)核病導(dǎo)致的死亡人數(shù)是其他傳染病死亡人數(shù)之和。目前，我國除了有450萬結(jié)核病患者，尚有大量結(jié)核桿菌潛伏感染者。因此，中國的結(jié)核病疫苗研究必須立足于中國特定的國情和感染狀況。由于對結(jié)核桿菌有效的抗生素種類不多，且已出現(xiàn)了大量的結(jié)核耐藥菌株，因此要最終控制并戰(zhàn)勝結(jié)核病，就必須依賴有效的疫苗。結(jié)核疫苗根據(jù)其應(yīng)用可分為預(yù)防性疫苗和治療性疫苗。習(xí)慣所說的疫苗就是指預(yù)防性疫苗，主要起疾病預(yù)防作用；治療性疫苗具有疾病治療作用，概括地講是指在已感染結(jié)核桿菌的機體內(nèi)通過疫苗免疫調(diào)動宿主的免疫能力，殺傷或抑制入侵及潛伏的結(jié)核桿菌(尤其是潛伏感染的細菌)，從而起到治療或輔助化學(xué)藥物治療的作用?？ń槊?BCG)作為目前唯一可用的結(jié)核病疫苗，對嬰幼兒結(jié)核病特別是重型結(jié)核病有顯著預(yù)防效果，但對全人群的總體保護效果不佳，主要體現(xiàn)在兩方面一是BCG有效保護時間短、對成人無保護效果，二是卡介苗僅能預(yù)防原發(fā)感染，對已感染結(jié)核桿菌的人群幾無預(yù)防作用，故難以控制新結(jié)核病例的增長。所以理想的結(jié)核疫苗最好既能預(yù)防結(jié)核桿菌的感染，又能預(yù)防結(jié)核桿菌感染者發(fā)生結(jié)核病，因此，針對BCG上述缺陷，目前結(jié)核病疫苗研究正由早期單一尋找優(yōu)于BCG的替代疫苗，逐漸過渡到針對不同人群的預(yù)防需求、研究不同類型的結(jié)核病疫苗，主要有如下三個研究方向(1)初免疫苗，將作為BCG替代疫苗，預(yù)防結(jié)核菌原發(fā)感染。但限于當(dāng)前人類對結(jié)核病的發(fā)病機制和免疫保護機制等尚有很多不明確的地方，BCG替代疫苗的研究多年來并未取得突破性進展，該研究將是個長期過程。(2)初免-加強疫苗，加強BCG的保護效果或延長BCG的保護時間，提高現(xiàn)行疫苗對成人肺結(jié)核的保護效果。(3)已感染人群用疫苗，預(yù)防結(jié)核桿菌潛伏感染者發(fā)生結(jié)核病，或作為活動性結(jié)核病的輔助治療性疫苗。我國有近6億結(jié)核菌感染者，其中10%的人最終會發(fā)生結(jié)核病，其發(fā)病率高、人數(shù)龐大。因此，已感染人群用疫苗最有可能在短期內(nèi)對我國結(jié)核病控制產(chǎn)生巨大影響。因此在結(jié)核病疫苗的研究領(lǐng)域，逐步出現(xiàn)了采用不同免疫策略來預(yù)防同一病原體所致疾病的不同類型疫苗研究，這在疫苗研究史上絕無僅有，但可能是控制結(jié)核病的必經(jīng)階段。從目前所研究的疫苗組成角度講，結(jié)核疫苗根據(jù)其種類可分為全菌疫苗、DNA疫苗和亞單位疫苗等1)全菌疫苗包括減毒活疫苗和滅活分枝桿菌疫苗。減毒活疫苗目前研究比較集中的是重組BCG(rBCG)、減毒分枝桿菌疫苗(如營養(yǎng)缺陷株)和其他分枝桿菌載體或病毒載體疫苗。其中，rBCG研究最多，通常是在BCG中表達/過量表達特定抗原，以增強BCG保護效果，以期作為初免疫苗，用以預(yù)防結(jié)核桿菌的原發(fā)感染。其他分枝桿菌載體或病毒載體疫苗，包括以恥垢等分枝桿菌為載體、以腺病毒、痘苗病毒為載體表達具有強免疫原性的結(jié)核菌抗原的疫苗，可用于BCG接種后的加強免疫。營養(yǎng)缺陷性MTB等減毒活疫苗，由于存在變異后返祖的可能性，使其研究和應(yīng)用受到一定制約。滅活分枝桿菌疫苗的安全性好，具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，可用于潛伏感染者的預(yù)防和結(jié)核病人的輔助治療。2)DNA疫苗雖然具有較好的前景，但結(jié)核DNA疫苗的發(fā)展依賴于整體核酸疫苗的發(fā)展，目前報道的DNA疫苗免疫保護效果大多難以超過BCG。關(guān)于DNA疫苗的安全性、免疫方式、持續(xù)表達能力等眾多問題尚未得到確認。3)亞單位疫苗多以結(jié)核桿菌保護性抗原為基礎(chǔ)，主要包括結(jié)核桿菌分泌蛋白(多由RD1區(qū)基因編碼)和細胞壁蛋白以及休眠期結(jié)核桿菌表達的抗原物質(zhì)等。亞單位疫苗能特異性的誘導(dǎo)CD4+Thl細胞和CD8+CTL細胞活化，并且使用安全，是理想的疫苗形式之一。由于人群中存在遺傳多樣性，單個蛋白抗原雖然會具有一定的免疫保護性，但抗原譜窄，還不足以引起有效的免疫保護，將多個抗原或多肽融合表達有助于提高疫苗的免疫保護率。另外亞單位疫苗需要有效的佐劑輔助才能引起理想的免疫應(yīng)答，不同的免疫佐劑可以引起Thl或Th2不同方向的免疫反應(yīng)。因此亞單位疫苗在設(shè)計時主要考慮兩個因素一是抗原的選擇，二是佐劑的應(yīng)用。在抗原的選擇上，就結(jié)核病亞單位疫苗而言，結(jié)核病保護性免疫主要是細胞免疫，誘導(dǎo)細胞免疫反應(yīng)的抗原主要存在于結(jié)核分枝桿菌的細胞壁、細胞質(zhì)和培養(yǎng)濾液中，其中分泌蛋白和細胞壁表面的蛋白是主要的保護性抗原。Ag85復(fù)合物是結(jié)核桿菌主要的分泌蛋白(占30%)，可分為三個組分Ag85a、Ag85b、Ag85c，主要作用是使分枝桿菌與纖連蛋白產(chǎn)生高親和力，具有分枝酰基轉(zhuǎn)移酶的活性，是合成海藻糖二分枝酸酯所必需的，而后者是保持結(jié)核分枝桿菌細胞壁完整性所必須的重要結(jié)構(gòu)。其中Ag85b全稱為抗原85復(fù)合物B(antigen85complexB)，又名分枝?；D(zhuǎn)移酶(Mycolyltransferase85B)，纖連蛋白結(jié)合蛋白B(fibronectin-bindingproteinB)，由基因Rvl886c(基因fbp)表達。基因全長978bp，蛋白全長325氨基酸，主要參與了結(jié)核分枝桿菌細胞壁的分支?；^程。Ag85b在Genebank的序列號為ID:885785，其制備方法可以參考以下文獻DeWitL，PalouM，ContentJ.Nucleotidesequenceofthe85B—proteingeneofMycobacteriumbovisBCGandMycobacteriumtuberculosis.DNASeq.1994;4(4):267-70;HarthG，LeeBY，WangJ，ClemensDL，HorwitzMA.Novelinsightsintothegenetics,biochemistry,andimm皿ocytochemistryofthe30_kilodaltonmajorextracellularproteinofMycobacteriumtuberculosis.Infectlmmun.1996Aug;64(8):3038—47;Erratumin:InfectImmun1997Feb;65(2):852。CFP-10(10kDaculturefiltrateprotein)禾口ESAT6(earlysecretoryantigenictarget6kDa)均是結(jié)核桿菌早期分泌蛋白，均具有很強的誘導(dǎo)細胞免疫的能力。兩個蛋白的基因均屬于結(jié)核桿菌基因差別區(qū)l(RDl)，RDl區(qū)在BCG和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌中缺失。CFP-10在Genebank中的序列號為ID:886194，其制備方法可以參考以下文獻BerthetFX，RasmussenPB，RosenkrandsI，AndersenP，GicquelB.AMycobacteriumtuberculosisoperonencodingESAT—6andanovellow_molecular_massculturefiltrateprotein(CFP-10).Microbiology.1998Nov;144(Pt11):3195-203;Ba潔sPF，MehraV，RivoireB，F(xiàn)ongSJ，Bre皿anPJ，VoegtlineMS，MindenP，HoughtenRA，BloomBR，ModlinRL.Immunoreactivityofa10—kDaantigenofMycobacteriumtuberculosis.JImmunol.1992Mar15;148(6):1835_40。ESAT6在Genebank中的序列號為ID:886209，其制備方法可以參考以下文獻S0rensenAL，NagaiS，HouenG，AndersenP，AndersenAB.Purificationandcharacterizationofalow_molecular_massT—cellantigensecretedbyMycobacteri咖tuberculosis.InfectImmun.1995May;63(5):1710-7;BerthetFX，RasmussenPB，RosenkrandsI，AndersenP，GicquelB.AMycobacteriumtuberculosisoperonencodingESAT—6andanovellow_molecular_massculturefiltrateprotein(CFP-10).Microbiology.1998Nov;144(Pt11):3195-203。融合蛋白CFP10-ESAT6的制備方法可以參考以下文獻LiH，ChenJ，LiuG，YaoW，YangJ，LiuY，ZengL，TianY，WangT.Constructionandexpressionofth印rokaryoticexpressionvectorofMTBcfplO_ESAT6fusiongene.ShengWuYiXueGongChengXueZaZhi.2007Jim;24(3):636-40;WangXY，BaoL，ZhaoMC，ZhangHD，LongY.ExpressionofthefusionproteinCFP10-ESAT6ofMycobacteriumtuberculosisandthestudyofitsimm皿ogenicity.SichuanDaXueXueBaoYiXueBan.2006May;37③353_6.Chinese。HspX又名a_晶體蛋白(alpha-crystal1in)，是一種位于結(jié)核分枝桿菌細胞膜內(nèi)側(cè)的熱休克蛋白(heatshockprotein)，屬于小熱休克蛋白家族(smallheatshockproteinfamily)，由基因Rv2031c(hspX)表達?；蛉L435bp，蛋白全長144氨基酸?？赡艿淖饔檬蔷S持結(jié)核桿菌在潛伏期(無癥狀感染狀態(tài))的活性，在感染初期對于菌體復(fù)制可能也有作用，可能是結(jié)核桿菌潛伏期的一個重要靶抗原。HspX在Genebank中的序列號為ID:887579，其制備方法可以參考以下文獻HaileY，Bj皿eG，WikerHG.ExpressionofthemceA，esat—6andhspXgenesinMycobacteriumtuberculosisandtheirresponsestoaerobicconditionsandtorestrictedoxygensupply.Microbiology.2002Dec;148(Pt12):3881-6;RoupieV，RomanoM，ZhangL，etal.Imm皿ogenicityofeightdormancyregulon—encodedproteinsofMycobacteriumtuberculosisinDNA_vaccinatedandtuberculosis—infectedmice.InfectImmun，2007,75(2):941-9。目前Ag85b和ESAT6用做結(jié)核病亞單位疫苗顯示出一定的保護力。研究表明，在結(jié)核桿菌感染的小鼠體內(nèi)，ESAT6產(chǎn)生了一定的保護效果(文獻01senAW，HansenPR，5HolmA，AndersenP.EfficientprotectionagainstMycobacteriumtuberculosisbyvaccinationwithasinglesubdominantepitopefromtheESAT_6antigen.EurJImmunol2000;30:1724-1732)。而基于ESAT6和Ag85b的融合蛋白與佐劑聯(lián)用后，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了較持久的保護作用(文獻WeinrichOlsenA，vanPinxterenLA，MengOkkelsL，BirkRasmussenP，AndersenP.Protectionofmicewithatuberculosissubunitvaccinebasedonafusionproteinofantigen85bandesat-6.InfectImm皿2001j69:2773-2778)。而HspX用于亞單位疫苗的研究尚未發(fā)現(xiàn)，但有文章指出作為潛伏期表達量升高的蛋白，HspX作為結(jié)核桿菌潛伏感染者的預(yù)防性疫苗，有一定優(yōu)勢(文獻AndersenP.Vaccinestrategiesagainstlatenttuberculosisinfection.TRENDSinMicrobiology.2006Vol.15No.1)。在佐劑的應(yīng)用上，在結(jié)核亞單位疫苗中，目前研究的佐劑主要有MPL(單磷酰脂質(zhì)A，3-0-descyl-4'-monophosphoryllipidA)，弗氏完全佐劑和不完全佐劑，DDA(二甲基三十六烷基胺，dimethyldioctadecylammoniumbromide)，QS21，ASOl，AS02，AS04等。目前上市疫苗中唯一批準使用的佐劑是Al(0H)3，但是Al(0H)3主要引起Th2型免疫應(yīng)答，單獨使用于結(jié)核疫苗時，不能引起足夠的細胞免疫應(yīng)答，而后者是抗結(jié)核的主要保護性免疫。另外，A1(0H)3多次注射后不良反應(yīng)會顯著增多，而結(jié)核潛伏感染者預(yù)防或結(jié)核病輔助治療性疫苗，均需在體內(nèi)多次注射，因此，傳統(tǒng)鋁佐劑在目前的結(jié)核亞單位疫苗中不常被考慮。MPL應(yīng)用較為廣泛，單獨使用或與DDA聯(lián)合使用效果都較好(例如01senAW，WilliamsA，OkketsIM，HatchG，AndersenA.Protectiveeffectofasubunitvaccinebasedonafusionofantigen85BandESAT—6intheaerosolguineapigmodel.InfectI匪n2004;72:6146-50.)。MPL與皂武類佐劑QS21以一定量配比后再加入角鯊烯和維生素E就構(gòu)成了佐劑AS01和AS02的主要成分，后兩種佐劑在國外某些在研結(jié)核疫苗中獲得較好的效果。但這些目前效果比較好的佐劑組成復(fù)雜，價格昂貴，一方面會使最終的疫苗產(chǎn)品價格升高，另一方面也會因獲得不易而限制它們在結(jié)核疫苗研究開發(fā)和評價中的應(yīng)用。另外，含非甲基化CpG二核苷酸的寡脫氧核苷酸(CpG0DN)做為免疫剌激序列能誘導(dǎo)Thl型為主的免疫應(yīng)答，在腫瘤、過敏性疾病中有潛在的應(yīng)用價值，目前也開始逐步在疫苗佐劑中嘗試實驗和研究。雖然已合成和篩選出了一些有活性的CpG0DN序列，但由于CpG0DN的免疫剌激作用具有種屬特異性，動物實驗中有活性的未必能在人體產(chǎn)生免疫剌激作用。由于還沒有弄明白CpGODN的構(gòu)效關(guān)系，要設(shè)計并合成出對人體能產(chǎn)生免疫剌激作用的CpG0DN也非易事，并且CpG0DN的安全性還未被驗證。因此，要將CpG0DN做為疫苗佐劑，還存在一定困難。
發(fā)明內(nèi)容正如
背景技術(shù)：
中指出的，我國有近6億結(jié)核菌感染者，其中10%的人最終會發(fā)生結(jié)核病，其發(fā)病率高、人數(shù)龐大。因此，已感染人群用疫苗最有可能在短期內(nèi)對我國結(jié)核病控制產(chǎn)生巨大影響。這就需要采用不同免疫策略，研制不同類型疫苗來防治結(jié)核病。另外，從結(jié)核病目前治療的現(xiàn)狀來講，單純依靠化學(xué)藥物治療來控制結(jié)核病在人群中蔓延的效果并不令人滿意。因此開發(fā)出具有預(yù)防和治療作用的疫苗將是對化學(xué)藥物治療結(jié)核病的極有利補充?；谶@樣的需求和研發(fā)構(gòu)思，本申請的發(fā)明人將具有不同特點的結(jié)核桿菌保護性抗原組合，并篩選出適當(dāng)?shù)淖魟纬闪吮景l(fā)明的結(jié)核疫苗。在抗原的組成上，本發(fā)明的結(jié)核亞單位疫苗包含Ag85b、ESAT6、CFP10和HspX四種蛋白成份。這四種蛋白成份可各自以獨立形式存在，也可以任何兩種或三種或四種蛋白的融合蛋白的形式存在于疫苗中，優(yōu)選的存在形式為Ag85b、融合蛋白CFP10-ESAT6、HspX。這四種蛋白成份在疫苗中的重量比為0.5-2:0.5-2:0.5-2:0.5-2，優(yōu)選為i:0.5:0.5:i，以單位劑量疫苗來講，四種蛋白成份的含量為每種蛋白5-20yg，優(yōu)選為每種蛋白5-10iig，更優(yōu)選為Ag85bl0iig、ESAT65iig、CFP105yg、HspX10iig。當(dāng)以Ag85b、CFP10-ESAT6、HspX的形式存在于疫苗中時，這三種抗原的重量比組成為0.5-2:0.5-2:o.5-2.，優(yōu)選重量比為i:i:i，以單位劑量疫苗來講，這三種抗原的含量為每種蛋白5-20iig，優(yōu)選為每種蛋白10iig。Ag85b、ESAT6和CFP10蛋白屬于結(jié)核桿菌保護性抗原，作為疫苗成分免疫人體后，剌激機體產(chǎn)生對于這三種蛋白的特異性細胞免疫，當(dāng)有結(jié)核桿菌進入或潛伏于人體時，這種較強的細胞免疫有助于抑制結(jié)核桿菌的增殖，或促進其清除，對結(jié)核病的預(yù)防有關(guān)鍵作用。HspX蛋白屬于結(jié)核桿菌潛伏期優(yōu)勢蛋白，由于在潛伏期，結(jié)核桿菌的其他蛋白分泌極少，因此HspX作為疫苗成分，可以在結(jié)核桿菌潛伏期誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較強的細胞免疫，有助于清除已進入人體且處于潛伏狀態(tài)的結(jié)核桿菌，進而有利于預(yù)防結(jié)核桿菌潛伏感染者發(fā)展為結(jié)核病患者。本申請的發(fā)明人通過對上述抗原的免疫原性研究證實了Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX三種蛋白均具有良好的免疫原性，聯(lián)合使用均能發(fā)揮各自的抗原作用，它們組合形成的疫苗，不僅適用于預(yù)防結(jié)核桿菌感染，也適用于結(jié)核桿菌潛伏感染者的治療。如前述，在亞單位疫苗中，佐劑是提高抗原免疫活性的重要成份，為了保證本發(fā)明形成的亞單位疫苗能夠產(chǎn)生有效的機體免疫應(yīng)答，還需要篩選出適當(dāng)?shù)淖魟?。影響佐劑效果的因素很多，如與其配伍的蛋白種類，與蛋白的配比，佐劑的制備工藝等因素。因此適用于目前已有結(jié)核亞單位疫苗的佐劑，可能并不適用于其他組成的結(jié)核亞單位疫苗；而且，目前效果比較好的佐劑組成復(fù)雜，價格昂貴，它們的應(yīng)用一方面會使最終的疫苗產(chǎn)品價格升高，另一方面也會因獲得不易而限制它們在結(jié)核疫苗研究開發(fā)和評價中的應(yīng)用，這對于我國的結(jié)核疫苗研發(fā)、生產(chǎn)及社會承受力都會產(chǎn)生很大負擔(dān)?；谏鲜鲈颍旧暾埖陌l(fā)明人對適用于本發(fā)明結(jié)核疫苗抗原成份的佐劑進行了研究和篩選?？紤]到A1(0H)3是目前唯一在上市疫苗中使用的佐劑，其安全性已被驗證和認可，并且Al(0H)3具有緩釋作用，對疫苗的持續(xù)釋放實現(xiàn)緩釋給藥有幫助，因此希望通過與其他佐劑的配伍使用，發(fā)揮Al(0H)3的這些優(yōu)勢。而Al(0H)3多次注射后不良反應(yīng)會顯著增多，需要控制其在疫苗中的含量，這對提高需反復(fù)注射的疫苗的安全性至關(guān)重要。本申請的發(fā)明人通過前期的研究發(fā)現(xiàn)，BCG-CpG-DNA，是BCG的DNA提取物，BCG的DNA中富含未甲基化的CpG基序，具有免疫調(diào)節(jié)作用?？紤]到BCG已在人群中廣泛應(yīng)用，其DNA提取物的安全性有保障，因此本申請的發(fā)明人嘗試將BCG-CpG-DNA做為免疫佐劑和7Al(0H)3配合使用，結(jié)果意外發(fā)現(xiàn)，兩者聯(lián)合做為本發(fā)明結(jié)核亞單位疫苗的佐劑時，能有效的提高機體對本發(fā)明結(jié)核亞單位疫苗的細胞免疫應(yīng)答，促進T細胞的增殖，調(diào)節(jié)Thl/Th2的平衡轉(zhuǎn)向Thl優(yōu)勢應(yīng)答。復(fù)合佐劑的效果遠好于單獨Al(0H)3或單獨BCG-CpG-DNA的使用效果，也遠好于Al(0H)3和BCG-CpG-DNA與其他抗原成份的配伍效果，比如乙肝抗原、流腦多糖抗原等，這說明不僅a1(0h)3和BCG-CpG-DNA的聯(lián)合具有協(xié)同作用，而且Al(OH)3和BCG-CpG-DNA復(fù)合佐劑與本發(fā)明結(jié)核亞單位疫苗的抗原成分之間也有協(xié)同效果。本發(fā)明所指的BCG-CpG-DNA是BCG的DNA提取物，其為片段長短不等的BCGDNA片段的混合物，其含有未甲基化的CpG基序，因此簡稱為"BCG-CpG-DNA"。在實現(xiàn)免疫佐劑效果方面，對BCGDNA片段的大小沒有特別要求，如果優(yōu)選DNA片段不低于lkb，或更優(yōu)選為5-10kb時，能得到更好的免疫佐劑效果。BCG的DNA富含未甲基化的CpG基序，因此能產(chǎn)生免疫佐劑的效果，如果優(yōu)選BCG-CpG-DNA中CpG的質(zhì)量百分含量在15.75%-24.75%，更優(yōu)選在21.5-23.5%時，能產(chǎn)生更好的免疫佐劑效果。BCG-CpG-DNA可采用常規(guī)的細菌基因組DNA的提取方法制備獲得，也可采用TohruTokunaga等的制備方法，參見JNCI，1984，Vol,72，No.4:955-962"Antitumoractivityofdeoxyribonucleicacidfractionfrommycobacteri咖bovisBCG.I.isolation,physicochemicalcharacterization,andantitumoractivity",也可米用中國發(fā)明專利ZL200410033878.1中記載的制備方法將菌種接種于適合分枝桿菌生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期時收集菌體；菌體經(jīng)破碎后離心收集上清液；上清液經(jīng)CTAB(溴化十六烷基三甲基胺)的沉淀物用NaCl溶液溶解后用有機溶劑抽提收集無蛋白層，該無蛋白層再次抽提后的上清液用乙醇處理收集沉淀，對該沉淀進行后處理。由這些示例性的方法獲得的BCG-CpG-DNA都能用于本發(fā)明的結(jié)核亞單位疫苗，產(chǎn)生良好的免疫佐劑效果。從制備方法的簡便性上，優(yōu)選采用中國發(fā)明專利ZL200410033878.1中記載的制備方法，在此全文引用ZL200410033878.1作為參考。本發(fā)明中BCG-CpG-DNA的CpG含量可以通過高效液相檢測而獲得，例如可以采用ZL200410033878.1中記載的通過反相_高效液相法(RP-HPLC)，采用特異甲基化酶Sssl修飾CpG二核苷酸的胞嘧啶(dC)為5-甲基胞嘧啶(m5-dC)，利用核酸酶PI和細菌堿性磷酸酶(BAP)將DNA水解為單個脫氧核苷，利用反相-高效液相法(RP-HPLC)對修飾和未修飾的DNA水解樣品中m5-dC檢出量的差別而對CpG進行定量。在本發(fā)明的結(jié)核亞單位疫苗中，佐劑的組成為Al(OH)3和BCG-CpG-DNA，兩種成份的重量比為28:i-i:4，優(yōu)選為i4:3-4:3;以單位劑量疫苗來講，ai(oh)3和BCG-CpG-DNA的含量為Al(OH)30.05mg_0.7mg，BCG-CpG-DNA25iig_200Pg，優(yōu)選為Al(0H)30.lmg-0.35mg，BCG-CpG-DNA75iig。加入BCG-CpG-DNA后，不僅提高了Al(0H)3的免疫佐劑效能，而且降低了Al(0H)3的用量，本申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在配合使用的情況下，A1(0H)3只需0.35mg/劑，就能產(chǎn)生很好的免疫應(yīng)答效果，該劑量遠低于a1(0h)3在疫苗中的通常用量范圍。下表l是中國藥典三部(2005版)中有關(guān)疫苗的氫氧化鋁用量要求，對比可見，通過與BCG-CpG-DNA配伍，本發(fā)明結(jié)核亞單位疫苗中a1(0h)3的用量遠低于目前a1(0h^的常規(guī)用量。表1中國藥典三部(2005版)中疫苗用氫氧化鋁的用量要求<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本發(fā)明的有益效果1、細胞免疫是抗結(jié)核病的主要保護性免疫，其中，T淋巴細胞免疫應(yīng)答起著至關(guān)重要的作用。本發(fā)明以T淋巴細胞免疫應(yīng)答作為評價機體細胞免疫功能的基本指標，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的結(jié)核病亞單位疫苗對機體T淋巴細胞應(yīng)答具有顯著的增強效果。Th細胞是免疫系統(tǒng)重要的調(diào)節(jié)細胞和效應(yīng)細胞，根據(jù)分泌的細胞因子不同，Th細胞被分為Thl和Th2兩大類，前者主要分泌IFN-y和IL-2等，后者主要分泌IL_4、IL-5和IL-10等。Thl/Th2的動態(tài)平衡受多因素調(diào)節(jié)，其中IL-12被認為是Thl應(yīng)答的始動因子，促進ThO細胞向Thl細胞分化；活化的Thl細胞分泌IFN-y，后者有利于激活巨噬細胞等效應(yīng)性細胞，促使后者分泌NO等效應(yīng)分子，進而實現(xiàn)抑制或殺滅結(jié)核桿菌的目的?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，呼吸系統(tǒng)的多種疾病與Thl/Th2的失衡有關(guān)，對結(jié)核病而言，Thl優(yōu)勢應(yīng)答介導(dǎo)保護性免疫反應(yīng)，Th2優(yōu)勢應(yīng)答則介導(dǎo)以遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)為主的反應(yīng)，伴隨著病理性免疫損傷(Mosma皿TR，SadS.TheexpandinguniverseofT-cellsubsets:Thl，Th2andmore.ImmunolToday,1996，17:138-146.)。本發(fā)明的結(jié)核病亞單位疫苗能有效的增強機體Thl類細胞因子的產(chǎn)生，對機體Thl/Th2應(yīng)答有顯著的調(diào)節(jié)作用，使機體對結(jié)核病的免疫反應(yīng)以Thl優(yōu)勢應(yīng)答為主。2、疫苗的組成特點使疫苗具有預(yù)防和治療兩種作用。3、疫苗的佐劑成份對本發(fā)明抗原成份的輔助免疫增強作用強，其效果遠好于單獨Al(OH)3和單獨BCG-CpG-DNA，也遠好于Al(OH)3和BCG-CpG-DNA與其他疫苗活性成份的配伍效果，比如乙肝抗原、流腦多糖抗原等，這說明不僅A1(0H)3和BCG-CpG-DNA的聯(lián)合具有協(xié)同作用，而且Al(0H)3和BCG-CpG-DNA復(fù)合佐劑與本發(fā)明結(jié)核亞單位疫苗中的抗原成分之間也有協(xié)同效果。4、疫苗的佐劑成份所采用的Al(0H)3和BCG-CpG-DNA都是已廣泛用于人體的藥物或生物制品，安全性高；另外制備工藝成熟，價格低廉。圖1Ag85b蛋白的SDS-PAGE電泳圖圖2HspX蛋白的SDS-PAGE電泳圖圖3CFP10-ESAT6蛋白的SDS-PAGE電泳圖圖4本發(fā)明的結(jié)核亞單位疫苗體內(nèi)產(chǎn)生抗_Ag85b-IgG的結(jié)果圖5本發(fā)明的結(jié)核亞單位疫苗體內(nèi)產(chǎn)生抗HspX-IgG的結(jié)果圖6本發(fā)明的結(jié)核亞單位疫苗體內(nèi)產(chǎn)生抗C/E-IgG抗體的結(jié)果(C/E即融合蛋白CFP10-ESAT6)圖7-9本發(fā)明的結(jié)核亞單位疫苗促進T淋巴細胞增殖的結(jié)果圖10-12本發(fā)明的結(jié)核亞單位疫苗促進腹腔巨噬細胞分泌IL-12的結(jié)果圖13-15本發(fā)明的結(jié)核亞單位疫苗酶聯(lián)免疫斑點實驗結(jié)果圖16本發(fā)明的結(jié)核亞單位疫苗對結(jié)核桿菌感染豚鼠的臟器病變指數(shù)結(jié)果圖17本發(fā)明的結(jié)核亞單位疫苗對結(jié)核桿菌感染豚鼠的脾臟結(jié)核桿菌荷菌量結(jié)果具體實施例方式以下以實施例的方式對本發(fā)明進行優(yōu)選方式的闡述。實施例1Ag85b、CFP10-ESAT6、HspX三種抗原的制備1、Ag85b基因的克隆表達以及Ag85b蛋白的純化從genebank查獲結(jié)核桿菌H37Rv中抗原Ag85b的核酸和氨基酸序列，根據(jù)目的序列設(shè)計引物。其中，上游引物P1:5'-CACGCATATGACAGACGTGAGCC-3，(劃線部分為Ndel酶切位點)，下游引物P2:5，-TTGAATTCTCAGCCGGCGCCT-3，(劃線部分為EcoRI酶切位點)。以H37Rv全基因組為模板，用上述引物對目的片段進行PCR擴增，擴增體系為50ul(ddH2020.5ul、10XBuffer5ul、Taq酶0.5ul、dNTP4ul、上游引物5ul、下游引物5ul、DNA模板10ul)，擴增條件為94°C10min、94。C45s、62.2°C45s、72。Clmin、循環(huán)33次、72。C5min，4t:保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，進行膠回收，獲得目的片段，經(jīng)Ndel和EcoRI雙酶切后在T4DNA連接酶催化下分別與pET30a克隆表達載體16。C連接過夜。連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a，37t:培養(yǎng)過夜。挑選菌落于10mlLB培養(yǎng)基擴增，提取質(zhì)粒后用上述內(nèi)切酶消化，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定正確后的陽性菌落經(jīng)質(zhì)粒測序進行進一步驗證，并確認其基因序列正確。從測序正確的菌落中提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL-21感受態(tài)細胞，獲得重組菌，于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組菌，待菌液600nm光密度(opticaldensity,OD)值達到0.60.8時，加入異丙基_P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其終濃度為0.8mmol/L，誘導(dǎo)表達4h。離心經(jīng)誘導(dǎo)表達的菌液，菌體沉淀用T-E緩沖液(Tris50mmol/L，EDTA2mmol/L)洗滌后重懸，冰浴超聲裂解后離心、棄上清。沉淀用含4mol/LUrea的T-E緩沖液重懸后洗l-3遍，離心棄上清。沉淀用含6mol/LUrea的T-E緩沖液重懸，離心棄沉淀。上清完全透析至含有6mol/LUrea的T-E緩沖液中。用Source30Q陰離子交換柱進行純化，即用A液(含6mol/LUrea的T_E緩沖液)平衡柱子后上樣(流速2ml/min)，收集流穿峰，基線穩(wěn)定后用B液(含有6mol/LUrea和lmol/LNaCl的T-E緩沖液)線性洗脫(3ml/min)。收集流穿后，梯度復(fù)性至T-E緩沖液中(6-4-2-0mol/L)。2、HspX基因的克隆表達以及HspX蛋白的純化從genebank查詢結(jié)核桿菌H37Rv中抗原HspX的核酸和氨基酸序列，根據(jù)目的序列設(shè)計引物。其中，上游引物P1:5'-TTCATCATATGGCCACCACCCT-3，(劃線部分為加入的Ndel酶切位點)，下游引物P2:5，-GTGCAAGCTTTCAGTTGGTGGAC-3，(劃線部分為加入的HindIII酶切位點)。以H37Rv全基因組為模板，用上述引物對目的片段在50iUPCR體系中進行擴增，擴增體系為50ul(ddH2020.5ul、10XBuffer5ul、Taq酶0.5ul、dNTP4ul、上游引物5ul、下游引物5ul、DNA模板10ul)，擴增條件為94。C10min、94。C45s、53.7°C45s、72。Clmin、循環(huán)33次、72t:5min，4t:保存。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，進行膠回收，獲得目的片段，經(jīng)Ndel和HindIII雙酶切后在T4DNA連接酶催化下與pET30a克隆表達載體16°C連接過夜，連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a，37t:培養(yǎng)過夜。挑選菌落于10mlLB培養(yǎng)基擴增，提取質(zhì)粒后用上述內(nèi)切酶消化，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定正確后的陽性菌落經(jīng)質(zhì)粒測序進行進一步驗證，并確認其基因序列正確。從測序正確的菌落中提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL-21感受態(tài)細胞，獲得重組菌，于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組菌，待菌液600nm光密度(opticaldensity,0D)值達到0.60.8時，加入異丙基_P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其終濃度為0.8mmol/L，誘導(dǎo)表達4h。離心經(jīng)誘導(dǎo)表達的菌液，菌體沉淀用T-E緩沖液洗滌后重懸，冰浴超聲裂解后離心，取上清液待做純化。用陰離子交換柱(QHP，QS印haroseHighPerformance)和疏水(PhenylS印haroseHighPerformance)柱進行純化。用A液(T-E緩沖液)平衡柱子后上樣(流速2ml/min)，待流穿完全流出基線穩(wěn)定后，分別用15%、50%、100%B液(含lmo1/LNaCl的T-E緩沖液)線性洗脫(3ml/min)，收取50%B洗脫液；經(jīng)含40%硫酸銨的T-E緩沖液平衡柱子后上樣(流速2ml/min)，待流穿完全流出基線穩(wěn)定后，分別以60%、80%、100%B液(T-E緩沖液)洗脫，收集100%B洗脫液，再經(jīng)含35%硫酸銨的T-E緩沖液平衡柱子后上樣(流速2ml/min)，待流穿完全流出基線穩(wěn)定后，分別以90X、100XB液(T-E緩沖液)洗脫，收集100%洗脫液。3、cfpl0-esat6基因的克隆表達以及CFP10-ESAT6蛋白的純化從genebank查詢結(jié)核桿菌H37Rv中抗原cfp10和ESAT6的核酸和氨基酸序列，根據(jù)目的序列應(yīng)用基因拼接法設(shè)計引物。其中，cfp10的上游引物P1:5，-GATAGTCTCATATGGCAGAGATGAAGACCG-3'(劃線部分為加入的Ndel酶切位點)；cfp10的下游重疊引物P2:5'-引物P3:5'-GCTGGCGGTGGAAGCGGAGGTGGTGGAAGCGGAGGAGGTGGAAGCATGACAGAGCAGCAG—-3';ESAT6下游引物P45'-CATGAATTCCTATGCGAACATCCCAGTGACG_3'(劃線部分為加入的EcoRI酶切位點)；P2刪除終止密碼TGA;在P2的5'端和P3的5'端分別引入互補的Linker(Gly4Ser》3。以H37Rv全基因組為模板，用上述引物對cfplO和esat6分別在50ulPCR體系中進行擴增，擴增體系為50ul(ddH2030.5ul、10XBuffer5ul、Taq酶0.5ul、dNTP4ul、上游引物4ul、下游引物4ul、DNA模板2ul);然后利用OverlapPCR反應(yīng)擴增cfpl0-esat6融合基因，擴增體系為50ul(ddH2031.5ul、10XBuffer5ul、Taq酶O.5ul、dNTP4ul、上游引物4ul、下游引物4ul、cfp10PCR純產(chǎn)物2ul，ESAT6PCR純產(chǎn)物2ul)。cfp10擴增條件為96°C5min、96。C45s、60。C45s、72。Clmin、循環(huán)30次、72。C7min，4。C保存；esat6擴增條件為96°C5min、96。C45s、62。C45s、72。Clmin、循環(huán)30次、72。C7min，4。C保存；cfpl0-esat6融合基因的擴增條件為96°C5min、96。Clmin、64。Clmin、72。Clmin、循環(huán)30次、72。C7min。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，進行膠回收，獲得目的片段，經(jīng)Ndel和EcoRI雙酶切后在T4DNA連接酶催化下與pET30a克隆表達載體16。C連接過夜，連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a，37t:培養(yǎng)過夜。挑選菌落于10mlLB培養(yǎng)基擴增，提取質(zhì)粒后用上述內(nèi)切酶消化，1X瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定正確后的陽性菌落經(jīng)質(zhì)粒測序進行進一步驗證，并確認其基因序列正確。從測序正確的菌落中提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL-21感受態(tài)細胞，獲得重組菌，于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組菌，待菌液600nm光密度(opticaldensity,OD)值達到0.60.8時，加入異丙基_P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其終濃度為0.8mmol/L，誘導(dǎo)表達4h。離心經(jīng)誘導(dǎo)表達的菌液，菌體沉淀用PB緩沖液洗滌后重懸，冰浴超聲裂解后離心，取上清液待做純化。用陰離子交換柱(QHP，QS印haroseHighPerformance)進行純化。用A液(PB緩沖液)平衡柱子后上樣(流速2ml/min)，待流穿完全流出基線穩(wěn)定后，用5XB液(含lmol/LNaCl的PB緩沖液)梯度洗脫(2ml/min)，收集洗脫液。4、蛋白鑒定純化后的蛋白經(jīng)12%的SDS-PAGE電泳，并進行N末端測定，結(jié)果，三種蛋白分子量大小和N末端氨基酸序列分別與Ag85b、HspX、CFP10-ESAT6相符三種蛋白分子量大小分別為34.4kD，16kD，23kD;三種蛋白的N末端氨基酸序列分別為MTDVSRKIRAWGRRL、MATTLPVQRHPRSLF和MAEMKTDAATLAQEAG。實施例2BCG-CpG-DNA的提取和制備參照ZL200410033878.1說明書第3-7頁具體實施方式中"一、BCG-CpG-DNA的制備"和"二、提取物中CpG有效成分的檢測"中記載的方法，制備用于以下實驗中所用結(jié)核亞單位疫苗的BCG-CpG-DNA，并測定提取物中CpG的含量。采用上述方法提取的BCG-CpG-DNA中CpG的質(zhì)量百分含量為22.5%。實施例3本發(fā)明的結(jié)核亞單位疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答的研究將BALB/c小鼠隨機分為抗原組(以"Ag"代表)、BCG-CpG-DNA組(以"CpG"代表)、抗原和Al(OH)3組(以"Ag+Al"代表)、抗原和BCG-CpG-DNA組(以"Ag+CpG"代表)、抗原、Al(OH)3和BCG-CpG-DNA組(以"Ag+Al+CpG"代表)，以及生理鹽水對照組(以"NS"代表)。根據(jù)分組給各組小鼠分別皮下免疫相應(yīng)藥物，每次給藥組每只小鼠免疫0.2ml，其中各組分含量為(0.2ml中的含量，即每只動物的免疫量)Ag包含Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10iig，CpG75iig，Al(OH)30.35mg;生理鹽水對照組小鼠每只注射0.2ml生理鹽水。表2給藥實驗組的用藥對照表組別劑量(每只小鼠免疫量)Ag(抗原組)Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10iigCpG(BCG-CpG-DNA組)CpG75iigAg+A1(抗原和A1(0H)3組)Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10iigAl(OH)30.35mgAg+CpG(抗原和BCG-CpG-DNA組)Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10iigCpG75iigAg+Al+CpG(抗原、Al(OH)3和BCG-CpG-DNA組)Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10iigAl(OH)30.35mgCpG75iig每周免疫1次、連續(xù)免疫3次。末次免疫后1周，摘眼球處死小鼠，分離外周血血清，用于血清抗體的檢測；無菌取脾，制備脾臟單個核細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為lX106/ml或2X106/ml;收集腹腔灌洗液，分離腹腔巨噬細胞，調(diào)整細胞濃度為2.5X106/ml。1、血清學(xué)檢測將小鼠血清1000倍稀釋后加入用Ag85b、HspX或C/E蛋白(C/E蛋白即CFP10-ESAT6融合蛋白)預(yù)包被的酶標版中，室溫孵育2小時后，洗板后加入抗小鼠IgG抗體(HRP標記)，室溫孵育2小時后，洗板，加入TMB顯色液，室溫反應(yīng)10-15min，加入2MH2S04終止反應(yīng)。測定450/620nm吸光度值。分析血清中抗-Ag85b-IgG、抗HspX-IgG和抗C/E-IgG抗體含量。檢測結(jié)果參見圖4-6。由實驗結(jié)果可見，僅含有活性成份Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX的亞單位疫苗能使機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，但其中HspX的抗體水平比較低，但添加了Al(OH)3或者Al(OH)3和BCG-CpG-DNA之后，能顯著的提高機體HspX的抗體水平，并且Al(OH)3和BCG-CpG-DNA聯(lián)合使用的效果要好于單獨使用Al(OH)3或BCG-CpG-DNA;對于提高機體CFP10-ESAT6抗體水平而言，Al(0H)3和BCG-CpG-DNA聯(lián)合使用的效果要好于單獨使用BCG-CpG-DNA;對于提高機體Ag85b抗體水平而言，Al(OH)3和BCG-CpG-DNA聯(lián)合使用的效果要好于單獨使用Al(OH)313或BCG-CpG-DNA。綜合這三種抗原的抗體情況可見，抗原、Al(OH)3和BCG-CpG-DNA組能使機體有效產(chǎn)生針對三種抗原的抗體，做為佐劑的Al(OH)3和BCG-CpG-DNA聯(lián)合使用，所產(chǎn)生的效果好于單獨使用Al(OH)3或者BCG-CpG-DNA，并且結(jié)果具有顯著性差異。2、淋巴細胞增殖實驗將上述脾淋巴細胞分裝96孔板，每孔200ill(細胞濃度為1X106/ml)，然后添加20ii1如下剌激源，使其在孔內(nèi)終濃度為ConA(O.8yg/ml)、PPD(2yg/ml)、Ag85b(10yg/ml)、CFP10-ESAT6(10iig/ml)、HspX(10iig/ml)和培養(yǎng)基(作空白對照)。37°C，5%C02全濕潤培養(yǎng)70h后，每孔加入15iilMTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，離心去上清。每孔加入100ill20%SDS-DMF細胞裂解液，37"C過夜，置酶標儀(WellscanMK3)上比色，測定波長為570nm，參考波長為630nm。計算復(fù)孔的OD值平均值以反應(yīng)T細胞增殖強度。實驗結(jié)果參見圖7-9。由實驗結(jié)果可見，無論是單獨的抗原，還是添加了Al(OH)3或者BCG-CpG-DNA的抗原，促進T細胞增殖的能力都不明顯，而添加了Al(OH)3和BCG-CpG-DNA的抗原組中T細胞增殖顯著提高，從數(shù)值上表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用，反映出機體對本發(fā)明的結(jié)核病疫苗產(chǎn)生了強烈的細胞免疫應(yīng)答。這表明，Al(0H)3和BCG-CpG-DNA聯(lián)合使用能有效提高三種抗原引發(fā)的T淋巴細胞的增殖，所產(chǎn)生的效果好于單獨使用Al(0H)3或者BCG-CpG-DNA，具有協(xié)同作用。3、腹腔巨噬細胞分泌IL-12的檢測(ELISA法)將上述腹腔巨噬細胞分裝24孔板，每孔1ml(細胞濃度為2.5X106/ml)，貼壁培養(yǎng)2小時后洗去未貼壁細胞，再加入1ml培養(yǎng)基，并分別加入100ill如下剌激原，使其在孔內(nèi)終濃度為Ag85b(10iig/ml)、CFP10-ESAT6(10iig/ml)、HspX(10iig/ml)、LPS(10iig/ml)和培養(yǎng)基(作空白對照)。37°C、5%(A全濕潤培養(yǎng)48h后離心，取上清，-8(rC保存。用小鼠IL-12p70ELISA試劑盒測定腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清中IL-12含量。實驗結(jié)果參見圖10-12。由實驗結(jié)果可見，與對照組相比，單獨的抗原、以及單獨的A1(0H)3或者BCG-CpG-DNA與抗原組合，誘導(dǎo)巨噬細胞分泌IL-12的能力比較低；而Al(OH)3和BCG-CpG-DNA聯(lián)合使用，與抗原組合，極大促進了巨噬細胞分泌IL-12的能力，反映出ThO細胞向Thl細胞分化的增強，T細胞免疫Thl/Th2的平衡向Thl優(yōu)勢應(yīng)答轉(zhuǎn)化，所產(chǎn)生的效果遠好于單獨使用Al(OH)3或者BCG-CpG-DNA，結(jié)果具有顯著性差異，表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用。這說明單獨的抗原，以及單獨的Al(OH)3或者BCG-CpG-DNA與抗原組合，都不能有效的促進ThO細胞向Thl細胞分化，即將T細胞免疫引導(dǎo)到Thl優(yōu)勢應(yīng)答上。而聯(lián)合使用Al(OH)3、BCG-CpG-DNA和抗原，能有效的促進ThO細胞向Thl細胞分化，將誘導(dǎo)Thl優(yōu)勢應(yīng)答。4、酶聯(lián)免疫斑點實驗(ELISPOT):用抗IFN-Y單克隆抗體包被培養(yǎng)板，10%FBS-1640培養(yǎng)基封閉過夜。往培養(yǎng)板中加入上述每只小鼠的細胞懸液(lOOul/孑L2X106/ml)，并分別加入20ill如下剌激原，使其在孔內(nèi)終濃度為ConA(0.8iig/ml)、PPD(2yg/ml)、Ag85b(16yg/ml)、CFP10-ESAT6(16iig/ml)、HspX(16yg/ml)和培養(yǎng)基(作空白對照)。37°C、5%C02全濕潤培養(yǎng)24h，洗去細胞后，向每孔加入生物素標記二抗，室溫反應(yīng)2h，洗板后向每孔加入酶標親和素，室溫反應(yīng)lh，洗板后向每孔加入底物至斑點明顯出現(xiàn)，終止反應(yīng)后，晾干培養(yǎng)板。用CTLElispot讀板儀計數(shù)每孔斑點數(shù)。實驗結(jié)果參見圖13-15。由實驗結(jié)果可見，單獨的抗原在提高淋巴細胞IFN-y的分泌上，幾乎沒有作用；對比做為佐劑成份的Al(OH)3和BCG-CpG-DNA，BCG-CpG-DNA在輔助抗原提高淋巴細胞IFN-y分泌上的能力略強于Al(0H)3，但整體作用仍很低；而抗原、A1(OH)3和BCG-CpG-DNA聯(lián)合使用后，極大的提高了淋巴細胞IFN-y的分泌，反映出Thl細胞的活化和活化后的活性很高，所產(chǎn)生的效果遠好于單獨使用Al(OH)3或者BCG-CpG-DNA，結(jié)果具有顯著性差異，表現(xiàn)出非常明顯的協(xié)同作用。這說明單獨的抗原，以及單獨的Al(OH)3或者BCG-CpG-DNA與抗原組合，都不能有效的產(chǎn)生Thl優(yōu)勢應(yīng)答，而聯(lián)合使用Al(OH)3和BCG-CpG-DNA和抗原，能有效誘導(dǎo)出Thl優(yōu)勢應(yīng)答，并且使Thl細胞活化后的活性提高，表現(xiàn)出IFN-y分泌量的極大提高。實施例3的實驗表明，僅含有抗原成份Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX的亞單位疫苗能使機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，但其中HspX的抗體水平很低，與對照組接近，但添加了A1(0H)3或者Al(0H)3和BCG-CpG-DNA的復(fù)合佐劑，能顯著的提高機體中HspX的抗體水平，也能提高機體中Ag85b、CFP10-ESAT6的抗體水平。但就引發(fā)機體的細胞免疫而言，無論是抗原成份Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX本身，BCG-CpG-DNA本身，還是Al(OH)3或BCG-CpG-DNA單獨與抗原成份Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX聯(lián)用，效果都遠低于Al(OH)3和BCG-CpG-DNA聯(lián)合使用的效果，尤其在活化后的Thl細胞的活性(反映在IFN-y的分泌)上這種差異特別明顯。這充分說明了，抗原成份Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX，與Al(OH)3和BCG-CpG-DNA配合而成的結(jié)核病亞單位疫苗，能有效的引起機體免疫應(yīng)答，尤其是形成細胞免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)Thl/Th2的平衡，使之向有利于結(jié)核病的保護性免疫反應(yīng)——Thl優(yōu)勢應(yīng)答的方向轉(zhuǎn)化。實施例4本發(fā)明的結(jié)核亞單位疫苗對結(jié)核桿菌感染豚鼠的免疫保護效果豚鼠對結(jié)核分枝桿菌更敏感，是結(jié)核病疫苗效力評價的優(yōu)選模型。本發(fā)明以豚鼠模型為基礎(chǔ)，對本發(fā)明的結(jié)核亞單位疫苗的免疫保護效果進行了研究。以結(jié)核分枝桿菌感染豚鼠，將感染豚鼠隨機分為Ag、Ag+Al、Ag+CpG、Ag+Al+CpG實驗組和NS對照組。在感染后5天根據(jù)分組給各給藥組動物免疫相應(yīng)藥物，以后每隔2周免疫1次，共免疫3次。每次免疫方式為后腿肌肉注射0.2ml/只，其中各組分含量為(0.2ml中的含量，即每只動物的免疫量)Ag包含Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10yg，CpG75yg，Al(0H)30.35mg;生理鹽水組動物注射0.2ml生理鹽水。表3給藥實驗組的用藥對照表組別劑量(每只豚鼠免疫量)AG(抗原組)Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10iig<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>末次免疫后2周解剖所有豚鼠，觀察豚鼠的肝、脾、肺、淋巴結(jié)等各臟器結(jié)核病變程度，并以雙盲法進行病變評分；脾臟結(jié)核桿菌荷菌量脾臟勻漿后作系列稀釋，再接種改良羅氏培養(yǎng)基，計數(shù)結(jié)核桿菌菌落形成單位，計算其對數(shù)值，作統(tǒng)計學(xué)處理。各組臟器結(jié)核病變評分見表4和圖16。表4臟器病變評分<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>脾臟結(jié)核桿菌荷菌量結(jié)果見表5和圖17。表5脾臟結(jié)核桿菌荷菌量(lgCFU)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>從上述實驗結(jié)果可見，Ag+Al+CpG實驗組豚鼠的各臟器病變評分低于其他各實驗組，并顯著低于對照組。脾臟結(jié)核桿菌荷菌量也有相同的變化趨勢。值得一提的是，在結(jié)核疫苗效力評價領(lǐng)域中，豚鼠脾臟中結(jié)核桿菌荷菌量降低1-2個lgCFU，都是非常不容易的，這相應(yīng)于整個荷菌量降低了一到兩個數(shù)量級。如果一個結(jié)核疫苗和空白對照組相比，能在脾臟結(jié)核桿菌荷菌量上降低1-2個lgCFU，即可提示該疫苗具有很好的保護效果。有文獻報道，抗結(jié)核桿菌的有效疫苗(如卡介苗)在保護效果上也是降低1-2個lgCFU:如文獻(l)BCG組與陰性對照組相比，在攻擊后20-60天內(nèi)，肺和淋巴結(jié)荷菌量降低約1個lgCFU(DianeOrdway，MarcelaHenao-Tamayo，CrystalShanley，etal.InfluenceofMycobacteri咖bovisBCGVaccinationonCellularImmuneResponseofGuineaPigsChallengedwithMycobacteriumtuberculosis.CLINICALANDVACCINEI匪UNOLOGY，Aug.2008，p.1248-1258);文獻(2)BCG組與對照組相比，肺荷菌量降低約1.35個lgCFU(SUSANL.BALDWIN,CELINED'SOUZA，ALAND.ROBERTS,etal.EvaluationofNewVaccinesintheMouseandGuineaPigModelofTuberculosis.INFECTIONANDIMMUNITY,June1998，p.2951-2959)。本發(fā)明的結(jié)核疫苗與生理鹽水對照組相比，脾臟荷菌量降低近1個lgCFU，與Al(OH)3組，或者BCG-CpG-DNA組相比，lgCFU的值降低了0.4-0.5個lg值，說明此種復(fù)合疫苗具有較好的保護效果。實施例5不同劑量BCG-CpG-DNA與Al(0H)3構(gòu)成的復(fù)合佐劑與抗原(Ag85b+CFP10-ESAT6+HspX)聯(lián)合免疫后對豚鼠的抗結(jié)核保護作用以結(jié)核分枝桿菌感染豚鼠，將感染豚鼠隨機分為Ag、Ag+Al、Ag+Al+CpGl、Ag+Al+CpG2、Ag+Al+CpG3、Ag+Al+CpG4、Ag+Al+CpG5實驗組和NS對照組。在感染后5天根據(jù)分組給各組動物免疫相應(yīng)藥物，以后每隔2周免疫1次，共免疫3次。每次免疫方式為后退肌肉注射O.2ml/只，疫苗中各組分濃度為Ag為Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX按1:1:1混合，濃度均為50iig/ml(每種抗原注射至每只豚鼠為10iig);CpGl、CpG2、CpG3、CpG4和CpG5濃度分別為62.5iig/ml、250iig/ml、375iig/ml、500iig/ml和750iig/ml(每只豚鼠接受的CpG劑量分別為12.5iig、50iig、75iig、100iig和150yg);A1(0H)3濃度為1.75mg/ml(每只豚鼠接受的劑量為0.35mg);生理鹽水組動物注射0.2ml生理鹽水。表6給藥實驗組的用藥對照表<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>組別劑量(每只豚鼠免疫量)Ag+Al+CpG5(抗原、Al(OH)3和BCG-CpG-DNA組)Ag85b、CFP10-ESAT6和HspX各10iigAl(OH)30.35mgCpG150iig自結(jié)核桿菌感染后7周解剖所有豚鼠，觀察豚鼠的肝、脾、肺、淋巴結(jié)等各臟器結(jié)核病變程度，并以雙盲法進行病變評分；脾臟結(jié)核桿菌荷菌量脾臟勻漿后作系列稀釋，再接種改良羅氏培養(yǎng)基，計數(shù)結(jié)核桿菌菌落形成單位，計算其對數(shù)值，作統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果如下表7臟器病變評分和脾臟結(jié)核桿菌荷菌量(lgCFU)組別臟器病變指數(shù)(X±SD)脾臟結(jié)核菌荷菌量lgCFU(X士SD)N.S50.8±16.95.45±0.76Ag62.2±20.25.61±0.51Ag+Al58.3±25.55.30±0.35Ag+Al+CpGl59.4±15.35.68±0.44Ag+Al+CpG235.6±18.15.04±0.81Ag+Al+CpG342.2±19.24.47±1.82Ag+Al+CpG439.4±17.24.96±0.97Ag+Al+CpG542.8±18.94.88±0.61臟器外觀陰性對照組和Ag組豚鼠肺和脾上有大量、明顯的結(jié)核病灶，肝上也可見到典型的結(jié)核病灶；Ag+Al和Ag+Al+CpGl組豚鼠各臟器結(jié)核病變依然嚴重；Ag+Al+CpG2、Ag+Al+CpG3、Ag+Al+CpG4和Ag+Al+CpG5組豚鼠各臟器結(jié)核病變得到不同程度的抑制，說明結(jié)核桿菌的增殖受到有效抑制，特別是Ag+Al+CpG3組豚鼠各臟器結(jié)核病灶明顯減少。與病變評分結(jié)果類似，Ag組、Ag+Al、Ag+Al+CpGl組和陰性對照組豚鼠脾臟結(jié)核桿菌的負荷均較高，但Ag+Al+CpG2、Ag+Al+CpG3、Ag+Al+CpG4和Ag+Al+CpG5組豚鼠脾臟結(jié)核桿菌得到不同程度的抑制，進一步說明本發(fā)明的疫苗可有效抑制結(jié)核桿菌在豚鼠體內(nèi)的增殖，特別是Ag+Al+CpG3組豚鼠脾臟結(jié)核桿菌負荷明顯降低。從實驗看，BCG-CpG-DNA用量為25yg_200yg，Al(OH)3的量為0.05mg_0.7mg時，18兩者聯(lián)用能產(chǎn)生更好的免疫效果'權(quán)利要求一種結(jié)核亞單位疫苗，其特征在于包含Ag85b、ESAT6、CFP10和HspX蛋白。2.如權(quán)利要求1所述的結(jié)核亞單位疫苗，其特征在于進一步包含A1(0H)3和BCG-CpG-DNA，所述的BCG-CpG-DNA是BCG的DNA提取物，其為片段長短不等的BCGDNA片段的混合物。3.如權(quán)利要求2所述的結(jié)核亞單位疫苗，其特征在于Al(OH)3和BCG-CpG-DNA的含量為單位劑量疫苗中Al(OH)30.05mg-0.7mg，BCG-CpG-DNA25iig_200iig，優(yōu)選為Al(0H)30.lmg-O.35mg，BCG-CpG-DNA75iig。4.如權(quán)利要求2-3任一項所述的結(jié)核亞單位疫苗，其特征在于Al(OH)3和BCG-CpG-DNA的重量比為28:i-i:4，優(yōu)選為i4:3-4:3。5.如權(quán)利要求1-4任一項所述的結(jié)核亞單位疫苗，其特征在于Ag85b、ESAT6、CFP10和HspX以獨立的蛋白形式存在，或者以任何兩種或三種或四種蛋白的融合蛋白形式存在，優(yōu)選以Ag85b、融合蛋白CFP10-ESAT6和HspX的形式存在。6.如權(quán)利要求1-5任一項所述的結(jié)核亞單位疫苗，其中Ag85b、ESAT6、CFP10、HspX的含量為單位劑量疫苗中每種蛋白5iig-20iig，優(yōu)選為每種蛋白5iig-10iig，更優(yōu)選為Ag85b10iig、ESAT65iig、CFP105iig、HspX10iig。7.如權(quán)利要求1-6任一項所述的結(jié)核亞單位疫苗，其中Ag85b、ESAT6、CFPIO、HspX的重量比為0.5-2:0.5-2:0.5-2:0.5-2，優(yōu)選為i:0.5:0.5:i。8.如權(quán)利要求1-7任一項所述的結(jié)核亞單位疫苗，其中Ag85b、CFP10-ESAT6、HspX的含量為單位劑量疫苗中每種蛋白5-20yg，優(yōu)選為每種蛋白10i!g。9.如權(quán)利要求1-8任一項所述的結(jié)核亞單位疫苗，其中Ag85b、CFP10-ESAT6、HspX的重量比為0.5-2:0.5-2:o.5-2.，優(yōu)選重量比為i:i:i。全文摘要本申請涉及一種結(jié)核亞單位疫苗，其以Ag85b、ESAT6、CFP10和HspX蛋白為疫苗抗原成份，以Al(OH)3和BCG-CpG-DNA(BCG的DNA提取物)為復(fù)合佐劑。以Ag85b、ESAT6、CFP10和HspX蛋白為疫苗抗原成份，使疫苗既能預(yù)防結(jié)核桿菌感染，又能預(yù)防已感染結(jié)核桿菌的感染者發(fā)生結(jié)核病，起到預(yù)防性治療的作用。以Al(OH)3和BCG-CpG-DNA為復(fù)合佐劑，能有效提高疫苗的免疫效果，促進T細胞增殖，調(diào)節(jié)Th1/Th2動態(tài)平衡，使T細胞免疫向Th1優(yōu)勢應(yīng)答轉(zhuǎn)化。文檔編號A61P31/00GK101745104SQ201010107449公開日2010年6月23日申請日期2010年2月9日優(yōu)先權(quán)日2010年2月9日發(fā)明者喬萊艷,寇麗杰,徐苗,楊蕾,沈小兵,王國治,蘇城,蔣仁生,蒲江,賈淑珍,趙愛華,都偉欣,陳保文,陳磊,陶立峰申請人:中國藥品生物制品檢定所;安徽龍科馬生物制藥有限責(zé)任公司