專(zhuān)利名稱(chēng)：一種治療白癜風(fēng)的復(fù)方藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療白癜風(fēng)的復(fù)方藥物及其制備方法，屬于民族醫(yī)藥學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
白癜風(fēng)是一種常見(jiàn)多發(fā)的色素性皮膚病，表現(xiàn)為局部或泛發(fā)性色素脫失。祖國(guó)醫(yī)學(xué)很早就有關(guān)于本病的記載，公元601年隋代巢元方《諸病源候論》一書(shū)就已講到“白癜者，面及頸項(xiàng)身體皮肉變白，與肉色不同，亦不痛癢，謂之白癜?！卑遵凹船F(xiàn)在的白癜風(fēng)。白癜風(fēng)在世界各地均有發(fā)生。發(fā)病率估計(jì)在1％左右。一般膚色淺的人發(fā)病率較低，膚色較深的人發(fā)病率較高。美國(guó)白人發(fā)病率為1％，丹麥為0.4％，日本為2％，而南印度高達(dá)4％。我國(guó)目前只有部分地區(qū)的資料，根據(jù)上海市11萬(wàn)人皮膚調(diào)查報(bào)告，白癜風(fēng)占調(diào)查人數(shù)的0.54％。本病雖不影響患者正常生理活動(dòng)，但影響美容，給病人造成的心理負(fù)擔(dān)和精神痛苦仍是巨大的。因此，對(duì)本病的防治具有重要的意義。由于白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，因此對(duì)白癜風(fēng)的治療僅停留在治標(biāo)的階段。目前對(duì)白癜風(fēng)的治療手段有限，總體上分為手術(shù)療法和非手術(shù)療法，非手術(shù)療法包括光化學(xué)療法、激素療法、免疫抑制劑療法和中藥療法；手術(shù)療法包括自表皮移植、細(xì)胞移植、皮膚削磨等。采用光學(xué)療法會(huì)對(duì)皮膚產(chǎn)生光毒性，易導(dǎo)致皮膚癌的發(fā)生；長(zhǎng)期使用激素類(lèi)藥物或者免疫抑制劑等治療會(huì)導(dǎo)致患者自身免疫和體液免疫下降等問(wèn)題；手術(shù)療法由于給病患帶來(lái)痛苦、價(jià)格昂貴、要求技術(shù)條件高、成功率低等原因不能被廣泛應(yīng)用；中醫(yī)中藥治療使用方便，應(yīng)用范圍廣，不受部位、類(lèi)型限制，維吾爾醫(yī)藥作為中華醫(yī)藥寶庫(kù)中一枝奇葩，在對(duì)白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)理上見(jiàn)解獨(dú)特，在藥物治療上有特殊而顯著的療效。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種治療白癜風(fēng)的復(fù)方藥物及其制備方法，該復(fù)方藥是由維藥補(bǔ)骨脂、驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊、高良姜、盒果藤四味藥材為原料，加入藥學(xué)上可接受的輔料，采用溶劑提取、濃縮、除雜等預(yù)處理和超微粉碎制成，該復(fù)方藥是根據(jù)中醫(yī)藥理論，結(jié)合民族醫(yī)藥的特點(diǎn)，依據(jù)少數(shù)民族在長(zhǎng)期的民間臨床實(shí)踐，采用簡(jiǎn)便合理的提取方法，使得每一味藥材治療白癜風(fēng)的有效成分得以溶出，從提取工藝上保證了其藥理作用的發(fā)揮。該復(fù)方藥療效確切、副作用少、復(fù)發(fā)率低、服用劑量小的，適用于片劑、膠囊劑、滴丸，為白癜風(fēng)患者應(yīng)用提供了方便。
本發(fā)明所述的一種治療白癜風(fēng)的復(fù)方藥物，以制備1000g為基數(shù)，其中補(bǔ)骨脂5-30份，驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊8-25份，高良姜10-20份，盒果藤9-18份，輔料為淀粉、糊精、微晶纖維素、硬脂酸鎂、聚維酮、羧甲基淀粉鈉、甘油明膠、硬脂酸鈉、植物油、甲基硅油、液體石蠟或蟲(chóng)膠6-29份制成。
所述的一種治療白癜風(fēng)的復(fù)方藥物的制備方法，按下列步驟進(jìn)行 a、將經(jīng)篩選好的補(bǔ)骨脂、高良姜、驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊藥材混合粉碎至5-80目，用6-12倍量的溶劑提取1-4次，溫度20℃-100℃，每次提取時(shí)間1-3小時(shí)，合并提取液，回收溶劑，濃縮，真空干燥或噴霧干燥，即得干浸膏，粉碎成粉末，過(guò)60-120目藥篩，備用； b、采用常規(guī)的超微粉碎方法將盒果藤粉碎過(guò)200-400目的藥篩，備用； c、將步驟a和步驟b混合均勻，即得混合藥粉； d、將步驟c混合藥粉與輔料充分混勻，按常規(guī)制藥方法制成片劑、膠囊劑或滴丸即可。
步驟a提取溶劑為20-95％濃度的乙醇水溶液或水溶液。
本發(fā)明結(jié)合現(xiàn)代化的技術(shù)和方法，采用溶劑提取和超微粉碎技術(shù)，提高功效成分的提取率，使其符合藥物在體內(nèi)吸收、分布代謝的規(guī)律，提高藥效。
本發(fā)明所述的一種治療白癜風(fēng)的復(fù)方藥物，其特點(diǎn)為組方獨(dú)特，療效確切、副作用少、制備工藝簡(jiǎn)單易行，具有通脈、理血，清除異常粘液質(zhì)，促進(jìn)皮膚著色，治療白癜風(fēng)之功效，適用于白癜風(fēng)患者內(nèi)服。
本發(fā)明所述的一種治療白癜風(fēng)的復(fù)方藥物，其藥理特性為 所用補(bǔ)骨脂、驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊為主藥，二者清除皮膚過(guò)盛或淤滯的異常粘液質(zhì)，促進(jìn)色素沉著，恢復(fù)皮膚顏色；補(bǔ)骨脂用于治療白癜風(fēng)已有很長(zhǎng)的歷史，研究發(fā)現(xiàn)，黑素細(xì)胞的遷移和黑素合成在白癜風(fēng)復(fù)色過(guò)程中有重要作用。補(bǔ)骨脂對(duì)黑素細(xì)胞可溶性總蛋白合成和c-kit基因蛋白表達(dá)有促進(jìn)作用。補(bǔ)骨脂酊劑在臨床上用于白癜風(fēng)的治療，收到了良好的效果。目前，已將補(bǔ)骨脂提取物制成不同劑型對(duì)白癜風(fēng)患者進(jìn)行治療，并且療效顯著。
驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊對(duì)白癜風(fēng)的治療作用，主要是通過(guò)抑制機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫，降低機(jī)體對(duì)自身組織(如黑素細(xì)胞)的免疫反應(yīng)，減少自身組織的損傷。此外，驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊對(duì)酪氨酸酶有激活作用，可提高皮膚對(duì)紫外線(xiàn)的敏感性，對(duì)酪氨酸酶活性和黑素生成量均呈劑量依賴(lài)性增強(qiáng)作用，它還直接補(bǔ)充局部微量元素，改善局部微循環(huán)。
高良姜、盒果藤燥濕祛寒，溫胃消食，開(kāi)通阻滯，作為輔助藥，起到抗氧化、增強(qiáng)免疫功能的作用，間接治療白癜風(fēng)。
現(xiàn)代元素醫(yī)學(xué)研究表明，銅、鋅、鐵、鈣、鎂、錳、鍶、硒元素與白癜風(fēng)發(fā)病相關(guān)性最大，而這幾種元素又不同程度地分布于補(bǔ)骨脂、驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊、高良姜、盒果藤中，通過(guò)補(bǔ)充微量元素輔助治療白癜風(fēng)。
具體實(shí)施例方式 下面以具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明 實(shí)施例1(制備片劑，并以表的方式進(jìn)行列舉) a、將經(jīng)篩選好的補(bǔ)骨脂、高良姜、驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊藥材混合粉碎至5目，用6倍量的水溶液提取1次，溫度20℃，提取時(shí)間4小時(shí)，回收溶劑，濃縮，真空干燥，即得干浸膏，粉碎成粉末，過(guò)60目藥篩，備用； b、采用常規(guī)的超微粉碎方法將盒果藤粉碎過(guò)200目的藥篩，備用； c、將步驟a和步驟b混合均勻，即得混合藥粉； d、將步驟c混合藥粉與輔料充分混勻，按常規(guī)制藥方法制成片劑即可。
表1 制備0.5g的片劑
注表中MCC，CMS-Na，PVP分別為微晶纖維素，羧甲基纖維素鈉，聚維酮。
實(shí)施例2(制備片劑，并以表的方式進(jìn)行列舉) a、將經(jīng)篩選好的補(bǔ)骨脂、高良姜、驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊藥材混合粉碎至20目，用8倍量的20％濃度的乙醇水溶液2次，溫度40℃，每次提取時(shí)間1.5小時(shí)，合并提取液，回收溶劑，濃縮，噴霧干燥，即得干浸膏，粉碎成粉末，過(guò)80目藥篩，備用； b、采用常規(guī)的超微粉碎方法將盒果藤粉碎過(guò)250目的藥篩，備用； c、將步驟a和步驟b混合均勻，即得混合藥粉； d、將步驟c混合藥粉與輔料充分混勻，按常規(guī)制藥方法制成片劑即可見(jiàn)表。
表2制備0.4g的片劑
注表中MCC，CMS-Na，PVP分別為微晶纖維素，羧甲基纖維素鈉，聚維酮。
實(shí)施例3(制備片劑，并以表的方式進(jìn)行列舉) a、將經(jīng)篩選好的補(bǔ)骨脂、高良姜、驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊藥材混合粉碎至50目，用10倍量的40％濃度的乙醇水溶液提取3次，溫度60℃，提取時(shí)間2小時(shí)，合并提取液，回收溶劑，濃縮，真空干燥，即得干浸膏，粉碎成粉末，過(guò)100目藥篩，備用； b、采用常規(guī)的超微粉碎方法將盒果藤粉碎過(guò)300目的藥篩，備用； c、將步驟a和步驟b混合均勻，即得混合藥粉； d、將步驟c混合藥粉與輔料充分混勻，按常規(guī)制藥方法制成片劑即可。
表3制備0.4g的片劑
注表中MCC，CMS-Na，PVP分別為微晶纖維素，羧甲基纖維素鈉，聚維酮。
實(shí)施例4(制備片劑，并以表的方式進(jìn)行列舉) a、將經(jīng)篩選好的補(bǔ)骨脂、高良姜、驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊藥材混合粉碎至80目，用12倍量的60％濃度的乙醇水溶液提取3次，溫度80℃，每次提取時(shí)間2小時(shí)，合并提取液，回收溶劑，濃縮，真空干燥，即得干浸膏，粉碎成粉末，過(guò)120目藥篩，備用； b、采用常規(guī)的超微粉碎方法將盒果藤粉碎過(guò)350目的藥篩，備用； c、將步驟a和步驟b混合均勻，即得混合藥粉； d、將步驟c混合藥粉與輔料充分混勻，按常規(guī)制藥方法制成片劑即可。
表4制備0.4g的片劑
注表中MCC，CMS-Na，PVP分別為微晶纖維素，羧甲基纖維素鈉，聚維酮。
實(shí)施例5(制備片劑，并以表的方式進(jìn)行列舉) a、將經(jīng)篩選好的補(bǔ)骨脂、高良姜、驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊藥材混合粉碎至50目，用7倍量的80％濃度的乙醇水溶液提取4次，溫度35℃，每次提取時(shí)間1小時(shí)，合并提取液，回收溶劑，濃縮，噴霧干燥，即得干浸膏，粉碎成粉末，過(guò)120目藥篩，備用； b、采用常規(guī)的超微粉碎方法將盒果藤粉碎過(guò)400目的藥篩，備用； c、將步驟a和步驟b混合均勻，即得混合藥粉； d、將步驟c混合藥粉與輔料充分混勻，按常規(guī)制藥方法制成片劑即可。
表5制成0.3g的片劑
實(shí)施例6(制備片劑，并以表的方式進(jìn)行列舉) a、將經(jīng)篩選好的補(bǔ)骨脂、高良姜、驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊藥材混合粉碎至70目，用9倍量的95％濃度的乙醇水溶液提取2次，溫度100℃，每次提取時(shí)間1小時(shí)，合并提取液，回收溶劑，濃縮，真空干燥，即得干浸膏，粉碎成粉末，過(guò)70目藥篩，備用； b、采用常規(guī)的超微粉碎方法將盒果藤粉碎過(guò)300目的藥篩，備用； c、將步驟a和步驟b混合均勻，即得混合藥粉； d、將步驟c混合藥粉與輔料充分混勻，按常規(guī)制藥方法制成片劑即可。
表6 制備0.3g的片劑
注表中MCC，CMS-Na，PVP分別為微晶纖維素，羧甲基纖維素鈉，聚維酮。
實(shí)施例7(制備片劑，并以表的方式進(jìn)行列舉) 制備方法同實(shí)施例1，加入粘合劑，濕法制粒，整粒，以硬脂酸鎂作為潤(rùn)滑劑，灌裝成0號(hào)膠囊，膠囊重約0.3g。
表7
實(shí)施例8(制備膠囊，并以表的方式進(jìn)行列舉) 制備方法同實(shí)施例2，灌裝成0號(hào)膠囊，膠囊重約0.3g。
表8
實(shí)施例9(制備膠囊，并以表的方式進(jìn)行列舉) 制備方法同實(shí)施例3，灌裝成0號(hào)膠囊，膠囊重約0.3g。
表9
實(shí)施例10(制備膠囊，并以表的方式進(jìn)行列舉) 制備方法同實(shí)施例4，灌裝成1號(hào)膠囊，膠囊重約0.25g。
表10
實(shí)施例11(制備膠囊，并以表的方式進(jìn)行列舉) 制備方法同實(shí)施例5，灌裝成1號(hào)膠囊，膠囊重約0.25g。
表11
實(shí)施例12(制備膠囊，并以表的方式進(jìn)行列舉) 制備方法同實(shí)施例6，灌裝成1號(hào)膠囊，膠囊重約0.25g。
表12
實(shí)施例13(制備滴丸，并以表的方式進(jìn)行列舉) 制備方法同實(shí)施例1，按常規(guī)制藥方法制成滴丸。
表13
注表中PEG為聚乙二醇。
實(shí)施例14(制備滴丸，并以表的方式進(jìn)行列舉) 制備方法同實(shí)施例2，按常規(guī)方法制成滴丸。
表14
注表中PEG為聚乙二醇 實(shí)施例15(制備滴丸，并以表的方式進(jìn)行列舉) 制備方法同實(shí)施例3，按常規(guī)制藥方法制成滴丸。
表15
注表中PEG為聚乙二醇 實(shí)施例16(制備滴丸，并以表的方式進(jìn)行列舉) 制備方法同實(shí)施例4，按常規(guī)制藥方法制成滴丸。
表16
實(shí)施例17(制備滴丸，并以表的方式進(jìn)行列舉) 制備方法同實(shí)施例5，按常規(guī)制藥方法制成滴丸。
表17
實(shí)施例18(制備滴丸，并以表的方式進(jìn)行列舉) 制備方法同實(shí)施例6，按常規(guī)制藥方法制成滴丸。
表18
實(shí)施例19 1.實(shí)驗(yàn)材料 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 黑色豚鼠(250±20g)112只，雌雄各半。
1.2主要試劑 氫醌、過(guò)氧化氫、Dopa-氧化酶、鼠抗人酪氨酸酶單克隆抗體、DAB-H2O2、Elvision試劑 1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器 光學(xué)顯微鏡(LEICA DM2500)、pH計(jì)(SartoriμsPB-10)、離心機(jī)(XYJ80-2)、全自動(dòng)生化分析儀(Olympμs AM 400)、電子天平(JA1203)、生物組織攤烤片機(jī)(KZPG-1A)、生物組織包埋機(jī)(BMG-1)、切片機(jī)(RM2235)、粉碎機(jī)(ST-10B)、微波爐(Galanzwap700)、恒溫水域鍋(DK-8D) 2 方法 2.1試劑的配制 略 2.2給藥 治療白癜風(fēng)的復(fù)方藥物高、中、低劑量的給藥量分別為1160mg/kg、870mg/kg、580mg/kg。
陽(yáng)性對(duì)照藥給藥劑量換算 白靈片人用量為12片每天，0.3g每片，即3600mg/70kg＝52mg/kg，折算到豚鼠的劑量＝5.42×52mg/kg＝282mg/kg·d 2.3具體試驗(yàn)方法 將上述112只黑色豚鼠，采用隨機(jī)分組方案平均分為8組，每組雌雄各7只。脫去各組動(dòng)物背部黑色毛5cm×5cm，將其中7組采用5％氫醌對(duì)黑色豚鼠進(jìn)行皮膚脫色，第8組動(dòng)物每天涂抹等量生理鹽水，連續(xù)涂抹30天。
具體分組情況及實(shí)驗(yàn)方法如下 ①I(mǎi)組(高劑量組) 動(dòng)物脫毛區(qū)涂抹5％氫醌，每次0.5ml，每天2次。采用氫醌脫色30天后，每只動(dòng)物每天灌胃給復(fù)方藥物混懸液1160mg/kg，連續(xù)觀察給藥30天。
②II組(中劑量組) 動(dòng)物脫毛區(qū)涂抹5％氫醌0.5ml，每天2次。采用氫醌脫色30天后，每只動(dòng)物每天灌胃給復(fù)方藥物混懸液870mg/kg，連續(xù)觀察給藥30天。
③III組(低劑量組) 動(dòng)物脫毛區(qū)涂抹5％氫醌0.5ml，每天2次。采用氫醌脫色30天后，每只動(dòng)物每天灌胃給復(fù)方藥物混懸液580mg/kg，連續(xù)觀察給藥30天。
④IV組(陽(yáng)性藥物對(duì)照組) 動(dòng)物脫毛區(qū)涂抹5％氫醌0.5ml，每天2次。采用氫醌脫色30天后，每?jī)芍粍?dòng)物每天給白靈片564mg/kg，連續(xù)觀察給藥30天。
⑤V組(中劑量預(yù)防組) 動(dòng)物脫毛區(qū)涂抹5％氫醌0.5ml，每天兩次，連續(xù)涂抹30天。從氫醌脫色之日起，每只動(dòng)物每天灌胃給復(fù)方藥物混懸液870mg/kg，連續(xù)觀察給藥60天。
⑥VI組(自身恢復(fù)組) 動(dòng)物脫毛區(qū)涂抹5％氫醌0.5ml，每天2次，連續(xù)涂抹30天。采用氫醌脫色30天后，動(dòng)物不加任何藥物干預(yù)，觀察自身恢復(fù)情況，連續(xù)觀察30天。
⑦VII組(模型組) 動(dòng)物脫毛區(qū)涂抹5％氫醌0.5ml，每天兩次，連續(xù)涂抹30天。采用氫醌脫色30天后，處死動(dòng)物，觀察各項(xiàng)指標(biāo)。
⑧VIII組(正常對(duì)照組) 動(dòng)物脫毛區(qū)涂抹生理鹽水0.5ml，每天2次，連續(xù)涂抹30天。在其余各組開(kāi)始藥物干預(yù)開(kāi)始，每只每天灌胃生理鹽水2ml，連續(xù)觀察給藥30天。
以上各組動(dòng)物每5天對(duì)受試區(qū)脫毛一次。
3.結(jié)果與分析 給藥結(jié)束后，肉眼觀察各組動(dòng)物受試區(qū)皮膚顏色，處死動(dòng)物，取皮膚組織，進(jìn)行固定，石蠟包埋，切片后對(duì)黑素細(xì)胞進(jìn)行Dopa-氧化酶染色和Lillie染色作豚鼠表皮黑素細(xì)胞(melanocyte，MC)數(shù)、含黑素顆?；准?xì)胞數(shù)、酪氨酸酶含量的觀察。
3.1受試后肉眼觀察動(dòng)物受試區(qū)皮膚情況 3.1.1各氫醌脫色組動(dòng)物受試區(qū)皮膚，較正常對(duì)照組動(dòng)物受試區(qū)皮膚明顯偏白。
3.1.2預(yù)防給藥組動(dòng)物皮膚，較其它氫醌脫色組動(dòng)物受試區(qū)皮膚偏黑。
3.1.3自身恢復(fù)組動(dòng)物皮膚，較其它氫醌脫色組動(dòng)物受試區(qū)皮膚偏白。
3.1.4高、中、低給藥劑量組、陽(yáng)性對(duì)照藥物組受試區(qū)皮膚肉眼觀察無(wú)明顯差別。
3.2表皮黑素細(xì)胞的觀察 Dopa-氧化酶染色后，棕黑色染色為黑素細(xì)胞陽(yáng)性。分別于光鏡下測(cè)定每個(gè)高倍鏡視野內(nèi)各組MC數(shù)量，每個(gè)標(biāo)本觀察10個(gè)高倍鏡視野，計(jì)算每100個(gè)表皮基底細(xì)胞中MC的平均數(shù)量。用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
表1 表皮MC計(jì)數(shù)(x±s)
[注]*P＜0.05(與正常對(duì)照組比較)；△△P＜0.01(與模型組比較)；▲P＜0.05(與中劑量組比較)。
3.3含黑素顆粒的基底細(xì)胞計(jì)數(shù) Lillie染色后，黑色素呈暗綠色為陽(yáng)性，分別于光鏡下測(cè)定各組含黑素顆粒的基底細(xì)胞數(shù)量，每個(gè)標(biāo)本觀察10個(gè)高倍鏡視野，計(jì)算每100個(gè)表皮基底細(xì)胞中含黑素顆粒的基底細(xì)胞的平均數(shù)量。
表2 表皮含黑素顆粒基底細(xì)胞計(jì)數(shù)(x±s)
[注]**P＜0.01(與正常對(duì)照組比較)；△△P＜0.01(與模型組比較)。
3.4酪氨酸酶含量觀察 酪氨酸酶陽(yáng)性產(chǎn)物定位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，顯微鏡下細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒、或團(tuán)塊狀為陽(yáng)性表達(dá)。采用二級(jí)計(jì)分法判定結(jié)果，陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)＜5％為0分；5％-25％為1分；25％-50％為2分；50％-75％為3分；＞75％為4分。按染色強(qiáng)度分類(lèi)淡黃色1分；黃或深黃2分；褐或棕黃色3分。兩者相加小于2分為陰性(-)，2-3分為陽(yáng)性(+)，4-5分為中等陽(yáng)性(2+)，6-7分為強(qiáng)陽(yáng)性(3+)。各組動(dòng)物皮膚之間的陽(yáng)性率比較均采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有顯著性差異。
表3 酪氨酸酶強(qiáng)度(x)
[注]**P＜0.01(與正常對(duì)照組組比較)；△△P＜0.01(與模型組比較)。
4討論 正常MC定位于表皮基底層，黑素細(xì)胞起源于外胚層的神經(jīng)嵴，在胚胎發(fā)育過(guò)程中通過(guò)間充質(zhì)逐漸移行到表皮、毛囊、眼等處。黑素細(xì)胞的發(fā)育大致經(jīng)歷了神經(jīng)嵴細(xì)胞、成黑素細(xì)胞和黑素細(xì)胞三個(gè)階段。黑素細(xì)胞的數(shù)量或功能異常，將會(huì)引起許多色素性皮膚病，如白癜風(fēng)。
有兩種已知的機(jī)制可以導(dǎo)致黑素細(xì)胞的死亡壞死和凋亡。壞死是外源性的細(xì)胞毒性因子引起的細(xì)胞破壞，以浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞攻擊細(xì)胞或組織為主要特征。細(xì)胞死亡的另一種方式是凋亡，或稱(chēng)為程序性死亡。凋亡是由細(xì)胞內(nèi)部的一系列基因調(diào)控的重要機(jī)制，通過(guò)凋亡，多細(xì)胞生物能夠控制局部細(xì)胞的數(shù)目。
白癜風(fēng)的病因不明，有許多實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，特定的環(huán)境和化學(xué)物質(zhì)對(duì)黑素細(xì)胞有選擇性毒害作用，可能是白癜風(fēng)發(fā)病的因素之一。苯酚和兒茶酚的芳香族和脂肪族產(chǎn)物，對(duì)體內(nèi)外對(duì)黑素細(xì)胞有明顯的毒性作用。本試驗(yàn)采用氫醌脫色法制造的白癜風(fēng)動(dòng)物模型，就是利用了苯酚和兒茶酚的芳香族對(duì)黑素細(xì)胞的選擇性毒性，導(dǎo)致黑素細(xì)胞的壞死或者凋亡。
本試驗(yàn)采用一種治療白癜風(fēng)的復(fù)方藥物治療化學(xué)脫色所致的黑素細(xì)胞脫失的白癜風(fēng)動(dòng)物模型，通過(guò)治療可以看出給藥組動(dòng)物皮膚受試區(qū)較未經(jīng)藥物治療動(dòng)物的黑素細(xì)胞明顯增加，因此可以得出結(jié)論該藥可促進(jìn)黑素細(xì)胞的生物修復(fù)或者生成。另外經(jīng)藥物治療后，動(dòng)物表皮基底層含黑素顆粒細(xì)胞較未經(jīng)治療組明顯增多，表明該藥可以促進(jìn)黑素的生成。
在黑素細(xì)胞的黑素生物合成過(guò)程中，酪氨酸酶是黑素合成的關(guān)鍵酶，其活性決定著黑素合成的速度和產(chǎn)量。酪氨酸酶的表達(dá)定位于表皮基底部黑素細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，為黃或棕黃色顆粒，呈局部灶性或彌漫性分布。本試驗(yàn)顯示與模型組動(dòng)物受試區(qū)皮膚相比，高、中、低劑量給藥組酪氨酸酶表達(dá)量明顯增加，預(yù)防給藥組動(dòng)物皮膚受試區(qū)酪氨酸酶的表達(dá)含量同樣高出模型組，說(shuō)明這種治療白癜風(fēng)的復(fù)方藥物對(duì)酪氨酸酶的表達(dá)有促進(jìn)作用，可能是通過(guò)對(duì)酪氨酸酶表達(dá)的上調(diào)作用治療白癜風(fēng)。
實(shí)施例20 1實(shí)驗(yàn)材料 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1.1.1家兔 成年健康新西蘭兔8只(3.15±0.32kg)，雌雄各半。
1.1.2Wistar大鼠 Wistar大鼠16只(250±20g)，雌雄各半。
1.2細(xì)胞 A375黑素瘤細(xì)胞(購(gòu)于中國(guó)科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)) 1.3主要試藥與試劑 1.3.1試劑 DMEM培養(yǎng)液(GIBCO公司)、四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT，美國(guó)Sigam公司)、小牛血清(杭州四季清生物公司)、二甲基亞砜(天津市光復(fù)化工研究所，070617) 1.3主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(MCO175)、酶標(biāo)儀(550)、電子分析天平(Sartorius BS224S)、倒置顯微鏡(XT101) 2方法 2.1試劑的配制 2.1.1DMEM培養(yǎng)液 將一袋粉末狀DMEM培養(yǎng)基溶于1000ml的超純水中，按說(shuō)明加入NaHCO33.7g，調(diào)節(jié)pH為7.2，超凈工作臺(tái)下蔡氏濾器過(guò)濾分裝，然后加入滅活后的血清，使血清最終濃度為10％，同時(shí)加入青霉素、鏈霉素，使其終濃度分別為100U/ml，100μg/ml。
2.1.2 D-Hanker’s液的配制 NaCl 8.0g、KCl 0.4g、Na2HPO4·12H2O 0.716g、KH2PO40.06g、NaHCO3 0.35g、酚紅0.01g 將上述試劑溶解于超純水中，調(diào)pH至7.0-7.2，定容為1000ml。高壓滅菌后，于超凈臺(tái)內(nèi)加入濾過(guò)除菌的青霉素、鏈霉素，使其終濃度分別為100U/ml，100μg/ml，4℃冰箱保存待用。
2.1.3 MTT溶液 250mgMTT溶于50mlD-Hanker’s液中，無(wú)菌條件下過(guò)濾、分裝。
2.1.4 血清的處理 將購(gòu)買(mǎi)的小牛血清于恒溫水浴鍋中，56℃滅活30min。
2.2 實(shí)驗(yàn)方法 2.2.1 A375黑素瘤細(xì)胞的傳代擴(kuò)增 ①新購(gòu)細(xì)胞的換液 將新購(gòu)買(mǎi)來(lái)的A375黑素瘤細(xì)胞，迅速置于超靜工作臺(tái)上，將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液輕輕倒出，然后向75cm細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入配制好的DMEM培養(yǎng)液后，37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
②細(xì)胞的傳代 觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)至培養(yǎng)瓶底的80％時(shí)，進(jìn)行傳代。
向75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入0.5ml0.25％胰酶，輕輕搖晃，使液體充分浸潤(rùn)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞，倒掉多余液體，迅速將培養(yǎng)瓶放置于培養(yǎng)箱中，3min后取出。然后顯微鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞蜷縮成團(tuán)。
取出后立即加入含血清的DMEM培養(yǎng)液20ml，然后用無(wú)菌一次向注射器充分吹打，使細(xì)胞團(tuán)分散，直至完全均勻。
然后將細(xì)胞懸液分裝至兩個(gè)新的75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，繼續(xù)于37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
③A375黑素瘤細(xì)胞的凍存 細(xì)胞傳代至第三代后，取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞進(jìn)行凍存。
(1)向75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入0.5ml 0.25％的胰酶，輕輕搖晃，使液體充分浸潤(rùn)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞，倒掉多余液體，迅速將培養(yǎng)瓶放置于培養(yǎng)箱中，3min后取出。然后顯微鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞蜷縮成團(tuán)。
(2)3min后將培養(yǎng)瓶取出，向瓶?jī)?nèi)加入20ml高糖完全DMEM培養(yǎng)液，然后用一次性注射器充分吹打，使細(xì)胞團(tuán)分散，直至完全均勻。
(3)將吹打均勻的細(xì)胞懸液用1000μl移液槍吸取900μl，將吸取的細(xì)胞懸液置于凍存管后再加入100μl二甲基亞砜。
(4)將細(xì)胞凍存管無(wú)菌操作條件下標(biāo)記、密封。
(5)將細(xì)胞凍存管放置于4℃冰箱中30min。
(6)于4℃冰箱中取出后置于-20℃冰箱中30min。
(7)于-20℃冰箱中取出后-80℃超低溫冰箱中過(guò)夜。
(8)第二天置于液氮中凍存，并記錄凍存日期與細(xì)胞品系。
2.2.2家兔含藥血清的制備 ①實(shí)驗(yàn)分組 將8只家兔分為給藥組和空白對(duì)照組，每組雌雄各兩只。
②家兔給藥劑量 采用公式(mg/kg)dB＝dA*kB/kA(B家兔 A人)進(jìn)行計(jì)算，得出家兔每公斤體重正常每日應(yīng)用劑量為349mg，2.5kg家兔正常每日應(yīng)用劑量為873mg。
采用家兔灌胃器，可容許的混懸濃度為25％。給藥組動(dòng)物每只每天灌胃給藥30ml，家兔給藥劑量相當(dāng)于人用劑量的10倍。
③給藥方法 給藥組每只家兔每天灌胃給藥30ml，分兩次給藥。連續(xù)給藥4天。
空白對(duì)照組每只家兔每天灌胃生理鹽水30ml，分兩次給藥。連續(xù)給藥4天。
④血清的獲得 上述各組動(dòng)物于最后一次給藥后0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h靜脈無(wú)菌取血，分離血清。
⑤血清的制備 將每只動(dòng)物各個(gè)采血時(shí)段分離所得的血清經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，并且取各取血時(shí)段所得血清一部分，得到合并血清。然后每組取一雌一雄動(dòng)物血清和一部分合并血清經(jīng)56℃、30min滅活兩只動(dòng)物血清不做滅活處理。
2.2.3 家兔含藥血清藥效學(xué)評(píng)價(jià) ①取100μl傳至第四代的A375黑素瘤細(xì)胞株懸液接種于96孔板內(nèi)，其中第一列不接種，作為空白對(duì)照列。
②向細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)含細(xì)胞株的孔內(nèi)分別加入各組動(dòng)物各個(gè)取血時(shí)段分離的無(wú)菌滅活與未滅活血清40μl，每組血清加4個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)不加血清的A375黑素正常對(duì)照孔4個(gè)平行孔，每孔終體積140μl，正常對(duì)照孔加培養(yǎng)液加至140μl。
③將加樣細(xì)胞37℃，5％CO2培養(yǎng)72h。
④培養(yǎng)結(jié)束前4h加入MTT溶液(5mg/L)15μl，繼續(xù)于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。
⑤終止培養(yǎng)后，棄去上清液，每孔加入100μl二甲基亞砜，沉淀充分溶解后，于酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔A值。
2.2.4大鼠含藥血清的制備 ①實(shí)驗(yàn)分組 將16只大鼠分為給藥組和空白對(duì)照組，每組雌雄各半。
②大鼠給藥劑量 采用公式(mg/kg)dB＝dA*kB/kA(B大鼠 A人)進(jìn)行計(jì)算，得出大鼠每公斤體重正常每日應(yīng)用劑量為674mg，300g大鼠正常每日應(yīng)用劑量為202mg。
采用大鼠灌胃器，可容許的混懸濃度為15％。給藥組動(dòng)物每只每天灌胃給藥10ml，大鼠給藥劑量相當(dāng)于臨床人用劑量的7.5倍。
③給藥方法 給藥組每只大鼠每天灌胃給藥10ml，分兩次給藥。連續(xù)給藥4天。
空白對(duì)照組每只大鼠每天灌胃生理鹽水10ml，分兩次給藥。連續(xù)給藥4天。
④血清的獲得 上述各組動(dòng)物于最后一次給藥后0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h分別眼眥無(wú)菌取血，分離血清。
⑤血清的制備 將每只動(dòng)物各個(gè)采血時(shí)段分離所得的血清合并后經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，然后每組血清的一部分經(jīng)56℃、30min滅活處理，其余血清不做滅活處理。
2.2.5大鼠含藥血清藥效學(xué)評(píng)價(jià) ①取100μl傳至第四代的A375黑素瘤細(xì)胞株懸液接種于96孔板內(nèi)，其中第一列不接種，作為空白對(duì)照列。
②向細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)含細(xì)胞株的孔內(nèi)分別加入各組動(dòng)物各個(gè)取血時(shí)段分離的無(wú)菌滅活與未滅活合并血清40μl，每組血清加4個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)不加血清的A375黑素瘤細(xì)胞正常對(duì)照孔4個(gè)平行孔，每孔終體積140μl，正常對(duì)照孔加培養(yǎng)液加至140μl。
③將加樣細(xì)胞37℃，5％CO2 培養(yǎng)72h。
④培養(yǎng)結(jié)束前4h加入MTT溶液(5mg/L)15μl，繼續(xù)于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。
⑤終止培養(yǎng)后，棄去上清液，每孔加入100μl二甲基亞砜，沉淀充分溶解后，于酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔A值。
3結(jié)果 3.1家兔含藥血清對(duì)A375黑素瘤細(xì)胞增殖的影響 表1家兔含藥血清對(duì)A375黑素瘤細(xì)胞增殖的影響(x±s，n＝8)
[注]△與I組比較p＜0.01；▲與I組比較p＜0.05。
3.2大鼠含藥血清對(duì)A375黑素瘤細(xì)胞增殖的影響 表2大鼠含藥血清對(duì)A375黑素瘤細(xì)胞增殖的影響(x±s，n＝8)
[注]△p＜0.01(與I組比較)；▲p＜0.01(與I組比較)。
4討論 通過(guò)本次試驗(yàn)，我們可以得出如下結(jié)論，以A375黑素瘤細(xì)胞為模型，采用血清藥理學(xué)方法可以有效地評(píng)價(jià)治療白癜風(fēng)藥物的藥效。此次試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示(1)制備治療白癜風(fēng)復(fù)方藥物的家兔含藥血清，給藥兩小時(shí)后采血藥物活性最強(qiáng)；(2)家兔含藥血清不經(jīng)滅活作用于細(xì)胞，活性強(qiáng)；(3)家兔、大鼠給藥后得到的含藥血清均對(duì)A375黑素瘤細(xì)胞的增殖有明顯促進(jìn)作用。
權(quán)利要求
1.一種治療白癜風(fēng)的復(fù)方藥物，其特征在于以制備1000g為基數(shù)，其中補(bǔ)骨脂5-30份，驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊8-25份，高良姜10-20份，盒果藤9-18份，輔料為淀粉、糊精、微晶纖維素、硬脂酸鎂、聚維酮、羧甲基淀粉鈉、甘油明膠、硬脂酸鈉、植物油、甲基硅油、液體石蠟或蟲(chóng)膠6-29份制成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療白癜風(fēng)的復(fù)方藥物的制備方法，其特征在于按下列步驟進(jìn)行
a、將經(jīng)篩選好的補(bǔ)骨脂、高良姜、驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊藥材混合粉碎至5-80目，用6-12倍量的溶劑提取1-4次，溫度20℃-100℃，每次提取時(shí)間1-3小時(shí)，合并提取液，回收溶劑，濃縮，真空干燥或噴霧干燥，即得干浸膏，粉碎成粉末，過(guò)60-120目藥篩，備用；
b、采用常規(guī)的超微粉碎方法將盒果藤粉碎過(guò)200-400目的藥篩，備用；
c、將步驟a和步驟b混合均勻，即得混合藥粉；
d、將步驟c混合藥粉與輔料充分混勻，按常規(guī)制藥方法制成片劑、膠囊劑或滴丸即可。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟a提取溶劑為20-95％濃度的乙醇水溶液或水溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療白癜風(fēng)的復(fù)方藥物及其制備方法，是以維藥補(bǔ)骨脂、驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊、高良姜、盒果藤四味藥材為原料，加入藥學(xué)上可接受的輔料，采用溶劑提取、濃縮、除雜等預(yù)處理和超微粉碎制成，該復(fù)方藥是根據(jù)中醫(yī)藥理論，結(jié)合民族醫(yī)藥的特點(diǎn)，依據(jù)少數(shù)民族在長(zhǎng)期的民間臨床實(shí)踐，采用簡(jiǎn)便合理的提取方法，使得每一味藥材治療白癜風(fēng)的有效成分得以溶出，從提取工藝上保證了其藥理作用的發(fā)揮。該復(fù)方藥療效確切、副作用少、復(fù)發(fā)率低、服用劑量小的，適用于片劑、膠囊劑、滴丸，為白癜風(fēng)患者應(yīng)用提供了方便。
文檔編號(hào)A61P17/00GK101766779SQ20101010756
公開(kāi)日2010年7月7日 申請(qǐng)日期2010年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月9日
發(fā)明者閆明, 霍仕霞, 高莉, 唐曉琴 申請(qǐng)人:閆明