專利名稱：鎮(zhèn)痛活性肽grr及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及鎮(zhèn)痛活性肽GRR及其鎮(zhèn)痛活性保守氨基酸殘 基及其獲得方法與應(yīng)用，具體地說，本發(fā)明涉及蝎鎮(zhèn)痛活性肽GRR及其衍生物、類似物、活 性片段的結(jié)構(gòu)及其制備方法，以及作為鎮(zhèn)痛藥物在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蝎作為中醫(yī)珍貴藥材又稱全蟲、全蝎，始載于《開寶本草》，《本草綱目》列于蟲部40 卷，距今已有2000多年的藥用歷史，具有熄風(fēng)鎮(zhèn)痙、攻毒散結(jié)、痛絡(luò)止痛之功效。臨床用于 治療偏頭痛、面神經(jīng)癱瘓、風(fēng)濕痹痛及癌痛等癥，療效確切。蝎主要活性成分是尾腺分泌的 毒素，其中蘊(yùn)涵大量具有藥學(xué)價值的活性組分，是一個富含有多種功能肽的天然活性肽庫。目前，從蝎或蝎毒中分離純化并結(jié)構(gòu)解析具有鎮(zhèn)痛活性的成分還不是很多，如，蝎 鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽、蝎鎮(zhèn)痛抗菌活性肽等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供蝎鎮(zhèn)痛活性肽GRR及其制備與應(yīng)用，具體是利用蛋白提取、 分離、純化技術(shù)，從蝎毒或蝎尾或全蝎中篩選、分離、純化獲得蝎鎮(zhèn)痛活性肽GRR。鎮(zhèn)痛活性 肽GRR獲得方法簡單易行，可與任何載體混合制備醫(yī)學(xué)上可接受的劑型。本發(fā)明是從全蝎或蝎尾或蝎毒中，分離純化篩選獲得一種具有鎮(zhèn)痛活性的新型結(jié) 構(gòu)多肽。同時，利用基因工程技術(shù)或化學(xué)合成技術(shù)解決該活性肽的獲得方法。此外，利用基 因工程技術(shù)獲得仍具有鎮(zhèn)痛活性的該活性肽的衍生物或類似物或活性片段。再者，首次證 明活性肽的半胱氨酸殘基是其鎮(zhèn)痛活性保守性氨基酸殘基。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的，它包括(1)原料(蝎毒或蝎尾或全蝎)首 先進(jìn)行勻漿，利用蒸餾水或酸性溶液或堿性溶液溶解抽提，離心除去不溶雜質(zhì)得到抽提液； (2)該抽提液可以通過疏水層析柱、離子交換層析柱、凝膠過濾層析柱的不同組合以及經(jīng)超 濾去除鹽、雜蛋白和濃縮得到鎮(zhèn)痛活性肽GRR ； (3)經(jīng)反向?qū)游鲋玫礁呒兌鹊逆?zhèn)痛活性肽 GRR0比如，蝎毒經(jīng)酸性溶液溶解，離心除去不溶雜質(zhì)得到抽提液；抽提液經(jīng)疏水層析柱分離 得到鎮(zhèn)痛活性組分；得到鎮(zhèn)痛活性組分經(jīng)超濾以去除鹽和雜蛋白，同時進(jìn)行濃縮，通過離子 交換層析柱分離得到鎮(zhèn)痛活性組分；經(jīng)疏水層析柱進(jìn)一步分離得到鎮(zhèn)痛活性組分；經(jīng)超濾 以去除鹽和濃縮，通過離子交換層析柱純化得到鎮(zhèn)痛活性組分；經(jīng)凝膠過濾層析柱進(jìn)一步 純化得到鎮(zhèn)痛活性組分；經(jīng)反向?qū)游鲋玫礁呒兌鹊逆?zhèn)痛活性肽GRR。本發(fā)明目的之二是確定鎮(zhèn)痛活性肽GRR分子中的8個半胱氨酸殘基與鎮(zhèn)痛活性肽 GRR的鎮(zhèn)痛活性關(guān)系。是通過基因工程技術(shù)以及體內(nèi)生物活性實驗實現(xiàn)的，它包括利用基 因工程技術(shù)對鎮(zhèn)痛活性肽GRR分子中的8個半胱氨酸殘基，分別進(jìn)行一個或二個或三個或 四個或五個或六個或七個或八個半胱氨酸殘基被去除掉或被其他氨基酸殘基替換；針對分 離純化獲得的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行實驗動物鎮(zhèn)痛活性的比對，從實驗結(jié)果確定鎮(zhèn)痛活性肽GRR的 鎮(zhèn)痛活性保守性氨基酸殘基。
本發(fā)明目的之三是針對鎮(zhèn)痛活性肽GRR的鎮(zhèn)痛活性，利用基因工程技術(shù)獲得一系 列鎮(zhèn)痛活性肽GRR部分片段或衍生物或類似物，通過獲得表達(dá)產(chǎn)物的實驗動物體內(nèi)鎮(zhèn)痛活 性，以獲得可以進(jìn)一步開發(fā)鎮(zhèn)痛類藥物的鎮(zhèn)痛活性肽GRR及其部分片段或衍生物或類似 物，本發(fā)明所述的的獲得方法常規(guī)、簡單、產(chǎn)量高，不僅具有重要的指導(dǎo)意義和實用價值，也 為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明目的之四是提供多種鎮(zhèn)痛活性肽GRR及其部分片段或衍生物或類似物的 制備方法，它包括利用基因工程技術(shù)進(jìn)行表達(dá)或通過化學(xué)合成獲得。本發(fā)明的另一個目的是提供生產(chǎn)上述鎮(zhèn)痛活性肽GRR及其部分片段或衍生物或類似物的制備方法，該方法包括(1)將鎮(zhèn)痛活性肽GRR及其部分片段或衍生物或類似物編碼DNA重組至表達(dá)載 體；(2)用步驟(1)的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞(原核或真核細(xì)胞)；(3)在適合的誘導(dǎo)表達(dá)條件下，培養(yǎng)步驟(2)的被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(4)收獲并純化所得到的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供上述鎮(zhèn)痛活性肽GRR及其部分片段或衍生物或類似物的表達(dá)產(chǎn)物分 離純化方法?？墒褂名}析沉淀、超濾、離子交換層析、疏水作用層析和凝膠過濾等方法從細(xì) 胞的溶胞產(chǎn)物及培養(yǎng)液中分離并純化所需的表達(dá)產(chǎn)物。在表達(dá)產(chǎn)物的分離和純化過程中， 可使用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)或 蛋白免疫印跡法(WESTERN)檢測表達(dá)產(chǎn)物的存在及相應(yīng)分子大小。本發(fā)明首次進(jìn)行上述鎮(zhèn)痛活性肽GRR及其部分片段或衍生物或類似物的小鼠體 內(nèi)鎮(zhèn)痛生物學(xué)活性實驗。本發(fā)明還提供了上述鎮(zhèn)痛活性肽GRR及其部分片段或衍生物或類似物在生物制 藥領(lǐng)域的應(yīng)用，具體地說包括鎮(zhèn)痛生物活性。本發(fā)明的再一個目的是提供含有如上限定的蛋白質(zhì)及一種或多種醫(yī)藥上可接受 的載體或賦形劑的藥物組合物?？砂凑罩扑幑I(yè)領(lǐng)域已知的基本原則和方法制備適于胃腸 道夕卜途徑給藥的藥物組合物(^nSMRemington' sPharmaceutical Science, 15th.，Mack Publishing Company, 1980) 0可通過各種給藥途徑，特別是靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、腹腔 內(nèi)、鼻內(nèi)、皮內(nèi)、皮下等胃腸道外途徑投用本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明的再一個目的是提供如上限定的蛋白質(zhì)在生產(chǎn)鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。可使用 本發(fā)明的蛋白或含有該蛋白質(zhì)的藥物組合物作為治療劑，用于治療特定類型人體的各種疼 痛相關(guān)疾病。本發(fā)明的藥物組合物的治療有效劑量一般應(yīng)根據(jù)疾病的性質(zhì)、嚴(yán)重程度及對 藥物的敏感適應(yīng)性，以及給藥途徑等諸多因素由臨床醫(yī)生按照個體化原則來確定。在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞，常用的原核宿主細(xì)胞的 例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物 細(xì)胞等。
具體實施例方式
下面的實施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限 制本發(fā)明特批權(quán)利要求的范圍。
實施例1 從蝎毒獲得鎮(zhèn)痛活性肽GRR獲得鎮(zhèn)痛活性肽GRR的提取、分離、純化體系基本條件的特征1.操作溫度在 O0C -45°c ；2.溶液的酸堿度在PH2-PH12。上述條件既不破壞提取、分離、純化所采用介質(zhì) 的理 化性質(zhì)，又不影響鎮(zhèn)痛活性肽GRR的活性。(1)鎮(zhèn)痛活性成分的抽提A.蝎毒溶于蒸餾水后，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液用0. OlM鹽酸或磷酸 溶液調(diào)PH為2，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液用堿性溶液調(diào)pH為12，15000轉(zhuǎn)/分 離心15分鐘，上清液為蝎毒鎮(zhèn)痛活性成分的抽提液。B.蝎毒2. 0克溶于20毫升pH為2的緩沖溶液或酸性溶液，15000轉(zhuǎn)/分離心15 分鐘，取上清液用堿性溶液調(diào)pH為12，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液為蝎毒鎮(zhèn)痛活性 成分的抽提液。C.蝎毒溶于pH為12的緩沖溶液或堿性溶液，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清 液用酸性溶液調(diào)PH為2，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液為蝎毒鎮(zhèn)痛活性成分的抽提液。上述提取液的酸堿度從pH2_pH12，均不影響鎮(zhèn)痛活性成分的生物活性，且從原料 中能夠提取活性成分。(2)鎮(zhèn)痛活性肽GRR的疏水層析分離取上述鎮(zhèn)痛活性成分的抽提液，用鹽酸水溶液或磷酸水溶液或酸性溶液或堿性溶 液調(diào)PH至要求條件范圍下，加中性鹽至2M濃度，上樣于預(yù)先用2M中性鹽-緩沖液溶液平 衡的疏水層析柱，分別用2. OMU. 5M、1. 0M、0. 5M中性鹽-緩沖液洗脫，最后用緩沖液洗脫， 將含有鎮(zhèn)痛活性的洗脫液合并。疏水層析分離的特征1.疏水層析介質(zhì)選擇苯基-疏水層析添料或正辛烷-疏水 層析添料_或己烷_疏水層析添料_或丁烷_疏水層析添料；2.中性鹽選擇(HN3)2SO4或 Na2SO4或NaCl ；3.緩沖液的pH選擇在pH2_pH12，此條件既不影響鎮(zhèn)痛活性成分的生物活 性，又不影響活性成分的分離；4.緩沖液的濃度選擇在ImM-lOOmM，此條件既不影響鎮(zhèn)痛活 性成分的生物活性，又不影響活性成分的分離。(3)超濾處理鎮(zhèn)痛活性成分溶液利用超濾處理的目的是除去鎮(zhèn)痛活性成分溶液中的鹽或雜蛋白或更換緩沖液，此 夕卜，對鎮(zhèn)痛活性成分溶液進(jìn)行濃縮。選擇能夠使鎮(zhèn)痛活性肽GRR透過的超濾膜進(jìn)行超濾處 理，此時收集超濾透過液，而雜蛋白被截留實現(xiàn)分離的目的。選擇能夠截留鎮(zhèn)痛活性肽GRR 的超濾膜進(jìn)行超濾處理，此時收集超濾濃縮液(鎮(zhèn)痛活性肽GRR被截留)，而鹽、緩沖液的緩 沖對、能透過超濾膜的雜蛋白、水被透過，實現(xiàn)去除鹽、雜蛋白或更換緩沖液或濃縮的目的。超濾處理的特征1.透過鎮(zhèn)痛活性肽GRR的超濾膜選擇是分子量為IOkDa或 20kDa或30kDa或40kDa或50kDa的超濾膜，優(yōu)選30kDa的超濾膜，大于或小于30kDa的超 濾膜，其收率或超濾效率均受影響；2.截留鎮(zhèn)痛活性肽GRR的超濾膜選擇是分子量為IkDa 或2kDa或3kDa或5kDa的超濾膜，優(yōu)選IkDa的超濾膜，大于或小于IkDa的超濾膜，其收率 或超濾效率均受影響；3.超濾處理的溫度選擇在0°C-45°C，此條件既不破壞超濾膜的理化 性質(zhì)，又不影響鎮(zhèn)痛活性肽GRR的活性。(4)鎮(zhèn)痛活性肽GRR的離子交換層析分離
方法(3)超濾處理的鎮(zhèn)痛活性成分溶液，進(jìn)一步用本實驗的緩沖液進(jìn)行除鹽、緩 沖液更換和濃縮。待處理好的樣品液上樣于預(yù)先用緩沖液平衡好的離子交換層析柱，先用 緩沖液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白，分別用0. 05Μ、0. 1Μ、0· 15Μ、0. 2Μ、0· 25Μ、0. 3Μ、0· 4Μ、 0. 5Μ鹽溶液進(jìn)行階段洗脫，將含有鎮(zhèn)痛活性的洗脫液合并。離子交換層析分離的特征1.層析介質(zhì)選擇陽離子交換層析添料，如CM-離子交 換層析添料或SP-離子交換層析添料或S-離子交換層析添料等陽離子交換層析添料，此時 緩沖液酸堿度選擇在ΡΗ2-ΡΗ7 ；2.層析介質(zhì)選擇陰離子交換層析添料，如Q-離子交換層析 添料或DEAE-離子交換層析添料或QAE-離子交換層析添料等離子交換層析添料，此時緩沖 液酸堿度選擇在ρΗ7-ρΗ12 ；3.緩沖液的濃度選擇在lmM-50mM，此條件既不影響鎮(zhèn)痛活性成 分的生物活性，又不影響活性成分的分離；4.階段洗脫的鹽 溶液選擇是要求濃度的緩沖液 或在IOmM緩沖液中加中性鹽到需要的濃度；5.中性鹽選擇(HN3)2SO4或Na2SO4或NaCl或 KCl，優(yōu)選 NaCl。(5)鎮(zhèn)痛活性肽GRR的疏水層析進(jìn)一步分離得到的鎮(zhèn)痛活性成分按照方法(2)的基本框架進(jìn)一步分離。鎮(zhèn)痛活性成分溶液加 中性鹽至2M濃度，上樣于預(yù)先用2M中性鹽-緩沖液溶液平衡的疏水層析柱，進(jìn)行中性鹽濃 度梯度(2. OM 0. 0M)洗脫，合并收集含有鎮(zhèn)痛活性的洗脫峰，進(jìn)行超濾去鹽和濃縮處理。疏水層析分離的特征1.疏水層析介質(zhì)選擇苯基-疏水層析添料或正辛烷-疏水 層析添料_或己烷_疏水層析添料_或丁烷_疏水層析添料；2.中性鹽選擇(HN3)2SO4或 Na2SO4或NaCl ；3.緩沖液的pH選擇在pH2_pH12 ；4.緩沖液的濃度選擇在ImM-lOOmM。(6)鎮(zhèn)痛活性肽GRR的離子交換層析進(jìn)一步分離得到的鎮(zhèn)痛活性成分按照方法(4)的基本框架進(jìn)一步分離。待處理好的樣品液上 樣于預(yù)先用緩沖液平衡好的離子交換層析柱，先用緩沖液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白， 進(jìn)行鹽濃度梯度(0. OM 1. OM)洗脫，合并收集含有鎮(zhèn)痛活性的洗脫峰。離子交換層析分離的特征1.層析介質(zhì)選擇陽離子交換層析添料，如CM-離子交 換層析添料或SP-離子交換層析添料或S-離子交換層析添料等陽離子交換層析添料，此 時緩沖液酸堿度選擇在pH2-pH7 ；2.層析介質(zhì)選擇陰離子交換層析添料，如Q-離子交換 層析添料或DEAE-離子交換層析添料或QAE-離子交換層析添料等離子交換層析添料，此 時緩沖液酸堿度選擇在pH7-pH12;3.緩沖液的濃度選擇在lmM-50mM;4.鹽梯度洗脫的鹽 溶液選擇是要求濃度的緩沖液或在IOmM緩沖液中加中性鹽到需要的濃度；5.中性鹽選擇 (HN3) 2S04 或 Na2SO4 或 NaCl 或 KCl，優(yōu)選 NaCl。(7)鎮(zhèn)痛活性肽GRR的凝膠層析純化含有鎮(zhèn)痛活性的溶液進(jìn)行超濾濃縮，樣品液上樣于預(yù)先用洗脫液平衡好的凝膠過 濾層析柱并進(jìn)行純化，收集含有鎮(zhèn)痛活性的洗脫峰。凝膠層析分離的特征1.層析介質(zhì)可以選擇S印hacryl S-100HR或S印hacryl S-200HR 或 S印hadex G-50 或 S印hadex G-75 或 S印hadex G-100 或 S印hadex G-150 或 Superose 12 prep grade 或 Superose 6 prep grade 或 Superdex 30 prep grade 或 Superdex 75 prep grade 或Superose 12 HR或Superose 6 HR或Superdex Peptide HR或 Superdex75HR或SuperdexP印tide PE等凝膠層析添料；2.洗脫液的pH選擇在pH2_pH12 ； 3.洗脫液的濃度選擇在離子濃度大于0.15M及以上。
(8)鎮(zhèn)痛活性肽GRR的反相層析高純度純化活性組分，上樣于預(yù)先用0. 三氟醋酸-20%乙腈水溶液平衡好的反相層析柱，如SOURCE 15RPC、30RPC層析添料，先用0. 1 %三氟醋酸-20%乙腈水溶液充分洗滌，而后進(jìn) 行乙腈濃度梯度(20%至95% )洗脫，合并收集洗脫峰面積最大的洗脫峰組分-鎮(zhèn)痛活性 肽 GRR0從蝎毒獲得的鎮(zhèn)痛活性肽GRR的結(jié)構(gòu)特征GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGAD SGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR實施例2:從蝎尾獲得鎮(zhèn)痛活性肽GRR本實施例的策略、基本方法和基本過程同實施例1。(1)鎮(zhèn)痛活性成分的抽提A.蝎尾加蒸餾水后進(jìn)行勻漿，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液用0. OlM鹽酸或磷 酸溶液或酸性溶液調(diào)PH為2，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液用堿性溶液調(diào)pH為12， 15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液為蝎尾鎮(zhèn)痛活性成分的抽提液。B.蝎尾加pH為2的緩沖溶液或酸性溶液后進(jìn)行勻漿，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘， 取上清液用堿性溶液調(diào)PH為12，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液為蝎尾鎮(zhèn)痛活性成分的 抽提液。C.蝎尾加pH為12的緩沖溶液或堿性溶液后進(jìn)行勻漿，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘， 取上清液用酸性溶液調(diào)PH為2，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液為蝎尾鎮(zhèn)痛活性成分的 抽提液。上述提取液的酸堿度從pH2_pH12，均不影響鎮(zhèn)痛活性成分的生物活性，且從原料 中能夠提取活性成分。(2)鎮(zhèn)痛活性肽GRR的分離純化以及高純度純化取上述鎮(zhèn)痛活性成分的抽提液，同實施例1中的(2)-(8)的策略、基本方法和基本 過程分離純化鎮(zhèn)痛活性肽GRR。 從蝎尾獲得的鎮(zhèn)痛活性肽GRR的結(jié)構(gòu)特征GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGAD SGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。實施例3 從全蝎獲得鎮(zhèn)痛活性肽GRR本實施例的策略、基本方法和基本過程同實施例2。(1)鎮(zhèn)痛活性成分的抽提A.全蝎加蒸餾水后進(jìn)行勻漿，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液用0. OlM鹽酸 或磷酸溶液或酸性溶液調(diào)PH為2，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液用堿性溶液調(diào)pH為 12，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液為全蝎鎮(zhèn)痛活性成分的抽提液。B.全蝎加pH為2的緩沖溶液或酸性溶液后進(jìn)行勻漿，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘， 取上清液用堿性溶液調(diào)PH為12，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液為全蝎鎮(zhèn)痛活性成分的 抽提液。C.全蝎加pH為12的緩沖溶液或堿性溶液后進(jìn)行勻漿，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘， 取上清液用酸性溶液調(diào)PH為2，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液為全蝎鎮(zhèn)痛活性成分的抽提液。上述提取液的酸堿度從pH2_pH12，均不影響鎮(zhèn)痛活性成分的生物活性，且從原料 中能夠提取活性成分。取上述鎮(zhèn)痛活性成分的抽提 液，同實施例1中(2)-(8)的策略、基本方法和基本過 程分離純化鎮(zhèn)痛活性肽GRR。 從全蝎獲得的鎮(zhèn)痛活性肽GRR的結(jié)構(gòu)特征GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGAD SGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。實施例4 鎮(zhèn)痛活性肽GRR的獲得本實施例的策略、基本方法和基本過程同實施例1。蝎毒或蝎尾或全蝎中的鎮(zhèn)痛活性成分抽提的策略、基本方法和基本過程同實施例 1、實施例2和實施例3。鎮(zhèn)痛活性肽GRR的分離純化的策略、基本方法和基本過程同實施例1。獲得的鎮(zhèn)痛 活性成分抽提液可以通過疏水層析柱、離子交換層析柱、凝膠過濾層析柱的不同組合以及 經(jīng)超濾去除鹽、雜蛋白和濃縮得到鎮(zhèn)痛活性肽GRR，經(jīng)反相層析柱得到高純度的鎮(zhèn)痛活性肽 GRR。這種組合的特征1.鎮(zhèn)痛活性成分抽提液經(jīng)過離子交換層析分離_疏水層析分 離_離子交換層析進(jìn)一步分離_疏水層析進(jìn)一步分離_凝膠層析純化_反向?qū)游觯?.鎮(zhèn)痛 活性成分抽提液經(jīng)過凝膠層析純化_離子交換層析分離_疏水層析分離_離子交換層析 進(jìn)一步分離_疏水層析進(jìn)一步分離-反向?qū)游觯?.鎮(zhèn)痛活性成分抽提液經(jīng)過凝膠層析純 化_疏水層析分離_離子交換層析分離_疏水層析進(jìn)一步分離_離子交換層析進(jìn)一步分 離-反向?qū)游觯?.按照上述的分離純化體系，不論如何組合不同層析順序，均能分離純化獲 得鎮(zhèn)痛活性肽GRR。獲得的鎮(zhèn)痛活性肽GRR 的結(jié)構(gòu)特征GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYL AGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。實施例5 鎮(zhèn)痛活性肽GRR及其衍生物、類似物、活性片段的獲得1.鎮(zhèn)痛活性肽GRR基因的構(gòu)建本實施例列舉描述用于表達(dá)本發(fā)明鎮(zhèn)痛活性肽GRR及其衍生物、類似物、活性片 段基因的構(gòu)建策略和基本方法。根據(jù)鎮(zhèn)痛活性肽GRR (結(jié)構(gòu)參見

圖1.)的N末端和C末端氨基酸序列，分別設(shè)計相 應(yīng)寡核苷酸引物，同時在上述兩個寡核苷酸引物的5'端，分別加上限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和BamHI水解位點序列；以蝎cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物并進(jìn) 行核酸片段的凝膠回收；經(jīng)過限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和BamHI雙酶切后與同樣進(jìn)行雙酶 切的質(zhì)粒在T4 DNA Iigase的作用下進(jìn)行重組連接，熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH 5α，經(jīng) 過菌落PCR和限制性核酸內(nèi)切酶酶切驗證篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子后提交生物技術(shù)服務(wù)公司 進(jìn)行DNA序列測定。結(jié)果表明，通過上述基因工程的方法成功構(gòu)建鎮(zhèn)痛活性肽GRR基因。2.鎮(zhèn)痛活性肽GRR及其衍生物、類似物、活性片段的獲得利用基因過程技術(shù)，將鎮(zhèn)痛活性肽GRR基因重組至大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒中，提取質(zhì)粒進(jìn)行測序。該重組表達(dá)質(zhì)粒編碼表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征為MHHHHHHMGRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYC NGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。將陽性重組質(zhì)粒熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 ( λ DE3)，然后從該LB固體平板上挑取單菌落后接種至3ml LB(含卡那抗生素，50yg/ml)，于37°C，200r/min振蕩過夜培養(yǎng)。按 照1 %接種量將過夜培養(yǎng)物接種至400ml含相應(yīng)抗生素的新鮮LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于 370C，200r/min振蕩培養(yǎng)至0D600為0. 6-0. 8，加入終濃度為0. 166mmol/L的誘導(dǎo)物異丙基 β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，培養(yǎng)4h。結(jié)束發(fā)酵，3000g、4°C離心20min，收集菌體。用40ml 裂解緩沖液(0. IM PBS, 0. 15M NaCl，50mM咪唑)重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎，超聲結(jié)束后于 12，000g、4°C離心20min，得上清液，所得沉淀按照上述步驟重復(fù)破碎一次，合并兩次上清 液，直接上樣于0. IM PBS(pH 8.0)預(yù)先平衡好的金屬離子螯合層析柱，經(jīng)過兩個不同階段 的PH緩沖液分別充分洗滌5個柱床體積后，使用0. 5M咪唑(pH 9. 0)進(jìn)行洗脫并收獲該洗 脫液。所得產(chǎn)物經(jīng)過15% SDS-PAGE驗證其純度。由柱層析色譜圖和SDS-PAGE圖譜說明， 重組蛋白質(zhì)獲得高效表達(dá)，達(dá)到電泳純度。上述獲得的表達(dá)產(chǎn)物，利用化學(xué)法在M處斷裂肽 鏈，從而獲得鎮(zhèn)痛活性肽 GRR,結(jié)構(gòu)特征為GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAG KYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。同上原則獲得表達(dá)產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)特征為MGRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSG YCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。同上原則獲得表達(dá)產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)特征為MGRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSG YCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCH。同上原則獲得表達(dá)產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)特征為GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGY CYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCH。同上原則獲得表達(dá)產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)特征為MRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGY CYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCH。同上原則獲得表達(dá)產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)特征為RDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYC YLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCH。3.鎮(zhèn)痛活性肽GRR在酵母中的表達(dá)及其純化將編碼鎮(zhèn)痛活性肽GRR基因的序列用下列寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得插入片 斷。PCR反應(yīng)所使用的5'寡核苷酸引物序列含有EcoRV限制性內(nèi)切酶的酶切位點和鎮(zhèn)痛 活性肽GRR的N末端區(qū)域氨基酸序列的編碼序列，3'端引物序列含有EcoR I限制性內(nèi)切 酶的酶切位點、一個翻譯終止密碼子和鎮(zhèn)痛活性肽GRR的C末端區(qū)域氨基酸序列的編碼序 列。引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應(yīng)于酵母表達(dá)載體pPIC9K上的限制性內(nèi)切 酶酶切位點(其中EcoRV和SnaB I的內(nèi)切酶切口為平末端)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性 (Amplr和KarO，一個來自2 μ質(zhì)粒的復(fù)制子，一個AOXl啟動子，在畢赤酵母中可由甲醇誘導(dǎo) 高效表達(dá)，一個α -因子的信號肽序列，一個轉(zhuǎn)錄終止信號，一個HIS4選擇性標(biāo)記以及整合 序列。用SnaB I和EcoR I消化pPIC9K載體，用EcoR V和EcoR I消化插入片段，隨后 將插入片段連入PPIC9K載體，連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化E. coli DH 5 α菌株，在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在含有Amp (100 μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)含所需構(gòu)建物的克 隆。抽提質(zhì)粒，測序驗證插入片段正確插入。取質(zhì)粒線性化后，電轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞，線性化的重組載體通過與宿主基因組的同 源序列發(fā)生同源重組產(chǎn)生穩(wěn)定的酵母轉(zhuǎn)化體。利用G418篩選出高拷貝的整合轉(zhuǎn)化子。 將篩選得到的菌株接種于裝有25ml MGY、BMG或BMGY培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，于28 300C /250 300轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)至0D600 = 2 6 (16 18h)；室溫下3000轉(zhuǎn)/分離心5min，收 集菌體，用1/5到1/10原培養(yǎng)體積的匪、BMM或BMMY重懸菌體(約10 20ml)；將步驟2所 得的菌液置于IOOml的搖瓶中，用雙層紗布或粗棉布封口，放置于28 30°C /250 300轉(zhuǎn) /分的搖床上繼續(xù)生長；每24h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至終濃度為0. 5 1. 0%;分離樣 品的上清液，用截留分子量為3000Da的超濾膜超濾除去色素，用 SDS-PAGE、Western-Blot 及活性實驗檢測與鑒定重組蛋白的表達(dá)。該體系表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)特征為GRDAYIAQNYNCVYHC FRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。實施例6 鎮(zhèn)痛活性肽GRR分子中半胱氨酸殘基被替換表達(dá)產(chǎn)物的獲得本實施例獲得鎮(zhèn)痛活性肽GRR分子中半胱氨酸殘基被替換表達(dá)產(chǎn)物的策略和基 本方法，類同實施例1的策略和基本方法。本實施例列舉描述用于表達(dá)本發(fā)明鎮(zhèn)痛活性肽GRR(C12S)表達(dá)產(chǎn)物的重組質(zhì)粒 pSYPU/鎮(zhèn)痛活性肽GRR(C12S)的構(gòu)建策略和基本方法。根據(jù)鎮(zhèn)痛活性肽GRR氨基酸序列中C12前后氨基酸序列設(shè)計相應(yīng)寡核苷酸弓I物，其 中對應(yīng)半胱氨酸殘基的密碼子換成絲氨酸殘基的密碼子，以鎮(zhèn)痛活性肽GRR氨基酸序列C 末端氨基酸序列設(shè)計相應(yīng)寡核苷酸引物，同時在上述兩個寡核苷酸引物的5'端，分別加上 限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和BamHI水解位點序列；以構(gòu)建好的pSYPU/鎮(zhèn)痛活性肽GRR質(zhì)粒 為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。密碼子替換后的鎮(zhèn)痛活性肽GRR(C12S)基因進(jìn)行表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、 誘導(dǎo)表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物純化等基本過程同實施例5。獲得的鎮(zhèn)痛活性肽GRR(C12S)表達(dá)產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)特征為MGRDAYIAQNYNSVYHCFRDD YCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。同上原則獲得鎮(zhèn)痛活性肽GRR(C16S)表達(dá)產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)特征為MGRDAYIAQNYNCVY HSFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。同上原則獲得鎮(zhèn)痛活性肽GRR(C22S)表達(dá)產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)特征為MGRDAYIAQNYNCVY HCFRDDYSNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。同上原則獲得鎮(zhèn)痛活性肽GRR(C26S)表達(dá)產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)特征為MGRDAYIAQNYNCVY HCFRDDYCNGLSTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。同上原則獲得鎮(zhèn)痛活性肽GRR(C36S)表達(dá)產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)特征為MGRDAYIAQNYNCVY HCFRDDYCNGLCTENGADSGYSYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。同上原則獲得鎮(zhèn)痛活性肽GRR(C46S)表達(dá)產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)特征為MGRDAYIAQNYNCVY HCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHASWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。同上原則獲得鎮(zhèn)痛活性肽GRR(C48S)表達(dá)產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)特征為MGRDAYIAQNYNCVY HCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWSINLPDDKPIRIPGKCHRR。同上原則獲得鎮(zhèn)痛活性肽GRR(C63S)表達(dá)產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)特征為MGRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKSHRR。同上原則獲得鎮(zhèn)痛活性肽GRR-(C12S，C63S)表達(dá)產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)特征為MGRDAYIAQ NYNSVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKSHRR。同上原則獲得鎮(zhèn)痛活性肽GRR-(C16S，C36S)表達(dá)產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)特征為MGRDAYIAQ NYNCVYHSFRDDYCNGLCTENGADSGYSYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。同上原則獲得鎮(zhèn)痛活性肽GRR-(C22S，C46S)表達(dá)產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)特征為MGRDAYIAQ NYNCVYHCFRDDYSNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHASWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。同上原則獲得鎮(zhèn)痛活性肽GRR- (C26S，C48S)表達(dá)產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)特征為MGRDAYIAQ NYNCVYHCFRDDYCNGLSTENGADSGYCYLAGKYGHACWSINLPDDKPIRIPGKCHRR。實施例7:體內(nèi)鎮(zhèn)痛活性一小鼠醋酸扭體法本實施例通過小鼠體內(nèi)鎮(zhèn)痛模型確定鎮(zhèn)痛活性肽GRR的體內(nèi)生物活性_鎮(zhèn)痛活 性。此外也旨在驗證鎮(zhèn)痛活性肽GRR衍生物、類似物、活性片段以及鎮(zhèn)痛活性肽GRR分子中 半胱氨酸殘基被替換表達(dá)產(chǎn)物的鎮(zhèn)痛活性。蛋白濃度采用Lowry方法進(jìn)行測定。小鼠醋酸扭體法鎮(zhèn)痛模型將冰醋酸作為化學(xué)刺激物注入昆明種小鼠腹腔內(nèi)，繼 而引起深部的、大面積而較持久的疼痛刺激，致使小鼠產(chǎn)生“扭體”反應(yīng)(腹部內(nèi)凹、軀干與 后腿伸張、臀部高起)。18-22g昆明種小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分組，每組8只，腹腔注射樣品，20min后按 0. 2ml/20g腹腔注射0.6% (ν/ν)醋酸引起內(nèi)臟痛，5min后記錄小鼠IOmin內(nèi)的扭體次數(shù)。 以嗎啡為陽性對照，生理鹽水為空白對照，按照下述公式計算各個給藥組的扭體反應(yīng)抑制 率。
抑制率二 ΜΜ^Μ^Μ^Μ x 100% 空白組扭體次數(shù)鎮(zhèn)痛生物活性實驗結(jié)果表明1.生理鹽水空白組實驗動物扭體次數(shù)(Mean士SEM)為44. 58士2. 76 ；陽性對照 組(嗎啡，3. 51 μ mol/kg)實驗動物扭體次數(shù)(Mean士 SEM)為30. 07 士 1. 85，扭體抑制率為 32. 55%。2.從蝎毒、蝎尾、全蝎獲得的鎮(zhèn)痛活性肽GRR樣品組(0. 1375 μ mol/kg)的實驗動 物扭體抑制率均在61. 4%以上。3.鎮(zhèn)痛活性肽GRR衍生物、類似物、活性片段樣品組(0. 1375 μ mol/kg)的實驗動 物扭體抑制率均在57. 6%以上。4.鎮(zhèn)痛活性肽GRR分子中半胱氨酸殘基被替換表達(dá)產(chǎn)物樣品組(0. 1375 μ mol/ kg)的實驗動物扭體抑制率在21. 5%以上，該結(jié)果表明鎮(zhèn)痛活性肽GRR分子中半胱氨酸殘 基是其鎮(zhèn)痛活性保守性氨基酸殘基。
權(quán)利要求
鎮(zhèn)痛活性肽GRR，其特征在于，它是從蝎毒或蝎尾或全蝎提取、分離、純化獲得的如下氨基酸序列GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。
2.一種如權(quán)利要求1所述的鎮(zhèn)痛活性肽GRR的生產(chǎn)方法，其特征在于，它包括⑴蝎毒 或蝎尾或全蝎用蒸餾水或酸性溶液或堿性溶液溶解提取，離心除去雜質(zhì)得到抽提液，(2)抽 提液經(jīng)疏水層析柱分離得到鎮(zhèn)痛活性組分，(3)得到鎮(zhèn)痛活性組分經(jīng)超濾以去除鹽和雜蛋 白，同時進(jìn)行濃縮，通過離子交換層析柱分離得到鎮(zhèn)痛活性組分，(4)經(jīng)疏水層析柱進(jìn)一步 分離得到鎮(zhèn)痛活性組分，(5)經(jīng)超濾以去除鹽和濃縮，通過離子交換層析柱純化得到鎮(zhèn)痛活 性組分，(6)經(jīng)凝膠過濾層析柱進(jìn)一步純化得到鎮(zhèn)痛活性組分，(7)經(jīng)反向?qū)游鲋玫礁呒?度的鎮(zhèn)痛活性肽GRR。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鎮(zhèn)痛活性肽GRR的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的分離和純化 方法包括蝎毒或蝎尾或全蝎用蒸餾水或酸性溶液或堿性溶液溶解提取并經(jīng)離心除去雜質(zhì) 得到的抽提液，該抽提液可以通過疏水層析柱、離子交換層析柱、凝膠過濾層析柱的不同組 合以及經(jīng)超濾去除鹽、雜蛋白和濃縮得到鎮(zhèn)痛活性肽GRR。
4.一種如權(quán)利要求1所述的鎮(zhèn)痛活性肽GRR的鎮(zhèn)痛活性保守性氨基酸殘基，其特征在 于，它包括所述的鎮(zhèn)痛活性肽GRR的N-末端第12位、第16位、第22位、第26位、第36位、 第46位、第48位和第63位這八個半胱氨酸殘基。
5.鎮(zhèn)痛活性肽GRR的衍生物或類似物或活性片段，其特征在于，它包含權(quán)利要求1和權(quán) 利要求4任何一項所述的氨基酸序列全序或片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鎮(zhèn)痛活性肽GRR及其衍生物或類似物或活性片段，可以利用 基因工程技術(shù)進(jìn)行表達(dá)獲得，其特征在于，表達(dá)宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鎮(zhèn)痛活性肽GRR及其衍生物或類似物或活性片段，可以利用 化學(xué)合成技術(shù)獲得，其特征在于，化學(xué)合成為人工合成或合成儀合成。
8.鎮(zhèn)痛活性肽GRR及其衍生物或類似物或活性片段在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的鎮(zhèn)痛活性肽GRR及其衍生物或類 似物或活性片段可以與藥學(xué)上可接受的載體混合制備臨床上可接受的注射劑、口服制劑、 透皮吸收制劑、粘膜吸收制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及從天然材料提取、分離、純化獲得的鎮(zhèn)痛活性肽GRR及其制備方法、利用基因工程技術(shù)獲得鎮(zhèn)痛活性肽GRR方法、鎮(zhèn)痛活性肽GRR衍生物、類似物、活性片段的結(jié)構(gòu)及其制備方法和鎮(zhèn)痛活性肽GRR及其衍生物、類似物、活性片段作為鎮(zhèn)痛藥物在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。所述的鎮(zhèn)痛活性肽GRR是從蝎毒或蝎尾或全蝎提取、分離、純化獲得的如下氨基酸序列GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。所述的鎮(zhèn)痛活性肽GRR及其衍生物或類似物或活性片段可以與藥學(xué)上可接受的載體混合制備臨床上可接受的注射劑、口服制劑、透皮吸收制劑、粘膜吸收制劑。本發(fā)明所述的鎮(zhèn)痛活性肽GRR具有較好的鎮(zhèn)痛活性，其獲得方法常規(guī)、簡單、產(chǎn)量高。
文檔編號A61P29/00GK101880319SQ20101010746
公開日2010年11月10日 申請日期2010年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月9日
發(fā)明者劉巖峰, 吳春福, 崔勇, 張景海, 毛英姿, 郭桂麗 申請人:沈陽藥科大學(xué)