專利名稱：狂犬病毒Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)減毒活疫苗候選株的構(gòu)建與篩選的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組病毒疫苗領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種狂犬病毒減毒疫苗突 變株，其中狂犬病毒的糖蛋白的333位點(diǎn)由精氨酸突變?yōu)楣劝彼帷１景l(fā)明還涉及該狂犬病 毒減毒疫苗突變株的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
狂犬病是由狂犬病病毒引起的一種死亡率極高的人獸共患傳染病[1]。近兩年我國(guó) 人狂犬病的發(fā)病和死亡數(shù)均超過3000人/年，疫情呈明顯上升態(tài)勢(shì)，對(duì)人類健康和社會(huì)安 定構(gòu)成極大威脅[2’3]。流行病學(xué)調(diào)查表明，幾乎所有的溫血?jiǎng)游飳?duì)狂犬病病毒都易感。野生 動(dòng)物是狂犬病病毒的自然儲(chǔ)存宿主，犬、貓等家養(yǎng)動(dòng)物是狂犬病的主要傳播者。因此，防控 人狂犬病的關(guān)鍵應(yīng)從源頭上控制動(dòng)物狂犬病M。疫苗接種是控制狂犬病的有效手段。目前，世界上預(yù)防狂犬病最廣泛使用的是滅 活的狂犬病疫苗。這類疫苗盡管有效，但需要接種多針才能誘導(dǎo)足夠的免疫保護(hù)，而且價(jià)格 昂貴。與細(xì)胞培養(yǎng)疫苗相比，用感染動(dòng)物的神經(jīng)組織制備的滅活疫苗成本較低，但是，這類 疫苗會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副反應(yīng)，因此，目前滅活的狂犬病疫苗在發(fā)展中國(guó)家的應(yīng)用受到極大限 制。然而，僅含少量病毒的減毒活疫苗就能有效誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)，因?yàn)檫@種疫苗中的活 病毒能在接種的動(dòng)物體內(nèi)繁殖并合成病毒抗原。這類疫苗的生產(chǎn)成本通常比滅活疫苗顯著 降低，而且可以通過非注射的方式進(jìn)行接種。但減毒活疫苗毒株有時(shí)可由于自身殘留的毒 力或者病毒在體內(nèi)繁殖期間產(chǎn)生致病性變異而在接種的動(dòng)物中引發(fā)狂犬病。這就是通常不 使用減毒的活疫苗的主要原因。另一個(gè)原因是用傳統(tǒng)的方法開發(fā)減毒活疫苗周期長(zhǎng)不可預(yù) 測(cè)性多b’6]。因此，應(yīng)用反向遺傳技術(shù)通過體外對(duì)狂犬病病毒關(guān)鍵基因進(jìn)行突變、基因間置 換和基因重排等操作構(gòu)建與篩選重組毒株，則是獲得比現(xiàn)有疫苗更安全、更有效、更廉價(jià)的 狂犬病減毒活疫苗的有效手段[7’8]。狂犬病毒為彈狀病毒科狂犬病毒屬單股負(fù)鏈RNA病毒?；蚪M約121Λ，編碼核蛋 白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、糖蛋白(G)和大蛋白或依賴RNA的RNA聚合酶(L)五個(gè) 結(jié)構(gòu)蛋白。由于狂犬病毒無DNA復(fù)制中間體，不能發(fā)生病毒基因組與宿主細(xì)胞基因組的整 合；彈狀病毒中的大部分都具很高病毒滴度，具有容納和高水平表達(dá)外源多肽和蛋白的能 力；用所構(gòu)建的負(fù)鏈RNA病毒免疫動(dòng)物，能夠誘導(dǎo)很強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，為此狂 犬病毒等負(fù)鏈RNA病毒成為極具潛力的疫苗載體候選者[9a°’11]。1994年khnell等首次建立了狂犬病毒的反向遺傳操作技術(shù)，從感染性質(zhì)粒中成 功拯救狂犬病毒SAD-B19株[12]，這是狂犬病毒研究的里程碑。研究者們隨后陸續(xù)建立了 其他株病毒的反向遺傳系統(tǒng)[13’14]。簡(jiǎn)要地說，表達(dá)全長(zhǎng)反義基因組RNA的質(zhì)粒(基因組質(zhì) 粒)和三種分別表達(dá)病毒N、P、L蛋白的質(zhì)粒(輔助質(zhì)粒)共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。然后，反義基 因組RNA和這些蛋白組成一種反義基因組核糖核蛋白體(RNP)復(fù)合物。由于反義基因組 RNP復(fù)合物與在狂犬病病毒感染細(xì)胞中所產(chǎn)生的RNP復(fù)合物具有相同的生物活性，因此，用反義基因組RNP作為模板即可合成基因組RNA，隨后從基因組RNP中合成mRNA并表達(dá)病毒 蛋白?；蚪MRNP、其他病毒蛋白、M和G蛋白組裝后即產(chǎn)生了感染性重組狂犬病病毒。在 基因水平上操作狂犬病病毒，僅僅需要通過常規(guī)的分子克隆方法改變基因組質(zhì)粒上的病毒 cDNA序列，然后，將改造過的基因組質(zhì)粒同輔助質(zhì)粒一起用上述的方法轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中。在這 個(gè)系統(tǒng)中，為了提高疫苗毒株的安全性和免疫原性，可以有意地改變它的某些生物學(xué)性狀， 而經(jīng)典的方法則依賴于減毒相關(guān)性突變?cè)趥鞔^程中隨機(jī)、偶然地發(fā)生。在狂犬疫苗的研究中，針對(duì)糖蛋白(G)的研究最為活躍。糖蛋白(G)為狂犬病病 毒跨膜蛋白，是狂犬病毒致病性的主要成分，也是誘導(dǎo)機(jī)體保護(hù)性免疫的主要抗原[15]。Ito 等利用親代強(qiáng)毒Nishigahara株的G基因取代子代弱毒RC-HL株全基因組中的G基因，獲 得拯救的病毒，研究病毒對(duì)大鼠的致病力，研究發(fā)現(xiàn)原先弱毒的RC-HL株毒力增強(qiáng)[16’17]。由 此說明了糖蛋白對(duì)于病毒致病性的重要性。糖蛋白的結(jié)構(gòu)與毒力密切相關(guān)[18]。在與編碼 糖蛋白的基因(G基因)有關(guān)的狂犬病毒毒力致弱性研究中，除進(jìn)行G基因突變研究外，近 十幾年來國(guó)外學(xué)者還進(jìn)行了 G基因的刪除[19]、基因重排_(tái)、插入額外的G基因[21]等研究； 在國(guó)內(nèi)，目前郭霄峰等已有狂犬病毒拯救成功的報(bào)道[22’&。ERA(Evelyn-Rokitnicki-Abelseth)株是在獲得了 SAD株后，又經(jīng)地鼠腎細(xì)胞傳 了 35 40代后，再于BHK-21細(xì)胞上傳了 6代，獲得的SAD株的派生株，為紀(jì)念Evelyn、 Rokitnicky 禾口 Abelseth 三人而命名。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人所用狂犬病毒疫苗株為一株進(jìn)口 ERA株疫苗的克隆株， ERA(Evelyn-Rokitnicki-Abelseth)克隆株。為消除其毒力返強(qiáng)的隱患，本研究通過反向遺 傳操作構(gòu)建其感染性克隆，采用PCR突變技術(shù)將狂犬病毒糖蛋白(G或GP)的333位精氨酸 突變?yōu)楣劝彼?，?gòu)建出一免疫原性好、無致病性的狂犬病病毒基因突變疫苗候選株。更具體地，本發(fā)明提供以下各項(xiàng)1. 一種狂犬病毒減毒疫苗突變株，其中狂犬病毒的糖蛋白的333位點(diǎn)由精氨酸 (R)突變?yōu)楣劝彼?E)。在本發(fā)明中，這種狂犬病毒減毒疫苗也稱為狂犬病毒GP333位R —E 突變株。2.根據(jù)以上1所述的狂犬病毒減毒疫苗突變株，其中狂犬病毒的糖蛋白的333位 點(diǎn)的密碼子由AGA突變?yōu)镚AA。3.根據(jù)以上1或2所述的狂犬病毒減毒疫苗突變株，其中所述狂犬病毒為ERA株。 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的狂犬病毒減毒疫苗突變株其基因組序列如 SEQ ID No. 1 所示。4.根據(jù)以上1-3中任一項(xiàng)的狂犬病毒減毒疫苗突變株在制備用于預(yù)防狂犬病的 藥物中的應(yīng)用。5. 一種制備狂犬病毒減毒疫苗突變株的方法，其特征在于將狂犬病毒的糖蛋白的 333位點(diǎn)由精氨酸突變?yōu)楣劝彼帷?.根據(jù)以上5的所述方法，其中狂犬病毒的糖蛋白的333位點(diǎn)的密碼子由AGA突 變?yōu)镚AA。7.根據(jù)以上5或6所述的方法，其中所述狂犬病毒為ERA株。
8.根據(jù)以上5-7中任一項(xiàng)所述的方法，其包括以下步驟(1)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括狂犬病毒的全長(zhǎng)基因組cDNA序列；(2)將步驟(1)的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒中狂犬病毒的全長(zhǎng)基因組cDNA序列中編碼糖蛋白的 333位點(diǎn)的精氨酸的密碼子突變?yōu)榫幋a谷氨酸的密碼子；(3)構(gòu)建一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒，該輔助質(zhì)粒分別包括編碼所述狂犬病毒的核 蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述狂犬病毒的磷蛋白(P)的cDNA序列、和編碼所述狂犬病 毒的依賴RNA的RNA聚合酶(大聚合酶蛋白)(L)的cDNA序列；(4)將步驟O)中構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和步驟(3)中構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所述 狂犬病毒復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞，救獲重組狂犬病毒減毒疫苗突變 株。9.根據(jù)以上8所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是BHK-21細(xì)胞。10.根據(jù)以上8所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒分別是pCI-N、pCI-P和 PCI-L0在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)以上8所述的方法的步驟O)中構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄 質(zhì)粒是PCI-RV G333R/E(其中編碼糖蛋白的333位點(diǎn)的精氨酸的密碼子(AGA)已經(jīng)突變?yōu)?編碼谷氨酸的密碼子(GAA))?？袢〔《镜姆聪蜻z傳操作技術(shù)由Schnell等于1994年首先建立，該系統(tǒng)應(yīng)用T7 啟動(dòng)子系統(tǒng)，拯救病毒的效率較低，且需要痘苗病毒的參與影響了對(duì)所拯救病毒的篩選鑒 定。我們已成功建立了狂犬病毒ERA株反向遺傳操作系統(tǒng)，該系統(tǒng)在以往的操作系統(tǒng)上進(jìn) 行了改進(jìn)，使用了 CMV啟動(dòng)子，無需痘苗病毒的輔助，將ERA株全基因組表達(dá)質(zhì)粒以及輔助 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，就能使病毒獲得拯救，從而節(jié)省了操作時(shí)間，提高了病毒的拯救效率，該 系統(tǒng)的建立為狂犬病毒致病性的研究提出了新思路，也為新疫苗候選毒株的開發(fā)提供了良 好的技術(shù)平臺(tái)。


圖1.狂犬病病毒ERA株全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建；圖2. GP333位R — E突變株全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建；圖3A和3B. GP333位R — E突變株的鑒定(間接免疫熒光結(jié)果)；圖4. GP333位R — E突變株的鑒定(電子顯微鏡負(fù)染觀察)；圖5. GP333位R — E突變株的鑒定(RT-PCR電泳結(jié)果)；圖6. GP333位R — E突變株的鑒定(已純化PCR產(chǎn)物的測(cè)序分析)；圖7. GP333位R — E突變株的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特性；圖8和圖9. GP333位R — E突變株的遺傳穩(wěn)定性；圖10. GP333位R — E突變株的致病性(乳鼠)；圖11. GP333位R — E突變株的致病性(成年鼠)。
具體實(shí)施例方式下文將參考實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅是意圖舉例說明本發(fā)明，而不 是意圖限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由后附的權(quán)利要求具體限定。實(shí)施例1狂犬病毒GP333位R — E突變株的構(gòu)建和生物學(xué)活性鑒定
1材料和方法1. 1細(xì)胞與病毒Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞，ATCC No. CCL-81)培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的 DMEM ；NA細(xì)胞(神經(jīng)瘤細(xì)胞，購(gòu)自長(zhǎng)春軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的MEM ； BHK-21細(xì)胞(乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞，ATCC No. CCL-10)培養(yǎng)基為含5%胎牛血清的DMEM ；試驗(yàn)所 用狂犬病毒疫苗株為ERA株疫苗(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，AV61)，病毒中和實(shí)驗(yàn)所用狂 犬病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株CVS購(gòu)自長(zhǎng)春軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。1. 2主要試劑和儀器PrimerSTAR HS DNA Polymerase, T4 DNA連接酶，及限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自 TaKaRa公司。RNA提取試劑Trizol，鼠源反轉(zhuǎn)錄酶(MLV)試劑盒，磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒 (Calciumphosphate Transfection Kit)均購(gòu)自 Invitrogen 公司，膠回收(Gel Extraction Mini Kit)及質(zhì)粒小量提取試劑盒(Plasmid Mini Kit)均購(gòu)自上海華舜。質(zhì)粒中量提取試 劑盒購(gòu)自QIAGEN公司。普通顯微鏡與熒光顯微鏡分別購(gòu)自Leica公司。不同型號(hào)離心機(jī) 均購(gòu)自BECKMAN公司。P2級(jí)生物安全柜購(gòu)自LABC0NC0公司。1.3 引物1. 3. 1 ERA全長(zhǎng)cDNA克隆引物序列及酶切位點(diǎn)參照GeneBank中提供的狂犬病毒ERA株基因序列(GenBank Accession No. EF206707)，設(shè)計(jì)RT-PCR引物將全序列分為7段(Rl至R7，所用引物分別為R1F/R1R，R2F/ R2R, R3F/R3R, R4F/R4R, R5F/R5R, R6F/R6R 和 R7F/R7R)，引物序列見表 1。表1 ERA全長(zhǎng)cDNA克隆引物
引物名稱引物序列RlFGTCACTGCTAGCTGGTGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCACGCTTAACAACCAGATCAAAG CMidHam)RlRACTCGGCGAATGAGTTTGGAC (含 Sail)R2FTCGAATCATGATGAATGGAGGR2RCAGCCCACTGGAAGATAAAGG (含 Bst 11071)R3FCTGAGGGCATGAACTGGGTATR3RTCCCTGTCCCTCTGAGATTGT (含 SphI)R4FAAGAGTCAATCGATCAGAACCR4RCACAGGGACCGAACGTCTCTT (含 StuI)R5FAGAGAGCAGAAAAGTTTAGGCR5RTTGCCTCTCGAAACTCTGAAT (含 EcoRI)R6FGACGAGGTGGACAAGGTGGAGR6RCCCACTGAACCACTCTCAAGC (含 ApaI)R7FGTCTCGGAGCTTGACATAAGGR7RCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCCACGCTTAACA A ATA AACA AC A (CpoM HdvRz 序列)1. 3. 2狂犬病病毒糖蛋白(GP蛋白)333位分子修飾用引物ERA株GP333位R — E引物P1F、PlR及突變鑒定引物P2F、P2R見表2。表2 ERA GP333位R — E突變引物對(duì)，斜體加粗部分為突變堿基引物名稱引物序列PlFGCTCACTACAAGTCAGTCG/4AACTTGGAATGAGATCCTPlRAGGATCTCATTCCAAGTT7TGACTGACTTGTAGTGAGCP2FAGCATTTCCGCCCAACACCAGP2RCCGAGGATTCCAACAACT1.4全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建1. 4. 1狂犬病病毒ERA株全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建利用表1所示的引物，通過一系列RT-PCR反應(yīng)，構(gòu)建了覆蓋整個(gè)基因組的7個(gè)片 段(R1-R7)，利用各個(gè)片段間重疊部分的酶切位點(diǎn)，在pCI載體(購(gòu)自promega)上連接組裝 獲得了 11932nt的完整cDNA克隆，序列拼接結(jié)果已經(jīng)登錄GenBank，登錄號(hào)為FJ913470 (其 全序列與SEQ ID No. 1的區(qū)別僅在于編碼糖蛋白的333位點(diǎn)的密碼子沒有由AGA突變?yōu)?GAA)。在全長(zhǎng)cDNA片段兩端分別連有具有自我催化功能的錘頭狀核酶(Ham)和丁型肝炎核 酶(HdvRz)，構(gòu)建完成的質(zhì)粒命名為pCI-RV(其全序列見SEQ ID No. 5)(具體克隆過程見圖 1)。將表達(dá)核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)及大聚合酶蛋白(L)基因的開放閱讀框架(ORF)cDNA 分別緊接著克隆在PCI空載體T7/CMV啟動(dòng)子下游，分別構(gòu)成轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒pCI-N，pCI-P, pCI-L (質(zhì)粒pCI-N、pCI-P和pCI-L的核苷酸序列分別如SEQ ID Nos. 2，3和4所示)。1. 4. 2 GP333位R — E突變株全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建使用TaKaRa MutanBEST kit (Code No. D401)試劑盒，將 GP333 位(原堿基序列為 AGA,利用PCR方法突變?yōu)镚AA)，使原來的精氨酸(R)突變?yōu)楣劝彼?E)，構(gòu)建完成的質(zhì)粒命 名為pCI-RVG333R/E。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下以構(gòu)建完成的狂犬病病毒ERA株全長(zhǎng)cDNA克隆pCI_RV為模板，以RVGF 5'-GGCC GTTTAAACAACATCCCTCAAAAGACTCA-3’和 RVGR :5，-GGCCGTTTAAACTTTTTTTCTCGACTGAAAAGCTTA GATGAC-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段克隆至pBluescript的EcoRV位點(diǎn)并經(jīng)序列測(cè)定 分析，確定正確后命名為pblue-RVG。使用TaKaRa MutanBEST kit (Code NO. D401)試劑盒，以試驗(yàn)室已構(gòu)建保存的 pblue-RVG 質(zhì)粒為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為Pyrobest DNA Polymerase(TaKaRa) (5U/y L)0. 5μ L,上下游引物(P1F、PlR)各 1 μ L, IOXPyrobest BufferII 5 μ L, dNTP Mixture (各2. 5mM) 4 μ L，模板1 μ L，補(bǔ)加滅菌蒸餾水至50 μ L ；反應(yīng)條件94°C 30S, 55 °C 30S，72°C 5min，共30個(gè)循環(huán)。1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。切膠回收目的DNA片 段，加1 μ L DpnI酶于回收產(chǎn)物中混勻，37°C孵育lh，將4 10 μ L DpnI消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 100 μ L的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取4-5個(gè)克隆進(jìn)行序列的測(cè)定及分析。測(cè)序正確的質(zhì) 粒命名為 pblue-RVG333R/E。將pblue-RVG333R/E突變部分組裝連入pCI_RV質(zhì)粒中，替換未突變部分，即將 pblue-RVG333R/E通過xhol消化后與同樣處理過的pblue空質(zhì)粒連接，篩選正向連接質(zhì)粒， 再用 SpeI 和 HindIII 雙切，連接于 pblue_RV(XhoI/XhoI)的 SpeI 和 HindIII 之間，篩選 出的陽性質(zhì)粒命名為pblue-RV(xhoI/xhoI)G333R/E。將pCI空載體Nhel、MluI雙切后與 pCI-RV全長(zhǎng)質(zhì)粒NheI、MluI酶切回收產(chǎn)物連接，鑒定出的陽性克隆命名為pCI-RV(N/M)。將 pbIue-RV(xhol/xhol)G333R/E 經(jīng) XhoI、MluI 雙切后連接 pCI-RV(N/M)Xhol,MluI 酶切回收 產(chǎn)物，鑒定陽性克隆命名為 pCI-RV (N/M) G333R/E。將 pCI-RV (N/M) G333R/E 經(jīng) NheI、MluI 消化后與PCI-RV全長(zhǎng)質(zhì)粒NheI、MluI消化產(chǎn)物連接，鑒定出的陽性克隆即為pCI-RV G333R/ E(其全序列見SEQ ID No. 6)(具體過程見圖2)。1. 5 GP333位R — E突變株的拯救BHK-21細(xì)胞接種于35mm六孔板中，待生長(zhǎng)至50% 80%單層時(shí)，采用CaPO4轉(zhuǎn)染 試劑將轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pCI-RV G333R/E及輔助質(zhì)粒pCI-N、pCI_P和pCI-L分別以5 μ g、2. 5 μ g、 1. 25 μ g和1. 25 μ g的量共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，37 V 5% CO2培養(yǎng)，具體操作按磷酸鈣轉(zhuǎn)染試 劑盒(Calcium phosphate Transfection Kit)說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后8 12h，棄去轉(zhuǎn)染混 合物，用含10% DMSO的PBS液休克細(xì)胞2. 5min,加入完全DMEM培養(yǎng)液，37°C 5% CO2培養(yǎng)； 4 5d后將細(xì)胞刮下來，取500 μ L細(xì)胞懸液接種于生長(zhǎng)過夜、密度約80%的單層Vero細(xì) 胞，感作Ih后加入含5%胎牛血清的DMEM，37°C 5% CO2培養(yǎng)3 5d，將細(xì)胞懸液繼續(xù)在單 層Vero細(xì)胞上傳代三次以上，收獲鑒定。1. 6 GP333位R — E突變株的鑒定1. 6. 1間接免疫熒光(IFA)鑒定Vero細(xì)胞接種于M孔板中，待生長(zhǎng)至80% 90%單層時(shí)，按MOI約為1感染收獲 的病毒液，37°C感作Ih后加入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，3d后棄培養(yǎng)上清，PBS洗滌細(xì)胞2次， 用冷3%多聚甲醛室溫固定30min，PBST(PBS+Tween)洗滌細(xì)胞3次后用BSA封閉，分別 以1 100稀釋的鼠抗ERA全病毒高免血清(高免血清是用ERA多次接種小鼠制備的)和 相應(yīng)稀釋倍數(shù)的陰性血清作為一抗，作用30min。PBST洗滌細(xì)胞3次后加入適當(dāng)倍數(shù)稀釋 的稀熒光素(FITC)標(biāo)記的兔抗鼠二抗(Sigma)，作用30min，PBST洗滌后熒光顯微鏡觀察 結(jié)果。1.6.2電鏡觀察及RT-PCR鑒定收集感染細(xì)胞上清懸液，采用磷鎢酸負(fù)染法制備樣本，常規(guī)透射電鏡觀察病毒粒 子形態(tài)；取拯救病毒250 μ L，提取RNA (Trizol法)。用1. 3. 2中的P2F和P2R作為引物進(jìn)行 RT-PCR，對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，以確定救獲的病毒是否為GP333位R(AGA) — E(GAA)
突變株。1. 7 GP333位R — E突變株的傳代、滴定與生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)已鑒定正確的病毒按1. 5的方法繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)增至F7代，病毒細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)反復(fù)凍 融3次，-70°C凍存作為種毒，用于對(duì)救獲病毒的生物學(xué)特性分析。種毒作10倍連續(xù)梯度稀 釋，以100 μ L接種于NA細(xì)胞(神經(jīng)瘤細(xì)胞)，37°C感作Ih后加入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，3d 后棄培養(yǎng)上清，PBS洗滌細(xì)胞2次，用冷3%多聚甲醛室溫固定30min，PBST洗滌細(xì)胞3次后 用1%BSA封閉，分別以1 100稀釋的鼠抗ERA全病毒高免血清和相應(yīng)稀釋倍數(shù)的陰性血 清作為一抗，作用30min。PBST洗滌細(xì)胞3次后加入適當(dāng)倍數(shù)稀釋的熒光素(FITC)標(biāo)記的 兔抗鼠二抗，作用30min，PBST洗滌后熒光顯微鏡觀察結(jié)果，從而測(cè)得病毒滴度，滴度用PFU 表示；按0. 01M0I接種單層Vero細(xì)胞，分別于感染后Id (天)、2d、3d、4d、5d和6d按時(shí)間順 序分別收獲取樣，取樣結(jié)束后把收獲的病毒做10倍系列稀釋，以100 μ L接種于NA細(xì)胞，按 照上述方法固定染色，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，繪制病毒生長(zhǎng)動(dòng)力曲線。1. 8 GP333位R — E突變株遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)1. 8. 1乳鼠腦內(nèi)接種(MIT)傳代具體步驟為用酒精棉球?qū)? 3d乳鼠(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)頭部進(jìn)行局部消毒后，用ImL滅菌注射器分別吸取處理過的接種用病毒液(GP333位 R — E突變株)，在接種部位垂直進(jìn)針深約0. 25cm,顱內(nèi)接種0. 03mL,通常一種病毒注射5 6只乳鼠，注射后的乳鼠應(yīng)在有高效濾過裝置的負(fù)壓飼養(yǎng)籠內(nèi)飼養(yǎng)，可用燒熱的鑷子迅速對(duì) 乳鼠斷尾或斷耳區(qū)分。接種乳鼠歸窩前需先用酒精棉球涂抹母鼠鼻部，以免母鼠因嗅到異 味而吃掉接種乳鼠。7 IOd后，如發(fā)現(xiàn)乳鼠哺乳力減弱、步樣失調(diào)、麻痹，剖取鼠腦用生理 鹽水或PBS研磨，制成10% 30%的勻漿液(W/V)，2000r/min離心30min，取上清，將青霉 素/鏈霉素雙抗(Gibco) (1000IU/mL)等抗菌素按1 4量加入離心上清中，混勻后置4°C 感作過夜，接種前7000r/min離心lOmin，無菌取出上清，如上方法繼續(xù)傳代。將傳至不同代 次的病毒(SN-1 (SN是鼠腦的拼音縮寫，字母后面的數(shù)字表示傳代的代數(shù)，以下同)、SN-3和 SN-5)，分別提取RNA，以1. 3. 2中的P2F和P2R為引物進(jìn)行RT-PCR，對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行序列 分析，以確定傳代多次后修飾的減毒株糖蛋白序列的穩(wěn)定性、GP333位是否仍為E、是否發(fā) 生回復(fù)突變。1. 8. 2 NA細(xì)胞(神經(jīng)瘤細(xì)胞)傳代為了檢測(cè)修飾后的減毒株的遺傳穩(wěn)定性，將突變株病毒在NA細(xì)胞上進(jìn)行連續(xù)多 次傳代。具體步驟為NA細(xì)胞接種于6孔板中，待生長(zhǎng)至80% 90%單層時(shí)，按MOI約為 0.01感染病毒(GP333位R —E突變株)，37°C 5% CO2培養(yǎng)，逐日觀察應(yīng)無CPE，至第4天 將病毒細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)_20°C /37°C反復(fù)凍融3次，-70°C保存；將收獲的病毒進(jìn)行滴定后，按 MOI約為0. 01感染新鮮的NA細(xì)胞，至第4天凍融收毒，按如上方法繼續(xù)傳代。將傳至不同 代次的病毒(NA-1、NA-5、NA-IO, NA-15 和 NA-20)，分別提取 RNA,以 1. 3. 2 中的 P2F 和 P2R 為引物進(jìn)行RT-PCR，對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，以確定傳代多次后修飾的減毒株糖蛋白 序列的穩(wěn)定性、GP333位是否仍為E、是否發(fā)生回復(fù)突變。2 結(jié)果2. 1GP333位R — E突變株的鑒定間接免疫熒光結(jié)果顯示病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物可見綠色熒光，陰性對(duì)照沒有熒光 信號(hào)(圖3A和;3B)；經(jīng)電子顯微鏡負(fù)染觀察，觀察到了呈彈狀的病毒粒子，如圖4所示，符合 狂犬病毒電鏡下的形態(tài)特征；RT-PCR電泳結(jié)果可見一條大小約為980bp的特異性條帶(圖 5)；已純化PCR產(chǎn)物的測(cè)序分析表明，GP333位R(AGA)已突變?yōu)镋(GAA)(圖6)；擴(kuò)增至F7 代的GP333位R — E突變株病毒IFA滴定結(jié)果為107PFU/mL ；生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明病毒與 24h后開始復(fù)制，在第5d達(dá)到最高峰，表現(xiàn)類似狂犬病毒野生型對(duì)照株的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特性 (圖7)。由此可見，救獲的病毒為GP333位R(AGA) — E (GAA)突變株，且具有較高的生長(zhǎng)滴 度。命名為 rRV-G333R/E。2. 2 rRV-G333R/E突變株的遺傳穩(wěn)定性以傳至不同代次的鼠腦毒(SN-1、SN-3和SN_5)和傳至不同代次的NA細(xì)胞毒 (NA-1、NA-5、NA-10、NA-15和NA-20)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用P2F和P^為引物作PCR擴(kuò)增， 均擴(kuò)增出了 980bp的特異性條帶，與理論值大小相同。進(jìn)一步測(cè)定其序列并分析，結(jié)果與傳 代前毒種的核苷酸及氨基酸序列相同，GP333位均為E(GAA)(圖8和圖9)，均未發(fā)生回復(fù)突變。實(shí)施例2狂犬病毒rRV_G333R/E突變株的致病性除非另外特別指出，本實(shí)施例的材料和方法同實(shí)施例1。
rRV-G333R/E突變株致病性檢測(cè)將狂犬病毒ERA野生型對(duì)照株(106PFU/mL)、rRV_G333R/E突變株(107PFU/mL)原 液分別以50 μ L/只腦內(nèi)接種乳鼠及成年Balb/c小鼠(3周齡，10 13g，購(gòu)自北京維通利 華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，各病毒株分別接種10只，接種后的小鼠置于高效濾過裝置的 負(fù)壓飼養(yǎng)籠內(nèi)飼養(yǎng)，逐日觀察至接種后觀天，記錄存活數(shù)，接種后4天內(nèi)死亡的鼠為非特異 性死亡，不作統(tǒng)計(jì)。結(jié)果狂犬病毒ERA野生型對(duì)照株、rRV_G333R/E突變株腦內(nèi)接種乳鼠均致死。野 生型對(duì)照株攻毒后第6天乳鼠已全部死亡，而突變株攻毒后第7天引起乳鼠死亡，至第10 天時(shí)才全部死亡，與野生型對(duì)照株相比病程較緩慢(圖10)；腦內(nèi)接種成年鼠后，突變株完 全不致病，接種后的小鼠均健康存活(圖11)，體重?zé)o明顯減輕，說明突變株比野生型對(duì)照 株毒力弱，對(duì)成年鼠是安全的。實(shí)施例3狂犬病毒rRV_G333R/E突變株的免疫原性除非另外特別指出，本實(shí)施例的材料和方法同實(shí)施例1。rRV-G333R/E突變株免疫原性檢測(cè)1. rRV-G333R/E突變株對(duì)鼠的免疫原性將狂犬病毒ERA野生型對(duì)照株(106PFU/mL)、rRV_G333R/E突變株(107PFU/mL)原 液分別稀釋至106PFU/mL和2*106PFU/mL，以100 μ L/只經(jīng)肌肉注射途徑人工免疫5周齡成 年Balb/c小鼠(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，各病毒株分別免疫5只小鼠， 另設(shè)非免疫對(duì)照組，免疫后21d用同代次病毒，以相同劑量經(jīng)肌肉注射加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫 三周后采血測(cè)定血清中和抗體滴度。2. rRV-G333R/E突變株對(duì)犬的免疫原性將狂犬病毒ERA野生型對(duì)照株(106PFU/mL)、rRV_G333R/E突變株(107PFU/mL)原 液分別稀釋至106PFU/mL和2*106PFU/mL，以ImL/只經(jīng)肌肉注射途徑人工免疫3月齡比格 犬(購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，經(jīng)RFFIT檢測(cè)狂犬病中和抗體陰性)，各病毒株分 別免疫5只比格犬，另設(shè)非免疫對(duì)照組，免疫后21d用同代次病毒，以相同劑量經(jīng)肌肉注射 加強(qiáng)免疫，分別與一次免疫21d和加強(qiáng)免疫14d后采血并分離血清。血清經(jīng)56°C 30min滅 活后，按常規(guī)快速熒光灶抑制試驗(yàn)(RFFIT)以狂犬病毒標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒CVS作為攻擊毒株(購(gòu) 自長(zhǎng)春軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)檢測(cè)中和抗體。具體過程為血清樣品連續(xù)20倍至1280倍倍比 稀釋，同時(shí)設(shè)陰、陽性血清對(duì)照。將稀釋好的血清與含1000個(gè)LD50 CVS病毒等體積混合， 37°C孵育lh，取100 μ L加到過夜生長(zhǎng)的M孔Vero細(xì)胞，感染后4 經(jīng)間接免疫熒光法觀 察CVS在細(xì)胞的感染情況。記錄100%攻毒接種物被中和的最高血清稀釋倍數(shù)，觀察視野中 無感染細(xì)胞，作為被檢血清的中和抗體滴度。結(jié)果以CVS作為攻擊病毒株，檢測(cè)所采集的小鼠及犬免疫血清中和抗體，在 接毒后48h時(shí)進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，并在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。經(jīng)野生型疫苗株和 rRV-G333R/E突變株免疫所采集的小鼠及犬免疫血清都具有較高的中和抗體水平；犬一次 免疫后21d采血，同時(shí)以相同劑量、相同途徑進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫14d后再采血，結(jié)果顯示突 變株一次免疫21d血清的中和抗體水平比野生型疫苗株誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平稍低，而經(jīng)過 二次加強(qiáng)免疫兩毒株血清抗體水平均有顯著提高，且突變株加強(qiáng)效果更為明顯。具體數(shù)據(jù) 見表3和表4。
表3免疫小鼠血清RFFIT試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種狂犬病毒減毒疫苗突變株，其中狂犬病毒的糖蛋白的333位點(diǎn)由精氨酸突變?yōu)?谷氨酸，優(yōu)選其中狂犬病毒的糖蛋白的333位點(diǎn)的密碼子由AGA突變?yōu)镚kk0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的狂犬病毒減毒疫苗突變株，其中所述狂犬病毒為 ERA(Evelyn-Rokitnicki-Abelseth)克隆株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的狂犬病毒減毒疫苗突變株，其基因組序列如SEQID No. 1所示。
4.一種制備狂犬病毒減毒疫苗突變株的方法，其特征在于將狂犬病毒的糖蛋白的333 位點(diǎn)由精氨酸突變?yōu)楣劝彼?，?yōu)選將狂犬病毒的糖蛋白的333位點(diǎn)的密碼子由AGA突變?yōu)?GAA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述狂犬病毒為ERA克隆株。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其包括以下步驟(1)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括狂犬病毒的全長(zhǎng)基因組cDNA序列；(2)將步驟⑴的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒中狂犬病毒的全長(zhǎng)基因組cDNA序列中編碼糖蛋白的333位 點(diǎn)的精氨酸的密碼子突變?yōu)榫幋a谷氨酸的密碼子，優(yōu)選突變后的全長(zhǎng)基因組cDNA序列如 SEQ ID No. 1 所示；(3)構(gòu)建一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒，該輔助質(zhì)粒分別包括編碼所述狂犬病毒的核蛋白 (NP)的cDNA序列、編碼所述狂犬病毒的磷蛋白⑵的cDNA序列、和編碼所述狂犬病毒的依 賴RNA的RNA聚合酶(大聚合酶蛋白)(L)的cDNA序列；和(4)將步驟中構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和步驟(3)中構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所述狂犬 病毒復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞，救獲重組狂犬病毒減毒疫苗突變株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是BHK-21細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒分別是質(zhì)粒pCI-N、pCI-P和 pCI-L，其中質(zhì)粒pCI-N、pCI-P和pCI-L的核苷酸序列分別如SEQ ID Nos. 2，3和4所示。
9.通過權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)所述的方法制備的狂犬病毒減毒疫苗突變株。
10.試劑盒，其包括根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的狂犬病毒減毒疫苗突變株或通過 權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)所述的方法制備的狂犬病毒減毒疫苗突變株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種狂犬病毒減毒疫苗突變株，其中狂犬病毒的糖蛋白的333位點(diǎn)由精氨酸突變?yōu)楣劝彼?。本發(fā)明還涉及該狂犬病毒減毒疫苗突變株的制備方法和應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102134562SQ20101010915
公開日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2010年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月22日
發(fā)明者馮娜, 夏咸柱, 楊松濤, 步志高, 王喜軍, 葛金英 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所